Schicht-für-Schicht der Kollagenabscheidung in Mikrofluidik-Vorrichtungen zum Microtissue Stabilization
29. September 2015
Die Erzeugung von funktionellen Mikrogeweben in mikrofluidischen Geräten erfordert die Stabilisierung von Zellphänotypen durch Anpassung traditioneller Zellkulturtechniken an die begrenzten räumlichen Dimensionen in Mikrogeräten. Die Modifikation von Kollagen ermöglicht die schichtweise Abscheidung ultradünner Kollagenanordnungen, die Primärzellen wie Hepatozyten als mikrofluidische Gewebemodelle stabilisieren können.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine dünne Kollagenanordnung in einem mikrofluidischen Gerät auf Zellen abzuscheiden. Dies wird erreicht, indem zunächst angesäuertes natives Kollagen durch Methylierung modifiziert wird, um positiv geladene Kollagenmoleküle zu erzeugen. Der zweite Schritt besteht darin, angesäuertes natives Kollagen durch Ation zu modifizieren, um negativ geladene Kollagenmoleküle zu erzeugen.
Als nächstes werden die mikrofluidischen Geräte vorbereitet und mit Hepatozyten besiedelt, die sich über Nacht anheften und ausbreiten können. Der letzte Schritt besteht darin, die Kollagenanordnung abzuscheiden, indem die Zellen abwechselnd den positiv und negativ geladenen Kollagenlösungen ausgesetzt werden, um 10 Doppelschichten Kollagen auf der Zellschicht zu erzeugen. Letztendlich werden Phasen- und Immunfluoreszenzmikroskopie sowie Albumin- und Harnstoffassays verwendet, um die Entwicklung und Aufrechterhaltung der Zellpolarität und sekretorischen Funktion zu zeigen.
Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie die Hepatozytenkultur in Mikrogeräten mit ähnlichen Techniken ermöglicht, die seit über 20 Jahren in Plattenkulturen angewendet werden. Es sind keine komplexen Bauelementdesigns erforderlich und die abgeschiedene Matrix ist sehr dünn in der Größenordnung von 100 Nanometern. Wir hatten die Idee zu dieser Methode zum ersten Mal, als wir darüber nachdachten, wie man Capy-Zellkulturtechniken von Platten auf mikrofluidische Geräte übertragen könnte.
Die Kollagen-Sandwich-Methode funktioniert in offenen mikroskopischen Systemen, aber die verwendeten Hydrogele sind nicht kompatibel mit geschlossenen Mikrogeräten mit begrenzten Kanalhöhen. Verdünnen Sie 100 Milligramm einer nativen angesäuerten Kollagenlösung auf eine Konzentration von 0,5 Milligramm pro Milliliter mit Eis, kaltem, sterilem Wasser und legen Sie die Lösung auf Eis, um eine Albildung zu verhindern. Stellen Sie anschließend den pH-Wert der Kollagenlösung mit ein paar Tropfen eines normalen Natriumhydroxids auf neun bis 10 ein und rühren Sie die Lösung 30 Minuten lang vorsichtig bei Raumtemperatur um.
Wenn das Kollagen ausfällt, beginnt die Lösung trüb zu werden, schleudern Sie die ausgefällte Kollagenlösung 3000 Mal G für 25 Minuten herunter. Danach sollte ein klarer gelartiger Niederschlag im Boden der Röhrchen sichtbar sein, das Snat aspirieren und dann das gefällte Kollagen in 200 Millilitern Methanol mit 0,1 % normaler Salzsäure resuspendieren. Lassen Sie die Methylierungsreaktion unter Rühren bei Raumtemperatur für vier Tage nach der Methylierungszentrifuge ablaufen, die Lösung bei 3000 mal G für 25 Minuten zum Pelletieren des methylierten Kollagens, Anschließend aspirieren und entsorgen Sie das angesäuerte Methanolsupinat. Als nächstes lösen Sie das methylierte Kollagen in 25 Millilitern sterilem PBS auf und filtrieren Sie die Lösung durch ein 60-Mikron-Zellsieb.
Stellen Sie den pH-Wert der Lösung auf 7,3 bis 7,4 ein, indem Sie 20 Mikroliter eines normalen Natriumhydroxids verwenden. Beurteilen Sie die Konzentration der Kollagenlösung mit einem handelsüblichen Kollagen-ELIZA-Kit für Ratten oder einem Hydroxyprolin-Assay-Kit. Verdünnen Sie dann die Lösung auf drei Milligramm pro Milliliter mit sterilem PBS.
Sterilisieren Sie die methylierte Kollagenlösung, indem Sie sie in eine Glasflasche mit Schraubverschluss umfüllen. Vorsichtig drei Milliliter Chloroform auf den Boden der Flasche schichten und die Flasche über Nacht auf vier Grad Celsius fest werden lassen. Am nächsten Morgen.
Entfernen Sie aseptisch die oberste methylierte Kollagenschicht. Lagern Sie das methylierte Kollagen bei vier Grad Celsius und verwenden Sie es innerhalb eines Monats. Verdünnen Sie weitere 100 Milligramm native angesäuerte Kollagenlösung auf eine Konzentration von 0,5 Milligramm pro Milliliter mit Eis, kaltem, sterilem Wasser und legen Sie die Lösung auf Eis, um eine Dation zu verhindern, wie zuvor gezeigt, stellen Sie den pH-Wert der Kollagenlösung mit Natriumhydroxid ein und rühren Sie die Lösung bei Raumtemperatur um, um das Kollagen auszufällen.
Als nächstes lösen Sie 40 Milligramm sechs Cynikanhydrid in 10 Millilitern Aceton. Geben Sie diese Mischung langsam in Schritten von 0,5 Millilitern in die Kollagenlösung, während Sie den pH-Wert der Lösung umrühren und kontinuierlich überwachen. Halten Sie den pH-Wert über 9,0, indem Sie ein oder zwei Tropfen eines normalen Natriumhydroxids hinzufügen, wenn sich der pH-Wert 9,0 nähert, und rühren Sie 120 Minuten lang kontinuierlich bei Raumtemperatur um.
Beobachten Sie nach der Zugabe aller sechs Cynic- und Hydrid-Lösungen, wie die Mischung klar wird, wenn sich das Succinat-Kollagen auflöst, und überprüfen Sie weiterhin regelmäßig den pH-Wert, um sicherzustellen, dass er über 9,0 bleibt. Wenn sich das gesamte Succinat-Kollagen aufgelöst hat, stellen Sie den pH-Wert der Lösung auf 4,0 ein, indem Sie 20 Mikroliter einer normalen Salzsäure verwenden. Beobachten Sie die Lösung, die wieder trüb wird, wenn das Succinatkollagen ausfällt.
Zentrifugieren Sie anschließend die Lösung 25 Minuten lang bei 3000 mal G. Um das Succinatkollagen zu pelletieren, zu vergraben und die angesäuerte Snat mit nicht reaktivem Snicanhydrid zu entsorgen, lösen Sie das Succinat-Kollagen durch wiederholtes Pipettieren in 25 Millilitern sterilem PBS auf, was eine Endkonzentration von etwa drei Milligramm pro Milliliter ergibt. Filtrieren Sie dann die Lösung durch ein 60-Mikron-Zellsieb und stellen Sie dann den pH-Wert der Lösung auf 7,3 bis 7,4 ein.
Bestimmen Sie die Konzentration der Lösung in Schritten von 20 Mikrolitern eines normalen Natriumhydroxids mit einem handelsüblichen Kollagen-Ratten-ELIZA-Kit oder einem Hydroxyprolin-Assay-Kit. Verdünnen Sie dann die Lösung auf drei Milligramm pro Milliliter. Mit sterilem PBS sterilisieren Sie diese Kollagenlösung auf die gleiche Weise wie die methylierte Kollagenlösung.
Beginnen Sie mit der Herstellung eines mikrofluidischen Geräts mit Standardtechnik, das Zellkulturkammern mit einer Höhe von 100 Mikrometern, einer Breite von 0,4 bis 1,5 Millimetern und einem bis 10 Millimeter langen Kanal für das Zellwachstum aufweist. Verwenden Sie einen Plasmareiniger, um die Oberflächen des Geräts und eines Objektträgers zu oxidieren. Drücken Sie dann die beiden zusammen, um eine Verbindung zu bilden.
Nach der Sterilisation des Geräts durch Einwirkung von UV-Licht für mindestens 30 Minuten. Füllen Sie die Kammer mit 15 Mikrogramm pro Milliliter, Fibronektin in sterilem PBS und inkubieren Sie 45 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Sehen Sie sich als Nächstes das Gerät mit Zellen an, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben.
Bereiten Sie in einer Laminar-Flow-Gewebekulturhaube ausreichende Mengen methylierter und atierter Kollagenlösungen für 10 Anwendungen jeder Lösung pro Gerät sowie einige extreme Milliliter Medien vor. Halten Sie die Lösungen auf Eis. Spülen Sie die Geräte abwechselnd mit 20 Mikrolitern methylierten und dann atisierten Kollagenlösungen.
Warten Sie eine Minute zwischen jeder Anwendung. Spülen Sie das Gerät insgesamt 10 Mal pro Lösung. Arbeiten Sie schnell, um die Zeit zu minimieren, in der die Zellen ohne Medien sind, während Sie die Kollagenschichten wachsen lassen, es ist möglich, Kollagen langsam am Einlass und Auslass des mikrofluidischen Geräts anzusammeln.
Wenn der Widerstand gegen den Flüssigkeitsfluss zunimmt, spülen Sie das Gerät ein- oder zweimal mit dem Medium und fahren Sie dann mit dem Schichten fort. Nachdem Sie alle Schichten aufgetragen haben, spülen Sie das Gerät zweimal mit frischem Medium ab und kehren Sie in den Inkubator zurück. Methylierung und Ation verändern die Ladungseigenschaften der Kollagenmoleküle.
Die Ation entfernt positiv geladene Gruppen und ersetzt sie durch negativ geladene Gruppen, und die Methylierung entfernt negativ geladene Gruppen, wodurch positiv geladene Nettomoleküle entstehen, die eine schichtweise Ablagerung der beiden Kollagenvarianten auf geladenen Oberflächen wie Zellen ermöglichen. Primäre Hepatozyten, die in einem mikrofluidischen Gerät auf Fibronektin-beschichtetem Glas ausgeschieden sind, können Schicht für Schicht mit diesem beschichtet werden. Durch den Aufbau der Kollagenmatrix, die Ablagerung von 10 Doppelschichten auf den Zellen, entsteht Schicht für Schicht eine Kollagenschichtdicke von etwa 140 Nanometern Hepatozyten ohne oberes Kollagen.
Die Matrix verliert ihren differenzierten Phänotyp, zieht sich zusammen und hebt sich mit der Zeit von der Oberfläche der mikrofluidischen Geräte ab. Im Gegensatz dazu behalten Hepatozyten, die mit einer ultradünnen Kollagenanordnung bedeckt sind, ihre differenzierte Morphologie, eine Lebensfähigkeit von mehr als 90% und eine Polarisation über 14 Tage bei. Neben der Morphologie und Polarisation der Zellviabilität stellt die Kollagenschicht-für-Schicht-Technik auch die Funktion der primären Hepatozyten wieder her und stabilisiert sie, wie hier angegeben. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Kollagen methyliert und succiniert, um positiv und negativ geladene Kollagenlösungen herzustellen, und wie man sie Schicht für Schicht abscheidet, um dünne Kollagenanordnungen auf Zellen in mikrofluidischen Geräten zu erzeugen.
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Überblick
Diese Studie konzentriert sich auf die Ablagerung einer dünnen Kollagen-Anordnung auf Zellen innerhalb einer mikrofluidischen Vorrichtung, um Zellphänotypen zu stabilisieren. Die Methode beinhaltet die Modifizierung von Kollagen, um positiv und negativ geladene Moleküle zu erzeugen, die abwechselnd abgelagert werden, um eine mehrschichtige Struktur zu bilden.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Mikrofluidik
- Zellkultur
- Gewebe-Engineering
Hintergrund
- Mikrogewebe sind wichtig für die Nachahmung von Organfunktionen.
- Die Stabilisierung von Zellphänotypen ist entscheidend in mikrofluidischen Anwendungen.
- Kollagen ist eine Schlüsselkomponente im Gewebe-Engineering.
- Schichtenweise Ablagerungstechniken verbessern die Zellfunktionalität.
Ziel der Studie
- Eine Methode für die Kollagen-Anordnungsablagerung in mikrofluidischen Vorrichtungen zu entwickeln.
- Primäre Zellen wie Hepatozyten für Gewebemodellierung zu stabilisieren.
- Zellpolarität und Sekretionsfunktionen nach der Ablagerung zu bewerten.
Verwendete Methoden
- Modifizierung von nativem Kollagen durch Methylierung und Atung.
- Vorbereitung von mikrofluidischen Vorrichtungen und Besäung mit Hepatozyten.
- Schichtenweise Ablagerung von Kollagen durch abwechselnde Exposition von Zellen gegenüber geladenen Lösungen.
- Verwendung von Phasen- und Immunfluoreszenzmikroskopie zusammen mit Albumin- und Harnstoff-Assays.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Ablagerung von 10 Kollagen-Doppelschichten auf Hepatozyten.
- Nachgewiesene Erhaltung der Zellpolarität.
- Bestätigte Sekretionsfunktion der Hepatozyten durch Assays.
- Visualisierung der strukturellen Integrität mittels Mikroskopietechniken.
Schlussfolgerungen
- Die Methode stabilisiert effektiv Zellphänotypen in Mikrovorrichtungen.
- Schichtenweise Kollagenablagerung verbessert die Funktionalität des Gewebemodells.
- Dieser Ansatz kann auf andere Zelltypen für verschiedene Anwendungen übertragen werden.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Stabilizing primary hepatocyte morphology and function in microfluidic devices remains a critical challenge for liver tissue modeling and drug metabolism studies. This layer-by-layer collagen deposition technique enables long-term culture of microtissues by creating ultrathin, biocompatible matrices that recapitulate key aspects of the native extracellular matrix. By supporting differentiated phenotypes for over 14 days, the method improves predictive confidence in preclinical hepatocyte-based assays, reducing biological variability that can compromise lead identification and safety screening outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of hepatocyte-specific pathways by maintaining polarized morphology and secretory function essential for target validation in liver disease models.
- Operational Value: Reduces phenotypic drift during culture, increasing reproducibility of functional readouts used to de-risk mechanistic hypotheses.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized collagen-coated microfluidic platforms that support quantitative albumin and urea assays for consistent compound screening.
- Operational Value: Compatible with existing microfluidic fabrication workflows, allowing scalable integration into automated screening systems without complex device redesign.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains hepatocyte differentiation and function over two weeks, supporting preclinical continuity from discovery to toxicology studies.
- Operational Value: Extends the usable window for longitudinal assessment of drug-induced liver injury (DILI) biomarkers in microfluidic tissue models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum by enabling stable hepatocyte cultures that support early-stage assay development and preclinical validation of liver-targeted therapeutics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by preserving hepatocyte polarity and function, which are critical for assessing target engagement in metabolic pathways.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts via albumin and urea secretion, facilitating reliable compound evaluation in microtissue formats.
- Analytics: Generates functional endpoints that allow cross-condition comparison of hepatocyte health and metabolic activity.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by stabilizing phenotypes needed for disease-relevant modeling.
- Enterprise Reuse: Represents a adaptable surface modification technique applicable across multiple microfluidic platforms and cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through maintenance of differentiated hepatocyte phenotype and function over extended culture periods.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via ultrathin, precisely deposited collagen layers that minimize batch variability.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing false negatives from dedifferentiated cells in liver toxicity screening.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of candidates based on stable, long-term functional readouts from microfluidic liver models.
Implementation Considerations
- Expertise in collagen chemistry and microfluidic device preparation is required for methylation and succination steps.
- Access to centrifugation, pH control, and sterile filtration infrastructure is necessary for collagen modification.
- Standardization across teams depends on consistent layering timing and solution handling to ensure uniform thin-film deposition.
- Adaptation to other cell types requires validation of collagen compatibility and impact on phenotype stability.
- Practical limitations include the incompatibility of hydrogels with closed microfluidic devices having limited channel heights, as noted in the source.
