Name: Schicht-für-Schicht der Kollagenabscheidung in Mikrofluidik-Vorrichtungen zum Microtissue Stabilization (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Lernen Sie die schichtweise Kollagenabscheidung in Mikrofluidik-Vorrichtungen zur Stabilisierung von Hepatozyten-Phänotypen. Diese Methode ermöglicht die Kultivierung differenzierter Zellen in geschlossenen Mikrosystemen.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health unterstützt, einschließlich eines Zuschusses des Mikrophysiologischen Systemkonsortiums des National Center for Advancing Translational Sciences (UH2TR000503), eines Ruth L. Kirschstein National Research Service Award Postdoctoral Fellowship (F32DK098905 für WJM) und eines Pathway to Independence Award (DK095984 für AB) vom National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases.

1. Herstellung der Mutter Soluble Collagen-Lösung <ol><li> Bereiten Sie oder kaufen 200 mg angesäuert, lösliche, Kollagen Typ I aus Rattenschwänzen bei 1-3 mg / 15 ml mit Standard-Isolierung-Protokolle, wie durch Piez et al. </li><li> Skalieren der Menge des Ausgangsmaterials, bezogen auf das gewünschte Endvolumen modifizierte Kollagenlösungen. Etwa machen 25-30 ml methylierter und 25-30 ml succinylierte Kollagenlösungen, die jeweils auf 3 mg / ml, 200 mg lösliches natives Kollagen. </li></ol> 2. Collagen Methylierung <ol><li> Verdünnen Sie 100 mg des nativen, angesäuert (pH 2-3) Kollagenlösung auf eine Konzentration von 0,5 mg / mit eiskaltem sterilem Wasser ml und halten Sie die Lösung auf Eis, um die Gelierung zu verhindern. </li><li> Der pH-Wert der Kollagenlösung auf 9-10 mit einigen Tropfen 1 N NaOH und rührt bei Raumtemperatur 30 min. Beachten Sie die Kollagenniederschlag, so dass die Lösung trüb zu werden. </li&gt; <li> Spin down das ausgefallene Kollagenlösung bei 3.000 · g für 25 min. Eine klare, gelartige Ausfällung sollte der Boden der Röhrchen sichtbar. Absaugen und entsorgen der überstehenden Flüssigkeit. </li><li> Resuspendieren fällte Kollagen in 200 ml Methanol mit 0,1 N HCl und ermöglichen dem Methylierungsreaktion unter Rühren bei RT für 4 Tage auf. Das Kollagen wird nicht auflösen, sollte aber abgesehen in sehr kleine Stücke, die sichtbar die Lösung trübe machen zu brechen. </li><li> Nach der Methylierung, Zentrifuge die Lösung bei 3.000 × g für 25 Minuten, um die methylierte Kollagen zu pelletieren. Absaugen und entsorgen Sie die angesäuerte Methanolstand. </li><li> Auflösen methyliertes Kollagen in 25 ml sterilem PBS, was eine Konzentration von etwa 3 mg / ml, mit wiederholten Pipettieren, und filtriert die Lösung durch ein 60 &amp; mgr; m Zellsieb. Einstellen des pH der Lösung auf 7,3-7,4 unter Verwendung von 20 &amp; mgr; l in Schritten von 1 N NaOH. </li><li> Beurteilen Sie die concentration-Wert der Lösung unter Verwendung eines kommerziellen ELISA-Kits Ratten Kollagen oder Hydroxyprolin-Testkit. Verdünnen der Lösung, um 3 mg / ml mit steriler PBS. </li><li> Sterilisieren Sie die methylierte Kollagenlösung durch Überweisung auf eine Glasflasche mit einem Schraubverschluss, sorgfältig Schichtung 3 ml Chloroform am Boden der Flasche, damit die Flasche, um O / N bei 4 ° C aseptisch eingestellt, und entfernen Sie dann und speichern Sie die obere Schicht, die die methylierte Kollagen ist. </li><li> Bewahren Sie die Lösung bei 4 ° C für den Einsatz innerhalb von 1 Monat. </li></ol> 3. Kollagen Succinylierung <ol><li> Verdünnen Sie die anderen 100 mg des nativen, angesäuert (pH 2-3) Kollagenlösung auf eine Konzentration von 0,5 mg / mit eiskaltem sterilem Wasser ml und halten Sie die Lösung auf Eis, um die Gelierung zu verhindern. </li><li> Der pH-Wert der Kollagenlösung auf 9-10 mit einigen Tropfen 1 N NaOH und rührt bei Raumtemperatur 30 min. Das Kollagen muss ausfallen, wodurch die Lösung trüb zu werden. </li><li> Man löst 40 mg succinic Anhydrid (0,4 mg pro mg Kollagen) in 10 ml Aceton (1/20 des Volumens der Kollagenlösung). Langsam (in ca. 0,5 ml-Schritten) diese Mischung zu der Kollagenlösung unter Rühren, während der pH kontinuierlich überwacht. Aufrechterhaltung des pH-Wertes über 9,0 durch Zugabe von 1 oder 2 Tropfen 1 N NaOH der pH-Wert 9,0 nähert. </li><li> Weiterhin Rühren bei RT 120 Minuten nach Zugabe des gesamten Bernsteinsäureanhydrid in Aceton. Beachten Sie die Lösung klar zu werden, wie die succinylierte Kollagen löst. Den pH-Wert in regelmäßigen Abständen überprüfen, um sicherzustellen, dass es über 9,0 bleibt. </li><li> Einstellen des pH der Lösung auf 4,0 mit 20 ul Schritten von 1 N HCl. Beachten Sie die Lösung trüb wieder, wie die succinylierte Kollagen ausfällt. </li><li> Nach der Succinylierung, Zentrifuge die Lösung bei 3.000 × g für 25 Minuten, um die succinylierte Kollagen zu pelletieren. Absaugen und entsorgen Sie die angesäuerte Überstand mit nicht umgesetztem Bernsteinsäureanhydrid. </li><li> Man löst den succinyliert Kollagenin 25 ml sterilem PBS, was eine Konzentration von etwa 3 mg / ml, mit wiederholten Pipettieren, und filtriert die Lösung durch ein 60 &amp; mgr; m Zellsieb. Einstellen des pH der Lösung auf 7,3-7,4 unter Verwendung von 20 &amp; mgr; l in Schritten von 1 N NaOH. </li><li> Beurteilen Sie die Konzentration der Lösung unter Verwendung eines kommerziellen Collagen Ratten ELISA-Kit oder Hydroxyprolin-Assay-Kit. Verdünnen der Lösung, um 3 mg / ml mit steriler PBS. </li><li> Sterilisieren Sie die succinylierte Kollagenlösung durch Überweisung auf eine Glasflasche mit einem Schraubverschluss, sorgfältig Schichtung 3 ml Chloroform am Boden der Flasche, damit die Flasche, um O / N bei 4 ° C aseptisch eingestellt, und entfernen Sie dann und speichern Sie die obere Schicht, die die succinylierte Kollagen ist. </li><li> Bewahren Sie die Lösung bei 4 ° C für den Einsatz innerhalb von 1 Monat. </li></ol> 4. Überprüfung des Collagen Änderungen <ol><li> Bereiten Sie 1 ml-Proben von jedem der nativen, methylierte und succinylierte Kollagenlösungen und mit Wasser auf eine konzentration von 0,1 mg / mit sterilem Reinwasser für die Wasserstoffionen-Titration ml. Weitere verdünnen Puffer mindestens 1000-fach durch Dialyse gegen Wasser durch eine 10 kDa Cutoff membraneusing 3-Lösung Änderungen für jede mindestens 4 Std. </li><li> Einstellen des pH der Lösungen auf 7,3 mit kleinen Mengen von NaOH und HCl. Verwenden von pH 7,3 als eine willkürliche Referenz, führen Wasserstoffionen-Titration auf jede der Proben, wie durch Tanford 16 beschrieben, um Titrationskurven für die nativen, methylierte und succinyliert Kollagenlösungen erstellen. </li><li> Zur Erstellung der pH-Änderung pro Volumen an zugesetzter Säure gegenüber der Anzahl der gebundenen H + -Ionen pro Molekül. Der hohe pH-Wert &quot;Amino&quot; Bereich sollte eine Verschiebung in der succinylierte Kollagen in Richtung der Sternpunkt (ein Verlust von Amingruppen) zeigen, und der niedrige pH-Wert &quot;Carboxy&quot; Bereich sollte eine Linksverschiebung im methyliertes Kollagen (ein Verlust von Carboxylgruppen zeigen ) und eine Rechtsverschiebung in der succinyliertes Kollagen (eine Verstärkung in Carboxylgruppes), im Vergleich zur nativen Kollagen. </li><li> Beurteilen Sie die Wirksamkeit des Succinylierung Reaktion durch die Bestimmung der% der Aminogruppen in der nativen Kollagens durch Succinylierung ersetzt mit dem 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBA) kolorimetrisches Verfahren, nach Standardprotokollen 17,18. </li></ol> 5. Herstellung von Mikrofluidik-Geräte und Zellaussaat <ol><li> Fertigen mikrofluidischen Systemen mit Standardverfahren 9. Verwenden Replik Formen von PDMS aus SU-8 Master auf Silizium unter Verwendung der Photolithographie zur mikrofluidischen Zellkulturkammern mit 100 &amp; mgr; m groß, 0,4-1,5 mm breit und 1-10 mm lange Kanäle für das Zellwachstum zu schaffen definiert. </li><li> Verwenden Sie einen Plasma-Reiniger, um die Oberflächen des Gerätes und einen Glasobjektträger zu oxidieren, und drücken Sie dann zusammen zu binden. Nach der Sterilisierung der Vorrichtung durch Exposition gegenüber UV-Licht für mindestens 30 min, Füllen der Kammer mit 50 &amp; mgr; g / ml Fibronectin in sterilem PBS und Inkubation bei 37 ° C für 45 min. </li&gt; <li> Samen der Vorrichtung mit Zellen, wie primären Ratten oder menschliche Hepatozyten, die ein Kollagen-Gel für die Stabilisierung des Phänotyps oder Differenzierungszustand erfordern. Wir verwenden 20 ul frisch isolierten primären Ratten-Hepatozyten 7,19 oder handelsübliche kryokonservierten primären humanen Hepatozyten in 14 × 10 6 Zellen / ml pro Gerät ausgesät. </li><li> Lassen Sie die Zellen für 4-6 h zu befestigen, und dann waschen Sie ungebundene Zellen und ersetzen Sie die Plattenmedien mit Wachstumsmedien. Inkubieren Sie O / N, um volle Zelle sicherzustellen verbreiten und eine konfluente Monoschicht von Zellen. </li></ol> 6. Schicht-für-Schicht Kollagenablagerung <ol><li> In einer laminaren Strömung Gewebekultur Kapuze, vorzubereiten ausreichenden Mengen methylierter und succinylierte Kollagenlösungen für 10 Anwendungen jeder Lösung pro Gerät, sowie ein paar ml Medium. Bewahren Sie die Lösung auf Eis. Wir verwenden 20 &amp; mgr; l (10-15-fache des gesamten Gerätevolumen) Kollagen pro Schicht pro Gerät. </li><li> Seinfang mit der methylierten (polykationische) Lösung, alternative Spülen der Geräte mit 20 &amp; mgr; l von methylierten und dann succinyliert Kollagenlösungen, wartet 1 Minute zwischen jeder Anwendung. Spülen Sie das Gerät insgesamt 10-mal pro Lösung, die etwa 20 Minuten dauern sollte. Arbeiten Sie schnell auf der Höhe der Zeit sind die Zellen ohne Medien minimieren. </li><li> Beobachten Kollagen langsam ansammeln am Einlass / Auslass in Abhängigkeit von seiner Größe. Wenn der Strömungswiderstand erhöht, spülen Sie das Gerät einmal oder zweimal mit Medien, und dann weiter Schichtung. </li><li> Nach der Anwendung alle Schichten, spülen Sie das Gerät zweimal mit frischem Medium und zum Inkubator. Je nach Zelltyp, der extrazellulären Matrix-induzierte morphologische Veränderungen, wie erhöhte Polarisation in Hepatozyten, sollte innerhalb von wenigen Stunden sichtbar. </li><li> Vorbereitung repräsentativen Vorrichtungen für die Transmissionselektronenmikroskopie unter Verwendung von Standardverfahren, 9, um die Anwesenheit von einer Kollagenmatrix zu überprüfenAnordnung auf der Oberseite der kultivierten Zellen. </li></ol> 7. Die Stabilisierung der Zell-Phänotyp und Funktion <ol><li> Bild der Zellmorphologie, die Lebensfähigkeit und die Polarität mit Standardmethoden für den Zelltyp. Hepatozyten, Bilder zu sammeln über 14 Tage unter Verwendung der Phasenmikroskopie lebend / tot-Färbung auf Lebensfähigkeit und CMFDA Farbstoff zur apikalen Polarisation, um die Wirkungen des Kollagenablagerung zu demonstrieren. </li><li> Für Zellmorphologie, spülen Sie das Gerät durch den Einlass mit einer Pipette mit 20 ul PBS zu spülen, zu injizieren 20 ul PBS und Bild das Gerät unter Verwendung von Phasenkontrastmikroskopie. </li><li> Für lebend / tot-Färbung, spülen Sie das Gerät durch den Einlass mit einer Pipette mit 20 ul PBS zu spülen, zu injizieren 20 ul von LIVE / DEAD Färbelösung mit DAPI unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers, Inkubation 30 Min bei 37 ° C, spülen Sie die Gerät erneut mit 20 ul PBS und Bild das Gerät mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie. </li><li> Für Gallen canaliculi Färbung, spülen Sie das Gerät durch den Einlass mit einer Pipette mit 20 ul PBS zu spülen, zu injizieren 20 ul 2 uM CMFDA Färbelösung mit DAPI unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers, Inkubation 30 Min bei 37 ° C, spülen Sie das Gerät erneut mit 20 ul PBS und Bild das Gerät mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie. </li><li> Sammeln der verbrauchten Medien und messen zellulären Stoffwechselprodukte zu geeigneten Zeitpunkten über die Kulturdauer, um die Zellfunktion zu bestimmen. Hepatozyten, messen die Menge von Albumin und Harnstoff in den verbrauchten Medien. </li><li> Zuführen Endpunktfunktionsanalysen auf den Zellen selbst, wie die Beurteilung Enzymaktivitätsniveaus, Antikörperfärbung oder RNA-Analyse. Für Hepatozyten, zu induzieren und zu messen Cytochrom-P450-Enzymaktivitäten oder Phase-II-Konjugation Enzym Glutathion-S-Transferase. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Ultradünne reinem Kollagen Baugruppen auf geladenen Zellen oder Materialoberflächen mit Layer-by-Layer Deposition von modifizierten Kollagene hinterlegt. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass die Methylierung und Succinylierung von nativem Kollagen polykationische und polyanionische Kollagenlösungen (Abbildung 1), die mit der Schicht-für-Schicht-Technik verwendet werden kann, um ultradünne Kollagenmatrix Anordnungen an Zellen (2) zu hinterlegen oder andere geladene erstellen Materia...

Obwohl die Mikrofluidik die exquisite Kontrolle der zellulären Mikroumgebung ermöglicht, kann die Kultivierung von Zellen, insbesondere Primärzellen, in mikrofluidischen Geräten eine Herausforderung darstellen. Viele traditionelle Zellkulturtechniken wurden entwickelt, um die Zellfunktion bei der Kultivierung in Gewebekulturplatten zu erhalten und zu stabilisieren, aber die Übertragung dieser Techniken auf mikrofluidische Geräte ist oft schwierig. 
Eine solche Technik ist die Kultivierung von Zellen auf oder zwischen Kollagengelen als Modell der physiologischen 3D-Zellumgebung. 1 Kollagen Typ I ist aufgrund seiner Allgegenwart in der extrazellulären Matrix, der natürlichen Häufigkeit, der robusten Zellanheftungsstellen und der Biokompatibilität eines der am häufigsten verwendeten Proteine für Biomaterialien. 2 Viele Zellen profitieren von einer 3D-Kultur mit Kollagen, darunter Krebszellen3,45, mikrovaskuläre Endothelzellen6 und Hepatozyten7. Während die Verwendung von Kollagengelen in offenen Formaten, wie z. B. Gewebekulturplatten, einfach ist, machen die begrenzten Kanalabmessungen und die geschlossene Natur von mikrofluidischen Geräten die Verwendung von Flüssigkeiten, die gelieren, ohne den gesamten Kanal zu blockieren, unpraktisch.
Um dieses Problem zu lösen, haben wir die schichtweise Abscheidungstechnik8 mit chemischen Modifikationen von nativen Kollagenlösungen kombiniert, um ultradünne Kollagenanordnungen auf Zellen zu erzeugen, die in mikrofluidischen Geräten kultiviert wurden. Diese Schichten können die Zellmorphologie stabilisieren und ähnlich wie Kollagengele funktionieren und können in mikrofluidischen Geräten auf Zellen abgeschieden werden, ohne die Kanäle mit polymerisierter Matrix zu blockieren. Das Ziel dieser Methode ist es, natives Kollagen zu modifizieren, um polykationische und polyanionische Kollagenlösungen herzustellen und Zellen in mikrofluidischen Kulturen zu stabilisieren, indem dünne Kollagenmatrix-Anordnungen auf den Zellen abgeschieden werden. Diese Technik wurde verwendet, um die Morphologie und Funktion von primären Hepatozyten in mikrofluidischen Geräten zu stabilisieren. 9
Obwohl zuvor über schichtweise Abscheidung mit natürlichen und synthetischen Polyelektrolyten10 berichtet wurde, um Hepatozyten in Plattenkulturen11,12 und als Aussaatschicht für Hepatozyten in mikrofluidischen Geräten13,14 abzudecken, beschreibt dieses Verfahren die Abscheidung einer reinen Kollagenschicht auf Hepatozyten, wobei die 3D-Kollagenkulturtechniken nachgeahmt werden. In diesem Protokoll verwenden wir Hepatozyten als Beispielzellen, die mit Hilfe von 3D-Kollagenschichten aufrechterhalten werden können. Die vielen anderen Zelltypen, die von der 3D-Kultur in Kollagen profitieren, können in ähnlicher Weise von der Kultur nach schichtweiser Abscheidung einer ultradünnen Kollagenmatrix-Anordnung profitieren.

<table><tbody><tr><td>Kollagen Typ I, Rattenschwanz</td><td>Life Technologies</td><td>A1048301</td><td>Option für konzentriertes Rattenschwanzkollagen</td></tr><tr><td>Kollagen Typ I, Rattenschwanz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3867-1VL</td><td>Option für konzentriertes Rattenschwanzkollagen</td></tr><tr><td>Kollagen Typ I, Rattenschwanz</td><td>EMD Millipore</td><td>08-115</td><td>Option für konzentriertes Rattenschwanzkollagen</td></tr><tr><td>Kollagen Typ I, Rattenschwanz</td><td>R%D Systeme</td><td>3440-100-01</td><td>Option für konzentriertes Rattenschwanzkollagen-Bernsteinsäureanhydrid</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239690-50G</td><td>Succinylierungsreagenz</td></tr><tr><td>wasserfreies Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322415-100ML</td><td>Methylierungsreagenz</td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881-500G</td><td>pH-Fällungsreagenz</td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331-500ML</td><td>pH-Fällungsreagenz</td></tr><tr><td>Rattenkollagen Typ I ELISA</td><td>Chondrex</td><td>6013</td><td>Option zum Nachweis des Kollagengehalts</td></tr><tr><td>Hydroxyprolin-Assay-Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAK008-1KT,</td><td>Option zum Nachweis des Kollagengehalts</td></tr>, <tr><td>Hydroxyprolin-Assay-Kit</td><td>Quickzyme Biosciences</td><td>QZBtotcol1</td><td>Option zum Nachweis des Kollagengehalts</td></tr></tbody></table>

schicht-für-schicht der kollagenabscheidung in mikrofluidik-vorrichtungen zum microtissue stabilization

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Obwohl die Mikrofluidik eine exquisite Kontrolle der zellulären Mikroumgebung bietet, kann die Kultivierung von Zellen in mikrofluidischen Geräten challenging. 3D Kultur von Zellen in Kollagen-Typ-I-Gelen zur Stabilisierung der Zellmorphologie und -funktion beitragen, was für die Erstellung von mikrofluidischen Gewebemodellen in Mikrogeräten notwendig ist. Die Übertragung traditioneller 3D-Kulturtechniken für Gewebekulturplatten auf mikrofluidische Geräte ist aufgrund der begrenzten Kanalabmessungen oft schwierig. In dieser Methode beschreiben wir eine Technik zur Modifikation von nativem Typ-I-Kollagen, um polykationische und polyanionische Kollagenlösungen zu erzeugen, die mit schichtweiser Abscheidung verwendet werden können, um ultradünne Kollagenanordnungen auf Zellen zu erzeugen, die in mikrofluidischen Geräten kultiviert wurden. Diese dünnen Kollagenschichten stabilisieren die Zellmorphologie und -funktion, wie am Beispiel von primären Hepatozyten gezeigt wird, was die Langzeitkultur von Mikrogeweben in mikrofluidischen Geräten ermöglicht.

Natives Kollagen kann durch Methylierung und Succinylierung an polykationische und polyanionische Kollagenlösungen zur Verwendung in Schicht-für-Schicht-Abscheidungs ​​schaffen modifiziert werden. Succinylierung modifiziert die ε-Aminogruppen des nativen Kollagens mit Succinylgruppen und Methylierung modifiziert die Carboxylgruppen des nativen Kollagens mit einer Methylgruppe (1A). Diese Modifikationen der Kollagen-Protein Aminosäure-Seitenketten verändern die pH-Titrationskurven für die Lösungen. Succi...

Die Erzeugung von funktionellen Mikrogeweben in mikrofluidischen Geräten erfordert die Stabilisierung von Zellphänotypen durch Anpassung traditioneller Zellkulturtechniken an die begrenzten räumlichen Dimensionen in Mikrogeräten. Die Modifikation von Kollagen ermöglicht die schichtweise Abscheidung ultradünner Kollagenanordnungen, die Primärzellen wie Hepatozyten als mikrofluidische Gewebemodelle stabilisieren können.

Schicht-für-Schicht der Kollagenabscheidung in Mikrofluidik-Vorrichtungen zum Microtissue Stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine dünne Kollagenanordnung auf Zellen in einer mikrofluidischen Vorrichtung abzuscheiden. Dies wird erreicht, indem säurehaltiges natives Kollagen zunächst durch Methylierung modifiziert wird, um Kollagenmoleküle mit einer positiven Nettoladung zu erzeugen. Der zweite Schritt besteht darin, säurehaltiges natives Kollagen durch Carboxylierung zu modifizieren, um Kollagenmoleküle mit einer negativen Nettoladung zu erzeugen.Anschließend werden die mikrofluidischen Vorrichtungen vorbereitet und mit Hepatozyten besiedelt, die über Nacht andocken und sich ausbreiten können. Im letzten Schritt erfolgt die Abscheidung der Kollagenanordnung, indem die Zellen abwechselnd positiv und negativ geladenen Kollagenlösungen ausgesetzt werden, um 10 Kollagen-Bilagen auf der Zellschicht zu erzeugen. Abschließend werden Phasen- und Immunfluoreszenzmikroskopie sowie Albumin- und Harnstoff-Assays verwendet, um die Entwicklung und Aufrechterhaltung der Zellpolarität und sekretorischen Funktion nachzuweisen.Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie die Kultivierung von Hepatozyten in Mikrogeräten ermöglicht, wobei ähnliche Methoden

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Erstellung von Mikro-Gewebe mit zylindrischen Kollagengelen, Module genannt, die eingebetteten Zellen und die Oberfläche enthalten ist mit Endothelzellen beschichtet.

Herstellung von Micro-Gewebe mit Modulen von Collagen Gel enthaltenden Zellen

Dieses Modell geht von einem System myofibroblast besiedelten Fibringel, die verwendet werden, um die endogene Kollagen (Re-) Organisation in Echtzeit in einer zerstörungsfreien Weise studieren kann. Das Modell ist sehr abstimmbaren, wenn er auf verschiedene Zellquellen Medium Zusatzstoffe verwendet werden, und kann leicht an spezifische Anforderungen angepasst werden.

Ingenieurwesen Fibrin-basierten Tissue Konstrukte von Myofibroblasten und Anwendung von Constraints und abseihen to Cell und Collagen (Re) Organisation Induce

In dieser Arbeit stellen wir eine Technik zur schnellen Herstellung von lebendem Gefäßgewebe durch direkte Kultivierung von Kollagen, glatten Muskelzellen und Endothelzellen vor. Darüber hinaus wird ein neues Protokoll zur mechanischen Charakterisierung von künstlich hergestellten Gefäßgeweben beschrieben.

Engineering 3D cellularized Kollagengele für Gefäßgeweberegeneration

Wir stellen eine Methode zur mikrofluidischen Abscheidung von gemustertem Genipin und Fibronektin auf PDMS-Substraten vor, die eine erweiterte Lebensfähigkeit von Geweben mit vaskulären glatten Muskelzellen ermöglicht. Diese Gewebeherstellungsmethode wird mit der bisherigen vaskulären muskulären Dünnschichttechnologie kombiniert, um die Gefäßkontraktilität über krankheitsrelevante Zeitverläufe zu messen.

Mikrofluidischen Genipin Abscheidetechnik für Extended Kultur von mikrostrukturierten Vascular Muscular Thin Films

Kollagen ist eine Kernkomponente des ECM und liefert wichtige Hinweise für verschiedene zelluläre Prozesse im Bereich von Migration auf die Differenzierung und Proliferation. Vorausgesetzt, hier ist ein Protokoll für die Zellen in 3D-Kollagen-Hydrogele und eine fortgeschrittene Technik zur Erzeugung von randomisierten oder ausgerichteten Kollagenmatrizes mit PDMS Mikro einbetten.

Herstellung von 3D-Kollagen-Gel und Mikrokanäle für das Studium der 3D-Interaktionen<em&gt; In Vivo</em

Dieses Manuskript stellt ein Spritzgussverfahren microvessels zu entwickeln, die physiologischen Eigenschaften des Endothels rekapitulieren. Die Mikrofluidik-basierten Prozess erstellt Patent 3D Gefäßnetze mit tailor Bedingungen, wie Durchfluss, zelluläre Zusammensetzung, Geometrie und biochemische Steigungen. Das Herstellungsverfahren und Beispiele für mögliche Anwendungen beschrieben.

Mikrostrukturierung und Montage von 3D-Micro-Ader

Dieser Artikel enthält detaillierte Methoden zur Herstellung und Charakterisierung einer pneumatisch betätigten mikrofluidischen Vorrichtung für die Chondrozytenkompression.

Eine mikrofluidische Plattform zur Stimulierung von Chondrozyten mit dynamischer Kompression

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Entwicklung eines dreidimensionalen (3D) mikrofluidischen Modells von hoch ausgerichtetem menschlichem Herzgewebe zu erklären und zu demonstrieren, das aus Stammzellen gewonnenen Kardiomyozyten besteht, die mit Herzfibroblasten (CFs) in einem biomimetischen, kollagenbasierten Hydrogel in Kokulturiert sind, für Anwendungen in der Kardgewebeentwicklung, im Arzneimittelscreening und in der Krankheitsmodellierung.

Entwicklung von 3D-organisiertem menschlichem Herzgewebe innerhalb einer mikrofluidischen Plattform

Dieses Protokoll demonstriert die Verwendung eines mikrofluidischen Kanals mit sich ändernder Geometrie entlang der Strömungsrichtung des Fluids, um eine Dehndehnung (Dehnung) zu erzeugen, um Fasern in einem 3D-Kollagenhydrogel (&lt;250 μm Dicke) auszurichten. Die resultierende Ausrichtung erstreckt sich über mehrere Millimeter und wird durch die Dehndehnungsrate beeinflusst.

Mikrotechnische 3D-Kollagen-Hydrogele mit Faserausrichtung mit großer Reichweite

Hier stellen wir ein Protokoll zur Herstellung eines einzigartigen zweischichtigen mikrofluidischen Geräts vor, um die elektromechanische Regulation der Homöostase des Epithelgewebes zu untersuchen. Das Gerät legt statische physiologische elektrische Ströme senkrecht zur Gewebeebene an, die die Zell-Zell-Adhäsion, Proliferation und Extrusion beeinflussen. Lebendzell-Imaging und mechanische Stressmessungen enthüllen die Mechanismen dieser Prozesse.

Aufschluss über die elektromechanische Steuerung der Gewebehomöostase mit einem zweischichtigen mikrofluidischen Gerät

Lernen Sie die schichtweise Kollagenabscheidung in Mikrofluidik-Vorrichtungen zur Stabilisierung von Hepatozyten-Phänotypen. Diese Methode ermöglicht die Kultivierung differenzierter Zellen in geschlossenen Mikrosystemen.

Schicht-für-Schicht der Kollagenabscheidung in Mikrofluidik-Vorrichtungen zum Microtissue Stabilization

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