Name: Biomembran Fabrication durch das Lösungsmittel-unterstützten Lipiddoppelschicht (SALB) Methode (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Lernen Sie die SALB-Methode zur Herstellung unterstützter Lipiddoppelschichten auf Festkörpersubstraten. Diese vereinfachte Technik ermöglicht die Untersuchung von Membranproteinen für Arzneimittelforschung und molekulare Diagnostik.

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Die Autoren möchten sich Unterstützung von der National Research Foundation (NRF -NRFF2011-01 und NRF2015NRF-POC0001-19), der National Medical Research Council (NMRC / CBRG / 0005/2012) und Nanyang Technological University, um NJC bestätigen

1. Bildung der unterstützten Lipiddoppelschicht auf einer hydrophilen festen Träger <ol><li> Vorbereitung Lipidstammlösungen von 10 mg / ml 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC) und 1 mg / ml 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine- N - (Lissamine Rhodamin B sulfonyl) (Rh-PE) durch Lösen der jeweiligen Lipidpulver (entsprechend vorher mit einem analytischen Massenbilanz) in Isopropanol-Lösung eingewogen. </li><li> Und mischen Sie die Stammlösungen in Isopropanol, um das gewünschte Lipidgemisch in der letzten Konzentration herzustellen. Für die Fluoreszenzmikroskopie und FRAP sollte 0,5 Gew% Rh-PE in der Lipidmischung enthalten sein. </li><li> Spritzen Sie das Lipidgemisch in Isopropanol in den mikrofluidischen Kanal, bis sie gefüllt ist. </li><li> Inkubieren der Lipidmischung auf der Glasoberfläche für etwa 10 min. </li><li> Allmählich die Lipid-Lösung mit Wasser oder Pufferlösung unter Verwendung einer peristaltischen Pumpe bei einer sehr niedrigen Strömungsgeschwindigkeit(10-50 &amp; mgr; l / min). Alternativ, ersetzen Sie das Lipidgemisch durch wiederholtes Pipettieren. </li><li> Spülen Sie den Kanal gründlich mit überschüssigem Puffer, um die restliche Isopropanol zu entfernen. </li></ol> 2. Bildung von Cholesterin-angereicherten Unterstützte Membranen Hinweis: Die feste Oberfläche (SiO 2) unterstützt Vesikelfusion, aber die Membranzusammensetzung (hoher Cholesterinspiegel) hemmt Vesikelfusion weil Cholesterin angereicherte Vesikel haben eine hohe Biegesteifigkeit 30. <ol><li> Wird eine Stammlösung, die 10 mg / ml DOPC Lipid, 10 mg / ml Cholesterin und 1 mg / ml Rh-PE, indem zunächst die jeweiligen Pulver in Isopropanol. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1,2 bis 1,6 unter Verwendung der Stammlösungen in Schritt 2.1 vorbereitet. </li></ol> 3. Membranfluidität Assay <ol><li> Tauchen Sie die Objektträger in Natriumdodecylsulfat (SDS) -Lösung (1%) für 10 Minuten. </li><li> Gründlich waschen Sie die Folien mit VE-Wasser und spülen with Ethanol. </li><li> Föhnen Dias mit einem leichten Stickstoffstrom. </li><li> Setzen Sie die Folien an Sauerstoffplasma für 30 s bei maximaler HF-Leistung in der Sauerstoffplasmakammer. </li><li> Entfernen Sie die Schutzbeschichtung aus dem bodenlosen kommerziellen Mikrofluidkammer (1A) mit einer Pinzette und befestigen Sie den Objektträger auf der Klebeseite der Kammer (1B). </li><li> Montieren Sie die Anschlüsse und Schläuche in die Ein- und Austrittspositionen der Kammer und legen Sie den mikrofluidischen Kanal auf dem Mikroskoptisch (Abbildung 1c). </li><li> Bilden einen fluoreszenzmarkierten unterstützten Lipiddoppelschicht in der mikrofluidischen Kanal [Wiederholen Sie Schritt 1 mit der gewünschten Lipidzusammensetzung (beispielsweise 0,5 mg / ml DOPC), einschließlich 0,5 Gew% Rh-PE in einem organischen Lösungsmittel]. </li><li> Suchen Sie den Doppelschicht-Ebene mit einem 60X Ölimmersionsobjektiv (NA 1,49), um Bilder zu erfassen. </li><li> Nehmen Sie zwei Vorbleichbad Bilder dann Foto-Bleichen 301; m breiten kreisförmigen Fleck mit einem 532 nm, 100 mW Laserstrahls. Vor dem Bleichen, Aufwärmen der Laser, bis seine Intensität stabil geworden ist. Unmittelbar nach Photobleaching, erfassen eine Reihe von Bildern alle 1 Sek 2 min, um die Erholung der Fluoreszenzintensität bei den gebleichten Stelle folgen. </li></ol> 4. Cholesterin Quantification Assay <ol><li> Aussetzen Siliciumdioxid beschichtete Quarzkristall-Sensorchip, um Sauerstoffplasma für 30 s bei maximaler HF-Leistung in der Sauerstoffplasmakammer. Entfernen Sie den Chip aus der Kammer und sofort montieren Sie den Chip in der Messkammer. </li><li> Vor dem Experiment wurde zunächst die Frequenz und die Verlustleistung des Sensorchips in der Luft, um eine ordnungsgemäße Montage sicherzustellen, zu erwerben. <ol><li> Für die kommerzielle Q-Sense E1 oder E4 QCM-D Gerät, führen Sie den Q-Soft-Software-Programm und klicken Sie auf &quot;Erwerb&quot; und wählen Sie &quot;Setup Measurement&quot;. </li><li> In dem neuen Fenster, das angezeigt wird, überprüfen Sie die 3, 5, 7, 9, 11 und 13 Obertöne und klicken Sie dann auf Find and Run, um die Resonanzspektren zu überprüfen. Stellen Sie die Temperatur auf 24 ° C. Wenn eine oder mehrere Resonanzfrequenzen nicht mit den erwarteten Werten übereinstimmen, überprüfen Sie die Chip-Montage und wieder führen Sie diesen Schritt, bis eine Einigung erzielt wird. </li></ol></li><li> Beginnen die peristaltische Pumpe und Durchflusspufferlösung (10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,5) in die Messkammer mit einer Fließgeschwindigkeit von 100 ul / min. </li><li> In der Software-Programm, klicken Sie auf &quot;Erwerb&quot; und wählen Sie &quot;Neu starten Measurement&quot;, um die Resonanzfrequenz und Energieverlust Signale aufzuzeichnen. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis eine stabile Basislinie für die Frequenz und Verlustverschiebungen erhalten. Anmerkung: Für die Schritte nachfolgend erfolgt eine zusätzliche Frequenz und Dissipation Verschiebungen, die als Funktion der Zeit aufgezeichnet werden kann. </li><li> Injizieren Isopropanol (ohne Lipid) für 10 min. </li><li> Injizieren Sie die Mischung aus DOPC Lipid / Cholesterin bei dergewünschten Molverhältnis mit einer Gesamtlipidkonzentration von 0,5 mg / ml in Isopropanol für 10 min. </li><li> Injizieren Puffer für 20 min bei einer Fließgeschwindigkeit von 100 ul / min. </li><li> Injizieren einer Lösung aus 1 mM Methyl-β-Cyclodextrin (MßCD) in Puffer (Fließgeschwindigkeit 100 ml / min), bis das Frequenzsignal einen stabilen Wert erreicht, hergestellt. </li><li> Messung der relativen positiven Frequenzverschiebungen, die durch die MßCD Behandlungsschritt hervorgerufen wird, und die Berechnung der Masse von Cholesterin und DOPC Lipide durch Umwandeln der Af cho und Af DOPC Werte Massewerte durch Verwendung des Sauerbrey Gleichung [&amp; Dgr; m = - (C / N) &amp; times; &amp; delta; f, wobei C = 17,7 ng / cm 2, n: Oberton]. </li><li> Berechnung der Molfraktion Cholesterin im SLB, unter Berücksichtigung der Molekulargewichte von DOPC Lipid (786,1 g / mol) und Cholesterol (386,6 g / mol). </li></ol>

<ol><li>Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+membranes%3A+Scientific+and+practical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supported membranes: Scientific and practical applications.</a> Science. 271, 43-48 (1996).</li>
<li>Kraft, M. L., Weber, P. K., Longo, M. L., Hutcheon, I. D., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+separation+of+lipid+membranes+analyzed+with+high-resolution+secondary+ion+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phase separation of lipid membranes analyzed with high-resolution secondary ion mass spectrometry.</a> Science. 313, 1948-1951 (2006).</li>
<li>Kalb, E., Engel, J., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+proteins+to+specific+target+sites+in+membranes+measured+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Binding of proteins to specific target sites in membranes measured by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biochemistry. 29, 1607-1613 (1990).</li>
<li>Bally, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norovirus+GII.+4+Virus-like+Particles+Recognize+Galactosylceramides+in+Domains+of+Planar+Supported+Lipid+Bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Norovirus GII. 4 Virus-like Particles Recognize Galactosylceramides in Domains of Planar Supported Lipid Bilayers.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51, 12020-12024 (2012).</li>
<li>Bally, M., Graule, M., Parra, F., Larson, G., Höök, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+virus+biosensor+with+single+virus-particle+sensitivity+based+on+fluorescent+vesicle+labels+and+equilibrium+fluctuation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biointerphases%22%5BJournal%5D)">A virus biosensor with single virus-particle sensitivity based on fluorescent vesicle labels and equilibrium fluctuation analysis.</a> Biointerphases. 8, 10-1186 (2013).</li>
<li>Groves, J. T., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+planar+bilayers+in+studies+on+immune+cell+adhesion+and+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Supported planar bilayers in studies on immune cell adhesion and communication.</a> Journal of Immunological Methods. 278, 10-1016 Forthcoming.</li>
<li>Mager, M. D., Melosh, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Bilayer+Deposition+and+Patterning+via+Air+Bubble+Collapse%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Lipid Bilayer Deposition and Patterning via Air Bubble Collapse.</a> Langmuir. 23, 9369-9377 (2007).</li>
<li>Lenhert, S., Sun, P., Wang, Y., Fuchs, H., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+Parallel+Dip-Pen+Nanolithography+of+Heterogeneous+Supported+Phospholipid+Multilayer+Patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Massively Parallel Dip-Pen Nanolithography of Heterogeneous Supported Phospholipid Multilayer Patterns.</a> Small. 3, 71-75 (2007).</li>
<li>Mennicke, U., Salditt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+solid-supported+lipid+bilayers+by+spin-coating%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Preparation of solid-supported lipid bilayers by spin-coating.</a> Langmuir. 18, 8172-8177 (2002).</li>
<li>Tamm, L. K., McConnell, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+phospholipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Supported phospholipid bilayers.</a> Biophysical Journal. 47, 105-113 (1985).</li>
<li>Kalb, E., Frey, S., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+supported+planar+bilayers+by+fusion+of+vesicles+to+supported+phospholipid+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Formation of supported planar bilayers by fusion of vesicles to supported phospholipid monolayers.</a> Biochim Biophys Acta. 1103, 307-316 (1992).</li>
<li>Reimhult, E., Höök, F., Kasemo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+vesicle+adsorption+and+supported+biomembrane+formation+from+vesicles+in+solution%3A+influence+of+surface+chemistry%2C+vesicle+size%2C+temperature%2C+and+osmotic+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Intact vesicle adsorption and supported biomembrane formation from vesicles in solution: influence of surface chemistry, vesicle size, temperature, and osmotic pressure.</a> Langmuir. 19, 1681-1691 (2003).</li>
<li>Cho, N. -J., Jackman, J. A., Liu, M., Frank, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH-Driven+assembly+of+various+supported+lipid+platforms%3A+A+comparative+study+on+silicon+oxide+and+titanium+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">pH-Driven assembly of various supported lipid platforms: A comparative study on silicon oxide and titanium oxide.</a> Langmuir. 27, 3739-3748 (2011).</li>
<li>Boudard, S., Seantier, B., Breffa, C., Decher, G., Felix, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+pathway+of+formation+of+supported+lipid+bilayers+of+DMPC+by+varying+the+sodium+chloride+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Thin+Solid+Films%22%5BJournal%5D)">Controlling the pathway of formation of supported lipid bilayers of DMPC by varying the sodium chloride concentration.</a> Thin Solid Films. , 495-4246 (2006).</li>
<li>Stanglmaier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+distribution+of+anionic+phospholipids+in+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Asymmetric distribution of anionic phospholipids in supported lipid bilayers.</a> Langmuir. 28, 10818-10821 (2012).</li>
<li>Jackman, J. A., Choi, J. -H., Zhdanov, V. P., Cho, N. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+osmotic+pressure+on+adhesion+of+lipid+vesicles+to+solid+supports%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Influence of osmotic pressure on adhesion of lipid vesicles to solid supports.</a> Langmuir. 29, 11375-11384 (2013).</li>
<li>Rossetti, F. F., Bally, M., Michel, R., Textor, M., Reviakine, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+titanium+dioxide+and+phosphatidyl+serine-containing+liposomes%3A+formation+and+patterning+of+supported+phospholipid+bilayers+on+the+surface+of+a+medically+relevant+material%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Interactions between titanium dioxide and phosphatidyl serine-containing liposomes: formation and patterning of supported phospholipid bilayers on the surface of a medically relevant material.</a> Langmuir. 21, 6443-6450 (1021).</li>
<li>Cho, N. -J., Cho, S. -J., Cheong, K. H., Glenn, J. S., Frank, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Employing+an+amphipathic+viral+peptide+to+create+a+lipid+bilayer+on+Au+and+TiO2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Employing an amphipathic viral peptide to create a lipid bilayer on Au and TiO2.</a> Journal of the American Chemical Society. 129, 10050-10051 (2007).</li>
<li>Hardy, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+supported+lipid+bilayers+with+high+cholesterol+content+formed+by+%5Bsmall+alpha%5D-helical+peptide-induced+vesicle+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Biomimetic supported lipid bilayers with high cholesterol content formed by [small alpha]-helical peptide-induced vesicle fusion.</a> Journal of Materials Chemistry. 22, 19506-19513 (2012).</li>
<li>Wallin, M., Choi, J. -H., Kim, S. O., Cho, N. -J., Andersson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide-induced+formation+of+a+tethered+lipid+bilayer+membrane+on+mesoporous+silica%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Peptide-induced formation of a tethered lipid bilayer membrane on mesoporous silica.</a> European Biophysics Journal. , 1-10 (2014).</li>
<li>Coutable, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+tethered-lipid+bilayers+on+gold+surfaces+for+the+incorporation+of+integral+membrane+proteins+synthesized+by+cell-free+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Preparation of tethered-lipid bilayers on gold surfaces for the incorporation of integral membrane proteins synthesized by cell-free expression.</a> Langmuir. 30, 3132-3141 (2014).</li>
<li>Zan, G. H., Jackman, J. A., Cho, N. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AH+peptide-mediated+formation+of+charged+planar+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">AH peptide-mediated formation of charged planar lipid bilayers.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 118, 3616-3621 (2014).</li>
<li>Jackman, J. A., Zhao, Z., Zhdanov, V. P., Frank, C. W., Cho, N. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+adhesion+and+rupture+on+silicon+oxide%3A+Influence+of+freeze%E2%80%93thaw+pretreatment%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Vesicle adhesion and rupture on silicon oxide: Influence of freeze–thaw pretreatment.</a> Langmuir. 30, 2152-2160 (2014).</li>
<li>Tabaei, S. R., Choi, J. -H., Haw Zan,, Zhdanov, G., P, V., Cho, N. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvent-Assisted+Lipid+Bilayer+Formation+on+Silicon+Dioxide+and+Gold%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Solvent-Assisted Lipid Bilayer Formation on Silicon Dioxide and Gold.</a> Langmuir. 30, 10363-10373 (2014).</li>
<li>Hohner, A., David, M., Rädlera, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+solvent-exchange+deposition+of+phospholipid+membranes+onto+solid+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biointerphases%22%5BJournal%5D)">Controlled solvent-exchange deposition of phospholipid membranes onto solid surfaces.</a> Biointerphases. 5, 1-8 (2010).</li>
<li>Tabaei, S. R., Jackman, J. A., Kim, S. -O., Zhdanov, V. P., Cho, N. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvent-Assisted+Lipid+Self-Assembly+at+Hydrophilic+Surfaces%3A+Factors+Influencing+the+Formation+of+Supported+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Solvent-Assisted Lipid Self-Assembly at Hydrophilic Surfaces: Factors Influencing the Formation of Supported Membranes.</a> Langmuir. 31, 3125-3134 (2015).</li>
<li>Tabaei, S. R., Vafaei, S., Cho, N. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+Charged+Membranes+by+the+Solvent-Assisted+Lipid+Bilayer+%28SALB%29+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Method+on+SiO2+and+Al2O3.+Physical+Chemistry+Chemical+Physics.%2C+doi%3A10.1039%2FC5CP01428J%22%5BJournal%5D)">Fabrication of Charged Membranes by the Solvent-Assisted Lipid Bilayer (SALB) Formation.</a> Method on SiO2 and Al2O3. Physical Chemistry Chemical Physics., doi:10.1039/C5CP01428J. , (2015).</li>
<li>Jackman, J. A., Tabaei, S. R., Zhao, Z., Yorulmaz, S., Cho, N. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Assembly+Formation+of+Lipid+Bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22Coatings+on+Bare+Aluminum+Oxide%3A+Overcoming+the+Force+of+Interfacial+Water.+ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Self-Assembly Formation of Lipid Bilayer.</a> Coatings on Bare Aluminum Oxide: Overcoming the Force of Interfacial Water. ACS Applied Materials & Interfaces. 7, 959-968 (2015).</li>
<li>Keller, C., Kasemo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+specific+kinetics+of+lipid+vesicle+adsorption+measured+with+a+quartz+crystal+microbalance%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Surface specific kinetics of lipid vesicle adsorption measured with a quartz crystal microbalance.</a> Biophysical Journal. 75, 1397-1402 (1998).</li>
<li>Sundh, M., Svedhem, S., Sutherland, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+phase+separating+lipids+on+supported+lipid+bilayer+formation+at+SiO2+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Chemistry+Chemical+Physics%22%5BJournal%5D)">Influence of phase separating lipids on supported lipid bilayer formation at SiO2 surfaces.</a> Physical Chemistry Chemical Physics. 12, 453-460 (2010).</li>
<li>Cho, N. -J., Frank, C. W., Kasemo, B., Höök, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quartz+crystal+microbalance+with+dissipation+monitoring+of+supported+lipid+bilayers+on+various+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Quartz crystal microbalance with dissipation monitoring of supported lipid bilayers on various substrates.</a> Nature Protocols. 5, 1096-1106 (2010).</li>
<li>Beseničar, M. P., Bavdek, A., Kladnik, A., Maček, P., Anderluh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+cholesterol+extraction+from+lipid+membranes+by+methyl-%CE%B2-cyclodextrin%E2%80%94A+surface+plasmon+resonance+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Kinetics of cholesterol extraction from lipid membranes by methyl-β-cyclodextrin—A surface plasmon resonance approach.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1778, 175-184 (2008).</li>
<li>Pedersen, S., Jørgensen, K., Baekmark, T. R., Mouritsen, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indirect+evidence+for+lipid-domain+formation+in+the+transition+region+of+phospholipid+bilayers+by+two-probe+fluorescence+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Indirect evidence for lipid-domain formation in the transition region of phospholipid bilayers by two-probe fluorescence energy transfer.</a> Biophysical journal. 71, 554-560 (1996).</li>
<li>Okonogi, T., McConnell, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrast+inversion+in+the+epifluorescence+of+cholesterol-phospholipid+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Contrast inversion in the epifluorescence of cholesterol-phospholipid monolayers.</a> Biophysical Journal. 86, 880-890 (2004).</li>
<li>McConnell, H. M., Radhakrishnan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Condensed+complexes+of+cholesterol+and+phospholipids%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29-Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Condensed complexes of cholesterol and phospholipids.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1610, 159-173 (2003).</li>
<li>Tabaei, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+Cholesterol-Rich+Supported+Membranes+Using+Solvent-Assisted+Lipid+Self-Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Formation of Cholesterol-Rich Supported Membranes Using Solvent-Assisted Lipid Self-Assembly.</a> Langmuir. 30, 13345-13352 (2014).</li>
<li>Tabaei, S. R., Jackman, J. A., Liedberg, B., Parikh, A. N., Cho, N. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+Stripe+Superstructure+in+the+%CE%B2-Two-Phase+Coexistence+Region+of+Cholesterol%E2%80%93Phospholipid+Mixtures+in+Supported+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Observation of Stripe Superstructure in the β-Two-Phase Coexistence Region of Cholesterol–Phospholipid Mixtures in Supported Membranes.</a> Journal of the American Chemical Society. 136, 16962-16965 (2014).</li>
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Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen offenzulegen.

In dieser Arbeit wird ein Lösungsmittel-Austausch-Protokoll, in dem Lipide in Alkohol (Isopropanol, Ethanol oder n-Propanol) mit einem festen Träger inkubiert werden präsentiert und dann wird der Alkohol nach und nach mit einer wässrigen Pufferlösung, um einen Antrieb der Serien ersetzt von Phasenübergängen schließlich produzieren Lamellenphasen Lipid-Doppelschichten 24. Es wird gezeigt, daß das Verfahren ermöglicht die Herstellung von unterstützten Lipiddoppelschichten auf Oberflächen, wie etwa Gold, die unlösbar an den Vesikelfusion Verfahrens geeignet ist. Eine optimale Lipid-Konzentrationsbereich (0,1 bis 0,5 mg / ml) wurde für die komplette Doppelschichtbildung in experimentellen Standardformate bisher getestet wurde bestimmt. Bei Lipidkonzentrationen von weniger als 0,1 mg / ml, diskrete, mikroskopische Flecken von Doppelschichten gebildet werden. Andererseits wird bei Konzentrationen über 0,1 mg / ml und weniger als 0,5 mg / ml, eine vollständige und einheitliche Doppelschicht gebildet wird. Bei Lipidkonzentrationen oberhalb dieses Bereichs wurde ein Fluid-Doppelschicht noch als verifi gebildetvon FRAP Analyse ed zeigt jedoch, Fluoreszenzmikroskopie auf das Vorhandensein weiterer Lipidstrukturen auf der Oberseite der Doppelschicht. Auffällig ist, die Morphologie dieser zusätzlichen Lipidstrukturen, wie durch QCM-D-Analyse bestimmt, hing von dem Alkohol, der während der Inkubation Schritt verwendet wurde. Im Fall von Ethanol, die relativ hohen Δ f und Δ D verschiebt ähneln der QCM-D Signatur für ein adsorbiertes Vesikel Schicht erhalten. Wenn Isopropanol oder n-Propanol wurde stattdessen verwendet, war der Δ f etwas höher als der Wert für eine Doppelschicht (final Δ f von -30 bis -40 Hz) erwartet, während der Δ D war erheblich höher. Solche QCM-D Antworten würde ausgestreckte Lipidstrukturen (zB wurmähnliche Micellen) nach außen von der Membranoberfläche vorstehenden erwarten (wie durch Fluoreszenzmikroskopie in einigen Fällen sichtbar). Die Rate der Lösungsmittelaustausch ist ein weiterer wichtiger Parameter, der entscheidend sein kann, especmathematisch bei geringeren Lipidkonzentrationen (zB 0,1 mg / ml) verwendet werden. Schnelle Lösungsmittelaustausch bei niedriger Lipidkonzentration kann zur Bildung von unvollständigen Doppelschichten führen. In der Standard-Messkammer für QCM-D-Messungen in diesem Papier (Q-Sense E4 Messkammer), Durchflussraten von etwa 100 &amp; mgr; l / min verwendet wird, waren geeignet für hoch reproduzierbare komplette Doppelschichtbildung. Für Durchflusszellen mit anderen Geometrien und Volumen kann die optimale Durchflussrate variieren und muss empirisch auf der Grundlage der hier vorgeschlagenen Schritte bestimmt werden. Zusätzlich zum unterstützten Lipiddoppelschichten auf Oberflächen, die unhandhabbar Vesikelfusion sind, kann die SALB eingesetzt werden, um die Notwendigkeit von Lipidvesikeln, die zerreißen kann, wodurch die Tür zur Herstellung dieser Membranen mit komplexen Zusammensetzungen Öffnung zu umgehen. Als illustratives Beispiel Zusammensetzung wurden Lipidmischungen mit einem hohen Anteil von Cholesterin untersucht. Cholesterin ist ein wichtiger Bestandteil der mammalian Zellmembranen und ihre Bruch nähern können 45-50 Mol-% der Membranlipidzusammensetzung (beispielsweise in Erythrocyten). So sollte auch ein einfaches Modell einer Lipid-Doppelschicht, die eine menschliche Zelle Membran schließen Cholesterin. Während Vesikelfusion könnte zur fluidischen Lipiddoppelschichten nur 10-15% Cholesterin enthält, herzustellen, können die Verfahren SALB Bildung fluidischen Lipiddoppelschichten, die hohe Anteile von Cholesterin (bis zu 57 mol%, bestimmt durch QCM-D-Messungen quantifiziert) 36. Wenn jedoch das Niveau des Cholesterins wurde weiter erhöht (bis zu 63 mol%) wurden streifenförmigen Bereichen beobachtet 37. Die Co-bestehenden Domains waren flüssig, erinnern an die im Phasendiagramm des Cholesterin / Phospholipide Monoschicht an der Luft-Wasser-Grenzfläche in der β-Region beobachtet. Insgesamt ist die SALB Methode gezeigt, um eine einfache und effiziente Vorgehensweise sein, unterstützten Lipiddoppelschichten zu bilden, insbesondere in Fällen würde den Rahmen der herkömmlichen Vesikelfusion Methode. Bisher wurden die QCM-D Technik und Fluoreszenz-Mikroskopie hauptsächlich verwendet, um die unterstützten Lipiddoppelschichten durch die SALB Verfahren gebildet charakterisieren. Wir freuen uns, eine breite Palette von oberflächensensitiven analytischen Messungen Techniken, einschließlich der Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) 38, Rasterkraftmikroskopie (AFM) 39,40, Fourier-Transformations-Infrarot-Spektroskopie 41, X-ray 42 und Neutronenreflexionsvermögen 43, kann verwendet werden, um weiter zu charakterisieren und untersuchen einfache und komplexe Doppelschicht-Konfigurationen vorbereitet durch die SALB Verfahren werden. Diese neuen Möglichkeiten öffnen die Tür zu einer größeren Anzahl von Wissenschaftlern, die künstliche Zellmembranen durch die Nutzung eines einfachen und robusten Versuchsprotokoll zu erkunden.

Der Feststoff-unterstützten Lipiddoppelschicht 1 (SLB) ist eine vielseitige Plattform, die die grundlegenden Eigenschaften von Biomembranen wie die Dicke der Doppelschicht, zweidimensionalen Lipiddiffusionsvermögen und die Fähigkeit, membranassoziierten Biomolekülen Host bewahrt. Aufgrund der Komplexität von natürlichen Zellmembranen wurde dieses einfache Plattform wurde gezeigt, als eine effiziente Plattform für in vitro-Untersuchungen von Membranbezogenen Prozesse wie Floßbildung 2, Proteinbindungs ​​3, Viren und virusartige Partikel Bindungs ​​4,5 funktionieren und Zellsignal 6. In unmittelbarer Nähe zu einem festen Träger gebildet ist, ist der SLB-Plattform mit einer Vielzahl von Oberflächen-empfindliche Messungen Techniken kompatibel wie Gesamtreflexionsmikroskopie (TIRF), Quarzkristall-Mikrobalance-Dissipation (QCM-D) und die Impedanz-Spektroskopie. Mehrere Verfahren wurden entwickelt, um verschiedene Arten von SLBs einschließlich Luftblase zu erzeugenZusammenbruch 7 und Dip-Pen-Nanolithographie 8 für Submikrongröße Lipidflecken, Spin-Beschichtung 9 für Doppelschicht-Stacks und Langmuir-Blodgett (LB) 10 und Vesikelfusion (VF) 11 für die vollständige übergreifende, einzelne Lipiddoppelschichten. Die VF-Methode besteht aus der Adsorption von kleinen unilamellaren Vesikeln mit einem festen Träger und nachfolgender spontaner Bruch und Fusion, um eine kontinuierliche Lipid-Doppelschicht zu bilden. Jedoch unter physiologischen Bedingungen spontan Vesikel Bruch hauptsächlich auf Silizium basierende Materialien wie Siliziumdioxid, Glas und Glimmer beschränkt. Zusätzlich Vesikel Bruch nicht spontan Vesikel komplexer Lipidzusammensetzungen wie solche, die hohe Anteile an Cholesterin oder negativ geladenen Lipiden auftreten. Je nach System kann Vesikel Bruch durch weiteres Maßschneidern der experimentellen Bedingungen wie Temperatur 12 Lösung pH 13, und der Salzgehalt 14, osmotischen Schock 15 induziert werden </sauf&gt; oder Druck 16 oder die Zugabe von zweiwertigen Ionen, wie Ca 2+ 17. Alternativ kann das membranaktive Peptid AH, um eine Schicht von adsorbiertem Vesikel destabilisieren eingeführt werden, was zu einer Vesikel Bruch und die Doppelschichtbildung auf einer Strecke der Flächen 18-22. Außerdem ist eine erfolgreiche Doppelschichtbildung Herstellung einer gut kontrollierten Population von kleinen unilamellaren Vesikeln, die zeitaufwendig und schwierig, die für bestimmte Membranzusammensetzungen zu erreichen sein kann. Daher ist trotz seiner hohen Effizienz bei der optimalen Fällen (beispielsweise nach umfangreichen Gefrier-Auftau-Vorbehandlung von Vesikeln 23), deren allgemeine Anwendung Vesikelfusion wird durch den Umfang der geeigneten Substrate und Membranzusammensetzungen beschränkt. Das Lösungsmittel-unterstützte Lipiddoppelschicht (SALB) Methode 24-28 ist eine alternative Herstellungsmethode, die nicht Lipidvesikel erfordert. Das Verfahren beruht auf der Abscheidung o basierendf Lipidmoleküle auf einer festen Oberfläche in Gegenwart eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, gefolgt von einer allmählichen Austausch dieser Lösemittel mit einer wässrigen Pufferlösung, um SLB Bildung auszulösen. Während des Lösungsmittelaustauschschritt, der ternären Mischung von Lipiden, organischen Lösungsmittel und Wasser durchläuft eine Reihe von Phasenübergängen mit zunehmendem Wasseranteil, der zur Bildung von lamellaren Phasenstrukturen in der Hauptmassenlösung und einer SLB auf dem festen Substrat führt. Wichtig ist, umgeht diese Selbstorganisation Route die Notwendigkeit Vesikel Bruch, die in der Regel ist der limitierende Schritt für die Transformation von adsorbierten Vesikel in ein SLB. Das Protokoll ist anwendbar auf eine große Vielzahl von Oberflächen, einschließlich Siliciumdioxid, Aluminiumoxid, Chrom, Indiumzinnoxid und Gold. In diesem Dokument und in der begleitenden Video wird ein Vergleich von Lipidablagerung durch die SALB und Vesikelfusion Methoden vorgestellt. Insbesondere der Einfluss der experimentellen Parameter, einschließlich Lipidkonzentration, Strömungsgeschwindigkeit, und die Wahl des mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels auf die Qualität des von der SALB Verfahren gebildet Bilayer diskutiert. Analytische Charakterisierung der hergestellten SLBs wird von der QCM-D, Fluoreszenzmikroskopie und Fluoreszenzerholung nach Photobleaching (FRAP) Techniken durchgeführt. QCM-D-Überwachung ist eine oberflächensensitive Massenmesstechnik, die seit den bahnbrechenden Arbeiten von Keller und Kasemo 29 durchgeführt wird, wurde ausgiebig genutzt, um quantitativ Doppelschichtbildung zu untersuchen. Fluoreszenzmikroskopie erlaubt Inspektion der Membranhomogenität sowie die Visualisierung von Membrandomänen. Die FRAP Technik ist ein Standardwerkzeug, um die seitliche Beweglichkeit der Lipid-Moleküle in einer SLB, die eine wesentliche Eigenschaft des fluidischen Membranen bestimmen. Der erste Teil dieser Studie beinhaltet QCM-D-Analyse der SALB und Vesikelfusion Methoden angewandt, um Doppelschichtbildung auf Siliziumdioxid und Gold zu versuchen. Im zweiten Teil,Die Herstellung und Charakterisierung dieser Membranen mit einem Bereich von Cholesterinkonzentration mit dem SALB Verfahren demonstriert und die Ergebnisse werden mit den von der Vesikelfusion Verfahren erhaltenen verglichen.

<table><tbody><tr><td>QCM-D siliziumdioxidbeschichtete Substrate</td><td>QSense AB,&nbsp; </td><td></td><td></td>Schweden</tr><tr><td>QCM-D goldbeschichtete Substrate</td><td>QSense AB,&nbsp; </td><td></td><td></td>Schweden</tr><tr><td>Q-Sense E4 Modul</td><td>QSense AB,&nbsp; </td><td></td><td></td>Schweden</tr><tr><td>Plasmareiniger, PDC-32G</td><td>Harrick Plasma, Ithaca, NY</td><td>PDC-001 (115V) &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC)</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>850375P</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-(Lissamin-Rhodamin-B-Sulfonyl) (Ammoniumsalz) (Rh-PE)</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>810150P</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterin</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>700000P</td><td></td></tr><tr><td>Methyl-&beta;-Cyclodextrin</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C4555</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>673773</tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>459844</tr><tr><td>n-Propanol</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>279544</tr><tr><td>Sticky-Slide I 0.1 Luer</td><td>IBIDI</td><td>81128</td><td></td></tr><tr><td>Ellenbogen 1/8"</td><td>Cole-Parmer</td><td>30505-70</td><td></td></tr><tr><td>Silikonschlauch 1.6&#160; mm ID</td><td>IBIDI</td><td>10842</td><td></td></tr><tr><td>Glasdeckglas Nr. 1,5H, 25 mm x 75 mm</td><td>IBIDI</td><td>10812</td><td></td></tr><tr><td>Reglo Digital M2-2/12 Schlauchpumpe</td><td>Ismatec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>Artikel-Nr.: 71725</td><td></td></tr></tbody></table>

biomembran fabrication durch das lösungsmittel-unterstützten lipiddoppelschicht (salb) methode

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

Um Zellmembranen zu imitieren, ist der unterstützten Lipiddoppelschicht (SLB) eine attraktive Plattform, die In-vitro-Untersuchung von Membranbezogenen Prozesse ermöglicht, während zur Übertragung der Biokompatibilität und Biofunktionalität auf feste Substrate. Die spontane Adsorption und Ruptur Phospholipidvesikel ist die am häufigsten verwendete Methode, um SLBs bilden. Jedoch unter physiologischen Bedingungen Vesikelfusion (VF) ist, nur eine Teilmenge der Lipidzusammensetzungen und feste Träger begrenzt. Hier beschreiben wir ein einstufiges allgemeine Verfahren genannten Lösungsmittel-unterstützte Lipiddoppelschicht (SALB) Bildungsverfahren um SLBs die nicht Vesikel erfordert bilden. Die SALB Verfahren beinhaltet die Abscheidung von Lipidmolekülen auf einer festen Oberfläche in Gegenwart eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel (zB Isopropanol) und anschließender Lösungsmittelaustausch mit wßriger Pufferlösung um SLB Bildung auszulösen. Die kontinuierliche Lösungsmittelaustauschschritt ermöglicht Anwendung desVerfahren in einem Durchflusskonfiguration für die Überwachung Doppelschichtbildung und nachfolgende Änderungen unter Verwendung einer Vielzahl von oberflächensensitive Biosensoren. Die SALB Methode kann verwendet werden, um SLBs auf einer Vielzahl von hydrophilen festen Oberflächen, einschließlich derjenigen, die unlösbar zu Vesikelfusion sind herzustellen. Darüber hinaus ermöglicht es die Herstellung von SLBs von Lipidzusammensetzungen zusammengesetzt, die nicht mit der Vesikelfusion Verfahren hergestellt werden können. Hierin vergleichen wir Ergebnisse mit den SALB und konventionellen Vesikelfusion Methoden auf zwei veranschaulichende hydrophile Oberflächen, Siliciumdioxid und Gold erhalten. Um die experimentellen Bedingungen für die Herstellung von hochwertigen Doppelschichten über die SALB Verfahren hergestellt zu optimieren, wird die Wirkung von verschiedenen Parametern ab, einschließlich der Art des organischen Lösungsmittels in der Abscheidungsschritt, die Rate der Lösungsmittelaustausch, und der Lipidkonzentration sowie Tipps zur Problemlösung diskutiert . Bildung unterstützt Membranen, die hohe Anteile an Cholesterin ist auch DämonenFett mit dem SALB Verfahren, Hervorhebung der technischen Möglichkeiten des SALB Technik für eine breite Palette von Membrankonfigurationen.

Wir präsentieren ein experimentelles Protokoll, um eine unterstützte Lipiddoppelschicht auf festen Substraten ohne Verwendung von Lipidbläschen bilden. Wir zeigen, ein einstufiges Verfahren zur Herstellung einer Lipid-Doppelschicht auf Siliciumdioxid und Gold sowie trägergestützten Membranen mit Cholesterin angereicherten Domäne für verschiedene biologische Anwendungen bilden.

Biomembran Fabrication durch das Lösungsmittel-unterstützten Lipiddoppelschicht (SALB) Methode

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, unterstützte Membranen mittels der lösungsmittelunterstützten Lipiddoppelschicht-Methode herzustellen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Membranbiologie zu beantworten, beispielsweise zum Verständnis der grundlegenden Eigenschaften von Lipiden und Membranproteinen, und ermöglicht zudem Anwendungen wie die Arzneimittelentwicklung und molekulare Diagnostik. Der entscheidende Vorteil dieser Technik liegt darin, dass sie in vielen Fällen die Herstellung von unterstützten Lipidschichten erlaubt, was mit herkömmlichen Methoden nicht möglich ist.Das Verfahren ist außerdem einfach anzuwenden und erfordert minimale Probenvorbereitungen. Die Bedeutung dieser Technik erstreckt sich auf unsere Therapie- und Diagnoseverfahren, da sie die Untersuchung wichtiger Wirkstoffziele wie Membranproteine ermöglicht. Die Methode kann auch zur Herstellung biokompatibler Substrate für Anwendungen in der Materialwissenschaft genutzt werden.Die Idee zu dieser Methode entstand zunächst, als wir über die Schwierigkeiten herkömmlicher Methoden zur Membranherstellung diskutierten, die den Nachweis ermöglichen sollen, dass SHA schrittweise an fortgeschrittene Doktoranden aus unserem Labor vermittelt werden kann. Bereiten Sie eine Lipid-Stammlösung mit 10 Milligramm pro Milliliter DOPC-Lipid vor, indem Sie das Lipidpulver in Isopropanol-Lösung auflösen. Lösen Sie anschließend ruminmarkiertes DOPE-Lipidpulver in Isopropanol-Lösung, um eine Lipid-Stammlösung mit einem Milligramm pro Milliliter zu erhalten.Verdünnen und mischen Sie die Stammlösungen in Isopropanol, um die gewünschte Lipidmischung in der endgültigen Konzentration für Fluoreszenz-, Mikroskopie- und Fluoreszenz-Wiederherstellung nach Photobleaching (FRAP)-Experimente herzustellen; die Lipidmischung sollte 0,5 Gewichtsprozent R domine-markiertes DOPE enthalten. Geben Sie die Lipidmischung in Isopropanol in den mikrofluidischen Kanal, bis dieser gefüllt ist. Inkubieren Sie die Lipidmischung etwa 10 Minuten lang auf der Glasoberfläche.Der Salzaustausch sollte mit einer sehr geringen Flussrate erfolgen, da andernfalls die Qualität der Doppelschicht schlecht sein wird. Ersetzen Sie die Lipidlösung schrittweise durch Wasser oder Pufferlösung unter Verwendung einer peristaltischen Pumpe mit sehr geringer Flussrate. Spülen Sie anschließend den Kanal gründlich mit überschüssiger Pufferlösung aus, um das restliche Isopropanol zur Bildung von cholesterolangereicherten unterstützten Membranen zu entfernen.Stellen Sie eine Stammlösung her, die DOPC, Lipidcholesterin und Rho-Domäne enthält, markiert mit DOPE-Lipid, indem Sie zunächst die jeweiligen Pulver in Isopropanol lösen und dann denselben Protokollschritt wie zuvor wiederholen, um den Membranfluiditäts-Assay durchzuführen. Tauchen Sie zunächst den Glasobjektträger 10 Minuten lang in eine 1%ige Natrium-ESAL-Sulfat-Lösung ein. Spülen Sie die Objektträger danach gründlich mit entionisiertem Wasser aus und geben Sie einen Abschlußspülgang mit Ethanol.Trocknen Sie die Objektträger mit einem sanften Strom aus Stickstoff ab. Danach setzen Sie die Objektträger 30 Sekunden lang einer Sauerstoff-Plasma-Behandlung bei maximaler Hochfrequenzleistung in der Sauerstoff-Plasma-Kammer aus. Entfernen Sie anschließend mit einer Pinzette die Schutzfolie der bodenlosen kommerziellen mikrofluidischen Kammer und befestigen Sie den Glasobjektträger an der klebrigen Seite der Kammer.Bauen Sie die Anschlüsse und Schläuche an den Einlass- und Auslasspositionen der Kammer zusammen und platzieren Sie den mikrofluidischen Kanal auf dem Mikroskoptisch. Stellen Sie wie zuvor eine fluoreszenzmarkierte unterstützte Lipiddoppelschicht im mikrofluidischen Kanal her, indem Sie die gewünschte Lipidzusammensetzung verwenden, einschließlich eines 0,5 Gewichtsprozent-Rhodamin-markierten DOPE-Lipids in anorganischem Lösungsmittel. Suchen Sie als Nächstes die Doppelschichtebene mit einem 60x-Ölimmersionsobjektiv. Um Bilder aufzunehmen, nehmen Sie zunächst zwei Vorab-Aufnahmen vor der photobleachenden Behandlung vor.Erwärmen Sie den Laser, bis seine Intensität stabil geworden ist. Bleichen Sie dann einen kreisförmigen Bereich mit 30 Mikrometer Durchmesser mit einem 532 Nanometer, 100 Milliwatt starken Laserstrahl aus. Unmittelbar nach dem Ausbleichen.Nehmen Sie eine Serie von Bildern jede Sekunde über einen Zeitraum von zwei Minuten auf, um die Wiederherstellung und die Fluoreszenzintensität an der Bleichstelle zu verfolgen und eine Cholesterinquantifizierung durchzuführen. Exponieren Sie zunächst den mit Siliziumdioxid beschichteten Quarzkrystalsensor-Chip 30 Sekunden lang bei maximaler Hochfrequenzleistung der Sauerstoffplasmaanlage gegenüber Sauerstoffplasma. Entnehmen Sie den Chip aus der Kammer und montieren Sie ihn unmittelbar in der Messkammer, wobei vor dem Experiment ein Q-Sense-E4-A-Vierkanal-Quarzmikrowaage verwendet wird.Bestimmen Sie die Frequenz und Dissipation der Zensur und Luft, um eine korrekte Montage sicherzustellen. Führen Sie dazu das qof-Softwareprogramm aus. Klicken Sie auf Erfassung und wählen Sie im neu erscheinenden Fenster die Messungseinrichtung aus, und aktivieren Sie die Oberschwingungen 3, 5, 7, 9, 11 und 13.Klicken Sie dann auf Suchen und Ausführen. Um die Resonanzspektren zu überprüfen, stellen Sie die Temperatur auf 24 Grad Celsius ein. Sobald eine geeignete Montage erreicht ist, starten Sie die peristaltische Pumpe und leiten Sie Pufferlösung mit einer Flussrate von 100 µL pro Minute in die Messkammer. Klicken Sie im Softwareprogramm auf Erfassung und wählen Sie Messung neu starten, um die Signale der Resonanzfrequenz und der Energie-Dissipation aufzuzeichnen.Wiederholen Sie diesen Schritt, bis eine stabile Basislinie erreicht ist, für die Frequenz- und Dissipationsverschiebungen. Injizieren Sie das Isopropanol ohne Lipid für 10 Minuten.Anschlie&szlig;end erfolgt die Injektion der DOPC-Lipid- und Cholesterinmischung im gew&uuml;nschten molaren Verh&auml;ltnis mit einer Gesamtkonzentration von 0,5 Milligramm pro Milliliter in Isopropanol &uuml;ber einen Zeitraum von 10 Minuten. Danach wird 20 Minuten lang Puffer mit einer Flussrate von 100 Mikrolitern pro Minute injiziert. Anschlie&szlig;end wird eine L&ouml;sung von einem Millimolar Methyl-beta-Cyclodextrin, die in Puffer hergestellt wurde, injiziert, bis das Frequenzsignal einen stabilen Wert erreicht.Messen Sie die relativen positiven Frequenzverschiebungen, die durch den Methyl-β-Cyclodextrin-Behandlungsschritt verursacht werden, und berechnen Sie die Mengen an Cholesterin und DOPC-Lipiden wie im Textprotokoll beschrieben. Berechnen Sie anschließend den Molenbruch von Cholesterin in der unterstützten Lipiddoppelschicht unter Berücksichtigung der molaren Massen des DOPC-Lipids und von Cholesterin. Gezeigt ist hier ein repräsentatives Fluoreszenzmikroskopiebild einer A-D-O-P-C-Lipiddoppelschicht, die 0,5 Gewichtsprozent mit Rhodamin markiertes DOPE-Lipid enthält und auf Glasoberflächen mittels der SAL-Methode gebildet wurde.Das Experiment zur fluoreszenztechnischen Wiederherstellung nach Photobleaching zeigte eine nahezu vollständige Wiederherstellung der Fluoreszenz, was auf die laterale Fließfähigkeit der Lipiddoppelschicht hinweist. Hier sind repräsentative QCMD-Kurven der Frequenz- und Dissipationsänderungen für die Bildung einer unterstützten Doppelschicht dargestellt. Mithilfe der SAL-Methode wurden endgültige Resonanzfrequenzverschiebungen und Dissipationsverschiebungen erreicht, die der Bildung einer planaren Doppelschicht entsprechen, sobald die Methode beherrscht ist.Diese Technik kann in 30 Minuten durchgeführt werden, wenn sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man unterstützte Biomembranen mithilfe der Lösungsmittel-unterstützten Lipid-Doppelschicht-Methode herstellt. Bei dem Versuch, dieses Verfahren durchzuführen, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, vor dem Experiment frische Lipidlösungen herzustellen und den Lösungsmittelaustausch gemäß Ihrer experimentellen Anordnung zu optimieren. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die Rasterkraftmikroskopie angewendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise zur Bildung von Membrandomänen.

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In diesem Video demonstrieren wir ein Verfahren zur Untersuchung der Septinorganisation auf einer glasgestützten Lipiddoppelschicht in vitro mittels Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie.

Planar Supported Lipid Bilayer Assay: Eine mikroskopiebasierte In-vitro-Technik zur Untersuchung der Septin-Assemblierung auf biologischen Membranimitatoren

Dieses Video beschreibt die Technik zur Untersuchung der Septin-Protein-Assemblierung auf Mikrosphären, die mit Lipiddoppelschichten beschichtet sind. Diese Technik hilft beim Verständnis der krümmungsabhängigen Anordnungen von Proteinen auf gekrümmten Oberflächen.

Sphärisch gestützter Lipid-Doppelschicht-Assay: Eine Technik zur Beobachtung der Septin-Assemblierung auf Mikrosphären

Unterstützten Lipiddoppelschichten und natürlichen Membran Teilchen sind praktisch Systeme, die die Eigenschaften von Zellmembranen annähern kann und in einer Vielzahl von Analysestrategien eingearbeitet werden. Hier zeigen wir ein Verfahren zur Herstellung von Mikroarrays der unterstützten Lipiddoppelschicht beschichtete SiO 2-Kugeln, Phospholipid-Vesikel oder natürlichen Membranpartikeln.

Bildung Biomembrane Microarrays mit einem Rakel-basierten Montageverfahren

Die Herstellung von proteinfunktionalisierten planaren glasgestützten Lipiddoppelschichten, die Bestimmung der Proteinmobilität innerhalb und die Messung von Proteindichten wird hier gezeigt. Es wird eine Roadmap zum Bau eines rauschreduzierten Totalreflexionsmikroskops skizziert, das die Visualisierung von in einzelnen Doppelschichten residenten Fluorochromen mit hoher raumzeitlicher Auflösung ermöglicht.

Einzelmolekülfluoreszenzmikroskopie auf Planar Unterstützte Bilayers

Wir zeigen eine speicherbare, transportierbar Lipid-Doppelschicht Bildungssystem. Eine Lipid-Doppelschicht-Membran kann mit mehr als 80% Erfolgsquote innerhalb von 1 h gebildet werden, wenn eine gefrorene Membran Vorläufer auf Umgebungstemperatur gebracht wird. Dieses System wird mühsamen Prozesse reduzieren und Know-how mit Ionenkanälen verbunden.

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Hier präsentieren wir zwei ultraschnelle Protokolle zur Rekonstitution von Membranproteinen in Fusogenic Proteoliposomes und Verschmelzung von solchen Proteoliposomes mit Ziel Lipid Bilayer für Waschmittel-freie Lieferung dieser Membran Proteine in der postfusion Bilayer. Die Kombination dieser Ansätze ermöglicht schnelle und leichtführig Montage von komplexen Mehrkomponenten Membransystemen.

Waschmittel-freie ultraschnelle Rekonstitution von Membranproteinen in Lipid Bilayer mit Fusogenic ergänzende Rechnung Proteoliposomes.

Mitochondriale Fusion ist eine wichtige panostatische Reaktion, die der mitochondrialen Dynamik zugrunde liegt. Hier wird ein In-vitro-Rekonstitutionssystem beschrieben, um die mitochondriale Innenmembranfusion zu untersuchen, die Membran-Tethering, Andocken, Hämifusion und Porenöffnung auflösen kann. Die Vielseitigkeit dieses Ansatzes bei der Erforschung von Zellmembransystemen wird diskutiert.

Eine Modellmembranplattform zur Rekonstituierung der mitochondrialen Membrandynamik

Dieses Protokoll beschreibt die Bildung von Zell-imitierenden Uni-Lipid- und Multi-Lipid-Vesikeln, unterstützten Lipiddoppelschichten und suspendierten Lipiddoppelschichten. Diese In-vitro-Modelle können angepasst werden, um eine Vielzahl von Lipidtypen zu integrieren und können verwendet werden, um verschiedene Molekül- und Makromolekül-Interaktionen zu untersuchen.

Assemblierung von zellimitierenden unterstützten und suspendierten Lipiddoppelschichtmodellen zur Untersuchung molekularer Wechselwirkungen

Die zellfreie Rekonstitution war ein Schlüsselwerkzeug, um die Zytoskelett-Montage zu verstehen, und die Arbeit in den letzten zehn Jahren hat Ansätze zur Untersuchung der Septindynamik in minimalen Systemen etabliert. Hier werden drei komplementäre Methoden zur Beobachtung der Septinmontage in verschiedenen Membrankontexten vorgestellt: planare Doppelschichten, sphärische Stützen und Stabstützen.

Rekonstitution von Septin-Assemblierungen an Membranen zur Untersuchung biophysikalischer Eigenschaften und Funktionen

Hier wird ein Protokoll zur Durchführung und Analyse der Bindung, Mobilität und Assemblierung einzelner Moleküle auf künstlichen überfüllten Lipidmembranen unter Verwendung der Einzelmolekül-Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (smTIRF) vorgestellt.

Einzelmoleküldiffusion und Assemblierung auf polymerüberfüllten Lipidmembranen

Dieser Artikel bietet eine detaillierte Beschreibung, wie Proben für die Tracking von Einzelproteinen in festgestützten Lipiddoppelschichten erstellt werden können. Es erklärt außerdem ein einfaches Fluoreszenzmikroskop mit Einzelmolekülempfindlichkeit und hoher Bildrate. Abschließend skizzieren wir das Verfahren zur Extraktion von Einzelprotein-Trajektorien.

Verfolgung einzelner Proteine in Lipid-Doppelschichten mittels Fluoreszenzmikroskopie

Lernen Sie die SALB-Methode zur Herstellung unterstützter Lipiddoppelschichten auf Festkörpersubstraten. Diese vereinfachte Technik ermöglicht die Untersuchung von Membranproteinen für Arzneimittelforschung und molekulare Diagnostik.

Biomembran Fabrication durch das Lösungsmittel-unterstützten Lipiddoppelschicht (SALB) Methode

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