Zerkleinerte Gewebe in komprimierter Collagen: Ein zellhaltigen Biotransplant für einstufige rekonstruktive Reparatur

Das übergeordnete Ziel des folgenden Verfahrens besteht darin, autologes Gewebe zur Vergrößerung während einer rekonstruktiven Operation zu transplantieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Biopsie aus dem betreffenden Gewebe entnommen wird. Anschließend wird die Biopsie zerkleinert und ein plastisch komprimierter Polycaprolacton- oder PCL-Kollagen-Autotransplantat wird hergestellt.

Das PCL und das autologe zerkleinerte Gewebe werden anschließend integriert, um das 3D-Gerüst zu erzeugen. Wir haben eine Expansionsrate von eins zu sechs verwendet. Danach wird das Gerüst wieder in den Probanden transplantiert.

Letztlich kann die Regeneration des autotransplantierten Gewebes durch eine immunhistochemische Analyse der Proliferation und Reorganisation der Zellen innerhalb der Gerüste und der zerkleinerten Gewebepartikel beurteilt werden. Diese Methode wird an einem Tiermodell sowie an Haut und Urothel demonstriert. Die Bedeutung dieser Technik erstreckt sich auf die Behandlung stark missgebildeter Gewebe oder nach Traumata, insbesondere dort, wo ein schwerer Gewebedefekt für die chirurgische Reparatur vorliegt.

Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden, wie der In-vitro-Kultivierung, liegt darin, dass sie als einstufiger chirurgischer Eingriff durchgeführt werden kann. Eine visuelle Darstellung dieser Methode ist entscheidend, da die Schritte von der Gewinnung des Gewebes bis zur Transplantation unter sterilen Bedingungen erfolgen müssen. Um eine Schweine-Blasenbiopsieprobe zu gewinnen, fassen Sie zunächst die Blase mit der Pinzette und verwenden ein sterilisiertes Maßband, um die Abmessungen des Gewebes zu bestimmen.

Verwenden Sie anschließend einen sterilisierten Stift, um eine ellipsenförmige Biopsie von zwei mal einem Zentimeter zu markieren, wobei eine Expansionsrate von eins zu sechs angestrebt werden soll. Entfernen Sie das markierte Gewebe dann mit einem Skalpell und geben Sie die Blasenbiopsie in DMEM unter sterilen Bedingungen. Um eine Hautbiopsie zu gewinnen, entnehmen Sie mit einem Dermatom eine partiell dünne Probe von 0,3 Millimeter Dicke.

Danach das Gewebe in DMEM geben und die Wundfläche mit einem Verband abdecken. Anschließend die Blasenbiopsie zweimal in DMEM waschen und das Gewebe auf eine sterilisierte Präparationsplatte überführen, wobei die Mukosa nach oben zeigen soll. Mithilfe von Präparationsnadeln eine Seite der Probe auf der Platte fixieren und feine Scheren sowie Pinzetten verwenden, um das Mukosagewebe vom Detrusormuskel zu trennen.

Danach ein Zerkleinerungsgerät auf die Mukosa setzen und vertikal und horizontal von einem Ende des Gewebes zum anderen führen, um Gewebestücke von 0,8 mal 0,8 Millimeter zu erhalten. Beachten Sie, dass das Zerkleinerungsgerät beim Überfahren des Gewebes darauf gedrückt werden muss. Um ein plastisch komprimiertes Kollagen-Autotransplantat herzustellen, zunächst eine normale Natronlauge tropfenweise in 10X DMEM, ergänzt mit Kollagen Typ I, geben, bis das Medium von intensivem Gelb nach Rosa wechselt.

Nach Bestätigung eines pH-Werts von 7,4 bis 8 vorsichtig zwei Milliliter DMEM in die Lösung einmischen. Anschließend etwa zwei Milliliter Kollagen in eine Vertiefung einer 20x30x10 Millimeter großen rechteckigen Stahlform geben und das Kollagen zehn Minuten lang inkubieren. Sobald das Kollagen erstarrt ist, das geeignete Volumen des PCL-Biomaterials auf das gelierte Kollagen auftragen und die verbleibenden sechs Milliliter Kollagen darauf gießen.

Stellen Sie die Form erneut für weitere 20 Minuten in den Inkubator. Danach stapeln Sie eine dicke Schicht Mullbinden auf einer sterilen Oberfläche. Legen Sie dann ein 400 µm dickes Edelstahlgitter auf die Mullbinden, darauf ein 110 µm dickes Nylonnetz.

Überführen Sie das Kollagengel vorsichtig auf den Nylon-Mesh und entfernen Sie behutsam die rechteckige Stahlform. Überführen Sie das zerkleinerte Gewebe auf das Kollagen. Hier streben wir eine Expansion im Verhältnis eins zu sechs an.

Danach eine neue Schicht aus Nylonnetz auf das Kollagen-Gel und das Gewebe legen, gefolgt von einem zweiten Stahlnetz auf dem Nylonnetz und einer Belastungsplatte mit einem Gewicht von mindestens 120 Gramm. Nach fünf Minuten das Gewicht, die Stahlnetze und das Nylon vom Autotransplantat entfernen. Für die In-vitro-Kultur des Autotransplantats wird das verdünnte Konstrukt zunächst in Stücke geschnitten, die klein genug sind, um in 12-Loch-Platten zu passen.

Anschießend je ein Milliliter Keratinozyten-Medium in jede Mulde geben und die Gewebe drei bis sechs Wochen lang inkubieren. Um eine Autotransplantation mit zerkleinerte Blasenschleimhaut auf eine Schweineblase durchzuführen, den Transplantat mit DMEM befeuchten. Danach den Konstrukt mit feinen fortlaufenden Monofile-Nähten an das gesunde Gewebe annähen.

Überprüfen Sie, ob die Transplantatnaht dicht ist, indem Sie die Harnblase über den verbleibenden Harnkatheter mit Kochsalzlösung füllen. Um ein Autotransplantat mit zerkleinertem epidermalen Hautgewebe auf eine vollständig durch die Haut reichende Wunde zu transplantieren, befeuchten Sie das Transplantat mit DMEM. Anschließend befestigen Sie die Konstruktion mit Einzelnahtfäden an den Ecken und in der Mitte des Autotransplantats am Wundgrund der vollständig durch die Haut reichenden Wunde.

Schließlich sollte die Wunde mit einem plastischen Verband abgedeckt werden, um sie feucht zu halten. Wie in dieser Aufnahme einer zerkleinerten autologen Hauttransplantation zu sehen ist, kann das zusammengesetzte Biograft Greifen, Nähen und chirurgische Handhabung aushalten. Die Immunhistochemie zu verschiedenen Zeitpunkten während der In-vitro-Kultur zeigt, dass die Zellen proliferieren, wandern und sich zu einem kontinuierlichen Epithel mit einer für das Zellphänotyp typischen Mikroarchitektur umorganisieren.

Beispielsweise ist die Zellschicht auf der Oberfläche des Hautautotransplantats nach zwei Wochen etwa zwei Schichten dick. Rechts ist das Harnblasenepithel nach der gleichen Kultivierungszeit etwa acht Schichten dick. Nach fünf bis sechs Wochen ist das kontinuierliche Epithel sowohl bei zerkleinertem Hautepithel als auch bei zerkleinerten Harnblasenschleimhaut-Autotransplantaten ungefähr acht bis zehn Zellschichten dick.

Im Vergleich zur Gewebeexpansion in vitro ist diese Methode schneller, weniger arbeitsintensiv und erfordert keine anspruchsvollen Laborressourcen. Außerdem sind alle Bestandteile FDA-zugelassen, was deren Verwendung im standardmäßigen chirurgischen Umfeld ermöglicht. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, das Gel, die Biotransplantate und autologe Gewebe unter sterilen Bedingungen vorzubereiten.

Mit dieser Methode und anderen Verfahren wie der In-vitro-Kultur der Zellen können zusätzliche Fragen zur Zellproliferation und -differenzierung beantwortet werden. Nach ihrer Entwicklung könnte diese Technik den Weg für Forscher im Bereich der regenerativen Medizin ebnen. Auf diese Weise könnten wir schwere Fehlbildungen der Haut oder des Harnsystems mit autologen, gewebetechnisch hergestellten Transplantaten behandeln.