Verfahren für Dezellularisierung von Rattenlebern in einer oszillierenden Druck Perfusionsvorrichtung

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Rolle der Perfusionswurzel bei der Optimierung der Homogenität der Perfusionsdezellularisierung der Rattenleber zu bewerten. Dies wird erreicht, indem zunächst die Pfortadern und Leberarterien frisch isolierter Rattenlebern kanüliert werden. In einem zweiten Schritt werden die Lebern an ein Perfusionsgerät zur selektiven Perfusion der Pfortadern oder der Leberarterien angeschlossen.

Als nächstes werden oszillierende Druckänderungen an die Perfusionskammer angelegt, um die intraabdominalen Druckänderungen nachzuahmen, die während der Atmung auftreten. Optimierung der Mikroperfusion der Leber, letztendlich zeigen Lebern, die über die Leberarterie unter oszillierenden Druckbedingungen perfundiert werden. Eine homogenere und schnellere Dezellularisierung, wie durch makroskopische Beobachtung und histologische und biochemische Analyse beurteilt wird. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der portalvenösen Perfusionsdezellularisierung besteht darin, dass die arterielle Perfusion unter oszillierenden Druckbedingungen zu einem homogeneren Dezellularisierungsergebnis führt.

In kürzerer Zeit kann diese Methode jedoch Einblicke in Verzögerungstechniken geben. Es kann auch auf andere Systeme angewendet werden, z. B. auf Res-Solarisationsexperimente, extraorale Perfusionsaufbauten und Organmodelle. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die Entnahme und arterielle Kanülierung von roten Lebern kompliziert sein kann.

Machen Sie vor der Entnahme der Leber einen schrägen Schnitt am Ende eines 1,5 Zentimeter großen Stücks eines peripheren Venenkatheters G 20. Schließen Sie den Katheter an einen Drei-Wege-Absperrhahn an und verwenden Sie eine 10-Milliliter-Spritze, die mit Ringerlösung gefüllt ist, um das System zu entlüften. Schneiden Sie anschließend die Nadel einer Schmetterlingskanüle auf eine Länge von fünf Millimetern ab und befestigen Sie mit Sekundenkleber einen fünf Zentimeter großen Schlauch an der Nadel.

Führe eine zwei Zentimeter lange Tube in die größere Tube ein und fixiere diese Tube ebenfalls mit Sekundenkleber. Schieben Sie ein weiteres Rohr über diese Konstruktion und kleben Sie es fest, um ein Widerlager zu erstellen. Verwenden Sie dann eine mit Ringerlösung gefüllte Fünf-Milliliter-Spritze, um die neu konstruierte arterielle Kanüle zu reinigen, um die Leber für die Ernte zu reparieren.

Beginnen Sie mit der Verwendung eines Verbandes für feuchte Ursachen, um den medialen und linken Leberlappen einer anästhesierten erwachsenen Ratte unter der Kuppel des Zwerchfells zu halten. Legen Sie zu diesem Zeitpunkt auch das Hepato Duodenalband und den oberen Leberlappen frei. Als nächstes zerlegst du mit zwei Mikrozangen und einer Federschere vorsichtig das Band, das am oberen Ovellappen befestigt ist, bis der Lappen beweglich ist.

Halten Sie dann den medialen und linken Lappen an Ort und Stelle. Bewege den Lappen mit feuchten Wattestäbchen unter die Kompresse des GRE und den Magen links vom Tier. Fixieren Sie den Magen mit einer Klemme und zerlegen Sie den kleinen Impuls.

Präparieren Sie dann den unteren oder mentalen Leberlappen, bis er beweglich ist, und bewegen Sie den Lappen mit einer Hinterhausklemme zurück in seine Höhle, um den Zwölffingerdarm zu halten, und bewegen Sie den Zwölffingerdarm nach links, um das Herpa-Zwölffingerdarmband freizulegen. Umschreiben des Gallengangs communis. Präparieren Sie dann den Gallengang aus dem Fett- und Bauchspeicheldrüsengewebe und schneiden Sie den Gang 1,5 Zentimeter von der Gallengangsgabelung entfernt.

Präparieren Sie die Salvene vom umgebenden Fettgewebe und legen Sie die Gastroduodenalvene frei. Ligattieren Sie dann die Vena gastroduodenalis zweimal mit sechs Nullnähten und teilen Sie die Vene zwischen den beiden Knoten. Präparieren Sie den Truncus coeliacus und die Arteria hepatica communis vom umgebenden Gewebe, bis alle arteriellen Ramia freigelegt sind.

Nachdem alle Arterien präpariert wurden, wird die Vena cavalis inferior zwischen der rechten Niere und dem rechten lateralen Leberlappen umschrieben und die Vene aus dem retroperitonealen Raum präpariert. Folgen Sie dem Truncus coeliacus, um die Aorta freizulegen. Anschließend wird das retroperitoneale Fettgewebe präpariert und die Aorta oberhalb des Truncus coeliacus umschrieben.

Injizieren Sie nun 1000 Einheiten Heparin in einem Milliliter Kochsalzlösung in den unteren Venenschwellkörper. Decken Sie den Schnitt mit einem Wattepad ab und warten Sie ein bis zwei Minuten, bis das Heparin wirkt. Umschreiben Sie dann die Aorta mit einer Zange und präparieren Sie die Aorta und den Vena caver inferior distal von der Niere aus.

Um die Pfortaderkanüle zu platzieren, machen Sie einen Fischmaulschnitt in der distalen Pfortadervene und öffnen Sie den Schnitt mit einer Pinzette. Kanülieren Sie dann die Pfortader und spülen Sie die Leber mit 20 Millilitern Ringerlösung, bis die Leber entmenschlicht wird. Verwenden Sie Seiden-Sechs-Null-Ligaturen, um die Kanüle an Ort und Stelle zu fixieren. Um die arterielle Kanüle zu platzieren, präparieren Sie die Aorta oberhalb des Truncus coeliacus, bis das Aortasegment aus dem retroperitonealen Raum befreit werden kann.

Schneiden Sie das Aortasegment in Längsrichtung ab, um ein Aortenpflaster zu generieren und führen Sie die selbstgebaute Kanüle in eine statische Halterung ein. Schieben Sie dann mit zwei Pinzetten das Aortenpflaster über die Kanüle und ligieren Sie die Leberarterie mit einer Seidennaht mit sechs Nullen über die Kanüle. Fixierung des Pflasters am Abutment zur Durchführung der Dezellularisierung: Verbinden Sie den Drei-Wege-Absperrhahn an der Pfortaderkanüle mit dem zugehörigen Reaktorzugang und verbinden Sie die arterielle Kanüle mit dem arteriellen Zugang, wobei darauf zu achten ist, dass keine Luft in die Systeme eindringt.

Schließen Sie als Nächstes das Atemschutzgerät an die Druckverteilungskammer an und verbinden Sie die Kammer mit dem Reaktor. Starten Sie die Druckanwendung. Dann wird die Dezellularisierung gestartet.

Fusionieren Sie die Leber mit 1% Tritton X 100 mit einer Geschwindigkeit von fünf Millilitern pro Minute. Lassen Sie den Abfall über den Abfluss des Perfusionsgeräts abfließen, um den Flüssigkeitsstand in der Perfusionskammer konstant und über der perfundierten Leber zu halten. Nach 90 Minuten wird das Detergens auf 1%SDS umgestellt. Lebern, die über die Kraftvene perfundiert werden, weisen eine homogene Aufklärung auf, die auf eine Dezellularisierung mit makroskopisch sichtbaren verbleibenden Zellen während und nach dem Prozess hinweist, während Lebern, die über die Leberarterie perfundiert werden, einen homogeneren Dezellularisierungsverlauf mit weniger sichtbaren verbleibenden Zellen aufweisen.

Wurden die Lebern unter oszillierenden Druckbedingungen perfundiert, waren keine verbleibenden Zellen sichtbar. Unabhängig von der Perfusion. Die wurzelhistologische Auswertung der dezellularisierten Lebermatrizen unterstützt den makroskopischen Befund in Lebern, die über die Leberarterie perfundiert wurden.

Es werden keine verbleibenden Zellen beobachtet, unabhängig davon, ob sie unter oszillierenden Druckbedingungen perfundiert wurden oder nicht, Lebern, die über die Pfortader perfundiert wurden, weisen jedoch Zonen verbleibender Zellen auf, selbst wenn sie unter oszillierenden Druckbedingungen perfundiert sind, obwohl diese Bedingungen die verbleibende Zellmasse in diesen Lebern reduzieren, beachten Sie die Erhaltung der extrazellulären Matrizen der Lebern unabhängig von den Dezellularisierungsbedingungen. Auch der DNA-Gehalt pro Trockengewicht der Lebermatrix nahm in allen Versuchsgruppen im Vergleich zur nativen Leber ab. Statistisch signifikant waren die Unterschiede allerdings nur in der Gruppe unter oszillierenden Druckbedingungen.

Darüber hinaus bestätigte der Korrosionsguss der dezellularisierten Lebermatrizen den Erhalt der Mikroanatomie der Leber während des Perfusionsprozesses. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man rote Lebern für eine reproduzierbare homogene Verzögerung entnimmt, kanüliert und perfundiert. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Triton X 100 und SDS äußerst gefährlich sein kann, und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens auch Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen getroffen werden sollten.