Name: Photostrukturierungs Proteinen und Zellen in wässriger Umgebung Mit TiO 2 Photokatalyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Erfahren Sie die Oberflächenmodifikation von Zellkultur-Scaffolds mittels TiO2-Photokatalyse zur selektiven Proteinadhäsion. Diese Methode ermöglicht die präzise Steuerung von Zelladhäsion in wässriger Umgebung.

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Autoren danken Herrn Kotaro Okubo für die freundliche Unterstützung bei der REM-Bildgebung. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Japan Society for the Promotion of Science Grant-in-Aid for Basic Research (B) (20310069), Grant-in-Aid for Research Activity Start-up (25880021) und durch Forschungsstipendien der Kurata Memorial Hitachi Science and Technology Foundation und der Nippon Sheet Glass Foundation for Materials Science and Engineering.

1. Herstellung von TiO 2 beschichtetes Deckglas <ol><li> Anzahl die Deckgläser mit einem Diamantreißnadel. Dies trägt nicht nur zur Spur jedes Deckgläschen zu halten, sondern auch um sicherzustellen, dass die richtige Seite der Probe nach oben weist. Reinigen der Deck zunächst unter fließendem ddH 2 O, dann mit dem in Piranha-Lösung eingetaucht werden (H 2 SO 4: H 2 O 2 = 4: 1). Nach 10 Minuten, spülen Sie die Deckgläser gründlich, 8-mal in ddH 2 O. Trocknen Sie die Deckgläser unter N 2 fließen. </li><li> Eingestellt TiO 2 -Target in der Radiofrequenz (RF) Sputtersystem. Bringen Sie die Deckgläser auf einem Probenhalter der Sputteranlage mit einem Polyimid-Band. Setzen Sie den Probenhalter in der Sputterkammer. Kammer evakuieren bis der Druck 2,0 × 10 -4 Pa. </li><li> Einzuführen Ar-Gas in die Kammer und den Abscheidungsdruck auf 4,0 mTorr. Während der Verschluss geschlossen ist, schrittweise zu erhöhendie HF-Leistung bis 70 W. </li><li> Öffnen des Verschlusses und Sputter für 15 min, um eine Folie mit einer Dicke von 120-150 nm (Abbildung 1: Schritt A) zu erhalten. Wachstumsrate des Films muss für jede einzelne Maschine abgeleitet werden. </li></ol> 2. Oberflächenbeschichtung mit Handy abweisenden Film <ol><li> Hydrophilisierung der TiO 2 -Oberfläche durch Behandeln der Probe mit O 2 -Plasma, nach Anweisungen des Herstellers des Plasmareaktors bereitgestellt. Wir behandeln die Probe für 5 Minuten bei 200 W mit O 2 Fluß von 100 sccm. Tauchen Sie die Probe in ddH 2 O und bestätigen, dass die Oberfläche superhydrophil ist. Trocknen Sie die Oberfläche gründlich unter N 2 -Strom. </li><li> Vorbereitung 1 mM Octadecyltrichlorsilan (OTS) Lösung durch Zugabe von 39,6 ul OTS zu 100 ml Toluol gegeben. Eintauchen der Probe in die Lösung für 1 h bei RT. Führen Sie diesen Schritt innerhalb einer N 2 -gefüllten Handschuhbeutel (Abbildung 1: Schritt B). </li><li> Um physisorbierte Moleküle zu entfernen, sonicate die Probe in Toluol, Aceton, Ethanol und ddH 2 O für 5 Minuten jeden, in dieser Reihenfolge. Spülen Sie die Proben vier Mal in frischem ddH 2 O und trocknen Sie die Oberfläche unter einem N 2 -Strom. Sollte die Oberfläche hydrophob mit einem Kontaktwinkel von 100-110 ° betragen. </li></ol> 3. Ex-situ-Oberflächenstrukturierung <ol><li> Arbeiten in einer Sterilbank, zu ziehen mehrere Kratzspuren mit einer Diamant-Reißnadel auf der Oberfläche. Die Markierungen helfen bei der Verfolgung der bearbeiteten Regionen und bringt auch Mikroskope in den Fokus. Sterilisieren der OTS-beschichteten TiO 2 durch Eintauchen der Probe in 70% Ethanol für 5 min. Dann zweimal spülen Sie die Probe in sterilisierte ddH 2 O </li><li> Legen Sie die Probe in einem 35-mm-Schale, und 2 ml PC12 Wachstumsmedium (siehe Schritt 4.2). Inkubation für mehr als 3 Stunden in einem CO 2 -Inkubator (37 ° C). Diese Vorgehensweise soll Serumalbumine absorbiert auf der Oberfläche zu lassen. Adsorbiert Albumine hemmen anschließende Adsorption von anderen proteIns und Zellen (1: Schritt C). </li><li> Während der Wartezeit, die Einrichtung des invertierten Fluoreszenzmikroskop. <ol><li> Schalten Sie die Bogenlampe, die UV-Filterwürfel einzufügen, und stellen Sie die Objektivlinse zu 20X. </li><li> Messen der Lichtintensität I (W cm -2) unter Verwendung eines UV-Intensitätsmesser, und berechnen Bestrahlungszeit t (in Sekunden) für eine Dosis von d (in J cm -2) als: t = d / I. Um zum Beispiel bei einer Dosis von 200 J cm -2 bestrahlt unter Verwendung einer Lichtquelle von 600 mW cm -2, beträgt 333 sec Bestrahlung erforderlich. </li><li> Verwenden Sie eine Objektmikrometer und schließen Sie die Feldblende zum Einstellen der Größe der Region zu bestrahlenden, beispielsweise 200 &amp; mgr; m. </li></ol></li><li> Nach 3 Stunden Inkubation ergänzen das Medium mit 200 ul 3,0 mg ml-1-Typ-IV-Kollagen (Col-IV; Endkonzentration von 300 &amp; mgr; g ml -1). </li><li> Übertragen Sie die 35-mm-Schale auf den Mikroskoptisch. Finden Sie den Kratzer mLade Fokus des Mikroskops auf die Probenoberfläche und Bestrahlen mit UV-Licht bei einer Dosis von 200 J cm -2 (Abbildung 1: Schritt D). Der Bereich der UV-Bestrahlung kann entweder durch Einstellen der Öffnung der Leuchtfeldblende oder durch Ersetzen der Feldblende mit einer Metallmaske Schiedsgeometrie verändert werden. </li><li> Ersetzen Sie das Medium mit frischem Wachstumsmedium (ohne Col-IV), und legen Sie die Probe wieder in den Inkubator. </li></ol> 4. Cell Culture <ol><li> Routinekultur von PC12-Zellen wird auf einem kollagenbeschichteten Plastikschale durchgeführt. <ol><li> Zur Beschichtung eines 60-mm-Gewebekulturschale mit Col-IV, zuerst die Oberfläche nass mit ddH 2 O und saugen alle ddH 2 O. </li><li> Bereiten 300 &amp; mgr; g ml -1 Col-IV durch Verdünnen der ursprünglichen Lösung (3 mg ml -1) 10x mit ddH 2 O. </li><li> Fügen Sie 200 ul von 300 &amp; mgr; g ml -1 Col-IV pro 60-mm-Schale. Lassen Sie die durch die Oberfläche verteilt Lösung. </li><li> Dry-Ter in einer Laminarströmungshaube Teller für ca. 1 Std. </li><li> Die Oberfläche zweimal gründlich mit 4 ml Dulbecco-phosphatgepufferter Kochsalzlösung (D-PBS). Bei Nichtgebrauch des beschichtete Schale sofort, spülen Sie die Teller einmal mit 4 ml ddH 2 O. Nach Absaugen ddH 2 O, speichern Sie die Schüssel in den Inkubator. Versuchen Sie nicht, halten Sie es für mehr als zwei Wochen gelagert. </li></ol></li><li> PC12-Zellen werden in einem Wachstumsmedium, das besteht aus gewachsen: Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (low glucose) + 10% fötales Rinderserum + 5% Pferdeserum + 1% Penicillin-Streptomycin-Lösung. Inkubieren Sie die Zellen in einem CO 2 Inkubator (37 ° C, 5% CO 2), und ersetzen Sie jeden zweiten Tag die Hälfte des Mediums. Passage-Zellen, bevor sie zu erreichen Fluss. <ol><li> Saugen Sie das Wachstumsmedium, und fügen Sie 2 ml PBS + (D-PBS + 10 mg ml -1 Rinderserumalbumin (BSA) + 10 mM EDTA) vorgewärmt auf 37 ° C. Inkubation für 5 min bei 37 ° C. Klopfen Sie leicht das Gericht auf alle Produkte zu lösenlls. </li><li> Sammeln Zellen in einem 15 ml konischen Röhrchen. Spülen Sie die Schale mit 3 ml frischem D-PBS, auf 37 ° C vorgewärmt. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 150 · g für 4 min. </li><li> Den Überstand aspirieren, und fügen Sie 1 ml des Wachstumsmediums. </li><li> Für Routinekultur, teilen Sie die Zellen 1: 3 bis 1: 5. </li></ol></li><li> Um Zellen Platte auf dem UV-modifizierte OTS / TiO 2 Probe zu zählen Zelldichte und fügen Sie 3,0 x 10 5 Zellen in einer 35-mm-Schale (Abbildung 1: Schritt E). Inkubiere die Schale in den befeuchteten Inkubator (37 ° C, 5% CO 2) für 1-2 Tage. Naiven und der Nervenwachstumsfaktor (NGF) -differentiated PC12-Zellen können für die Strukturierung Experimente eingesetzt werden. NGF Differenzierung werden 100 ng ml -1 von 7S-NGF in das Wachstumsmedium mehrere Tage vor Ausplattieren der Zellen auf die Probe gegeben. NGF-Differenzierung scheint die Haftfähigkeit der PC12-Zellen zu erhöhen und erleichtert die Handhabung, insbesondere bei der in-situ Strukturierungs eXperimente. </li></ol> 5. In-Situ Oberflächenstrukturierung <ol><li> Nach 1-2 Tagen Kultur auf die ex-situ modifizierten Oberfläche, zu bestätigen, dass die Zellen für die Befestigung und wächst nur auf dem UV-Bestrahlungsbereich. Richten Sie das Mikroskop, wie in Schritt 3.4 beschrieben. </li><li> Übertragung der Probe auf eine neue 35-mm-Gewebekulturschale, die das Wachstumsmedium, 100 ng ml -1 NGF (in dem Fall der Verwendung NGF-differenzierten Zellen) und 100 &amp; mgr; g ml -1 Col-IV. </li><li> Die Schale auf dem Mikroskoptisch. Finden Sie die passende Position, und strahlen UV-Licht bei einer Dosis von 200 J cm -2 (Abbildung 1: Schritt F, G). Die neu erstellte permissive Bereich ist mit einem Sternchen in Figur 1 angegeben: Schritt G. </li><li> Versuchen, die Verarbeitung einer einzelnen Probe innerhalb von 30 Minuten zu vervollständigen. Nach der Bestrahlung, übertragen Sie die Probe wieder in das Medium ohne Col-IV. </li><li> Seien Sie besonders vorsichtig bei der Durchführung die Schale mit cultured Zellen und Überführung der Probe vom Gericht, austeilen Ablösen der strukturierten Zellen zu verhindern. </li></ol><img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53045/53045fig1highres.jpg" width="700" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung des gesamten Prozesses. Siehe Text für Details. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53045/53045fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

In unserem aktuellen Protokoll wurde TiO 2 Film von RF-Magnetron-Sputtern gebildet. Wir bevorzugen diese Methode der Abscheidung, da es uns erlaubt, reproduzierbare Herstellung einer photokatalytischen TiO 2 -Schicht mit einer sub-nm Rauheit. Obwohl Sputter-Abscheidungsverfahren vertraut Materialwissenschaftler und Elektronik-Ingenieure sind, kann es nicht ganz zugänglich Biologen sein. In diesem Fall würde spinnbeschichteten TiO 2 -Films 23 eine Alternative sein. Bei diesem V...

Halbleiter-Lithographieverfahren und seine Derivate - wie Photolithographie 1,2, Elektronenstrahllithographie 3-6 und 7-10 Mikrokontaktdruck - sind mittlerweile ein etabliertes Werkzeug in der Zellbiologie, lebende Zellen in einer definierten Position und Geometrie wachsen. Die Musterungsverfahren beruht auf der Verwendung von mikro Substrate, bestehend aus Mikro-Insel Zelle permissive Beschichtung in einem nicht-permissiven Hintergrund. Ein solches Substrat dient als Vorlage, um Muster der Zellen. Diese Technologien haben uns zur Verfügung gestellt, die die neuen Methoden, um Zellen und ihre Funktion Ingenieur bei einem Ein- und Mehrzellebene, um die inhärenten Eigenschaften von Zellen zu extrahieren, und um den Durchsatz von zellbasierten Wirkstoff-Screening-11 zu erhöhen. Der Grad Freiheits in Zellmusterungs würde erheblich zunehmen, wenn die Schablonenmustergeometrie in situ verändert werden, das heißt, während die Zellen auf den n kultivierturface. Die herkömmlichen Verfahren zur Musterbildung kann hier nicht direkt angewendet werden, da sie Verfahrensproben in der Atmosphäre oder im Vakuum. Deshalb werden verschiedene neue Oberflächenmodifikationstechniken sind vorgeschlagen worden, die basieren, zB auf photoreaktiven Verbindungen 12,13 oder Laserablation 5,14, um nur einige zu nennen. Die vorgeschlagenen Verfahren sind gut durch Robertus et al von Choi et al. 16 und Nakanishi 17 überprüft. 15, und in jüngerer Zeit. Hier in diesem Artikel beschreiben wir eine neue Methode der in-situ-Oberflächenmodifizierung, die Vorteile der photokatalytischen Zersetzung von organischen Molekülen auf einem Titandioxid nimmt (TiO 2) Fläche 18,19. In diesem Verfahren wird ein TiO 2 -Film zwischen dem Glassubstrat und dem organischen Film, der die Zellen eine Schnittstelle eingeführt und der organische Film in situ durch lokales Bestrahlen mit ultravioletten (UV) zerlegtLicht in einem interessierenden Bereich (λ &lt;388 nm). Wir zeigen, dass das neue Protokoll kann verwendet werden, um Mikrostrukturen der extrazellulären Matrixproteinen und lebenden Zellen sowohl ex situ und in situ zu erzeugen. TiO 2 ist biokompatibel, chemisch stabil und optisch transparente, Features, von denen macht es freundlich in Zellkulturexperimenten einzuführen. Dieses Protokoll stellt eine Materialwissenschaften basierte Alternative zur Modifizierung von Zellkultur-Gerüsten in Zellkulturumgebung.

<table><tbody><tr><td>Glasdeckglas</td><td>Warner</td><td>Instruments CS-15R15</td><td>15 mm Durchmesser, #1,5 Dicke</td></tr><tr><td>Diamantritzer</td><td>Ogura Jewel Industry</td><td>D-Point Pen</td><td></td></tr><tr><td>RF Sputtersystem</td><td>ANELVA</td><td>SPC350</td><td></td></tr><tr><td>TiO2 Sputtertarget</td><td>Kojundo Chemical Lab</td><td>Titan (IV) oxid,</td><td>Zielreinheit, 99,9%</td></tr><tr><td>Plasmareaktor</td><td>Yamato</td><td>PR301</td><td></td></tr><tr><td>n-Octadecyltrichlorsilan (OTS)</td><td>Aldrich</td><td>104817</td><td></td></tr><tr><td>Toluol</td><td>Wako</td><td>204-01866</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekulturschale (35&#160; mm)</td><td>Greiner</td><td>627160</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekulturschale (60&#160; mm)</td><td>BD Falcon</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>Typ-IV Kollagen</td><td>Nitta Gelatine</td><td>Cellmatrix Typ IV</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11885-084</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>12483-020</td><td>Hitzeinaktivierung und Durchgang durch ein 0,22&#160; &#956; m Filter vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Pferdeserum</td><td>Gibco</td><td>26050-088</td><td>Durchgang durch ein 0.22&#160; &#956; m Filter vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (100x)</td><td>Nacalai tesque</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>7S Nervenwachstumsfaktor (NGF)</td><td>Alomone Labs</td><td>N-130</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Dojindo</td><td>N001</td><td>Stammlösung in 0,5 M</td></tr><tr><td>TiO<>sub2 Nanopartikel</td><td>Tayca</td><td>TKD-701</td><td></td></tr></tbody></table>

photostrukturierungs proteinen und zellen in wässriger umgebung mit tio<sub&gt; 2</sub&gt; photokatalyse

Photopatterning Proteins and Cells in Aqueous Environment Using TiO2 Photocatalysis

Organische Verunreinigungen auf der Oberfläche eines Titandioxid (TiO 2), adsorbiert durch Photokatalyse unter ultraviolettem Licht (UV) zerlegt werden. Hier beschreiben wir eine neuartige Protokoll unter Verwendung des TiO 2 Photokatalyse zur Zellaffinität der Substratoberfläche lokal zu verändern. Für dieses Experiment wurde eine dünne TiO 2 -Schicht wurde durch Sputtern beschichtet auf einem Deckglas, und die TiO 2 -Oberfläche wurde anschließend mit einem Organosilan Monoschicht aus Octadecyltrichlorsilan (OTS) ableitet, die die Zelladhäsion hemmt modifiziert. Die Probe wurde in einem Zellkulturmedium eingetaucht ist, und konzentrierte UV-Licht wurde auf einem achteckigen Bereich bestrahlt. Wenn eine neuronale Zelllinie PC12-Zellen wurden auf der Probe überzogen, Zellen, die nur auf die UV-bestrahlte Fläche haftet. Wir zeigen weiter, daß diese Oberflächenmodifikation kann auch in situ erfolgen, das heißt, auch wenn die Zellen auf dem Substrat wächst. Korrekte Modifikation der Oberfläche benötigt eine extrazelluläre Matrix protein Kollagen in dem Medium zum Zeitpunkt der UV-Bestrahlung vorliegen. Die hier vorgestellte Methode kann potenziell in Strukturierung mehrere Zelltypen für den Bau von Co-Kultur-Systeme oder willkürlich zu manipulieren Zellen unter Kultur eingesetzt werden.

2A zeigt eine Querschnittsrasterelektronenmikroskopie (SEM) -Bild der durch Sputtern abgelagerten TiO 2 -Films. Aus der Beobachtung wurde Dicke des Films auf ungefähr 150 nm zu sein. Hier fällt auf, die Flachheit des abgeschiedenen TiO 2 -Films. Weiteren Analyse durch Rasterkraftmikroskopie (AFM) ergab, dass die Wurzel aus dem mittleren quadratischen (RMS) Rauheit der Oberfläche betrug 0,2 nm (2B). Wenn der TiO 2 -Oberfläche ...

Wir beschreiben ein Protokoll zur Modifikation der Zellaffinität einer Gerüstoberfläche in wässriger Umgebung. Die Methode nutzt die Titandioxid-Photokatalyse, um organische Schichten im lichtbestrahlten Bereich zu zersetzen. Wir zeigen, dass es verwendet werden kann, um Mikrodomänen von Gerüstproteinen zu erzeugen, sowohl ex situ als auch in situ.

Photostrukturierungs Proteinen und Zellen in wässriger Umgebung Mit TiO<sub&gt; 2</sub&gt; Photokatalyse

Organic contaminants adsorbed on the surface of titanium dioxide (TiO2) can be decomposed by photocatalysis under ultraviolet (UV) light. Here we describe ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, eine Oberflächenmodifizierung eines Zellkulturscaffolds unter Verwendung der photocatalytischen Aktivität von Titandioxid durchzuführen. Dies wird erreicht, indem eine dünne Schicht aus Titandioxid auf einen Glasdeckel aufgebracht und anschließend mit einem Octa-Dessalin beschichtet wird, um die gesamte Oberfläche hydrophob zu machen. In einem zweiten Schritt wird das Substrat blockiert, indem es in Zellkulturmedium mit Serumalbumin getaucht wird.Das Albumin bindet an die Oberfläche und macht sie für die Zelladhäsion nicht permissiv. Anschließend wird die Probe in eine wässrige Lösung überführt, die Kollagen enthält, und danach wird die Oberfläche mit fokussiertem UV-Licht bestrahlt. Dadurch können sich Kollagenmoleküle gezielt im bestrahlten Bereich anlagern und machen diesen Bereich für die Zelladhäsion permissiv.Dieser Prozess kann wiederholt werden, um mehrere Proteine oder Zelltypen zu mustern. In diesem Video zeigen wir, wie der adhesive Bereich von PC 12-Zellen gezielt durch UV-Bestrahlung modifiziert werden kann. Die Idee zu dieser Methode kam uns, als wir erkannten, dass die Photokatalyse durch Titandioxid kommerziell als selbstreinigende Glasscheiben eingesetzt wird, die organische Verunreinigungen auf der Oberfläche bei Lichteinwirkung entfernen, wobei der Ablauf so beschaffen ist, dass er einen Doktoranden aus meinem Labor anziehen wird.Beginnen Sie damit, die Deckgläser mit einem Diamantschreiber zu nummerieren, um sicherzustellen, dass die korrekte Seite der Probe nach oben zeigt. Reinigen Sie anschließend die Deckgläser zunächst unter fließendem doppelt destilliertem Wasser und tauchen Sie sie dann 10 Minuten lang in Piranha-Lösung ein. Nach 10 Minuten spülen Sie die Deckgläser achtmal mit doppelt destilliertem Wasser ab und trocknen sie unter Stickstoffstrom.Als Nächstes wird ein Titanoxid-Target in ein Hochfrequenz-Sputtersystem eingesetzt, und die gereinigten Deckgläser werden mit einem Polyamid-Klebeband am Probenträger befestigt. Der Probenträger wird in die Sputterkammer gebracht und die Kammer wird evakuiert, bis der Druck 2,0 × 10⁻⁴ Pa erreicht. Danach wird Argon-Gas in die Kammer eingeleitet und der Abscheidedruck auf 4,0 mTorr eingestellt, während der Verschluss geschlossen bleibt. Die HF-Leistung wird dann schrittweise auf 70 Watt erhöht.Öffnen Sie dann den Verschluss und sputtern Sie 15 Minuten lang, um einen Film mit einer Dicke von 120 bis 150 Nanometern zu erhalten. Trocknen Sie zunächst einen Glasbecher und eine Pinzette 30 Minuten lang bei 120 Grad Celsius im Ofen. Danach bringen Sie die Deckgläser in einen Plasma-Reaktor und behandeln die Titandioxid-Oberfläche fünf Minuten lang mit Sauerstoff-Plasma bei 200 Watt und einem Sauerstofffluss von 100 Standard-Kubikzentimetern pro Minute, um eine hydrophilerere Oberfläche zu erzeugen.Entfernen Sie dann die Proben und tauchen Sie sie in zweifach destilliertes Wasser, um zu überprüfen, ob die Oberfläche superhydrophil ist, und trocknen Sie die Oberfläche anschließend gründlich unter Stickstoffstrom. Danach bringen Sie die Proben, den trockenen Becher und die Pinzette in eine mit Stickstoff gefüllte Handschuhbox und bereiten eine einmillimolare Lösung von Octo desal Trichlorethylen in Toluol vor. Tauchen Sie die Probe eine Stunde lang bei Raumtemperatur in die Lösung ein, um eine selbstassemblierte Monoschicht auf der Titandioxidoberfläche zu bilden.Entfernen Sie anschließend alle Phasormoleküle, indem Sie die Probe in Toluol, Aceton und Ethanol spülen sowie abschließend fünf Minuten lang in zweifach destilliertem Wasser. Danach spülen Sie die Probe viermal mit frischem zweifach destilliertem Wasser ab und trocknen die Oberfläche unter einem Stickstoffstrom.Die beschichteten Deckgläser durch Eintauchen der Proben in 70 % Ethanol für fünf Minuten sterilisieren. Anschließend die Proben zweimal mit steriler, doppelt destillierter Wasser spülen. Danach die Probe in eine 35-Millimeter-Schale geben und zwei Milliliter PC12-Wachstumsmedium hinzufügen.Inkubieren Sie die Proben mindestens drei Stunden lang in einem CO2-pufferierten Inkubator bei 37 Grad Celsius, während das Serumalbumin im Medium auf die Oberfläche der Deckgläser adsorbiert. Richten Sie das invertierte Fluoreszenzmikroskop ein, indem Sie zunächst die Bogenlampe einschalten. Danach setzen Sie den UV-Filterkubus ein und drehen das Objektiv auf eine 20-fache Vergrößerung.Messen Sie die Lichtintensität mit einem UV-Intensitätsmessgerät und berechnen Sie die Bestrahlungsdauer für eine Dosis von 200 Joule pro Quadratzentimeter. Verwenden Sie danach ein Objektmikrometer und stellen Sie den Durchmesser des zu bestrahlenden Bereichs durch Einstellung der Feldblende auf 200 Mikrometer ein. Nach der dreistündigen Inkubation ergänzen Sie das Medium, das die Deckgläser bedeckt, mit 200 Mikrolitern einer 3,0 Milligramm pro Milliliter Lösung vom Typ IV Kollagen.Überführen Sie danach die 35-Millimeter-Schale auf den Mikroskoptisch und fokussieren Sie das Mikroskop mithilfe der Kratzmarkierungen auf die Probenoberfläche. Bestrahlen Sie einen Bereich der Deckglasoberfläche mit UV-Licht in einer Dosis von 200 Joule pro Quadratzentimeter. Ersetzen Sie anschließend das Medium durch zwei Milliliter frisches Wachstumsmedium mit NGF und ohne Typ-vier-Kollagen und stellen Sie die Probe wieder in den Inkubator.Ernten Sie kultivierte, durch NGF differenzierte PC-12-Zellen in einem 15-Milliliter-Konischglas und zentrifugieren Sie das Gefäß bei 150 ×g für vier Minuten. Anschließend den Überstand abpipettieren und ein Milliliter Wachstumsmedium hinzufügen. Resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren mit einem Hämocytometer.Bestimmen Sie die Zelldichte und geben Sie 3,0 × 10⁵ Zellen in eine 35-mm-Schale, die die modifizierten Deckgläser enthält. Inkubieren Sie die Schale nach ein- bis zweitägiger Kultur auf der XC2-modifizierten Oberfläche für ein bis zwei Tage in einem 5 % CO₂-Inkubator bei 37 °C. Überprüfen Sie mithilfe eines Mikroskops, ob die Zellen sich ausschließlich auf dem UV-bestrahlten Bereich der Deckgläser anheften und vermehren.Fügen Sie dann 67 Mikroliter Typ-IV-Kollagen der Schale mit den kultivierten Zellen hinzu, sodass die endgültige Kollagenkonzentration 100 Mikrogramm pro Milliliter beträgt, wobei das Mikroskop für die Oberflächenmusterung eingerichtet ist. Stellen Sie die Schale auf den Mikroskoptisch und positionieren Sie den Bestrahlungsbereich neben der aktuellen Zellposition. Bestrahlen Sie die Deckglasfläche mit UV-Licht in einer Dosis von 200 Joule pro Quadratzentimeter.Nach der Bestrahlung das Medium durch eines ohne Kollagen ersetzen und die Probe erneut in den Inkubator stellen, wobei versucht werden sollte, die Verarbeitung einer einzelnen Probe innerhalb von 30 Minuten abzuschließen. Dies ist ein Querschnittsbild der mittels Sputtern abgeschiedenen Titandioxid-Schicht, aufgenommen mittels Rasterelektronenmikroskopie. Anhand der Beobachtung wurde die Dicke der Schicht auf etwa 150 Nanometer geschätzt.Auffällig ist hier auch die Flachheit des abgeschiedenen Titandioxidsfilms. Eine weitere Analyse mittels Rasterkraftmikroskopie ergab, dass die quadratische mittlere Rauheit der Oberfläche nur 0,2 Nanometer betrug. Kollagen Typ IV und die Lösung lagern sich bevorzugt in dem durch UV-Licht bestrahlten Bereich an, in dem die Albumine durch den Laser verdrängt werden.Um die Vielseitigkeit dieses Ansatzes zu demonstrieren, wurden auch andere Proteine wie Fibrin mit derselben Technik strukturiert. Hier wachsen Zellen auf der mit XC zwei strukturierten Region der Deckglasfläche und direkt daneben im Bereich, der durch die gestrichelte Linie gekennzeichnet ist. Das Deckglas wurde kürzlich vor Ort mit UV-Licht bestrahlt und mit Typ-vier-Kollagen beschichtet.In den folgenden fünf Tagen proliferieren die Zellen und migrieren, um den neu codierten Bereich zu bedecken. Das hier vorgestellte Verfahren kann beliebig zur Manipulation von Zellen unter Kultur eingesetzt werden und potenziell zur Mustergestaltung mehrerer Zelltypen, um aufwändige Kalt-Kokulturen-Systeme aufzubauen.

photopatterning-proteins-cells-aqueous-environment-using-tio2

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Non-Fouling-PEG Silan-Monoschicht wurde von einzeln adressierbaren ITO-Elektroden auf Glas durch Anlegen einer reduktiven Potential desorbiert. Elektrochemisches Abtragen von PEG-Silan-Schicht aus ITO-Mikroelektroden für die Zelladhäsion erlaubt, in einem räumlich definierten Weise erfolgen, mit zellulären Mustern entsprechenden eng an die Elektrode Muster.

Patterning Cells auf optisch transparenten Indium-Zinn-Oxid-Elektroden

Dieses Protokoll beschreibt eine Mikro-kompatible Methode zur Zellstrukturierung auf SiO 2. Eine vordefinierte Parylene-C Design ist fotolithographisch auf SiO 2-Wafer gedruckt. Nach der Inkubation mit Serum (oder andere Aktivierungslösung) Zellen anhaften speziell auf (und wachsen nach der Konformität) zugrunde liegenden Parylene-C, und dabei von SiO 2-Regionen zurückgeschlagen.

Musterbildung auf Photolithographische Definierte Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substrate

Es werden Verfahren zur Herstellung segmentierter und koaxialer Nanodrähte durch schablonierte Elektrodeposition in Nanoporen beschrieben. Als Beispiele wurden segmentierte Nanodrähte hergestellt, die aus Ag- und ZnO-Segmenten bestehen, und koaxiale Nanodrähte, die aus einerTiO2-Schale und einem Ag-Kern bestehen. Die Nanodrähte wurden in photokatalytischen Wasserstoffbildungsexperimenten verwendet.

Herstellung und Verwendung von photokatalytisch aktiven segmentierte Ag | ZnO und TiO Koaxial<sub&gt; 2</sub&gt; Ag-Nanodrähte Hergestellt von gestützte Elektrochemische Abscheidung

Ein Protokoll für das photochemische oxidative Wachstum von kleinen kristallinen Iridiumoxid-Nanopartikeln auf der Oberfläche von CdSe@CdS ausgesäten Stäbchen-Nanopartikeln wird vorgestellt.

Photochemische oxidative Wachstum von Iridium-Nanopartikel auf CdSe @ CdS-Nanostäbchen

Diese Arbeit untersucht die Eignung des Tintenstrahldrucks für die Herstellung von farbstoffsensibilisierten Solarzellen. Eine bindemittelfreie TiO2-Nanopartikel-Tinte wurde formuliert und auf ein FTO-Glassubstrat gedruckt.  Die gedruckte Schicht wurde zu einer Zelle mit einer aktiven Fläche von 0,25 cm2 und einem Wirkungsgrad von 3,5 % verarbeitet.

Digitaldruck von Titandioxid für farbstoffsensibilisierte Solarzellen

Verfahren zur voll bedruckbar, fullerenfreie, hochluftstabile, bulk-Heterojunction-Solarzellen auf Basis von Ti-Alkoxide als Elektronenakzeptor und dem elektronenschiebenden Polymerherstellung wird hier beschrieben. Darüber hinaus wird ein Verfahren zur Bestimmung der Morphologie der photoaktiven Schicht durch die molekulare Sperrigkeit der Ti-Alkoxid-Einheiten steuert berichtet.

Morphologie-Steuerung für Volldruck organisch-anorganische Masse-Heterosolarzellen Basierend auf einem Ti-Alkoxid und halbleitendes Polymer

Das übergeordnete Ziel dieses Projektes war es, das Elektrospinnen zu verwenden, um eine Photoanode mit verbesserter Leistung für farbstoffsensibilisierte Solarzellen herzustellen.

Elektrospinnen von photokatalytischen Elektroden für farbstoffsensibilisierte Solarzellen

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um kostenlos Transfer Chromophore basierend auf einem zusammengesetzten Polyoxometalate/Polymermembran vorzubereiten.

Vorbereitung der Polyoxometalate-basierten Foto-responsive Membranen für die Foto-Aktivierung von Mangan-oxid-Katalysatoren

Hier präsentieren wir Ihnen detaillierte Protokolle für Lösung verarbeitet Silber-Wismut-Jod (Ag-Bi-I) ternärer Halbleiter Dünnschichten auf TiO2hergestellt-beschichtet, transparenten Elektroden und ihre mögliche Anwendung als Luft-stabil und bleifrei Optoelektronische Geräte.

Lösung verarbeitet "Silber-Wismut-Jod" ternäre Dünnschichten für bleifrei-Photovoltaik-Absorber

Wir haben einen auf Stilben basierenden organischen Farbstoff direkt in einen Cobaloximkern integriert, um eine Photosensiatisator-Katalysator-Dyade für die photokatalytischeH2-Produktion zu erzeugen. Wir haben auch ein einfaches Versuchs-Setup zur Bewertung der lichtgesteuerten H2-Produktion durch photokatalytische Baugruppen entwickelt.

Entwicklung von Photosensiatisator-Cobaloxim-Hybriden für die solargetriebene H2-Produktion unter wässrigen aeroben Bedingungen

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Eine vollständige Methode zur Bewertung der Leistung von Photokatalysatoren für den Abbau von Antibiotika in der Umweltsanierung

Erfahren Sie die Oberflächenmodifikation von Zellkultur-Scaffolds mittels TiO2-Photokatalyse zur selektiven Proteinadhäsion. Diese Methode ermöglicht die präzise Steuerung von Zelladhäsion in wässriger Umgebung.

Photostrukturierungs Proteinen und Zellen in wässriger Umgebung Mit TiO

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