Das Studium von Proteinfunktionen und die Rolle der Altered Protein Expression von Antikörper-Interferenz und Dreidimensionale Rekonstruktionen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Proteinfunktionen und die Rolle der veränderten Proteinexpression auf effiziente und streng kontrollierte Weise zu untersuchen. Dies wird durch die Anwendung von Antikörpern erreicht, um die Menge an funktionellem Protein zu reduzieren, die der Zelle zur Verfügung steht. Um dies zu erreichen, werden Antikörper an ein Peptid namens Chariot gekoppelt, das eine Passage durch die Zellmembranen vermittelt.

Anschließend werden die interessierenden zellulären Strukturen abgebildet und in 3D rekonstruiert, um die Auswirkungen der Behandlung zu bewerten. Die Ergebnisse zeigen, dass Chariot-Peptide besonders gut geeignet sind, um nukleäre Proteine durch Antikörperinterferenz zu bekämpfen. Die Hauptvorteile dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der RNA-Interferenz bestehen darin, dass die Antikörper, die in die Zelle transportiert werden, sofort wirksam sind und dass der Forscher den Grad der Interferenz durch Anpassung der Antikörperdosen streng kontrollieren kann.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Proteinfunktionen in vielen Zelltypen geben kann, ist sie besonders interessant für das Targeting von Proteinen in primären neuronalen Kulturen, die sehr empfindlich auf Behandlungen reagieren, aber Chariot sehr gut vertragen. Zur Vorbereitung wird lyophilisiertes Chariot-Peptidpulver in sterilem Wasser bei zwei Mikrogramm pro Mikroliter resuspendiert. Klopfen Sie vorsichtig auf die Tube, um das Pulver in die Lösung zu mischen.

Bereiten Sie dann kleine Arbeitsaliquote vor, für jede Reaktion werden nur zwei Mikroliter benötigt, und lagern Sie die Aliquote bei 20 Grad Celsius. Bereiten Sie als Nächstes Säugetierzellen für die Transfektion vor, indem Sie sie auf eine 24-Well-Platte mit einem halben Milliliter Antibiotika enthaltendem Medium aussäen. Bei der Verwendung von Neuronen säen Sie die Zellen nur in den beiden mittleren Reihen und mit geringer Dichte aus.

Die leeren Vertiefungen sind später nützlich. Seien Sie schnell. Kultivierte Neuronen sollten nicht länger als ein paar Minuten außerhalb des Inkubators sein.

Bis sich die Neuronen im gewünschten Entwicklungsstadium befinden, tauschen Sie zweimal pro Woche etwa ein Viertel bis die Hälfte ihres Mediums aus. Nicht-neuronale Kulturen sollten verwendet werden, wenn die Zellen zu 50 % zusammenfließen. Das folgende Verfahren wird für sechs Tests und sechs Kontrollproben gezeigt.

Bereiten Sie für jede Ladung eine Verdünnung von 0,1 bis 2 Mikrogramm in 50 Mikrolitern 1X PBS pro Probe vor. Makromolekulare Komplexe aus vorgebundenen Primär- und Sekundärantikörpern können ebenfalls als Fracht verwendet werden. Mischen Sie die Lösung mit einem sanften Strudel, gefolgt von einer kurzen Zentrifugation.

Verdünnen Sie dann für jede Reaktion zwei Mikroliter Chariot-Stammlösung in 50 Mikrolitern PBS. Verwenden Sie für jede Probe separate Röhrchen, um eine Selbstassoziation von Chariot zu vermeiden. Kombinieren Sie nun die vorbereiteten Proteine in den Chariot-Verdünnungen.

Mischen und schleudern Sie die kombinierten Proteine. Inkubieren Sie die Probe 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, um die Bildung von Wagenladungskomplexen zu ermöglichen. Die optimale Proteinpeptidmenge hängt von der Fracht und dem verwendeten Zelltyp ab.

Daher sollte dieser Betrag empirisch bestimmt werden. Vorher etwas Wachstumsmedium ohne Zusatzstoffe sowie 1X PBS mit 0,5 Millimolar Magnesiumchlorid und Calciumchlorid auf 37 Grad Celsius vorwärmen. Verdünnen Sie nun zunächst die vorbereiteten Chariot-Komplexe mit 100 Mikrolitern Medium.

Entfernen Sie das Medium aus den plattierten Zellen und geben Sie es zur Wiederverwendung in die leeren Vertiefungen. Waschen Sie dann die Zellen vorsichtig mit 500 Mikrolitern vorgewärmter 1X PBS-, Calcium- und Magnesiumchloridlösung. Tragen Sie das Medium, das die Chariot-Komplexe trägt, auf die Zellen auf und schütteln Sie die Platte vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung der Lösung zu gewährleisten.

Bringen Sie die Zellen schnell wieder in den Inkubator und warten Sie eine Stunde, bevor Sie fortfahren. Bei Neuronen übertragen Sie nach einer Stunde Inkubation die gespeicherten Medien in die Vertiefungen. Für alle anderen Zellen fügen Sie Serum bis zu einer Endkonzentration von 10 % hinzu. Kultivierte Neuronen sind sehr empfindlich, z. B. gegenüber Änderungen der Medientemperatur und des pH-Werts.

Daher sollten diese Zellen gewaschen und vorsichtig mit vorgewärmten Lösungen transfiziert und so schnell wie möglich wieder in den Inkubator zurückgebracht werden. Setzen Sie die Inkubation so lange wie nötig fort, abhängig von der transfizierten Fracht und dem Zelltyp. Verarbeiten Sie die Zellen nach der Inkubation wie gewohnt für nachfolgende Analysen.

Sowohl Fixationsprotokolle als auch Live-Imaging sind mit dieser Technik kompatibel. Nehmen Sie mit einem Laser-Scanning-Mikroskop mit einem 63-fachen Objektiv Bilder in einem Abstand von etwa 0,25 bis 0,5 Mikrometern auf, um Z-Stapel mit ausreichender Detailgenauigkeit zu erhalten und gleichzeitig ein Ausbleichen zu vermeiden. Der genaue Schichtabstand hängt von der Größe der zu rekonstruierenden Struktur ab und muss individuell festgelegt werden.

Öffnen Sie für die Bildrekonstruktion die LSM-Dateien in Imaris. Bei dieser Software wird die Escape-Taste verwendet, um zwischen Auswählen und Navigieren zu wechseln. Es können auch mehrere Objekte ausgewählt werden, indem Sie die Strg-Taste gedrückt halten.

Gehen Sie mit der Anzeigeanpassung in jeden Kanal und passen Sie den Kontrast an, bis die hellsten Strukturen die Sättigung erreichen. Diese Anpassung hat keinen Einfluss auf die Oberflächenkonstruktion, hilft jedoch bei der Schwellenwertierung des Bildes. Wenn das zu rekonstruierende Objekt in verschiedenen Dateien enthalten ist, verwenden Sie die Funktion Bearbeiten und Slices hinzufügen, um die entsprechenden Dateien zu kombinieren.

Klicken Sie anschließend auf das Symbol Neue Oberflächen hinzufügen und wählen Sie Nur einen Interessenbereich segmentieren. Passen Sie nun die Ränder des Auswahlfelds an das gewünschte Objekt an. Passen Sie die Form und Neigung der rechteckigen Form an, bis sich alle erforderlichen Strukturen in der Box befinden.

Die Auswahl muss in jedem Bild über die gesamte Z-Ebene angepasst werden. Unerwünschte Gegenstände können später entfernt werden. Wählen Sie als Nächstes einen geeigneten Kanal aus.

Um fortzufahren, verwenden Sie das Schwellenwert-Tool, um die interessierende Struktur zu rekonstruieren. Der Detaillierungsgrad der Oberfläche oder der Kugeldurchmesser sollte so eingestellt werden, dass er mit den zu rekonstruierenden Strukturen übereinstimmt. Abhängig von der Signalcharakteristik kann entweder die absolute Intensität oder der lokale Kontrast verwendet werden.

Im Allgemeinen funktioniert der lokale Kontrast besser für diffuse Signale. Aufgrund der Eigenschaften dieses Signals wird der lokale Kontrast verwendet, um das Protein im Zellkern zu rekonstruieren. In jedem Fall müssen die Einstellungen für jedes Signal oder jede gewünschte Struktur separat angepasst werden.

Schließen Sie die Rekonstruktion ab, indem Sie auf den grünen Pfeil am unteren Bildschirmrand klicken. Passen Sie dann das Objekt mit dem Bleistift-Werkzeug weiter an. Vergleichen Sie die Rekonstruktionen sorgfältig mit dem Originalsignal und schneiden und entfernen Sie Oberflächen, indem Sie die Bilder nach Bedarf neigen, damit das Schnittwerkzeug seinen Zweck genau erfüllen kann.

Messen Sie nun das Volumen, die Fläche und die Intensitäten der einzelnen Oberflächen, indem Sie Statistiken, Detaillierte Statistiken und Durchschnittswerte auswählen. Falls gewünscht, können farbcodierte Statistiken erstellt werden, indem Sie die Registerkarte Farbe der entsprechenden Oberfläche auswählen und die ausgewählte Option von Basis in Statistisch codiert ändern. Mit dem Werkzeug "Schnappschuss erstellen" können Bilder für die Veröffentlichung aufgenommen werden.

Wenn mehrere Objekte innerhalb desselben Bereichs rekonstruiert werden sollen, kann die Funktion Parameter speichern verwendet werden, um die Informationen zu speichern. Simiat, das in HEK293-Zellen exprimiert wurde, wurde spezifisch durch Simiat-Antikörper nachgewiesen, die von Chariot-Peptiden in die Zellen transportiert wurden. Simiat-Antikörper-Assemblagen gelangen nach der Anwendung sowohl in das Soma als auch in den Zellkern, wo sie spezifisch mit FLAG-Simiate co-lokalisieren, wie durch die gelben Pfeile markiert.

Dosisabhängig induzierten Simiat-Antikörper eine massive Apoptose in HEK293-Zellen, während Kontrollantikörper keine Wirkung zeigten. Angesichts der Tatsache, dass neuronale Zellen sehr empfindlich auf toxische Wirkungen reagieren, wurde die Technik auf primäre Hippocampuskulturen angewendet, bei denen es beim Vergleich von Schein- oder unbehandelten und Chariot-behandelten Zellen keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Neuronen gab. Nach dem gleichen Anwendungsschema wurden Antikörperansammlungen von Ziegen-Anti-Meerschweinchen Alexa568 in etwa 83 % der Zellen beobachtet, wo sie sowohl in Somata als auch in Zellkernen in unterschiedlichem Ausmaß auftraten.

Diese Beobachtungen wurden durch eine 3D-Analyse weiter unterstützt, die mit den Ergebnissen der HEK293-Zellen übereinstimmte. Daher kann die Chariot-Technik erfolgreich zur Transfektion dissoziierter primärer Hippocampus-Neuronen eingesetzt werden. Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei bis sechs Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Die komplexe Bildung von Chariot und dem Protein of Interest dauert etwa 40 Minuten. Um die Zellen mit diesen Komplexen zu transfizieren, dauert es 70 Minuten und je nach Größe und Eigenschaften der Fracht weitere ein bis vier Stunden. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden durchgeführt werden, um die Funktion eines Proteins detaillierter zu analysieren, wie z. B. Live-Bildgebung und Motilitätsassays, Analysen und elektrophysiologische Aufzeichnungen.