Ein organ High Throughput-System zur Charakterisierung von Arzneimittelempfindlichkeit von Primary Multiple Myelomzellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Chemosensitivität von primären Multiplen Myelom-Zellen gegenüber einem Panel chemotherapeutischer Wirkstoffe zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Multiple-Myelom-Zellen, die aus frischem Knochenmarkaspirat isoliert wurden, mit Präkultur-Stroma aus Patienten und Kollagen vermischt werden. Im zweiten Schritt wird die Zellmischung in eine Mehrlochplatte eingesät.

Die Zellen werden anschließend mit den gewünschten chemotherapeutischen Wirkstoffen behandelt, und die Platte wird in den Inkubator eines motorisierten Mikroskoptisches überführt, um die Zellen über einen Zeitraum von 96 Stunden nacheinander abzubilden. Letztendlich kann ein Algorithmus zur digitalen Bildanalyse verwendet werden, um Überlebenskurven für jeden Wirkstoff und jede Konzentration zu erstellen. Die wichtigsten Vorteile dieser Methode im Vergleich zu herkömmlichen Endpunkt-Überlebensassays bestehen darin, dass mehrere chemotherapeutische Wirkstoffe an einer einzigen Patientenprobe getestet werden können und dass die Vitalität der Patientenzellen über mehrere Tage hinweg kontinuierlich gemessen werden kann, ohne dass die Zellen vom Stromagewebe oder der Matrix getrennt werden müssen.

Die Implikationen dieser Technik reichen bis hin zur Therapie hämatopoetischer Tumore, da sie theoretisch zur Vorhersage der klinischen Ansprechrate auf bestimmte Chemotherapieregime verwendet werden kann. Die Idee zu diesem Protokoll entstand, als uns bewusst wurde, dass der Austausch unserer ursprünglichen mikrofluidischen Objektträger durch Mehrlochplatten die Kosten und die zur Durchführung des Experiments benötigte Zeit erheblich reduzieren würde. Um primäre Multiplen Myelome vorzubereiten, beginnen Sie mit der Ko-Kultur aus Knochenmark-abstammenden mesenchymalen Stromazellen unter Verwendung eines Mehrkanalpipettiersystems, indem Sie die Zellen in RPMI 1640 auf die sechsfache Endkonzentration einsetzen.

Als Nächstes 50 µL jedes Zelltyps mit frisch hergestelltem Typ-I-Kollagen auf ein Endvolumen von 300 µL vermischen. Anschließend mit einer Mehrkanalpipette acht µL der Zell-Matrix-Mischung in die Mitte jedes Wells einer 384-Loch-Platte manuell pipettieren und die Platte zentrifugieren, um alle Zellen in derselben Fokusebene zu konzentrieren.

Nach dem Schleudern die Platten eine Stunde lang unter Zellkulturbedingungen inkubieren, um die Polymerisation des Gels zu ermöglichen. Anschließend 80 Mikroliter ergänztes Wachstumsmedium in jedes Loch geben und die Platte über Nacht inkubieren, damit das Stromagewebe am Boden der Platte anhaften kann. Um Ko-Kulturen aus multiplem Myelom und Stromagewebe mit einem robotischen Pipettierer vorzubereiten, suspendieren Sie zunächst 300 Mikroliter CD138-positiver multipel-myelomatischer Zellen und 300 Mikroliter stromaler Zellen in RPMI 1640 Medium mit der sechsfachen endgültigen gewünschten Dichte, wie gerade gezeigt.

Danach beide Zelltypen in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen, das mit CD138-positiv beschriftet ist, zusammenmischen und das Röhrchen in einen Zellkultur-Inkubator stellen. Anschließend 60 µL der entsprechenden multiplen Myelom-Zelllinie und 60 µL der stromalen Zellen in RPMI 1640-Medium bei der sechsfachen endgültigen gewünschten Dichte suspendieren und beide Zelltypen in einem zweiten 1,5-Milliliter-Röhrchen, das mit Zelllinie beschriftet ist, zusammenmischen und ebenfalls bei 37 °C inkubieren. Auf dem Roboterpipettierer die Zellansäme-Script-Datei laden.

Danach eine 200-Mikroliter-Pipettenspitzenbox in Station A, eine Mikrotiterplatte in Station B und eine sterile 3-84-Loch-Platte in Station E des Roboters platzieren. Anschließend das CD138-positive Zellgemisch mit dem Röhrchen frisch zubereiteten CD138-Vormischmedium vermengen und 1,5 Milliliter der resultierenden Zellsuspension in die Vertiefung Nummer eins der Mikrotiterplatte übertragen.

Stellen Sie den Rest der Zellen auf Eis und starten Sie das Programm. Der Roboter wird die ersten 176 Vertiefungen der 384-Loch-Platte beimpfen und dann anhalten. Nutzen Sie diese Zeit, um die verbleibenden CD138-positiven Zellen in Vertiefung zwei der Mikrotiterplatte zu überführen, und setzen Sie das Programm danach fort.

Der Roboter wird die verbleibenden 144 Vertiefungen der Platte erfassen und erneut anhalten. Mischen Sie nun die Zellen aus der Zelllinienröhre mit einer frisch zubereiteten Zelllinien-Vormischung und übertragen Sie das Gemisch in Vertiefung Nummer drei der Mikrotiterplatte. Setzen Sie dann das Programm erneut fort, sodass der Roboter die verbleibenden 64 Vertiefungen der 3 × 84-Loch-Platte beimpfen kann.

Wenn das letzte Loch beimpft wurde, zentrifugieren Sie die Zellen und überführen Sie die Koinkubationen in den Zellkulturtrockenschrank zur Kollagenpolymerisation. Nach einer Stunde laden Sie das Medien-Schicht-Skript auf den Roboter und stellen eine Pipettenspitzenbox mit 120 Mikrolitern in Station A, ein Reagenzreservoir mit 31 Millilitern RPMI 1640 Medium, ergänzt mit fetalem Kälberserum, Patientenplasma und Antibiotika, in Station B und die CED 3 84-Loch-Platte in Station E. Führen Sie dann das Programm aus. Der Roboter überträgt 81 Mikroliter des supplementierten Mediums in jedes Loch.

Wenn der Roboter fertig ist, bringen Sie die Zellen zurück in den Inkubator, um der Matrix zu ermöglichen, über Nacht an dem Substrat zu haften. Um die ausgesäten Zellen mit dem gewünschten Wirkstoff zu behandeln, laden Sie zunächst das Medien-Schicht-Wirkstoffplatten-Skript in der Benutzeroberfläche des robotischen Pipettiersystems. Danach platzieren Sie eine Pipettenspitzenbox mit 120 Mikrolitern in Station A, ein Reservoir mit 21 Millilitern RPMI 1640, ergänzt mit FPS-Patientenplasma und Antibiotika, in Station B und eine leere 384-Well-Platte in Station E; führen Sie anschließend das Programm aus, woraufhin das robotische Pipettiersystem 30 Mikroliter Medium in alle Vertiefungen gibt.

Die 3 84er-Platte. Anschließend gemäß der Vorlage 200 Mikroliter Wirkstoff bei 20-facher maximaler Konzentration in jedes Loch einer Mikrotiterplatte zum Kontrollansatz geben. Dann Medium zugeben, ergänzt durch FPS-Patientenplasma und Antibiotika.

Danach eine 120-Mikroliter-Pipettenspitzenbox in Station A, die Mikrotiterplatte mit Wirkstoffen in Station B und eine 384-Well-Platte mit Medium in Station C platzieren und das Wirkstoffplatten-Programm laden. Der robotische Pipettierer erzeugt eine serielle Verdünnung im Verhältnis 1:3, wie in dieser Abbildung dargestellt. Anschließend eine neue 120-Mikroliter-Pipettenspitzenbox in Station A, die 384-Well-Platte mit verdünntem Wirkstoff in Station B und die 384-Well-Platte mit sezernierten Zellen in Station C platzieren und das Wirkstoffzugabe-Programm starten.

Der robotische Pipettierer überträgt acht Mikroliter Wirkstoff aus jedem Loch der Wirkstoffplatte auf das entsprechende Loch der Zellplatte. Nachdem das letzte Loch behandelt wurde, bringen Sie die Zellplatte unverzüglich in den Inkubator des Digitalmikroskops. Um die Zellen abzubilden, reinigen Sie anschließend das Innere des Tisch-Inkubators mit einem mit Ethanol angefeuchteten Wischtuch und tauschen vorsichtig den Deckel der Platte gegen den Deckel des Inkubators aus.

Als Nächstes folgen Sie den Softwareanweisungen, um die Landmarken für die Bereiche von Interesse hinzuzufügen, die während des Experiments nacheinander abgebildet werden sollen. Schließlich stellen Sie mit einem Objektiv mit 5- oder 10-facher Vergrößerung die Zellen scharf, bis die multiplen Myelomzellen als helle Scheiben, umgeben von einem dunklen Ring, erscheinen und die stromalen Zellen kaum sichtbar sind. In diesem Experiment wurden die lebenden Multiplen Myelomzellen am Ende des Experiments bei der höchsten Wirkstoffkonzentration, zu der Zeit, als alle Multiplen Myelomzellen abgestorben waren, künstlich grün eingefärbt, wobei praktisch kein grünes Signal in den stromalen Zellen und den humanen Nabelvenenendothelzellen beobachtet wurde.

Die Robotersoftware wurde anschließend verwendet, um den schrittweisen Verlust der Vitalität zu verfolgen, der durch die Exposition gegenüber den verschiedenen Wirkstoffkonzentrationen im Laufe der Zeit verursacht wird. Vor Beginn des Bildaufnahme-Prozesses ist es wichtig, alle ansaatgefüllten Vertiefungen sorgfältig zu beobachten, da Artefakte die Bildanalyse-Software irreführen und zu falschen Ergebnissen führen können. Beispielsweise zeigt hier das Ergebnis eine übermäßige Dichte an Stromazellen oder zu viel Zeit zwischen der Trypsinierung und der Ansäzung, was zur Bildung von Zellagglomerationen führt, wie auf diesem Bild zu sehen ist.

Wenn die Zelllinien in zu hoher Dichte ausgesät werden, bilden sie Kolonien, während sie sich replizieren, wodurch die Genauigkeit des Algorithmus zur digitalen Bildanalyse verringert wird, da es zunehmend schwierig wird, eine Zelle von der anderen zu unterscheiden. Zudem wurden zu wenige multipel myeloide Zellen ausgesät, wenn die Anzahl der aus dem Knochenmarkaspirat gewonnenen multipel myeloiden Zellen unter 500.000 liegt. Es ist notwendig, das Totvolumen der verwendeten Röhre vor dem Aussäen der Zellen zu bestimmen und dieses Volumen in die Verdünnungsberechnungen einzubeziehen. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb von zwei bis drei Stunden durchgeführt werden.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, das vorgemischte Medium mit dem Kollagen auf Eis zu halten, um eine Polymerisation zu verhindern, bevor die Zellen bereit sind. Es hat auch dazu beigetragen, zu untersuchen, wie die Heterogenität der Chemosensitivität der Tumorlast die Tiefe und Dauer der Patientenantwort bestimmen kann.