Name: Schicht-für-Schicht der Kollagenabscheidung in Mikrofluidik-Vorrichtungen zum Microtissue Stabilization (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Lernen Sie die schichtweise Kollagenabscheidung in Mikrofluidik-Vorrichtungen zur Stabilisierung von Hepatozyten-Phänotypen. Diese Methode ermöglicht die Kultivierung differenzierter Zellen in geschlossenen Mikrosystemen.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health unterstützt, einschließlich eines Zuschusses des Mikrophysiologischen Systemkonsortiums des National Center for Advancing Translational Sciences (UH2TR000503), eines Ruth L. Kirschstein National Research Service Award Postdoctoral Fellowship (F32DK098905 für WJM) und eines Pathway to Independence Award (DK095984 für AB) vom National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases.

1. Herstellung der Mutter Soluble Collagen-Lösung <ol><li> Bereiten Sie oder kaufen 200 mg angesäuert, lösliche, Kollagen Typ I aus Rattenschwänzen bei 1-3 mg / 15 ml mit Standard-Isolierung-Protokolle, wie durch Piez et al. </li><li> Skalieren der Menge des Ausgangsmaterials, bezogen auf das gewünschte Endvolumen modifizierte Kollagenlösungen. Etwa machen 25-30 ml methylierter und 25-30 ml succinylierte Kollagenlösungen, die jeweils auf 3 mg / ml, 200 mg lösliches natives Kollagen. </li></ol> 2. Collagen Methylierung <ol><li> Verdünnen Sie 100 mg des nativen, angesäuert (pH 2-3) Kollagenlösung auf eine Konzentration von 0,5 mg / mit eiskaltem sterilem Wasser ml und halten Sie die Lösung auf Eis, um die Gelierung zu verhindern. </li><li> Der pH-Wert der Kollagenlösung auf 9-10 mit einigen Tropfen 1 N NaOH und rührt bei Raumtemperatur 30 min. Beachten Sie die Kollagenniederschlag, so dass die Lösung trüb zu werden. </li&gt; <li> Spin down das ausgefallene Kollagenlösung bei 3.000 · g für 25 min. Eine klare, gelartige Ausfällung sollte der Boden der Röhrchen sichtbar. Absaugen und entsorgen der überstehenden Flüssigkeit. </li><li> Resuspendieren fällte Kollagen in 200 ml Methanol mit 0,1 N HCl und ermöglichen dem Methylierungsreaktion unter Rühren bei RT für 4 Tage auf. Das Kollagen wird nicht auflösen, sollte aber abgesehen in sehr kleine Stücke, die sichtbar die Lösung trübe machen zu brechen. </li><li> Nach der Methylierung, Zentrifuge die Lösung bei 3.000 × g für 25 Minuten, um die methylierte Kollagen zu pelletieren. Absaugen und entsorgen Sie die angesäuerte Methanolstand. </li><li> Auflösen methyliertes Kollagen in 25 ml sterilem PBS, was eine Konzentration von etwa 3 mg / ml, mit wiederholten Pipettieren, und filtriert die Lösung durch ein 60 &amp; mgr; m Zellsieb. Einstellen des pH der Lösung auf 7,3-7,4 unter Verwendung von 20 &amp; mgr; l in Schritten von 1 N NaOH. </li><li> Beurteilen Sie die concentration-Wert der Lösung unter Verwendung eines kommerziellen ELISA-Kits Ratten Kollagen oder Hydroxyprolin-Testkit. Verdünnen der Lösung, um 3 mg / ml mit steriler PBS. </li><li> Sterilisieren Sie die methylierte Kollagenlösung durch Überweisung auf eine Glasflasche mit einem Schraubverschluss, sorgfältig Schichtung 3 ml Chloroform am Boden der Flasche, damit die Flasche, um O / N bei 4 ° C aseptisch eingestellt, und entfernen Sie dann und speichern Sie die obere Schicht, die die methylierte Kollagen ist. </li><li> Bewahren Sie die Lösung bei 4 ° C für den Einsatz innerhalb von 1 Monat. </li></ol> 3. Kollagen Succinylierung <ol><li> Verdünnen Sie die anderen 100 mg des nativen, angesäuert (pH 2-3) Kollagenlösung auf eine Konzentration von 0,5 mg / mit eiskaltem sterilem Wasser ml und halten Sie die Lösung auf Eis, um die Gelierung zu verhindern. </li><li> Der pH-Wert der Kollagenlösung auf 9-10 mit einigen Tropfen 1 N NaOH und rührt bei Raumtemperatur 30 min. Das Kollagen muss ausfallen, wodurch die Lösung trüb zu werden. </li><li> Man löst 40 mg succinic Anhydrid (0,4 mg pro mg Kollagen) in 10 ml Aceton (1/20 des Volumens der Kollagenlösung). Langsam (in ca. 0,5 ml-Schritten) diese Mischung zu der Kollagenlösung unter Rühren, während der pH kontinuierlich überwacht. Aufrechterhaltung des pH-Wertes über 9,0 durch Zugabe von 1 oder 2 Tropfen 1 N NaOH der pH-Wert 9,0 nähert. </li><li> Weiterhin Rühren bei RT 120 Minuten nach Zugabe des gesamten Bernsteinsäureanhydrid in Aceton. Beachten Sie die Lösung klar zu werden, wie die succinylierte Kollagen löst. Den pH-Wert in regelmäßigen Abständen überprüfen, um sicherzustellen, dass es über 9,0 bleibt. </li><li> Einstellen des pH der Lösung auf 4,0 mit 20 ul Schritten von 1 N HCl. Beachten Sie die Lösung trüb wieder, wie die succinylierte Kollagen ausfällt. </li><li> Nach der Succinylierung, Zentrifuge die Lösung bei 3.000 × g für 25 Minuten, um die succinylierte Kollagen zu pelletieren. Absaugen und entsorgen Sie die angesäuerte Überstand mit nicht umgesetztem Bernsteinsäureanhydrid. </li><li> Man löst den succinyliert Kollagenin 25 ml sterilem PBS, was eine Konzentration von etwa 3 mg / ml, mit wiederholten Pipettieren, und filtriert die Lösung durch ein 60 &amp; mgr; m Zellsieb. Einstellen des pH der Lösung auf 7,3-7,4 unter Verwendung von 20 &amp; mgr; l in Schritten von 1 N NaOH. </li><li> Beurteilen Sie die Konzentration der Lösung unter Verwendung eines kommerziellen Collagen Ratten ELISA-Kit oder Hydroxyprolin-Assay-Kit. Verdünnen der Lösung, um 3 mg / ml mit steriler PBS. </li><li> Sterilisieren Sie die succinylierte Kollagenlösung durch Überweisung auf eine Glasflasche mit einem Schraubverschluss, sorgfältig Schichtung 3 ml Chloroform am Boden der Flasche, damit die Flasche, um O / N bei 4 ° C aseptisch eingestellt, und entfernen Sie dann und speichern Sie die obere Schicht, die die succinylierte Kollagen ist. </li><li> Bewahren Sie die Lösung bei 4 ° C für den Einsatz innerhalb von 1 Monat. </li></ol> 4. Überprüfung des Collagen Änderungen <ol><li> Bereiten Sie 1 ml-Proben von jedem der nativen, methylierte und succinylierte Kollagenlösungen und mit Wasser auf eine konzentration von 0,1 mg / mit sterilem Reinwasser für die Wasserstoffionen-Titration ml. Weitere verdünnen Puffer mindestens 1000-fach durch Dialyse gegen Wasser durch eine 10 kDa Cutoff membraneusing 3-Lösung Änderungen für jede mindestens 4 Std. </li><li> Einstellen des pH der Lösungen auf 7,3 mit kleinen Mengen von NaOH und HCl. Verwenden von pH 7,3 als eine willkürliche Referenz, führen Wasserstoffionen-Titration auf jede der Proben, wie durch Tanford 16 beschrieben, um Titrationskurven für die nativen, methylierte und succinyliert Kollagenlösungen erstellen. </li><li> Zur Erstellung der pH-Änderung pro Volumen an zugesetzter Säure gegenüber der Anzahl der gebundenen H + -Ionen pro Molekül. Der hohe pH-Wert &quot;Amino&quot; Bereich sollte eine Verschiebung in der succinylierte Kollagen in Richtung der Sternpunkt (ein Verlust von Amingruppen) zeigen, und der niedrige pH-Wert &quot;Carboxy&quot; Bereich sollte eine Linksverschiebung im methyliertes Kollagen (ein Verlust von Carboxylgruppen zeigen ) und eine Rechtsverschiebung in der succinyliertes Kollagen (eine Verstärkung in Carboxylgruppes), im Vergleich zur nativen Kollagen. </li><li> Beurteilen Sie die Wirksamkeit des Succinylierung Reaktion durch die Bestimmung der% der Aminogruppen in der nativen Kollagens durch Succinylierung ersetzt mit dem 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBA) kolorimetrisches Verfahren, nach Standardprotokollen 17,18. </li></ol> 5. Herstellung von Mikrofluidik-Geräte und Zellaussaat <ol><li> Fertigen mikrofluidischen Systemen mit Standardverfahren 9. Verwenden Replik Formen von PDMS aus SU-8 Master auf Silizium unter Verwendung der Photolithographie zur mikrofluidischen Zellkulturkammern mit 100 &amp; mgr; m groß, 0,4-1,5 mm breit und 1-10 mm lange Kanäle für das Zellwachstum zu schaffen definiert. </li><li> Verwenden Sie einen Plasma-Reiniger, um die Oberflächen des Gerätes und einen Glasobjektträger zu oxidieren, und drücken Sie dann zusammen zu binden. Nach der Sterilisierung der Vorrichtung durch Exposition gegenüber UV-Licht für mindestens 30 min, Füllen der Kammer mit 50 &amp; mgr; g / ml Fibronectin in sterilem PBS und Inkubation bei 37 ° C für 45 min. </li&gt; <li> Samen der Vorrichtung mit Zellen, wie primären Ratten oder menschliche Hepatozyten, die ein Kollagen-Gel für die Stabilisierung des Phänotyps oder Differenzierungszustand erfordern. Wir verwenden 20 ul frisch isolierten primären Ratten-Hepatozyten 7,19 oder handelsübliche kryokonservierten primären humanen Hepatozyten in 14 × 10 6 Zellen / ml pro Gerät ausgesät. </li><li> Lassen Sie die Zellen für 4-6 h zu befestigen, und dann waschen Sie ungebundene Zellen und ersetzen Sie die Plattenmedien mit Wachstumsmedien. Inkubieren Sie O / N, um volle Zelle sicherzustellen verbreiten und eine konfluente Monoschicht von Zellen. </li></ol> 6. Schicht-für-Schicht Kollagenablagerung <ol><li> In einer laminaren Strömung Gewebekultur Kapuze, vorzubereiten ausreichenden Mengen methylierter und succinylierte Kollagenlösungen für 10 Anwendungen jeder Lösung pro Gerät, sowie ein paar ml Medium. Bewahren Sie die Lösung auf Eis. Wir verwenden 20 &amp; mgr; l (10-15-fache des gesamten Gerätevolumen) Kollagen pro Schicht pro Gerät. </li><li> Seinfang mit der methylierten (polykationische) Lösung, alternative Spülen der Geräte mit 20 &amp; mgr; l von methylierten und dann succinyliert Kollagenlösungen, wartet 1 Minute zwischen jeder Anwendung. Spülen Sie das Gerät insgesamt 10-mal pro Lösung, die etwa 20 Minuten dauern sollte. Arbeiten Sie schnell auf der Höhe der Zeit sind die Zellen ohne Medien minimieren. </li><li> Beobachten Kollagen langsam ansammeln am Einlass / Auslass in Abhängigkeit von seiner Größe. Wenn der Strömungswiderstand erhöht, spülen Sie das Gerät einmal oder zweimal mit Medien, und dann weiter Schichtung. </li><li> Nach der Anwendung alle Schichten, spülen Sie das Gerät zweimal mit frischem Medium und zum Inkubator. Je nach Zelltyp, der extrazellulären Matrix-induzierte morphologische Veränderungen, wie erhöhte Polarisation in Hepatozyten, sollte innerhalb von wenigen Stunden sichtbar. </li><li> Vorbereitung repräsentativen Vorrichtungen für die Transmissionselektronenmikroskopie unter Verwendung von Standardverfahren, 9, um die Anwesenheit von einer Kollagenmatrix zu überprüfenAnordnung auf der Oberseite der kultivierten Zellen. </li></ol> 7. Die Stabilisierung der Zell-Phänotyp und Funktion <ol><li> Bild der Zellmorphologie, die Lebensfähigkeit und die Polarität mit Standardmethoden für den Zelltyp. Hepatozyten, Bilder zu sammeln über 14 Tage unter Verwendung der Phasenmikroskopie lebend / tot-Färbung auf Lebensfähigkeit und CMFDA Farbstoff zur apikalen Polarisation, um die Wirkungen des Kollagenablagerung zu demonstrieren. </li><li> Für Zellmorphologie, spülen Sie das Gerät durch den Einlass mit einer Pipette mit 20 ul PBS zu spülen, zu injizieren 20 ul PBS und Bild das Gerät unter Verwendung von Phasenkontrastmikroskopie. </li><li> Für lebend / tot-Färbung, spülen Sie das Gerät durch den Einlass mit einer Pipette mit 20 ul PBS zu spülen, zu injizieren 20 ul von LIVE / DEAD Färbelösung mit DAPI unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers, Inkubation 30 Min bei 37 ° C, spülen Sie die Gerät erneut mit 20 ul PBS und Bild das Gerät mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie. </li><li> Für Gallen canaliculi Färbung, spülen Sie das Gerät durch den Einlass mit einer Pipette mit 20 ul PBS zu spülen, zu injizieren 20 ul 2 uM CMFDA Färbelösung mit DAPI unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers, Inkubation 30 Min bei 37 ° C, spülen Sie das Gerät erneut mit 20 ul PBS und Bild das Gerät mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie. </li><li> Sammeln der verbrauchten Medien und messen zellulären Stoffwechselprodukte zu geeigneten Zeitpunkten über die Kulturdauer, um die Zellfunktion zu bestimmen. Hepatozyten, messen die Menge von Albumin und Harnstoff in den verbrauchten Medien. </li><li> Zuführen Endpunktfunktionsanalysen auf den Zellen selbst, wie die Beurteilung Enzymaktivitätsniveaus, Antikörperfärbung oder RNA-Analyse. Für Hepatozyten, zu induzieren und zu messen Cytochrom-P450-Enzymaktivitäten oder Phase-II-Konjugation Enzym Glutathion-S-Transferase. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Ultradünne reinem Kollagen Baugruppen auf geladenen Zellen oder Materialoberflächen mit Layer-by-Layer Deposition von modifizierten Kollagene hinterlegt. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass die Methylierung und Succinylierung von nativem Kollagen polykationische und polyanionische Kollagenlösungen (Abbildung 1), die mit der Schicht-für-Schicht-Technik verwendet werden kann, um ultradünne Kollagenmatrix Anordnungen an Zellen (2) zu hinterlegen oder andere geladene erstellen Materia...

Obwohl die Mikrofluidik die exquisite Kontrolle der zellulären Mikroumgebung ermöglicht, kann die Kultivierung von Zellen, insbesondere Primärzellen, in mikrofluidischen Geräten eine Herausforderung darstellen. Viele traditionelle Zellkulturtechniken wurden entwickelt, um die Zellfunktion bei der Kultivierung in Gewebekulturplatten zu erhalten und zu stabilisieren, aber die Übertragung dieser Techniken auf mikrofluidische Geräte ist oft schwierig. 
Eine solche Technik ist die Kultivierung von Zellen auf oder zwischen Kollagengelen als Modell der physiologischen 3D-Zellumgebung. 1 Kollagen Typ I ist aufgrund seiner Allgegenwart in der extrazellulären Matrix, der natürlichen Häufigkeit, der robusten Zellanheftungsstellen und der Biokompatibilität eines der am häufigsten verwendeten Proteine für Biomaterialien. 2 Viele Zellen profitieren von einer 3D-Kultur mit Kollagen, darunter Krebszellen3,45, mikrovaskuläre Endothelzellen6 und Hepatozyten7. Während die Verwendung von Kollagengelen in offenen Formaten, wie z. B. Gewebekulturplatten, einfach ist, machen die begrenzten Kanalabmessungen und die geschlossene Natur von mikrofluidischen Geräten die Verwendung von Flüssigkeiten, die gelieren, ohne den gesamten Kanal zu blockieren, unpraktisch.
Um dieses Problem zu lösen, haben wir die schichtweise Abscheidungstechnik8 mit chemischen Modifikationen von nativen Kollagenlösungen kombiniert, um ultradünne Kollagenanordnungen auf Zellen zu erzeugen, die in mikrofluidischen Geräten kultiviert wurden. Diese Schichten können die Zellmorphologie stabilisieren und ähnlich wie Kollagengele funktionieren und können in mikrofluidischen Geräten auf Zellen abgeschieden werden, ohne die Kanäle mit polymerisierter Matrix zu blockieren. Das Ziel dieser Methode ist es, natives Kollagen zu modifizieren, um polykationische und polyanionische Kollagenlösungen herzustellen und Zellen in mikrofluidischen Kulturen zu stabilisieren, indem dünne Kollagenmatrix-Anordnungen auf den Zellen abgeschieden werden. Diese Technik wurde verwendet, um die Morphologie und Funktion von primären Hepatozyten in mikrofluidischen Geräten zu stabilisieren. 9
Obwohl zuvor über schichtweise Abscheidung mit natürlichen und synthetischen Polyelektrolyten10 berichtet wurde, um Hepatozyten in Plattenkulturen11,12 und als Aussaatschicht für Hepatozyten in mikrofluidischen Geräten13,14 abzudecken, beschreibt dieses Verfahren die Abscheidung einer reinen Kollagenschicht auf Hepatozyten, wobei die 3D-Kollagenkulturtechniken nachgeahmt werden. In diesem Protokoll verwenden wir Hepatozyten als Beispielzellen, die mit Hilfe von 3D-Kollagenschichten aufrechterhalten werden können. Die vielen anderen Zelltypen, die von der 3D-Kultur in Kollagen profitieren, können in ähnlicher Weise von der Kultur nach schichtweiser Abscheidung einer ultradünnen Kollagenmatrix-Anordnung profitieren.

<table><tbody><tr><td>Kollagen Typ I, Rattenschwanz</td><td>Life Technologies</td><td>A1048301</td><td>Option für konzentriertes Rattenschwanzkollagen</td></tr><tr><td>Kollagen Typ I, Rattenschwanz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3867-1VL</td><td>Option für konzentriertes Rattenschwanzkollagen</td></tr><tr><td>Kollagen Typ I, Rattenschwanz</td><td>EMD Millipore</td><td>08-115</td><td>Option für konzentriertes Rattenschwanzkollagen</td></tr><tr><td>Kollagen Typ I, Rattenschwanz</td><td>R%D Systeme</td><td>3440-100-01</td><td>Option für konzentriertes Rattenschwanzkollagen-Bernsteinsäureanhydrid</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239690-50G</td><td>Succinylierungsreagenz</td></tr><tr><td>wasserfreies Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322415-100ML</td><td>Methylierungsreagenz</td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881-500G</td><td>pH-Fällungsreagenz</td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331-500ML</td><td>pH-Fällungsreagenz</td></tr><tr><td>Rattenkollagen Typ I ELISA</td><td>Chondrex</td><td>6013</td><td>Option zum Nachweis des Kollagengehalts</td></tr><tr><td>Hydroxyprolin-Assay-Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAK008-1KT,</td><td>Option zum Nachweis des Kollagengehalts</td></tr>, <tr><td>Hydroxyprolin-Assay-Kit</td><td>Quickzyme Biosciences</td><td>QZBtotcol1</td><td>Option zum Nachweis des Kollagengehalts</td></tr></tbody></table>

schicht-für-schicht der kollagenabscheidung in mikrofluidik-vorrichtungen zum microtissue stabilization

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Obwohl die Mikrofluidik eine exquisite Kontrolle der zellulären Mikroumgebung bietet, kann die Kultivierung von Zellen in mikrofluidischen Geräten challenging. 3D Kultur von Zellen in Kollagen-Typ-I-Gelen zur Stabilisierung der Zellmorphologie und -funktion beitragen, was für die Erstellung von mikrofluidischen Gewebemodellen in Mikrogeräten notwendig ist. Die Übertragung traditioneller 3D-Kulturtechniken für Gewebekulturplatten auf mikrofluidische Geräte ist aufgrund der begrenzten Kanalabmessungen oft schwierig. In dieser Methode beschreiben wir eine Technik zur Modifikation von nativem Typ-I-Kollagen, um polykationische und polyanionische Kollagenlösungen zu erzeugen, die mit schichtweiser Abscheidung verwendet werden können, um ultradünne Kollagenanordnungen auf Zellen zu erzeugen, die in mikrofluidischen Geräten kultiviert wurden. Diese dünnen Kollagenschichten stabilisieren die Zellmorphologie und -funktion, wie am Beispiel von primären Hepatozyten gezeigt wird, was die Langzeitkultur von Mikrogeweben in mikrofluidischen Geräten ermöglicht.

Natives Kollagen kann durch Methylierung und Succinylierung an polykationische und polyanionische Kollagenlösungen zur Verwendung in Schicht-für-Schicht-Abscheidungs ​​schaffen modifiziert werden. Succinylierung modifiziert die ε-Aminogruppen des nativen Kollagens mit Succinylgruppen und Methylierung modifiziert die Carboxylgruppen des nativen Kollagens mit einer Methylgruppe (1A). Diese Modifikationen der Kollagen-Protein Aminosäure-Seitenketten verändern die pH-Titrationskurven für die Lösungen. Succi...

Die Erzeugung von funktionellen Mikrogeweben in mikrofluidischen Geräten erfordert die Stabilisierung von Zellphänotypen durch Anpassung traditioneller Zellkulturtechniken an die begrenzten räumlichen Dimensionen in Mikrogeräten. Die Modifikation von Kollagen ermöglicht die schichtweise Abscheidung ultradünner Kollagenanordnungen, die Primärzellen wie Hepatozyten als mikrofluidische Gewebemodelle stabilisieren können.

Schicht-für-Schicht der Kollagenabscheidung in Mikrofluidik-Vorrichtungen zum Microtissue Stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine dünne Kollagenanordnung auf Zellen in einer mikrofluidischen Vorrichtung abzuscheiden. Dies wird erreicht, indem säurehaltiges natives Kollagen zunächst durch Methylierung modifiziert wird, um Kollagenmoleküle mit einer positiven Nettoladung zu erzeugen. Der zweite Schritt besteht darin, säurehaltiges natives Kollagen durch Carboxylierung zu modifizieren, um Kollagenmoleküle mit einer negativen Nettoladung zu erzeugen.Anschließend werden die mikrofluidischen Vorrichtungen vorbereitet und mit Hepatozyten besiedelt, die über Nacht andocken und sich ausbreiten können. Im letzten Schritt erfolgt die Abscheidung der Kollagenanordnung, indem die Zellen abwechselnd positiv und negativ geladenen Kollagenlösungen ausgesetzt werden, um 10 Kollagen-Bilagen auf der Zellschicht zu erzeugen. Abschließend werden Phasen- und Immunfluoreszenzmikroskopie sowie Albumin- und Harnstoff-Assays verwendet, um die Entwicklung und Aufrechterhaltung der Zellpolarität und sekretorischen Funktion nachzuweisen.Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie die Kultivierung von Hepatozyten in Mikrogeräten ermöglicht, wobei ähnliche Methoden wie bei Plattenkulturen angewandt werden, die bereits seit über 20 Jahren eingesetzt werden. Sie erfordert keine komplexen Gerätekonstruktionen, und die abgeschiedene Matrix ist sehr dünn, im Bereich von 100 Nanometern. Die Idee zu dieser Methode entstand erstmals, als wir darüber nachdachten, wie man Kultivierungstechniken für Kapillarzellen von Platten auf mikrofluidische Geräte übertragen könnte.Die Kollagen-Sandwich-Methode funktioniert in offenen mikroskopischen Systemen, die verwendeten Hydrogele sind jedoch mit geschlossenen Mikrogeräten mit begrenzter Kanalhöhe nicht kompatibel. Verdünnen Sie 100 Milligramm einer nativen, angesäuerten Kollagenlösung mit eiskaltem, sterilen Wasser auf eine Konzentration von 0,5 Milligramm pro Milliliter und stellen Sie die Lösung auf Eis, um eine Vernetzung zu verhindern. Danach stellen Sie den pH-Wert der Kollagenlösung mit einigen Tropfen einer einnormalen Natronlauge auf einen Wert zwischen neun und 10 ein und rühren die Lösung vorsichtig 30 Minuten bei Raumtemperatur um. Während das Kollagen ausfällt, wird die Lösung trüb werden. Zentrifugieren Sie die ausgefallene Kollagenlösung mit 3000 × g für 25 Minuten. Danach sollte sich am Röhrchenboden ein klarer, gelartiger Niederschlag absetzen. Aspirieren Sie das Überstand, und resuspendieren Sie das ausgefällte Kollagen anschließend in 200 Milliliter Methanol mit 0,1 normaler Salzsäure. Lassen Sie die Methylierungsreaktion unter Rühren bei Raumtemperatur über vier Tage stattfinden. Nach der Methylierung zentrifugieren Sie die Lösung mit 3000 × g für 25 Minuten, um das methylierte Kollagen zu pelletieren, danach aspirieren und entsorgen Sie das angesäuerte Methanol-Überstand. Lösen Sie danach das methylierte Kollagen in 25 Milliliter sterilem PBS auf und filtrieren Sie die Lösung durch einen 60-Mikrometer-Zellfilter.Stellen Sie den pH-Wert der Lösung unter Verwendung von 20-Mikroliter-Schritten einer normalen Natronlauge auf 7,3 bis 7,4 ein. Bestimmen Sie die Konzentration der Kollagenlösung mithilfe eines kommerziellen ELISA-Kits für Rattenkollagen oder eines Hydroxyprolin-Assay-Kits. Verdünnen Sie die Lösung anschließend mit steriler PBS auf drei Milligramm pro Milliliter.Sterilisieren Sie die methylierte Kollagenlösung, indem Sie sie in eine Glasflasche mit Schraubverschluss umfüllen. Schichten Sie vorsichtig drei Milliliter Chloroform am Boden der Flasche ab und lassen Sie die Flasche über Nacht bei vier Grad Celsius stehen. Am nächsten Morgen.Entfernen Sie unter aseptischen Bedingungen die obere methylierte Kollagenschicht. Bewahren Sie das methylierte Kollagen bei vier Grad Celsius auf und verwenden Sie es innerhalb eines Monats. Verdünnen Sie eine weitere Menge von 100 Milligramm natives, sauer eingesetztes Kollagen auf eine Konzentration von 0,5 Milligramm pro Milliliter mit eiskaltem, sterilem Wasser und stellen Sie die Lösung auf Eis, um eine Denaturierung zu verhindern. Wie zuvor gezeigt, stellen Sie den pH-Wert der Kollagenlösung mit Natriumhydroxid ein und rühren die Lösung bei Raumtemperatur um, um das Kollagen auszufällen.Als Nächstes lösen Sie 40 Milligramm Sechs-Cynic-Anhydrid in 10 Milliliter Aceton. Geben Sie diese Mischung in 0,5-Milliliter-Schritten unter Rühren langsam zur Kollagenlösung hinzu und überwachen Sie dabei kontinuierlich den pH-Wert der Lösung. Halten Sie den pH-Wert durch Zugabe von ein oder zwei Tropfen einer normalen Natriumhydroxidlösung über 9,0, wenn der pH-Wert 9,0 annähert, und rühren Sie weiterhin 120 Minuten bei Raumtemperatur.Nachdem alle sechs Portionen der Cyanid- und Hydridlösung hinzugefügt wurden, beobachten Sie, wie die Mischung klar wird, während das Succinat-Kollagen sich auflöst. Überprüfen Sie regelmäßig den pH-Wert, um sicherzustellen, dass er über 9,0 bleibt. Wenn sich das gesamte Succinat-Kollagen aufgelöst hat, stellen Sie den pH-Wert der Lösung mit jeweils 20 Mikroliter-Einheiten von einnormaler Salzsäure auf 4,0 ein. Beobachten Sie, wie die Lösung erneut trüb wird, während das Succinat-Kollagen ausfällt.Zentrifugieren Sie die Lösung anschließend bei 3000 × g für 25 Minuten. Um das Succinat-Kollagen-Pellet zu erhalten und das azidifizierte Snat mit inaktiver Snic-Anhydrid zu entsorgen, lösen Sie das Succinat-Kollagen durch mehrfaches Pipettieren in 25 Milliliter steriler PBS unter Erzielung einer Endkonzentration von etwa drei Milligramm pro Milliliter. Danach filtrieren Sie die Lösung durch einen 60-Mikron-Zellsieb und stellen anschließend den pH-Wert der Lösung auf einen Wert zwischen 7,3 und 7,4 ein.Unter Verwendung von 20 Mikroliter-Zugaben einer normalen Natronlauge bewerten Sie die Konzentration der Lösung mit einem kommerziellen Ratten-Kollagen-ELISA-Kit oder einem Hydroxyprolin-Assay-Kit. Anschließend verdünnen Sie die Lösung auf drei Milligramm pro Milliliter. Sterilisieren Sie diese ated Kollagenlösung mit steriler PBS auf die gleiche Weise wie die methylierte Kollagenlösung.Beginnen Sie mit der Herstellung eines mikrofluidischen Geräts mithilfe einer Standardmethode, das Zellkulturchambers mit 100&nbsp;Mikrometer hohen, 0,4 bis 1,5&nbsp;Millimeter breiten und ein bis zehn Millimeter langen Kanälen für das Zellwachstum aufweist. Verwenden Sie einen Plasma-Reiniger, um die Oberflächen des Geräts und eines Objektträgers zu oxidieren. Drücken Sie anschließend beide Teile zusammen, um eine Verbindung zu bilden.Nach der Sterilisation des Geräts durch Bestrahlung mit UV-Licht für mindestens 30 Minuten. Die Kammer mit 15 Mikrogramm pro Milliliter Fibronectin in sterilem PBS füllen und bei 37 Grad Celsius für 45 Minuten inkubieren. Als Nächstes das Gerät mit Zellen besiedeln, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben.In einer laminaren Luftströmungstisch-Zellkulturhaube ausreichende Mengen an methylierten und atierten Kollagenlösungen für jeweils 10 Applikationen pro Gerät sowie einige zusätzliche Milliliter Medium vorbereiten. Die Lösungen auf Eis halten. Die Geräte abwechselnd mit jeweils 20 Mikrolitern methylierter und dann atierter Kollagenlösung durchspülen.Warten Sie jeweils eine Minute zwischen den einzelnen Applikationen. Spülen Sie das Gerät insgesamt zehnmal pro Lösung durch. Arbeiten Sie zügig, um die Zeit, in der die Zellen während des Aufbaus der Kollagenschichten ohne Medium sind, zu minimieren; es ist möglich, langsam ansteigende Kollagenansammlungen am Einlass und Auslass des mikrofluidischen Geräts zu beobachten.Wenn der Widerstand gegen den Flüssigkeitsfluss zunimmt, spülen Sie das Gerät ein- oder zweimal mit Medium und fahren Sie anschließend mit der Schichtung fort. Nachdem alle Schichten aufgebracht wurden, spülen Sie das Gerät zweimal mit frischem Medium und stellen Sie es zurück in den Inkubator. Methylierung und Azetylierung verändern die Ladungseigenschaften der Kollagenmoleküle.Die Amidierung entfernt positiv geladene Gruppen und ersetzt sie durch negativ geladene Gruppen, während die Methylierung negativ geladene Gruppen entfernt und dadurch Moleküle mit einer netto positiven Ladung erzeugt. Dies ermöglicht eine schichtweise Abscheidung der beiden Kollagenvarianten auf geladenen Oberflächen wie Zellen. Primäre Hepatozyten, die in einer mikrofluidischen Vorrichtung auf mit Fibronectin beschichtetem Glas ausgesät wurden, können mit dieser schichtweisen Methode beschichtet werden. Die Assembly der Kollagenmatrix und die Abscheidung von 10 Bilagen auf den Zellen erzeugt eine Kollagenschichtdicke von etwa 140 Nanometern. Hepatozyten ohne eine obere, schichtweise aufgebrachte Kollagenschicht.Matrix verlieren im Laufe der Zeit ihr differenziertes Phänotyp, kontrahieren und lösen sich von der Oberfläche mikrofluidischer Geräte ab. Im Gegensatz dazu behalten Hepatozyten, die mit einer ultradünnen Kollagenanordnung bedeckt sind, ihre differenzierte Morphologie, eine Vitalität von über 90 % und Polarisation über einen Zeitraum von 14 Tagen bei. Neben der Zellvitalität, Morphologie und Polarisation ermöglicht die Kollagen-Layer-by-Layer-Technik zudem die Wiederherstellung und Stabilisierung der Funktion primärer Hepatozyten, wie hier gezeigt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Kollagen methyliert und succiniert, um netto positiv und negativ geladene Kollagenlösungen herzustellen, und wie man diese in der Layer-by-Layer-Abscheidung verwendet, um dünne Kollagenanordnungen auf Zellen in mikrofluidischen Geräten aufzubauen.

layer-layer-collagen-deposition-microfluidic-devices-for-microtissue

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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