Name: Verwendung enzymatischer Biosensoren auf endogenes ATP oder H Quantifizieren 2 O 2 In der Niere (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Lernen Sie die Verwendung enzymatischer Biosensoren zur Echtzeitmessung von ATP und Wasserstoffperoxid in Nierengewebe. Diese Methode ermöglicht präzise Untersuchungen der extrazellulären Zellsignalgebung in vivo und ex vivo.

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Wir schätzen Sarissa Biomedical für ihre Arbeit bei der Entwicklung der in der vorliegenden Manuskript verwendeten Sensoren. Diese Forschung wurde von der National Heart, Lung unterstützt, and Blood Institute gewährt HL108880 (A. Staruschenko), HL 116264 (A. Cowley) und HL 122662 (A. Staruschenko und A. Cowley), ein Projekt des Medical College of finanziert Wisconsin Komitee Forschung Angelegenheiten # 9306830 (O. Palygin) und Vorschieben eines gesünderen Wisconsin Forschungs- und Ausbildungsprogramm # 9520217, und das Young Investigator Grants des National Kidney Foundation (O. Palygin).

Folgende Tierverfahren im Rahmen der NIH Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren eingehalten werden. Vorherige Genehmigung wurde von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) erhalten. HINWEIS: Lesen der Sensorherstellers soll während des Versuchs-Design und vor ihrer Verwendung erfolgen. Im Anschluss an diese Anweisungen werden optimale Ergebnisse zu erzielen, wenn Sie die Sensoren. 1. Sensorkalibrierung <ol><li> Frische Stammlösungen vor dem Beginn des Experiments. </li><li> Erstellen Puffer A enthaltend 10 mM NaPi-Puffer, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl 2 und 2 mM Glycerin. Den pH-Wert auf 7,4 unter Verwendung von NaOH. Bei 2-8 ° C. </li><li> Mit Hilfe eines Aktien ATP-Konzentration (100 mM) bei -20 ° C gelagert werden, erstellen Sie einen frischen 10 mM ATP Kalibrierungslösung durch Zugabe von 10 &amp; mgr; l Lager bis 90 &amp; mgr; l Puffer A </li><li> Rehydrieren die ATP-Sensor durch Anordnen seiner Spitze (2) in ter Rehydratisierung Kammer mit Puffer A für mindestens 10 min bei 2-8 ° C. HINWEIS: Nach Rehydratisierung sollten die Sensoren nicht der Luft für mehr als 20 Sekunden ausgesetzt werden, oder die Empfindlichkeit des Sensors verringert werden. Wenn Langzeitbelichtungen, um Luft zu erwarten sind, tauchen Sie den Sensor kurz in eine Lösung von Glycerin. Die Sensoren können für mehrere Experimente verwendet werden, aber diese müssen auf dem gleichen Tag wie Sensor Rehydratisierung auftreten. Die Sensoren können in der Rehydratisierung Kammer mit Puffer A bis zu 24 Stunden gelagert werden. </li><li> Schalten Sie den Dual-Channel-Potentiostaten (Abbildung 3) und starten Sie die Aufnahme-System-Software. </li><li> Eine Eichkammer mit 3 ml Puffer A Legen Sie die Referenz-Elektrode in die Eichkammer. Nehmen Sie jede Sensor aus der Rehydrierung Kammer, dann verbinden Sie es mit dem Manipulator und fügen diesen in die Kalibrierkammer Lösung. HINWEIS: Verwenden Sie eine Standard-Silikon beschichtete Petrischale als Kalibrierkammer. Führen Sie alle Kalibrierungen und studies in einem Faradayschen Käfig auf einem Hochleistungslabor Lufttisch um das Signalrauschen während der Amperometrie-Aufnahmen (Abbildung 4) zu reduzieren. Kalibrierungen werden am besten so nah an den Beginn der Datensammlung wie möglich durchgeführt. Für die in vivo-Anwendungen der optimale Zeitpunkt für die Kalibrierung ist bei der Tier Erholung nach der Operation Zeitraum. </li><li> Ex-vivo-Kalibrierung <ol><li> Zuführen Cyclovoltammetrie in der Kalibrierungskammer durch zyklisches die Sensoren von -500 mV bis +500 mV mit einer Geschwindigkeit von 100 mV / sec für 10 Zyklen. Dies die Empfindlichkeit der Sensoren erheblich verbessert. Siehe Figur 5 für die aus den 10 Zyklen beobachtet Spuren. </li><li> Polarisieren der Sensoren an +600 mV nach dem letzten Zyklus. Der Sensorstrom wird zu einer Asymptote zerfallen. Eine stetige Lektüre wird nach einem Minimum von 5 Minuten erreicht. Notieren Sie den Nullwert. </li></ol></li><li> In-vivo-Sensor-Kalibrierung <ol><li> Nicht die zyklische Voltammetrie auf die in vivo Senso auszuführenrs. Stattdessen polarisieren den Sensor in der Eichkammer 30 sec bis +500 mV. Setzen Sie dann die Potentiostaten auf 0 mV und lassen Sie den Sensorstrom zu einer Asymptote steigen. Der Sensorstrom ist mindestens 2 min auf Asymptote zu nehmen. Notieren Sie den Nullwert. </li></ol></li><li> Nacheinander hinzuzufügen Satz Mengen an ATP-Lösung in die Kammer, um eine Kalibrierungslinie umfasst eine gewünschte Erfassungsbereich zu erzeugen. Die ATP-Lösung erzeugt eine scharfe Spitze in dem Sensorsignal zunächst, gefolgt von einem Verfall wie der ATP diffundiert gleichmäßig in der Kammer. Nehmen Signalwerte, sobald der Signalpegel nach jedem ATP zusätzlich stabilisiert. 6A und 7 zeigen Spuren und schlug vor, ATP-Konzentrationen sowohl für ex vivo und in vivo Studien auf. HINWEIS: Es ist wichtig, um die Selektivität der Elektroden mit Hilfe Fängern der Analyten zu bestätigen. Die vorliegende Protokoll Apyrase, um die Spezifität des ATP-Sensor und Katalase für die H &lt;testensub&gt; 2 O 2 Signal (6B). Wenn Medikamente verabreicht werden sollen, sollten Messungen ihrer Reaktivität mit den Sensoren vor der Untersuchung bestimmt werden. </li><li> In 3 ul Apyrase aus einem Vorrat von 2 mg / ml (89 UN / mg), um die Spezifität des ATP-Sensor (der Strom, der durch ATP-Anwendung hergestellt werden, sollten zu dem Null-Niveau (Abbildung 7) reduzieren zu testen. </li><li> In 3 ul von Katalase aus einem Vorrat von 2 mg / ml (100 UN / mg), um die Spezifität der Null-Sensor (der Strom, der durch H 2 O 2 produziert Anwendung sollte auf den Nullwert zu reduzieren) zu testen. </li></ol> 2. Tierchirurgie für Sensor Studies <ol><li> Chirurgie für ex vivo <ol><li> Betäuben das Versuchstier mit Isofluran (5% Induktion, 1,5 bis 2,5% Wartung) / Klasse O 2 medizinische oder einer anderen zugelassenen Methode. 15 &#39;12 Tiere müssen ständig überwacht werden, um ein angemessenes Niveau der Anästhesie zu gewährleisten. StLage Atemfrequenz und toe Prise Reaktion verwendet werden, um angemessene Betäubung bestätigen. Hinweis: Euthanize das Tier nach anerkannten IACUC Protokolle. Bei Vollendung aller nicht überleben Verfahren euthanize tief narkotisierten Tieren durch Thorakotomie Induzieren Pneumothorax den humanen Tod des Tieres 12 zu gewährleisten. </li><li> Legen Sie die Ratte auf einem temperaturgesteuerten Operationstisch in Rückenlage. Und gleichzeitig eine angemessene Narkosetiefe, einen Mittellinienschnitt von ca. 5 cm im Einklang mit der linken Niere und setzen die distalen abdominalen Aorta. </li><li> Wickeln Sie ein Ligatur um die Zöliakie und mesenterica superior Arterien und der Bauchaorta oberhalb dieser Arterien, aber nicht unterbinden. Wickeln zwei Ligaturen um die Bauchaorta unterhalb der Nierenarterien. </li><li> Klemmen Sie die Bauchaorta oberhalb der Ligaturen. Binden Sie das untere Blattschraube. Katheterisierung der abdominalen Aorta mit Polyethylenschlauch (PE50). Sichern Sie den Katheter mit dem zweiten Aorta Ligatur. </li><li> Entfernen Sie die Klemme und ligieren die mesenterialen und Zöliakie Arterien. Perfusion der Niere bei 6 ml / min mit Hanks Balanced Salt Solution bei RT für 2-3 min, bis die Niere vollständig blanchiert. </li><li> Auszuschneiden der Niere und des Katheters verbundene Abschnitt der Aorta. Legen Sie die Niere in einen 3 ml Petrischale mit Bad-Lösung gefüllt. Hinweis: Experiment-Protokoll kann bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Die Badlösung enthält in mM: 145 NaCl, 4,5 KCl, 2 MgCl 2, 1 CaCl 2, 10 HEPES, pH 7,35 mit NaOH eingestellt. </li></ol></li><li> Chirurgie für In-vivo- <ol><li> Betäuben die Ratte mit zugelassenen IACUC Protokolle. Zur in vivo-Analyse betäuben die Ratten mit Ketamin (20 mg / kg im) und Inactin (50 mg / kg ip). Die Tiere müssen ständig überwacht werden, um eine angemessene Gabe von Betäubungsmitteln zu gewährleisten. Eine stabile Atemfrequenz und toe Prise Reaktion verwendet werden, um angemessene Betäubung bestätigen. </li><li> Nach entsprechender Anästhesietiefe zu erhaltened, legen Sie die Ratte in Rückenlage auf einer temperierten geerdeten Oberfläche auf dem Lufttisch entfernt. Sollte die Oberfläche vorgewärmt und bei 36 ° C gehalten werden. </li><li> Unter Beibehaltung richtige Narkosetiefe, stellen einen Mittellinienschnitt etwa 5 cm im Einklang mit der Niere. </li><li> Verwenden eines Fadens abgelenkt und verankern die kutanen und subkutanen Gewebe, so dass die gesamte Niere sichtbar ist. Legen Sie die Niere in einer Niere cup, alle Bewegungsartefakte zu minimieren. </li><li> Verwenden eine IV Infusion von 2% BSA 0,9% NaCl mit 1 ml / 100 g / h über die Jugularvene um das Blutvolumen aufrecht zu erhalten. Kanülieren beide Harnleiter zur Urinsammlung. Platz Krawatten um den mesenterica superior und Zöliakie Arterien und die distale Aorta für die Manipulation von renalen Perfusionsdruck (10A). </li><li> Wenn die Anwendung pharmakologischer Mittel ist während der in-vivo-Experimente benötigt wird Einführen eines interstitiellen Katheter empfohlen (10B </strong&gt;). </li></ol></li></ol> 3. Datenerfassung einrichten <ol><li> Öffnen Sie das Datenerfassungsprogramm und stellen Sie die Polarität sowohl für ex vivo und in vivo-Experimente an anodische Positive. Stellen Sie das Programm, um Daten als ASCII-Code zu speichern. </li><li> Positionieren Sie die Mikromanipulatoren zum schnellen Einsetzen der Sensoren in die Nieren. HINWEIS: Alternativ können Sie einen Dummy-Sonde mit dem Mikromanipulator angebracht, um zur Verwirklichung der gewünschten Anordnung von Sensoren. </li><li> Ex vivo Datenerfassungs- <ol><li> Perfusion der Niere mit Badlösung (ab 2.1.6) über den kanülierten Aorta bei einer konstanten Rate von 650 ul / min. Verwendung chirurgische Scheren, entfernen Sie vorsichtig die Nierenkapsel, die für Sensor Insertion erforderlich ist. </li><li> Sichern die Niere mit Gummibändern über die Niere umreift und mit Silikon beschichteten Schale mit Stiften befestigt. </li><li> Platzieren der Referenzelektrode in der Nähe der Niere in die Petrischale mit ihrer Spitze in Submersdie Pufferlösung. </li></ol></li><li> In-vivo-Datenerfassung <ol><li> Legen Sie die Niere in einer Niere Tasse. Je nach Belastung und Alter des Tieres mit einem Größe der Tasse, die die Niere locker hält. Abbildung 8 zeigt zwei Größen von Nierenschalen. Ähnliche Becher sind für verschiedene physiologische Ansätze auf der Analyse der Nierenfunktion fokussiert wie micropuncture etc 16 eingesetzt. Anmerkung: Die Position der Nieren Schale ist entscheidend, um die mechanischen Geräusche durch das Tier erzeugte Atem zu entfernen, aber nicht stören oder blockieren Nierenperfusion oder Urinflusses. </li><li> Lassen Sie 45 Minuten Erholungszeit, bevor die Datenerfassung. </li><li> Mit Hilfe eines 26-30G Nadel, machen Sie eine Einstichloch an der gewünschten Stelle und Tiefe des Sensors in der Niere. Tupfen Sie die Oberfläche Loch exsudiert Blut zu entfernen. Hinzufügen Glycerinlösung auf die Oberfläche der Niere. Dies wird die Nierenfläche vor dem Austrocknen während des Experiments zu verhindern. </li&gt; <li> Entfernen Sie den ersten Sensor von der Rehydrierung Kammer und befestigen Sie es an den Mikromanipulator. Schnell, innerhalb von 20 Sekunden, legen Sie die Elektrode in die frisch erstellten Loch in der Niere. Die Schritte 3,5-3,9 für das Null-Sensor. </li><li> Legen Sie die Referenzelektrode in die Niere, ca. 1 cm von der Sensoren. </li></ol></li><li> Einschalten des Potentiostaten und Aktivieren der Aufzeichnungsprogramm auf dem Computer, Fig. 9 zeigt die endgültige Konfiguration des ex vivo Nierendatenerfassung, Fig. 10 zeigt die endgültige Konfiguration des in vivo Nierendatenerfassung mit einem eingeführten Katheter. </li></ol> 4. Datenanalyse <ol><li> Importieren Sie die ASCII-Datendatei in Origin oder ähnliche Software. </li><li> Konzentration aktuelle Verhältnis <ol><li> Verwenden Sie die lineare Anpassung / extrapolieren-Funktion, um eine lineare Konzentration (x-Achse), um Strom zu bauen (y-Achse) Beziehung für die ATP oder H 2 </sub&gt; O 2 Kalibrierungspunkten (6 und 7). linearen Ausgleichsgeraden: y = mx + b </li></ol></li><li> Gleichzusetzen, um die aktuelle Konzentration </li><li> Subtrahieren der gemessenen Spuren des Nullsensor von denen der ATP-Sensor, um die tatsächliche durch intrazelluläres ATP erzeugten Strom zu erhalten. </li><li> Konvertieren Sie die ATP-Werte in pA durch Amperometrie an nM unter Verwendung des Kalibrierungsgleichung in 4.2.1 beschrieben. Bestimmen Sie die Konzentration des subtrahiert Datenspur des ATP-Sensor durch den Import jedes eingestellten Strom in den &quot;x&quot; -Wert und Auflösen nach y (die Konzentration des Analyten). </li><li> Genauso werden H 2 O 2 -Konzentration von seinem Kalibrierungsgleichung, wenn nötig. </li></ol>

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</ol>

Sensoren für die Videoaufzeichnung dieser Handschrift wurden von Sarissa Biomedical Limited (Coventry, UK) zur Verfügung gestellt.

Die vorliegenden Protokolle wurden entwickelt, um eine verbesserte zeitliche und räumliche Auflösung der ATP bereitzustellen und H 2 O 2 Signalisierung für ex vivo isolierten, perfundierten und in vivo durchbluteten Niere. Die Differenzen zwischen den Protokollen und den hier verwendeten Sensoren liefern eine optimale Datenerfassung entweder für pharmakologische Mittel oder physiologische Studien. Protokolle bestehen aus 1) Sensorkalibrierung, 2) chirurgische Verfahren, 3) Datenerfassungsein...

Enzymatische Mikroelektroden-Biosensoren (auch als Sensoren in der vorliegenden Handschrift verwiesen wird) haben ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung dynamischer Signalprozesse in lebenden Zellen und Geweben. Die Sensoren liefern in biologisch relevanten Konzentrationen erhöhten zeitlichen und räumlichen Auflösung von Zellsignalmoleküle. Anstelle der Entnahme und Analyse extrazellulären Flüssigkeiten in Intervallen über einen langen Zeitraum angewendet, reagieren diese Sensoren so schnell ihre Enzyme reagieren mit dem Analyten, wodurch Echtzeitmessungen 1,2. Schnelle Erkennung von interstitiellen Konzentrationen von autokrinen und parakrinen Faktoren wie Purine oder Wasserstoffperoxid und die Dynamik ihrer Freisetzung kann verwendet werden, um ein Profil für die Wirkungen von Arzneimitteln in normalen und pathologischen Bedingungen 3 einzurichten. Derzeit haben die meisten Anwendungen mit Sensoren in der Hirngewebeschnitten und Zellkulturen 4-10 gewesen. Die in dieser Handschrift Ziel, ausführliche Protokollelegen die Mittel zur Echtzeit-Konzentrationen von Analyten in Voll Nieren genau zu messen. Die folgenden Protokolle wurden entwickelt, um interstitielle ATP und H 2 O 2 Signalisierung in den Nieren zu untersuchen. In der natürlichen Umgebung der Niere wird die extrazelluläre ATP schnell von endogenen ectonucleotidases in seine Derivate (ADP, AMP und Adenosin) abgebaut. Die hier verwendeten Sensoren sind sehr selektiv, um ATP über andere Purine oder ATP-Abbauprodukte 11. Dies bietet einen großen Vorteil, denn sie ermöglicht eine genaue Überwachung der konstanten und dynamischen Konzentrationen von ATP-Freisetzung und ihre Signalfunktion. Interstitielle ATP-Konzentration wird unter Verwendung der Kombination von zwei Mikroelektroden, eine ATP-Sensor und einem Null-Sensor gemessen. Die Null-Sensor in Kombination mit Katalase-Anwendungen in der Lage ist interstitiellen H erkennen 2 O 2 -Konzentrationen 12. Die folgenden Protokolle verwenden zwei verschiedene Designs sensors, die Eigenschaften optimal für die beiden ex vivo oder in vivo-Anwendungen haben. Beide Ausführungen beruhen auf dem sequentiellen katalytische Umsetzung von Glycerinkinase und Glycerin-3-phosphat-Oxidase in einer Sensorschicht enthalten enzymatische und wird durch die Anwesenheit von ATP angetrieben. In dem Satz von Sensoren in den ex-vivo-Studien verwendet werden, H 2 O 2, dem letzten enzymatischen Reaktionsproduktes durch Oxidation auf einer Platin / Iridium (Pt-Ir) Drahtelektrode detektiert. Sensoren für In-vivo-Studien sind stattdessen auf H auf einem Mediator beschichteten Goldelektrode durchbluteten Gewebes entwickelt auf der Basis 2 O 2 -Reduktion. In 1 ist ein Schema der beiden in dieser Handschrift beschriebenen Protokollen. Die Null-Sensor ist identisch mit dem entsprechenden ATP-Sensor, außer es die gebundenen Enzyme fehlen. Daher kann, zusätzlich zu der Erfassung des H 2 O 2 mit dem Enzym Katalase, die Null-Sensor mealeistet unspezifische Interferenzen. ATP-Konzentrationen werden durch Subtrahieren der Null erfaßt unspezifische Störungen und Hintergrund H 2 O 2 aus der ATP-Sensorsignal berechnet. Mehrere Sensoren sind ebenfalls im Handel erhältlich, um andere Analyte einschließlich Adenosin, ionosine, Hypoxanthin, Acetylcholin, Cholin, Glutamat, Glucose, Lactat, D-Serin für die ex vivo-Anwendungen oder Adenosin, ionosine und Hypoxanthin für in vivo zu detektieren, wenn in Kombination mit dem entsprechenden Null Sensors. Die Fähigkeit des Sensors zur Analyten genau zu erfassen, hängt von der korrekten Vor- und Nach- Kalibrierungen 13. Dies stellt sicher, dass die Analyse berücksichtigt die Drift der Sensorempfindlichkeit, die beim Einsatz in biologischen Geweben auftritt. Der Sensor enthält ein Depot von Glycerin, das als Reagens bei der Sensor enzymatischen Reaktionen verwendet wird. Wenn der Sensor nicht in Badlösungen mit Glycerin verwendet wird, wird er im Laufe der Zeit ausgewaschen. Kürzere rufnehmen Zeiten sind dann notwendig, um die Sensordrift zu minimieren. Zusätzlich Sensor Bewuchs durch endogene Proteasen und Proteinfragmente können die Empfindlichkeit der Sensoren 14 stark vermindert. Die vorliegende Manuskript stellt die Verwendung von Mikroelektroden enzymatische Biosensoren zur ex vivo und in vivo-Nieren Zubereitungen. Echtzeit-Analyt-Quantifizierung bietet beispiellose Detail der zellulären Signaltransduktion, die neue Einblicke in die Mechanismen von Nierenerkrankungen und pharmakologische Mittel zu offenbaren kann.

<table><tbody><tr><td>Sensor-Kit</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SBK-ATP-05-125</td><td>Das Kit enthält eine Aufbewahrungsflasche, eine Rehydrationskammer, Elektrodenkabel und Referenzelektroden. Ebenfalls im Kit enthalten ist die Auswahl der Sensoren des Benutzers.</td></tr><tr><td>Sarissaprobe ATP Biosensor 125 &mu; m</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SBS-ATP-05-125</td><td>vor Gebrauch bei 2-8 oC</td></tr><tr><td>aufbewahren Sarissagold ATP Biosensor 50 &mu; m</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SGS-ATP-10-50</td><td>Vor Gebrauch bei 2-8 oC</td></tr><tr><td>aufbewahren Sarissaprobe Nullsensor 125 &mu; m</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SBS-NUL-20-125</td><td>vor Gebrauch bei 2-8 oC</td></tr><tr><td>lagern Sarissagold Nullsensor 50 &mu; m</td><td>Sarissa Biomedical</td><td>SGS-NUL-10-50</td><td>vor Gebrauch bei 2-8 oC</td></tr><tr><td>aufbewahren Sarissaprobe ATP Handbuch Sarissa</td><td>Biomedical</td><td></td><td><a href="http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf">http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf</a></td></tr><tr><td>Faradayscher Käfig&nbsp;</td><td>TMC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zweikanal-Potentiostat</td><td>Digi-Ivy</td><td>DY2021</td><td>Typ II Faradayscher Käfig</td></tr><tr><td>Datenerfassungsprogramm</td><td>Digi-Ivy</td><td>DY2000</td><td></td></tr><tr><td>Perfusionspumpe</td><td>Razel Scientific Instruments</td><td>Modell R99E</td><td></td></tr><tr><td>Faseroptische Beleuchtung</td><td>Schott</td><td>ACE 1</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MM-3</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator Magnetständer</td><td>Narishige</td><td>GJ-8</td><td></td></tr><tr><td>Lufttisch</td><td>TMC</td><td>63-500</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran-Beatmungsgerät</td><td>LEI Medical</td><td>M2000</td><td></td></tr><tr><td>3 ml Petrischale</td><td>Fisher Scientific</td><td>S3358OA</td><td></td></tr><tr><td>Nadel</td><td>Santa Cruz</td><td></td><td>26-30 G</td></tr><tr><td>Stifte</td><td></td><td></td><td>Standard Dissektionsstifte</td></tr><tr><td>Katheter</td><td></td><td></td><td>Polyethylenschlauch (PE50)</td></tr><tr><td>Kleber für Katheter Vetbond</td><td></td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Nahtmaterial</td><td>Look</td><td>SP117</td><td></td></tr><tr><td>Gummibänder</td><td></td><td></td><td>beliebig 2-4 mm breite Gummibänder</td></tr><tr><td>Silikon</td><td>Momentive</td><td>RTV-615 Klar 1#</td><td></td></tr><tr><td>Klemme</td><td>Fine Science Tools</td><td>18052-03</td><td></td></tr><tr><td>Das Standard-Präparierset</td><td></td><td></td><td>sollte ein Skalpell und eine Präparierschere enthalten.</td></tr><tr><td>Nierenbecher</td><td></td><td></td><td>Eigene</td></tr><tr><td>Standardchemikalien</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6559-25UMO</td><td>100 mM ATP-Lösung</td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7646</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Clipper</td><td>10250</td><td></td></tr><tr><td>Inactin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T133</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Clipper</td><td>2010012</td><td></td></tr><tr><td>Hanks Balanced Salt Solution&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td></td></tr></tbody></table>

verwendung enzymatischer biosensoren auf endogenes atp oder h quantifizieren<sub&gt; 2</sub&gt; o<sub&gt; 2</sub&gt; in der niere

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Enzymatische Mikro Biosensoren wurden weit verbreitet verwendet, um extrazelluläre Signalisierung in Echtzeit zu messen. Die meisten von ihr Einsatz zu Hirnschnitten und neuronalen Zellkulturen beschränkt. In jüngerer Zeit hat diese Technologie auf den ganzen Organen angewendet wurden. Fortschritte in der Sensordesign haben die Messung der Zellsignalisierung in durchbluteten Niere in vivo ermöglicht. Die vorliegenden Protokolle listen die erforderlichen Schritte, um ATP und H 2 O 2-Signalisierung in der Rattenniere Interstitium zu messen. Zwei separate Sensorkonstruktionen werden für die ex vivo und in vivo-Protokolle verwendet. Beide Sensortypen sind mit einer dünnen enzymatische Bioschicht auf einer Permselektivität Schicht überzogen, um schnell reagieren, empfindliche und selektive Biosensoren zu geben. Die Permselektivität Schicht schützt das Signal von den Interferenten in biologischem Gewebe, und die enzymatische Schicht die sequentielle katalytische Umsetzung von Glycerinkinase und Glycerin-3-phos nutztphosphat-Oxidase in Gegenwart von ATP, um H 2 O 2 zu produzieren. Der Satz von Sensoren für die Ex-vivo-Studien verwendet weiteren nachgewiesenen Analyten durch Oxidation von H 2 O 2 auf einer Platin / Iridium (Pt-Ir) Drahtelektrode. Die Sensoren für die in-vivo-Untersuchungen werden stattdessen auf die Reduktion von H 2 O 2 auf einen Mediator beschichteten Goldelektrode für bluteten Gewebe ausgelegt beruht. Endkonzentration Änderungen werden durch Echtzeit-Amperometrie gefolgt von Kalibrierung auf bekannte Konzentrationen des Analyten nachgewiesen. Zusätzlich kann die Spezifität des amperometrischen Signals durch den Zusatz von Enzymen wie Katalase und Apyrase, die unten H 2 O 2 und ATP entsprechend brechen zu bestätigen. Diese Sensoren stützen sich auch stark auf genaue Kalibrierungen vor und nach jedem Experiment. Die folgenden zwei Protokolle bauen das Studium der Echtzeit-Detektion von ATP und H 2O 2 in Nierengewebe, und kann weiter modifiziert werden, um die beschriebenen Verfahren zur Verwendung in anderen biologischen Präparaten oder ganzen Organen zu verlängern.

Das Design der enzymatischen Mikroelektroden-Biosensor ermöglicht die Echtzeit-Detektion von Analyten in ganzen Nieren. Die allgemeinen Versuchsplanung für die beiden ex vivo oder in vivo-Studien in 1 .Die verwendeten Sensoren veranschaulicht und die chirurgischen Verfahren davon ab, ob die Studie je ist ex vivo oder in vivo. Um reproduzierbare Ergebnisse, präzise vor und nach der Kalibrierung zu erhalten, sind kritisch. 6A zeigt eine</stro...

Enzymatische Mikroelektroden-Biosensoren ermöglichen Echtzeitmessungen der extrazellulären Zellsignalübertragung in biologisch relevanten Konzentrationen. Die folgenden Protokolle erweitern die Anwendungen von Biosensoren auf den ex vivo und in vivo Nachweis von ATP und H2O2 in der Niere.

Verwendung enzymatischer Biosensoren auf endogenes ATP oder H Quantifizieren<sub&gt; 2</sub&gt; O<sub&gt; 2</sub&gt; In der Niere

Enzymatic microelectrode biosensors have been widely used to measure extracellular signaling in real-time. Most of their use has been limited to brain ...

Das übergeordnete Ziel dieser Verfahren besteht darin, die endogenen interstitiellen Konzentrationen eines TP und von Wasserstoffperoxid in gesamten Nieren in Echtzeit zu messen. Dies wird erreicht, indem Sensoren zunächst für ex vivo- und in vivo-Anwendungen an bekannte Konzentrationen eines TP und von Wasserstoffperoxid rehydriert und kalibriert werden. Für die ex vivo-Installation der Sensoren wurde die Niere chirurgisch instrumentiert und vom Blut befreit.Dieses Verfahren wird durchgeführt, indem die Niere über die Aorta durchgespült wird. Anschließend wird die Rattenniere chirurgisch isoliert, in eine Messkammer platziert und mit physiologischer Kochsalzlösung perfundiert. ATP und Wasserstoffperoxid werden mithilfe von ex vivo-Sensoren für das In-vivo-Verfahren gemessen.Es wird ein Schnitt durchgeführt, um die durchblutete Niere sichtbar zu machen. Die Niere wird in die stabile Haltekappe platziert, und ein interstitieller Katheter kann zur Applikation von Wirkstoffen eingesetzt werden. Weitere Messungen der interstitiellen Konzentrationen von ATP und Wasserstoffperoxid in der Niere erfolgen mithilfe von In-vivo-Sensoren.Schließlich ermöglichen diese Protokolle den Einsatz enzymatischer Mikroelektroden-Biosensoren für die Echtzeitmessung von ATP und Wasserstoffperoxid im Niereninterstitium. Der Hauptvorteil enzymatischer Biosensoren liegt in ihrer Fähigkeit, endogene interstitielle Konzentrationen in biologischem Gewebe direkt zu messen. Hier wird diese Technologie zur Detektion von ATP- und Wasserstoffperoxidkonzentrationen im Interstitium einer isoliert perfundierten Niere oder in vivo verwendet.Die Präzision der enzymatischen Biosensoren ermöglicht Echtzeitmessungen der basal und dynamisch regulierten extrazellulären ATP- oder Wasserstoffperoxidkonzentrationen. Diese Messungen können Pharmakologika-Anwendungs- oder Krankheitsprofile für funktionell unterschiedliche Nierenregionen etablieren. Rehydrieren Sie sowohl die ATP- als auch die Nullsensoren, indem Sie ihre Spitzen mindestens 10 Minuten lang in separate Rehydratationskammern mit Puffer A bei zwei bis acht Grad Celsius geben.Schalten Sie das Dual-Channel-POTENTIA-Stat ein und starten Sie die Aufzeichnungssoftware. Stellen Sie das Programm so ein, dass die Daten im A-S-C-I-I-Code gespeichert werden, und setzen Sie die Sensorenpolarität auf anodisch positiv. Bereiten Sie eine Kalibrierkammer mit drei Milliliter Puffer vor und senken Sie die Referenzelektrode in die Kammer ab.Entfernen Sie jeden Sensor aus der Rehydratisierungslösung. Befestigen Sie sie an Mikromanipulatoren und führen Sie sie in die Kalibrierkammerlösung ein. Führen Sie alle Kalibrierungen und Untersuchungen in einem Faradayschen Käfig auf einem hochleistungsfähigen Laborlufttisch durch, um Signalrauschen zu reduzieren.Während der Pyrometrie-Aufnahmen führen Sie eine zyklische Voltammetrie an den ex vivo-Sensoren in der Kalibrierungskammer durch. Durch das Zyklieren der Sensoren von minus 500 Millivolt auf plus 500 Millivolt mit einer Geschwindigkeit von 100 Millivolt pro Sekunde über 10 Zyklen wird die Empfindlichkeit der Sensoren erheblich verbessert. Polarisiert anschließend die Sensoren auf plus 600 Millivolt.Nach dem letzten Zyklus wird der Sensorstrom auf einen asimtotischen Wert abklingen. Eine stabile Messung wird nach mindestens fünf Minuten erreicht. Notieren Sie den Nullwert und geben Sie nacheinander definierte Mengen einer TP-Lösung in die Kammer ein, um eine Kalibrierungsgerade zu erzeugen, die den gewünschten Nachweisbereich des ATP-Sensors abdeckt.Die ATP-Lösung erzeugt zunächst einen scharfen Peak im Sensorsignal, dem ein Abfall folgt, während sich das ATP gleichmäßig in der Kammer verteilt. Die Signalwerte sollten aufgezeichnet werden, sobald das Signalniveau stabil ist. Geben Sie für jede ATP-Zugabe drei Mikroliter, die von einer Stammlösung mit zwei Milligramm pro Milliliter stammen, hinzu, um die Spezifität des ATP-Sensors zu testen.Der durch eine TP-Anwendung erzeugte Strom sollte auf null abfallen, wenn nacheinander definierte Mengen einer Wasserstoffperoxidlösung in die Kammer gegeben werden, um eine Kalibrierungsgerade zu erzeugen, die einen Nachweisbereich umfasst. Die Werte des Nullsensorsignals sollten aufgezeichnet werden, sobald sich das Signal stabilisiert hat. Bei jeder Zugabe von Wasserstoffperoxid sollten drei Mikroliter Rinderlack aus einer Stammlösung von zwei Milligramm pro Milliliter hinzugefügt werden, um die Spezifität des Nullsensors zu testen. Der durch die Zugabe von Wasserstoffperoxid erzeugte Strom sollte bei ex vivo-Studien auf den Nullwert absinken.Rapa-Ligatur um die Arteria coeliaca und die Arteria mesenterica superior sowie um die Aorta abdominalis oberhalb dieser Arterien. Ligaturen Sie jedoch nicht erneut zwei Ligaturen um die Aorta abdominalis unterhalb der Nierenarterie. Ligaturen Sie die Aorta abdominalis distal unterhalb der Nierenarterie.Klemmen Sie die Aorta mindestens einen Zentimeter oberhalb der Ligatur und unterhalb der Nierenarterie. Katheterisieren Sie die Bauchaorta mit Polyäthylen-Schlauch zwischen der untersten Ligatur und der Klemme. Sichern Sie den Katheter mit der zweiten Aorta-Ligatur. Entfernen Sie die Klemme und ligieren Sie die Arteria mesenterica und die Arteria coeliaca sowie die Aorta oberhalb dieser Arterien. Perfundieren Sie die Niere sechs Minuten lang mit Hank's Balanced Salt Solution bei Raumtemperatur mit einer Geschwindigkeit von sechs Millilitern pro Minute, bis die Niere vollständig entfärbt ist. Zusätzlich kann die Vena renalis katheterisiert werden, um den Ausfluss von Flüssigkeit aufzufangen.Entfernen Sie vorsichtig mit einer chirurgischen Pinzette die Nierenkapsel, die für die Sensoreinführung notwendig ist. Entfernen Sie die Niere einschließlich des mit dem Katheter verbundenen Aortenabschnitts. Legen Sie die Niere in eine dreimilliliter-Petrischale, die mit Badlösung gefüllt ist.Perfusieren Sie die Niere über die kani­lu­lierte Aorta mit einer Badlösung mit einer konstanten Geschwindigkeit von 650 Mikrolitern pro Minute. Sichern Sie die Niere mit Gummibändern, die über der Niere befestigt und mit Nadeln an der silikonbeschichteten Schale fixiert sind. Platzieren Sie die Referenzelektrode nahe der Niere in der Petrischale, wobei die Spitzen in der Badlösung eingetaucht sind.Positionieren Sie die Mikromanipulatoren für eine schnelle Einführung der Sensoren in die Niere. Alternativ verwenden Sie eine Dummy-Sonde, die an jeden Mikromanipulator angebracht ist, um die gewünschte Platzierung der Sensoren für jeden Sensor zu erreichen, die nicht länger als 20 Sekunden dauern sollte. Entfernen Sie den Sensor aus der Wiederbefeuchtungskammer, befestigen Sie ihn am Mikromanipulator und führen Sie den Sensor in die Badlösung der Schale ein.Wenn eine längere Luftexposition erwartet wird, tauchen Sie den Sensor für jede Exposition kurz in eine Glycerinlösung ein. Polarisiert die Sensoren mit dem Potentiostaten auf plus 600 Millivolt und lassen Sie den Strom bis zur Sättigung ansteigen. Führen Sie jeden Sensor bis zur gleichen Tiefe in die Niere ein.Führen Sie die Datenanalyse gemäß dem Textprotokoll durch. Das Design des enzymatischen Mikroelektroden-Biosensors ermöglicht die Echtzeitdetektion von Analyten und ganzen Nieren, um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Genaue Kalibrierungen vor und nach dem Versuch sind entscheidend.Diese Abbildung zeigt eine repräsentative Aufzeichnung des Signals, das von den X pvo-, TP- und Nullsensoren während einer TP-Sensor-Kalibrierung erzeugt wird. Das Kalibrierungsverfahren liefert eine lineare Anpassung, die zur Berechnung der dynamischen Änderungen eines TP verwendet wird. Der Nullsensor wird durch Zugabe bekannter Wasserstoffperoxid-Konzentrationen zur Badlösung kalibriert, und die asim- zu am-Parametern werden aufgezeichnet. Die Zugabe von Katalysatoren zur Badlösung führt zu einem schnellen Stromabfall.Der In-vivo-Sensor erzeugt eine ähnliche Kurve, detektiert jedoch reduktive statt oxidativer Ströme und daher ist der Strom negativ. Auch die Kalibrierung ergibt eine lineare Anpassung im Bereich von 0,3 bis 80 Mikromolar. Hier wird die Spezifität des In-vivo-Sensors für ein TP gegenüber anderen Purinprodukten gezeigt. In dieser Abbildung dargestellt sind Angiotensin-zwei-induzierte Änderungen der endogenen interstitiellen Wasserstoffperoxidkonzentration in frisch isolierten Nieren von salzresistenten und salzempfindlichen Ratten.Angiotensin zwei induziert eine akute Freisetzung von Wasserstoffperoxid aus beiden Nieren. Die maximalen Amplituden waren jedoch in den Nieren von salzempfindlichen Ratten signifikant erhöht, insbesondere bei einer kochsalzreichen Ernährung. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist zu beachten, dass die Sensorspitze und die Oberfläche der Nierenrinde empfindlich sind und eine Beschädigung beider die Genauigkeit der Aufzeichnungen beeinträchtigt.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man endogene Substanzen und ganze Organe wie die Niere misst. Sie werden außerdem in der Lage sein, Kalibrierungen sowie die chirurgischen Verfahren, die für erfolgreiche Messungen erforderlich sind, genau durchzuführen. Wir haben diese Methode angewandt, um TP- und Wasserstoffperoxid-Basalspiegel sowie deren Freisetzung in der Niere zu untersuchen.Allerdings könnte derselbe Ansatz zur Bestimmung der Konzentrationen von Adenosin, Glutamat, Glukose und einigen anderen Substanzen verwendet werden, wenn entsprechende Sensoren eingesetzt werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die Wirkungen der Aktivierung der Proteinkinase C (PKC) Isozyme auf die mitochondriale Atmung und Funktionen mit oxidativen Phosphorylierung und auf Lebensfähigkeit der Zellen assoziiert werden beschrieben. Der Ansatz paßt adenoviralen Technik, um selektiv überexprimieren PKC-Isozyme in primären Zellkultur und einer Vielzahl von Assays, um mitochondriale Funktionen und Energiezustand der Zelle zu bestimmen.

Beurteilung der mitochondrialen Funktionen und Zellviabilität in Renal Überexpression Protein Kinase C-Isoenzyme

Wir beschreiben eine Methode zur Quantifizierung der Aktivität von K+-gegentransportierenden P-Typ-ATPasen durch heterologe Expression der Enzyme in Xenopus-Eizellen und Messung der Rb+- oder Li+-Aufnahme in einzelne Zellen mittels Atomabsorptionsspektrophotometrie. Die Methode ist eine empfindliche und sichere Alternative zu Radioisotopenflussexperimenten, die komplexe kinetische Studien ermöglicht.

Mess-Cation Transport von Na, K-und H, K-ATPase in<em&gt; Xenopus</em&gt; Oozyten mittels Atomabsorptionsspektrometrie: Eine Alternative zu Radioisotopen Assays

Hier beschreiben wir biochemische Assays, die zur Charakterisierung von ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Enzymen verwendet werden können, um 1) ATP-abhängiges Nukleosomengleiten zu katalysieren, 2) mit Nukleosomensubstraten zu interagieren und 3) ATP auf nukleosomen- oder DNA-abhängige Weise zu hydrolysieren.

Biochemischen Assays zur Analyse von Aktivitäten von ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Enzyme

Wir beschreiben ein grundlegendes Protokoll zur Quantifizierung der in vitro ATPase-Aktivität. Dieses Protokoll kann basierend auf dem Aktivitätsgrad und den Anforderungen an eine bestimmte gereinigte ATPase optimiert werden.

Messung<em&gt; In Vitro</em&gt; ATPase Aktivität für die enzymatische Charakterisierung

Proteinkinasen sind hochentwickelte Signalisierungsenzyme und Gerüste, die für die inter- und intrazelluläre Signaltransduktion kritisch sind. Wir stellen ein Protokoll zur Messung der Kinaseaktivität durch die Verwendung von radioaktiv markiertem Adenosintriphosphat ([γ- 32 P] ATP) vor, ein zuverlässiges Verfahren zur Erleichterung der zellulären Signalregulation.

Test der Proteinkinase-Aktivität mit radioaktiv markiertem ATP

Proteasen sind streng regulierte Enzyme grundlegende biologische Prozesse und Dysregulated Protease-Aktivität Laufwerke Fortschreiten von komplexen Krankheiten wie Krebs beteiligt. Diese Methode soll Nanosensoren geschaffen, die Protease-Aktivität in Vivo durch die Herstellung einer Spaltung Signal, das vom Host Urin nachweisbar ist und Krankheit diskriminiert messen.

Nanosensoren Protease-Aktivität In Vivo für die nicht-invasive Diagnostik zu erkennen

Wir charakterisierten ein neues Kinase-Protein mit robusten biochemischen Ansätzen: Western Blot-Analyse mit einem speziellen Antikörper an verschiedenen Zelllinien und Geweben, Wechselwirkungen durch Coimmunozipitungsexperimente, Kinase-Aktivität, die von Western Blot mit einem phosphospezifischen Antikörper und durch die ATP-Kennzeichnung von32P.

Charakterisierung auf molekularer Ebene mit robusten biochemischen Ansätzen eines neuen Kinase-Proteins

Ein Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NADH)-gekoppelter ATPase-Assay wurde an das semihohe Durchsatzscreening von kleinen Molekül-Myosininhibitoren angepasst. Dieser kinetische Assay wird in einem 384-Well-Mikroplattenformat mit einem Gesamtreaktionsvolumen von nur 20 l pro Brunnen ausgeführt. Die Plattform sollte für praktisch jedes ADP-produzierende Enzym gelten.

Eine semi-High-Throughput-Anpassung des NADH-gekoppelten ATPase-Assays zum Screening kleiner Molekülinhibitoren

Wir beschreiben ein Protokoll zur zelltypspezifischen Expression des genetisch codierten FRET-basierten Sensors ATeam1.03YEMK in organotypischen Scheibenkulturen des Mausvorhirns. Darüber hinaus zeigen wir, wie dieser Sensor für die dynamische Bildgebung von zellulären ATP-Spiegeln in Neuronen und Astrozyten verwendet wird.

Bildgebung von intrazellulärem ATP in organotypischen Gewebescheiben des Maushirns mit dem FRET-basierten Sensor ATeam1.03YEMK

Die Protease Fluorescent Detection Kit ist für die Messung der Protease-Aktivität mit Fluorometrie konzipiert. Es eignet sich auch zum Nachweis von Spuren von Protease-Kontamination. Die Methode basiert auf der proteolytischen hydroysis von einer proprietären Rezeptur eines FITC-markiertem Casein Substrat.

Die Nutzung der Protease Fluorescent Detection Kit für Protease-Aktivität zu bestimmen

Lernen Sie die Verwendung enzymatischer Biosensoren zur Echtzeitmessung von ATP und Wasserstoffperoxid in Nierengewebe. Diese Methode ermöglicht präzise Untersuchungen der extrazellulären Zellsignalgebung in vivo und ex vivo.

Verwendung enzymatischer Biosensoren auf endogenes ATP oder H Quantifizieren

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