Name: Immunfluoreszenz, um die zelluläre Aufnahme von menschlichem Lactoferrin und die damit verbundenen antivirale Aktivität gegen das Hepatitis C Virus-Monitor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Erfahren Sie die zelluläre Aufnahme von humanem Lactoferrin in Hepatozyten mittels Immunfluoreszenz und dessen antivirale Wirkung gegen das Hepatitis C Virus. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von HCV-Replikationshemmung.

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Diese Arbeit wurde sowohl von den Canadian Institutes of Health Research and Natural Sciences als auch vom Engineering Research Council of Canada finanziert. M. Bisaillon ist ein Chercheur Boursier Senior vom Fonds de Recherche en Santé du Québec und auch Mitglied des Centre de Recherche Clinique du Centre Hospitalier Universitaire de Sherbrooke. Wir danken Dr. Ralf Bartenschlager für die großzügige Spende des HCV-Replicon-Systems. Wir danken auch Dr. Charles Rice und Dr. Daniel Lamarre für die freundliche Bereitstellung der Leberzelllinie. Wir danken auch Guillaume Tremblay für die technische Unterstützung.

1. Zellen Vorbereitung und Behandlung <ol><li> In einer 24-Well-Platte, legte ein Glasabdeckung am Boden der Wells. Mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) Waschen Sie jede Vertiefung geben. </li><li> Samen Huh-7 Zellen Stütz HCV subgenomische Replikon in jeder Vertiefung bis zu einer Dichte von 5 × 10 4 Zellen / Vertiefung. Wenn es keine Behandlung, um zu tun, können die Zellen in einer höheren Dichte ausgesät werden. Das Kulturmedium ist Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat und 250 mg / ml G-418 (um das Replikon zu erhalten) ergänzt. </li><li> Inkubieren bei 37 ° C und 5% CO 2 am nächsten Tag zu behandeln, die Zellen mit 3 &amp; mgr; M hLF aus menschlicher Milch gereinigt. </li></ol> 2. Paraformaldehyd / Saccharose-Herstellung (12% PAF und 12% Saccharose) <ol><li> Setzen 500 ml PBS in einem Becherglas und Wärme zwischen 20 ° C und 30 ° C. 60 g Saccharose in PBS. 60 g des paraformaldehyd (PAF) in PBS / Saccharose-Lösung. Langsam NaOH 2N (3-7 ml), bis eine klare Lösung erhalten wird. </li><li> PH-Wert auf 7,4 mit HCl. Gesamte Volumen auf 500 ml mit PBS. Filter durch die Schwerkraft auf Whatman-Filter. Vor Gebrauch verdünnte die Lösung mit PBS auf eine Endkonzentration von 4% PAF und 4% Saccharose (Lagerung 4 ° C für 1 Woche Maximum). </li></ol> 3. Immunfluoreszenz <ol><li> Zum gewünschten Zeitpunkt (0 h, 2 h oder 24 h der Behandlung), waschen Sie die Zellen zweimal (1 min) mit PBS und fixieren mit PBS / 4% PAF / 4% Saccharose für 20 min bei RT. Die Zellen werden typischerweise bei 30-40% Konfluenz und 1,5x10 5 Zellen verwendet werden. </li><li> Permeabilisierung der Zellen mit 0,15% Triton X-100 in PBS für 5 min bei RT und Block in 10% normalem Ziegenserum (NGS) in PBS für 20 min. </li><li> Verdünnen Sie die primären Antikörper des Proteins von Interesse in 10% NGS (Beispiel: primäre Maus-Anti-hLF Antikörper verdünnt 1: 1.000). Wenden Sie den primären Antikörper zu den Zellen. </li><li> Nach 4 h bei RT oder O /N bei 4 ° C, waschen Sie die Zellen dreimal 5 min mit 10% NGS. Färben die Zellen mit Sekundärantikörper mit Fluorochrom in 10% NGS verdünnt markierten (Beispiel: Fluorochrom mit einer Anregungswellenlänge von 488 nm auf einen Antikörper, anti-Maus-1 verbunden: 1000) für 1 h bei RT im Dunkeln. </li><li> Die Zellen werden einmal für 5 Minuten mit PBS und färben die Zellen, die mit 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) (1 ug / ml) für 15 min bei RT im Dunkeln. </li><li> Für 5 Minuten mit PBS waschen Sie die Zellen zweimal. Berg decken Gläser auf Slowfade Eindeckmedium vor Visualisierung durch Mikroskopie. Die Zellen sind nun bereit für die Analyse durch Epifluoreszenz oder konfokalen Mikroskopie. </li><li> Verwenden Sie verschiedene Steuerelemente, um die Spezifität des Nachweises zu gewährleisten. Zum Beispiel können alle Antikörper, um die Autofluoreszenz zu detektieren weggelassen. Der primäre Antikörper weggelassen werden, um die nicht-spezifische Färbung mit dem sekundären Antikörper zu bestimmen. Schließlich, wenn möglich, zu steuern Zellen oder Gewebe, die nichtexprimieren das Molekül von Interesse kann auch verwendet werden. </li><li> Visualisieren Sie die Proben unter Verwendung von geeigneten Fluoreszenzmikroskop (Epifluoreszenz oder konfokalen) und Filtersätze für die Fluoreszenzmarkierung verwendet angemessen. Dias können auch in einer Diashow Fach an &lt;-20 ° C für die spätere Prüfung abgelegt werden. </li></ol> 4. Fluoreszenzmikroskopie <ol><li> Bewahren Sie die Proben in der Dunkelheit, um Photobleichung zu verhindern. Einschalten der Lichtquelle der ausgewählten Mikroskop (Epifluoreszenz oder konfokalen). </li><li> Schalten Sie das Mikroskop. Einschalten der Kamera für das Mikroskop. Legen Sie die Folie unter dem Mikroskop auf Visualisierung. In Immersionsöl auf der Folie, um die numerische Apertur der Objektivlinse zu erhöhen. </li><li> Wählen Sie die entsprechenden Filter. Stellen Sie den Fokus und entsprechende Ziel. Passen Sie die Fensterläden, um die entsprechenden Fluorochrom erkennen, sondern verhindern, Photobleichen. Halten Deckenbeleuchtung aus, um Hintergrundlicht zu minimieren, wenn man Probe. </li><li> Th ändernE-Filter, um verschiedene Fluorochrome (zB DAPI und für eine Anregungswellenlänge von 488 nm) zu visualisieren. Nehmen Sie Bilder mit der Kamera. </li></ol>

<ol><li>Odell, I. D., Cook, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Derm%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence techniques.</a> J Invest Derm. 133 (1), e4(2013).</li>
<li>Portugal, J., Waring, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assignment+of+DNA+binding+sites+for+4%E2%80%99%2C6-diamidine-2-phenylindole+and+bisbenzimide+%28Hoechst+33258%29.+A+comparative+footprinting+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Assignment of DNA binding sites for 4’,6-diamidine-2-phenylindole and bisbenzimide (Hoechst 33258). A comparative footprinting study.</a> Biochim Biophys Acta. 949 (2), 158-168 (1988).</li>
<li>Lichtman, J. W., Conchello, J. -A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy.</a> Nat Methods. 2 (12), 910-919 (2005).</li>
<li>St Croix, C. M., Shand, S. H., Watkins, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+microscopy%3A+comparisons%2C+applications%2C+and+problems%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Confocal microscopy: comparisons, applications, and problems.</a> BioTechniques. 39, Suppl 6. S2-S5 (2005).</li>
<li>Yi, M., Kaneko, S., Yu, D. Y., Murakami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+C+virus+envelope+proteins+bind+lactoferrin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Hepatitis C virus envelope proteins bind lactoferrin.</a> Journal of virology. 71, 5997-6002 (1997).</li>
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<li>Picard-Jean, F., Bouchard, S., Larivée, G., Bisaillon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intracellular+inhibition+of+HCV+replication+represents+a+novel+mechanism+of+action+by+the+innate+immune+Lactoferrin+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+research%22%5BJournal%5D)">The intracellular inhibition of HCV replication represents a novel mechanism of action by the innate immune Lactoferrin protein.</a> Antiviral research. 111, 13-22 (2014).</li>
<li>Johnson, G. D., Davidson, R. S., McNamee, K. C., Russell, G., Goodwin, D., Holborow, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fading+of+immunofluorescence+during+microscopy%3A+a+study+of+the+phenomenon+and+its+remedy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Fading of immunofluorescence during microscopy: a study of the phenomenon and its remedy.</a> J Immunol Methods. 55 (2), 231-242 (1982).</li>
<li>Green Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fluorescent+protein%3A+a+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">fluorescent protein: a perspective.</a> Protein Sci. 20 (9), 1509-1519 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Die HCV-Epidemie bleibt eine globale Bedrohung, mit 80% der neu infizierten Patienten entwickeln eine chronische Infektion, indem sie mit einem Risiko für Leberzirrhose, Leberversagen oder Leberzellkarzinom. Direkt wirkende antivirale Mittel Targeting HCV-Replikation und Reifung stellen erstklassige Anti-HCV-Mittel, wie kürzlich von der behördlichen Genehmigung von zwei NS3 N-Terminus-Protease-Inhibitoren (Boceprevir und Telaprevir) demonstriert. HLF anti-HCV-Aktivität wird derzeit angenommen, dass als das Eindringen de...

Immunfluoreszenz ist eine Technik, die ein Fluoreszenzmikroskop verwendet, um die Verteilung und/oder Lokalisierung eines Zielmoleküls in einer biologischen Probe zu visualisieren. Die Immunfluoreszenz beruht auf der Spezifität von fluoreszenzmarkierten Antikörpern gegen ihre entsprechenden Antigene innerhalb einer Zelle1. Es wird typischerweise an Gewebeschnitten und kultivierten Zelllinien verwendet, um die Verteilung/Lokalisation verschiedener biologischer Moleküle wie Proteine, Nukleinsäuren und Glykane zu analysieren. Es sollte beachtet werden, dass Immunfluoreszenz häufig in Kombination mit anderen Nicht-Antikörper-Methoden der Fluoreszenzfärbung verwendet wird, wie z. B. den 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)-Färbungen, die typischerweise zur Markierung von DNA2 verwendet werden. Darüber hinaus beinhaltet diese Technik die Fixierung der Zellen, was die Analyse der Zellen zu einem bestimmten Zeitpunkt ermöglicht.
Verschiedene Arten von Mikroskopen können verwendet werden, um Immunfluoreszenzproben zu analysieren. Das einfachste ist das Epifluoreszenzmikroskop (Abbildung 1), bei dem die Anregung des Fluorochroms und die Detektion der Fluoreszenz über denselben Strahlengangerfolgen 3. Da der größte Teil des Anregungslichts durch die Probe durchgelassen wird, kann nur reflektiertes exzitatorisches Licht zusammen mit dem emittierten Licht das Objektiv erreichen. Dieser Ansatz führt leider zu einem häufig hohen Signal-Rausch-Verhältnis. Im Gegensatz dazu bietet die konfokale Mikroskopie (Abbildung 2) einen deutlichen Vorteil bei der Erhöhung der optischen Auflösung und des Kontrasts, indem eine räumliche Lochblende hinzugefügt wird, die in der konfokalen Ebene des Objektivs platziert ist, um unscharfes Lichtzu eliminieren 4. Dieser Ansatz ermöglicht die Rekonstruktion dreidimensionaler Strukturen aus den erhaltenen Bildern. Da jedoch ein wichtiger Teil des Lichts der Probe an der Lochblende blockiert wird, sind oft Langzeitbelichtungen erforderlich.
Es gibt zwei Klassen von Immunfluoreszenztechniken, primäre (oder direkte) und sekundäre (oder indirekte). Bei der direkten Immunfluoreszenz handelt es sich um einen primären Antikörper, der an ein Fluorochrom gebunden ist (Abbildung 3). Diese Methode wird weniger häufig verwendet, da sie ein geringeres Signal liefert, höhere Kosten und weniger Flexibilität mit sich bringt1. Darüber hinaus sind solche Antikörper im Allgemeinen schwieriger im Handel zu finden. Auf der anderen Seite reduziert die direkte Bindung des Fluorochroms an den Antikörper die Anzahl der Schritte im Verfahren erheblich, spart Zeit und reduziert häufig unspezifische Hintergrundsignale. Dies schränkt auch die Möglichkeit einer Kreuzreaktivität von Antikörpern ein.
Indirekte Immunfluoreszenz beinhaltet einen primären, unmarkierten Antikörper, der spezifisch für das Epitop von Interesseist 1. Ein Sekundärantikörper, der das Fluorochrom trägt, erkennt dann den Primärantikörper und bindet an ihn (Abbildung 3). Obwohl die indirekte Immunfluoreszenz komplexer und zeitaufwändiger ist als die direkte Immunfluoreszenz, wird sie aufgrund ihrer hohen Empfindlichkeit häufig verwendet und liefert auch ein verstärktes Signal, da mehr als ein Sekundärantikörper an jeden Primärantikörper binden kann. Darüber hinaus ist eine breite Palette kommerzieller Sekundärantikörper zu erschwinglichen Preisen erhältlich.
Das Hepatitis-C-Virus (HCV) ist ein großes Problem für die öffentliche Gesundheit, mit 130-170 Millionen chronisch infizierten Menschen weltweit. Um die Epidemie zu stoppen, muss die Therapie gegen HCV sowohl wirksam als auch breit verfügbar sein. Studien, die sich auf sichere und erschwingliche Naturstoffe konzentrieren, die gegen HCV wirksam sind, haben die antivirale Aktivität des humanen Proteins Lactoferrin (hLF) gezeigt, das das zirkulierende Virion bindet und neutralisiert5. In der aktuellen Studie zeigte die Untersuchung der hLF-Aktivität auf dem subgenomischen HCV-Replikonsystem, das unabhängig vom Eintritt und der Ausscheidung von Viren ist, eine ausgeprägte antireplikative Aktivität von hLF gegen HCV. Dieses Manuskript stellt eine Studie vor, in der Immunfluoreszenz-Assays durchgeführt wurden, um die Internalisierung von hLF, einer wichtigen Komponente des Immunsystems6, in Leberzellen zu überwachen. Darüber hinaus haben wir das inhibitorische Potenzial von hLF auf die intrazelluläre Replikation des Hepatitis-C-Virus (HCV) überwacht.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Wisent</td><td>319-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>PAF</td><td>BioShop</td><td>PAR070.1</td><td>Entzündbarer fester Stoff, hautreizend, Lunge und Augen</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Wisent</td><td>311-425-CL</td><td>ohne Ca2+ & Mg2+</td></tr><tr><td>NGS</td><td>Wisent</td><td>053-150</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488-markiertes</td><td>Anti-Maus-Invitrogen</td><td>A11017</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 568-markiertes Anti-Kaninchen</td><td>Invitrogeb</td><td>A21069</td><td></td></tr><tr><td>Weizenkeim-Agglutinin Alexa Fluor 488-Konjugat (WGA)</td><td>Invitrogen</td><td>W11261</td><td>Potenziell mutagenes</td></tr><tr><td>Anti-NS5A-Kaninchen-Abcam</td><td></td><td>ab2594</td><td></td></tr><tr><td>Anti-hLF Maus</td><td>Abcam</td><td>ab10110</td><td></td></tr><tr><td>SlowFade</td><td>Invitrogen</td><td>S36937</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst Fleck</td><td>Life Techn.</td><td>H1399</td><td>Möglicherweise&nbsp; mutagen&nbsp;
und krebserregend</td></tr><tr><td>hLF</td><td>Sigma</td><td>L0520</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Mikroskop für sichtbare/Epifluoreszenz</td><td>Nikon</td><td>TE2000-E</td><td></td></tr><tr><td>Epifluoreszenz-/Konfokalmikroskop</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr></tbody></table>

immunfluoreszenz, um die zelluläre aufnahme von menschlichem lactoferrin und die damit verbundenen antivirale aktivität gegen das hepatitis c virus-monitor

Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus

Immunfluoreszenz ist eine Labortechnik häufig verwendet, um viele Aspekte der Biologie zu studieren. Er wird üblicherweise verwendet, um die Verteilung und / oder die Lokalisierung eines Zielmoleküls in Zellen und Gewebe zu visualisieren. Immunfluoreszenz beruht auf der Spezifität von Fluoreszenz-markierten Antikörpern gegen die entsprechenden Antigene in der Zelle. Direkte und indirekte Immunofluoreszenz Ansätze können verwendet werden, die auf der Verwendung von Antikörpern, die mit einem Fluorochrom gebunden verlassen. Direkte Immunfluoreszenz wird seltener verwendet, da sie geringere Signal, mit höheren Kosten und weniger Flexibilität. Im Gegensatz dazu ist die indirekte Immunfluoreszenz mehr allgemein wegen seiner hohen Empfindlichkeit verwendet und liefert ein verstärktes Signal seit mehr als einem sekundären Antikörper kann an jeden primären Antikörper zu befestigen. In diesem Manuskript wurden sowohl Epifluoreszenzmikroskopie und konfokale Mikroskopie verwendet, um die Internalisierung von menschlichem Lactoferrin, eine wichtige Komponente der Immun überwachenSystem, in Leberzellen. Außerdem überwacht wir die Hemmpotenzial hLF auf die intrazelluläre Replikation des Hepatitis C-Virus mittels Immunfluoreszenz. Sowohl die Vorteile und Nachteile, die mit diesen Ansätzen verbunden sind, diskutiert.

Die Fähigkeit der Leber Huh-7-Zelllinie exogen administrated hLF internalisiert wurde mittels Immunfluoreszenz auf einem konfokalen miscroscope überwacht. hLF wurde zu dem Kulturmedium zugegeben, und die Internalisierung wurde 24 h erlaubt, wonach wurde extrazelluläres hLF mit PBS gewaschen und restliche Membran gebunden hLF wurde mit einer 5 min Trypsinbehandlung (1 ml) abgebaut. Die Zellen wurden ausgesät und man ließ sie wieder halten 18 Stunden vor der Immunfluoreszenzfärbung. Um die cytoplasmatischen Grenzen beschr...

Das menschliche Lactoferrin (hLF) ist ein Bestandteil des Immunsystems. In dieser Studie werden Immunfluoreszenz-Assays verwendet, um sowohl die hepatozelluläre Aufnahme von hLF als auch eine qualitative Reduktion der Hepatitis-C-Virusreplikation nach Behandlung mit hLF nachzuweisen.

Immunfluoreszenz, um die zelluläre Aufnahme von menschlichem Lactoferrin und die damit verbundenen antivirale Aktivität gegen das Hepatitis C Virus-Monitor

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Internalisierung von humanem Lactoferrin in hepatische Zellen mittels Epifluoreszenz- und konfokaler Mikroskopie zu verfolgen und dessen hemmende Wirkung auf die intrazelluläre Replikation des Hepatitis-C-Virus (HCV) zu bewerten. Dazu werden HUH-7-Zellen kultiviert, die den HCV-subgenomischen Replicon tragen. Anschließend wird humanes Lactoferrin zu den wachsenden Zellen gegeben, wodurch das Protein in die Zellen eindringen kann.Anschließend werden die Zellen fixiert und mittels Fluoreszenzmikroskopie visualisiert. Die Ergebnisse zeigen, dass Hepatozyten in der Lage sind, HLF aus ihrer extrazellulären Umgebung aufzunehmen, und dass die Färbung des HCV-subgenomischen Replikons in mit HLF behandelten Zellen basierend auf der Fluoreszenzmikroskopie reduziert ist. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im EB-C-Virus-Forschungsfeld zu beantworten, beispielsweise welcher molekulare Mechanismus dafür verantwortlich ist, dass das Mittel die Virusreplikation hemmt.Um zu beginnen, geben Sie eine runde Deckglas in den Boden jedes Wells einer 24-Loch-Platte und spülen Sie die Wells mit PBS. Säen Sie HUH-7-Zellen, die das H

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Nachweis viraler RNA durch Fluoreszenz<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung (FISH)

Wir beschreiben zwei Methoden für die...

Zwei Methoden der Heterokaryon Formation zu entdecken HCV Restriktionsfaktoren

Source: Allaire, A., et al. Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus. J. Vis. Exp. (2015).The video demonstrates the procedure for preparing cells to assess the intracellular uptake and activity of an antiviral agent against the hepatitis C virus.

Preparing Cells to Analyze Intracellular Uptake and Activity of an Antiviral Agent

Quelle: Shah, R., et al. Einzelzell-Multiplex-Fluoreszenzbildgebung zur Visualisierung viraler Nukleinsäuren und Proteine sowie zur Überwachung von HIV-, HTLV-, HBV-, HCV-, Zika-Virus- und Influenza-Infektionen. J. Vis. Exp. (2020)Dieses Video zeigt die gleichzeitige Visualisierung von HIV-1-DNA, RNA und Kapsidprotein in infizierten menschlichen Lymphozyten mittels verzweigter DNA-Hybridisierung und Immunfluoreszenz, wodurch eine detaillierte Analyse der einzelnen Stadien der Virusreplikation...

Multiplexes Fluoreszenz-Imaging von viralen Nukleinsäuren und Proteinen in infizierten menschlichen Lymphozyten

Source: Ren, S., et al. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (2014).This video demonstrates an immunofluorescence-based method to detect Hepatitis C virus replication in infected hepatoma cells. The protocol involves cell fixation, antibody staining for viral protein and double-stranded RNA, and visualization using fluorophore-tagged secondary antibodies. Dual signal detection under a fluorescence microscope confirms active viral replication within the host cells.

Immunofluorescence Assay to Detect Hepatitis C Virus Replication Complexes in Infected Cells

Quelle: Ren, S., et al. Ein Protokoll zur Analyse der Replikation des Hepatitis-C-Virus. J. Vis. Exp. (2014)Dieses Video demonstriert den Fluoreszenz-Fokus-Assay, der zur Quantifizierung infektiöser Hepatitis-C-Viren in Zellkultur verwendet wird. Es zeigt die serielle Verdünnung des viralen Überstandes, die Infektion von Hepatomzellen und den Nachweis von Virusreplikationsstellen mittels antikörperbasierter Fluoreszenzmikroskopie.

Quantifizierung des infektiösen Hepatitis-C-Virus mittels Fluoreszenzmikroskopie

Dieses Video zeigt einen viralen Attachment-Assay zum Screening antiviraler Verbindungen. Unter Verwendung von genetisch veränderten Hepatitis-C-Viren und Luciferase werden inhibitorische Effekte auf die Virusanheftung bewertet, was sich in einer geringeren Lichtintensität in gleichzeitig behandelten Vertiefungen im Vergleich zu Vertiefungen, die nur mit dem Virus behandelt wurden, zeigt.

Ein Virus-Attachment-Assay für das Screening von antiviralen Verbindungen

Dieses Video zeigt einen Assay zur Bewertung von antiviralen Wirkstoffen, die auf bestimmte Schritte des viralen Eintritts in Wirtszellen und der Fusion mit dem Endosom abzielen. Die Zellen werden bei niedriger Temperatur inkubiert und dann mit HCV infiziert. Die niedrige Temperatur ermöglicht die Bindung des Virus an Wirtszellen, hemmt aber die Internalisierung über die Endozytose. Die antivirale Testverbindung wird zugegeben, und die Zellen werden bei physiologischer Temperatur inkubiert.

Ein Assay zur Bewertung der Wirkung von Testverbindungen auf den Eintritt und die Fusion von Viren in Wirtszellen

Dieses Video zeigt einen Immunfluoreszenz-Assay, der zur Messung der Neutralisation des humanen Cytomegalievirus (HCMV) entwickelt wurde. Virusspezifische Antikörper werden mit dem Virus gemischt und mit menschlichen Fibroblastenzellen inkubiert. Die Antikörper neutralisieren das Virus, so dass es die Wirtszellen nicht infizieren kann, während nicht neutralisierte Viren die Zellen infizieren. Nach der Inkubation wird das Ausmaß der Neutralisation durch Quantifizierung der virusinfizierten...

Eine Immunfluoreszenzmethode zur Messung der Neutralisation des humanen Cytomegalievirus

Hier wird ein Protokoll für einen Fluoreszenzbildgebungsansatz vorgestellt, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA, and protein (MICDDRP), eine Methode, die in der Lage ist, gleichzeitig Fluoreszenz-Einzelzellvisualisierung von viralen Proteinen und Nukleinsäuren unterschiedlicher Art und Strandung zu visualisieren. Dieser Ansatz kann auf eine Vielzahl von Systemen angewendet werden.

Einzelzell-Multiplex-Fluoreszenzbildgebung zur Visualisierung viraler Nukleinsäuren und Proteine und zur Überwachung von HIV-, HTLV-, HBV-, HCV-, Zika-Virus- und Influenza-Infektionen

Erfahren Sie die zelluläre Aufnahme von humanem Lactoferrin in Hepatozyten mittels Immunfluoreszenz und dessen antivirale Wirkung gegen das Hepatitis C Virus. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von HCV-Replikationshemmung.

Immunfluoreszenz, um die zelluläre Aufnahme von menschlichem Lactoferrin und die damit verbundenen antivirale Aktivität gegen das Hepatitis C Virus-Monitor (Video) | JoVE Journal

Immunfluoreszenz, um die zelluläre Aufnahme von menschlichem Lactoferrin und die damit verbundenen antivirale Aktivität gegen das Hepatitis C Virus-Monitor

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