Schicht-für-Schicht der Kollagenabscheidung in Mikrofluidik-Vorrichtungen zum Microtissue Stabilization
29. September 2015
Die Erzeugung von funktionellen Mikrogeweben in mikrofluidischen Geräten erfordert die Stabilisierung von Zellphänotypen durch Anpassung traditioneller Zellkulturtechniken an die begrenzten räumlichen Dimensionen in Mikrogeräten. Die Modifikation von Kollagen ermöglicht die schichtweise Abscheidung ultradünner Kollagenanordnungen, die Primärzellen wie Hepatozyten als mikrofluidische Gewebemodelle stabilisieren können.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine dünne Kollagenanordnung auf Zellen in einer mikrofluidischen Vorrichtung abzuscheiden. Dies wird erreicht, indem säurehaltiges natives Kollagen zunächst durch Methylierung modifiziert wird, um Kollagenmoleküle mit einer positiven Nettoladung zu erzeugen. Der zweite Schritt besteht darin, säurehaltiges natives Kollagen durch Carboxylierung zu modifizieren, um Kollagenmoleküle mit einer negativen Nettoladung zu erzeugen.
Anschließend werden die mikrofluidischen Vorrichtungen vorbereitet und mit Hepatozyten besiedelt, die über Nacht andocken und sich ausbreiten können. Im letzten Schritt erfolgt die Abscheidung der Kollagenanordnung, indem die Zellen abwechselnd positiv und negativ geladenen Kollagenlösungen ausgesetzt werden, um 10 Kollagen-Bilagen auf der Zellschicht zu erzeugen. Abschließend werden Phasen- und Immunfluoreszenzmikroskopie sowie Albumin- und Harnstoff-Assays verwendet, um die Entwicklung und Aufrechterhaltung der Zellpolarität und sekretorischen Funktion nachzuweisen.
Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie die Kultivierung von Hepatozyten in Mikrogeräten ermöglicht, wobei ähnliche Methoden wie bei Plattenkulturen angewandt werden, die bereits seit über 20 Jahren eingesetzt werden. Sie erfordert keine komplexen Gerätekonstruktionen, und die abgeschiedene Matrix ist sehr dünn, im Bereich von 100 Nanometern. Die Idee zu dieser Methode entstand erstmals, als wir darüber nachdachten, wie man Kultivierungstechniken für Kapillarzellen von Platten auf mikrofluidische Geräte übertragen könnte.
Die Kollagen-Sandwich-Methode funktioniert in offenen mikroskopischen Systemen, die verwendeten Hydrogele sind jedoch mit geschlossenen Mikrogeräten mit begrenzter Kanalhöhe nicht kompatibel. Verdünnen Sie 100 Milligramm einer nativen, angesäuerten Kollagenlösung mit eiskaltem, sterilen Wasser auf eine Konzentration von 0,5 Milligramm pro Milliliter und stellen Sie die Lösung auf Eis, um eine Vernetzung zu verhindern. Danach stellen Sie den pH-Wert der Kollagenlösung mit einigen Tropfen einer einnormalen Natronlauge auf einen Wert zwischen neun und 10 ein und rühren die Lösung vorsichtig 30 Minuten bei Raumtemperatur um.
Während das Kollagen ausfällt, wird die Lösung trüb werden. Zentrifugieren Sie die ausgefallene Kollagenlösung mit 3000 × g für 25 Minuten. Danach sollte sich am Röhrchenboden ein klarer, gelartiger Niederschlag absetzen. Aspirieren Sie das Überstand, und resuspendieren Sie das ausgefällte Kollagen anschließend in 200 Milliliter Methanol mit 0,1 normaler Salzsäure. Lassen Sie die Methylierungsreaktion unter Rühren bei Raumtemperatur über vier Tage stattfinden. Nach der Methylierung zentrifugieren Sie die Lösung mit 3000 × g für 25 Minuten, um das methylierte Kollagen zu pelletieren, danach aspirieren und entsorgen Sie das angesäuerte Methanol-Überstand. Lösen Sie danach das methylierte Kollagen in 25 Milliliter sterilem PBS auf und filtrieren Sie die Lösung durch einen 60-Mikrometer-Zellfilter.
Stellen Sie den pH-Wert der Lösung unter Verwendung von 20-Mikroliter-Schritten einer normalen Natronlauge auf 7,3 bis 7,4 ein. Bestimmen Sie die Konzentration der Kollagenlösung mithilfe eines kommerziellen ELISA-Kits für Rattenkollagen oder eines Hydroxyprolin-Assay-Kits. Verdünnen Sie die Lösung anschließend mit steriler PBS auf drei Milligramm pro Milliliter.
Sterilisieren Sie die methylierte Kollagenlösung, indem Sie sie in eine Glasflasche mit Schraubverschluss umfüllen. Schichten Sie vorsichtig drei Milliliter Chloroform am Boden der Flasche ab und lassen Sie die Flasche über Nacht bei vier Grad Celsius stehen. Am nächsten Morgen.
Entfernen Sie unter aseptischen Bedingungen die obere methylierte Kollagenschicht. Bewahren Sie das methylierte Kollagen bei vier Grad Celsius auf und verwenden Sie es innerhalb eines Monats. Verdünnen Sie eine weitere Menge von 100 Milligramm natives, sauer eingesetztes Kollagen auf eine Konzentration von 0,5 Milligramm pro Milliliter mit eiskaltem, sterilem Wasser und stellen Sie die Lösung auf Eis, um eine Denaturierung zu verhindern. Wie zuvor gezeigt, stellen Sie den pH-Wert der Kollagenlösung mit Natriumhydroxid ein und rühren die Lösung bei Raumtemperatur um, um das Kollagen auszufällen.
Als Nächstes lösen Sie 40 Milligramm Sechs-Cynic-Anhydrid in 10 Milliliter Aceton. Geben Sie diese Mischung in 0,5-Milliliter-Schritten unter Rühren langsam zur Kollagenlösung hinzu und überwachen Sie dabei kontinuierlich den pH-Wert der Lösung. Halten Sie den pH-Wert durch Zugabe von ein oder zwei Tropfen einer normalen Natriumhydroxidlösung über 9,0, wenn der pH-Wert 9,0 annähert, und rühren Sie weiterhin 120 Minuten bei Raumtemperatur.
Nachdem alle sechs Portionen der Cyanid- und Hydridlösung hinzugefügt wurden, beobachten Sie, wie die Mischung klar wird, während das Succinat-Kollagen sich auflöst. Überprüfen Sie regelmäßig den pH-Wert, um sicherzustellen, dass er über 9,0 bleibt. Wenn sich das gesamte Succinat-Kollagen aufgelöst hat, stellen Sie den pH-Wert der Lösung mit jeweils 20 Mikroliter-Einheiten von einnormaler Salzsäure auf 4,0 ein. Beobachten Sie, wie die Lösung erneut trüb wird, während das Succinat-Kollagen ausfällt.
Zentrifugieren Sie die Lösung anschließend bei 3000 × g für 25 Minuten. Um das Succinat-Kollagen-Pellet zu erhalten und das azidifizierte Snat mit inaktiver Snic-Anhydrid zu entsorgen, lösen Sie das Succinat-Kollagen durch mehrfaches Pipettieren in 25 Milliliter steriler PBS unter Erzielung einer Endkonzentration von etwa drei Milligramm pro Milliliter. Danach filtrieren Sie die Lösung durch einen 60-Mikron-Zellsieb und stellen anschließend den pH-Wert der Lösung auf einen Wert zwischen 7,3 und 7,4 ein.
Unter Verwendung von 20 Mikroliter-Zugaben einer normalen Natronlauge bewerten Sie die Konzentration der Lösung mit einem kommerziellen Ratten-Kollagen-ELISA-Kit oder einem Hydroxyprolin-Assay-Kit. Anschließend verdünnen Sie die Lösung auf drei Milligramm pro Milliliter. Sterilisieren Sie diese ated Kollagenlösung mit steriler PBS auf die gleiche Weise wie die methylierte Kollagenlösung.
Beginnen Sie mit der Herstellung eines mikrofluidischen Geräts mithilfe einer Standardmethode, das Zellkulturchambers mit 100 Mikrometer hohen, 0,4 bis 1,5 Millimeter breiten und ein bis zehn Millimeter langen Kanälen für das Zellwachstum aufweist. Verwenden Sie einen Plasma-Reiniger, um die Oberflächen des Geräts und eines Objektträgers zu oxidieren. Drücken Sie anschließend beide Teile zusammen, um eine Verbindung zu bilden.
Nach der Sterilisation des Geräts durch Bestrahlung mit UV-Licht für mindestens 30 Minuten. Die Kammer mit 15 Mikrogramm pro Milliliter Fibronectin in sterilem PBS füllen und bei 37 Grad Celsius für 45 Minuten inkubieren. Als Nächstes das Gerät mit Zellen besiedeln, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben.
In einer laminaren Luftströmungstisch-Zellkulturhaube ausreichende Mengen an methylierten und atierten Kollagenlösungen für jeweils 10 Applikationen pro Gerät sowie einige zusätzliche Milliliter Medium vorbereiten. Die Lösungen auf Eis halten. Die Geräte abwechselnd mit jeweils 20 Mikrolitern methylierter und dann atierter Kollagenlösung durchspülen.
Warten Sie jeweils eine Minute zwischen den einzelnen Applikationen. Spülen Sie das Gerät insgesamt zehnmal pro Lösung durch. Arbeiten Sie zügig, um die Zeit, in der die Zellen während des Aufbaus der Kollagenschichten ohne Medium sind, zu minimieren; es ist möglich, langsam ansteigende Kollagenansammlungen am Einlass und Auslass des mikrofluidischen Geräts zu beobachten.
Wenn der Widerstand gegen den Flüssigkeitsfluss zunimmt, spülen Sie das Gerät ein- oder zweimal mit Medium und fahren Sie anschließend mit der Schichtung fort. Nachdem alle Schichten aufgebracht wurden, spülen Sie das Gerät zweimal mit frischem Medium und stellen Sie es zurück in den Inkubator. Methylierung und Azetylierung verändern die Ladungseigenschaften der Kollagenmoleküle.
Die Amidierung entfernt positiv geladene Gruppen und ersetzt sie durch negativ geladene Gruppen, während die Methylierung negativ geladene Gruppen entfernt und dadurch Moleküle mit einer netto positiven Ladung erzeugt. Dies ermöglicht eine schichtweise Abscheidung der beiden Kollagenvarianten auf geladenen Oberflächen wie Zellen. Primäre Hepatozyten, die in einer mikrofluidischen Vorrichtung auf mit Fibronectin beschichtetem Glas ausgesät wurden, können mit dieser schichtweisen Methode beschichtet werden. Die Assembly der Kollagenmatrix und die Abscheidung von 10 Bilagen auf den Zellen erzeugt eine Kollagenschichtdicke von etwa 140 Nanometern. Hepatozyten ohne eine obere, schichtweise aufgebrachte Kollagenschicht.
Matrix verlieren im Laufe der Zeit ihr differenziertes Phänotyp, kontrahieren und lösen sich von der Oberfläche mikrofluidischer Geräte ab. Im Gegensatz dazu behalten Hepatozyten, die mit einer ultradünnen Kollagenanordnung bedeckt sind, ihre differenzierte Morphologie, eine Vitalität von über 90 % und Polarisation über einen Zeitraum von 14 Tagen bei. Neben der Zellvitalität, Morphologie und Polarisation ermöglicht die Kollagen-Layer-by-Layer-Technik zudem die Wiederherstellung und Stabilisierung der Funktion primärer Hepatozyten, wie hier gezeigt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Kollagen methyliert und succiniert, um netto positiv und negativ geladene Kollagenlösungen herzustellen, und wie man diese in der Layer-by-Layer-Abscheidung verwendet, um dünne Kollagenanordnungen auf Zellen in mikrofluidischen Geräten aufzubauen.
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Übersicht
Diese Studie konzentriert sich auf die Abscheidung einer dünnen Kollagenanordnung auf Zellen innerhalb einer mikrofluidischen Vorrichtung, um die Zellphänotypen zu stabilisieren. Das Verfahren beinhaltet die Modifizierung von Kollagen, um positiv und negativ geladene Moleküle zu erzeugen, die abwechselnd abgeschieden werden, um eine mehrschichtige Struktur zu bilden.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Mikrofluidik
- Zellkultur
- Gewebetechnik
Hintergrund
- Mikrogewebe sind entscheidend, um Organfunktionen nachzuahmen.
- Die Stabilisierung von Zellphänotypen ist bei mikrofluidischen Anwendungen von großer Bedeutung.
- Kollagen ist eine zentrale Komponente im Gewebeengineering.
- Schicht-für-Schicht-Abscheideverfahren verbessern die Zellfunktionalität.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Methode zur Ablagerung von Kollagenassemblierungen in mikrofluidischen Vorrichtungen.
- Stabilisierung von primären Zellen wie Hepatozyten für die Gewebemodellierung.
- Beurteilung der Zellpolarität und sekretorischen Funktionen nach der Ablagerung.
Verwendete Methoden
- Modifizierung von natives Kollagen durch Methylierung und Amidierung.
- Herstellung von mikrofluidischen Vorrichtungen und Besiedlung mit Hepatozyten.
- Geschichtete Ablagerung von Kollagen durch alternierende Exposition der Zellen gegenüber geladenen Lösungen.
- Anwendung von Phasen- und Immunfluoreszenzmikroskopie sowie Albumin- und Harnstoff-Assays.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Abscheidung von 10 Kollagenschichten auf Hepatozyten.
- Nachgewiesene Aufrechterhaltung der Zellpolarität.
- Bestätigte sekretorische Funktion der Hepatozyten mittels Assays.
- Visualisierung der strukturellen Integrität mithilfe von Mikroskopietechniken.
Schlussfolgerungen
- Die Methode stabilisiert Zellphänotypen in Mikrogeräten wirksam.
- Die schichtweise Kollagenabscheidung verbessert die Funktionalität des Gewebemodells.
- Dieser Ansatz kann auf andere Zelltypen für verschiedene Anwendungen übertragen werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Stabilisierung der Morphologie und Funktion primärer Hepatozyten in mikrofluidischen Vorrichtungen stellt weiterhin eine zentrale Herausforderung für die Modellierung von Lebergewebe und Studien zur Arzneimittelmetabolisierung dar. Diese schichtweise Kollagenabscheidungstechnik ermöglicht die Langzeitkultur von Mikrogeweben, indem ultradünne, biokompatible Matrizen erzeugt werden, die wesentliche Aspekte der nativen extrazellulären Matrix nachbilden. Indem sie differenzierte Phänotypen über einen Zeitraum von mehr als 14 Tagen unterstützt, verbessert die Methode die Vorhersagegenauigkeit präklinischer, auf Hepatozyten basierender Assays und verringert biologische Variabilität, die die Identifizierung von Wirkstoffkandidaten und die Ergebnisse von Sicherheitsuntersuchungen beeinträchtigen kann.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung hepatocyten-spezifischer Signalwege, indem die polarisierte Morphologie und sekretorische Funktion erhalten bleibt, die für die Zielvalidierung in Modellen von Lebererkrankungen unerlässlich sind.
- Operationaler Wert: Verringert den phänotypischen Drift während der Kultur und erhöht so die Reproduzierbarkeit funktioneller Messgrößen, die zur Absicherung mechanistischer Hypothesen verwendet werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt standardisierte, kollagenbeschichtete mikrofluidische Plattformen, die quantitative Albumin- und Harnstoff-Assays zur konsistenten Wirkstoffprüfung ermöglichen.
- Operationaler Wert: Kompatibel mit bestehenden mikrofluidischen Fertigungsabläufen, wodurch eine skalierbare Integration in automatisierte Screening-Systeme ohne komplizierte Neukonstruktion der Geräte möglich ist.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Erhält die Differenzierung und Funktion von Hepatozyten über zwei Wochen, wodurch eine kontinuierliche präklinische Bewertung von der Entdeckung bis zu Toxizitätsstudien ermöglicht wird.
- Operativer Wert: Verlängert den nutzbaren Zeitraum für die longitudinale Beurteilung von Biomarkern für arzneimittelinduzierte Leberschädigungen (DILI) in mikrofluidischen Gewebemodellen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess ein, indem sie stabile Hepatozytenkulturen ermöglicht, die die Entwicklung von Assays in einem frühen Stadium sowie die präklinische Validierung von auf die Leber zielenden Therapeutika unterstützen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem sie die Polarität und Funktion von Hepatozyten erhält, die für die Beurteilung der Zielstrukturen in Stoffwechselwegen entscheidend sind.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Messwerte über die Sekretion von Albumin und Harnstoff und ermöglicht so eine zuverlässige Bewertung von Verbindungen in Mikrogewebeformaten.
- Analytik: Erzeugt funktionelle Endpunkte, die einen Vergleich der Gesundheit und metabolischen Aktivität von Hepatozyten über verschiedene Bedingungen hinweg ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet die Entdeckungs- und präklinische Phase, indem sie Phänotypen stabilisiert, die für die modellhafte Abbildung krankheitsrelevanter Zustände erforderlich sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt eine anpassbare Oberflächenmodifikationstechnik dar, die auf mehreren mikrofluidischen Plattformen und Zelltypen anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit durch Erhaltung des differenzierten Hepatozyten-Phänotyps und -funktion über verlängerte Kultivierungszeiträume.
- Operationaler Wert: Standardisierung und Reproduzierbarkeit durch ultradünne, präzise aufgebrachte Kollagenschichten, die die Variabilität zwischen Chargen minimieren.
- Strategischer Wert: Verbesserte Go/No-Go-Entscheidungen durch Verringerung falsch-negativer Ergebnisse aufgrund dedifferenzierter Zellen bei der Lebertoxizitätsprüfung.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierung von Kandidaten basierend auf stabilen, langfristigen funktionellen Messwerten aus mikrofluidischen Lebermodellen.
Durchführungsüberlegungen
- Kenntnisse in der Kollagenchemie und der Herstellung mikrofluidischer Vorrichtungen sind für die Methylierungs- und Succinierungsschritte erforderlich.
- Der Zugang zu Zentrifugationsgeräten, pH-Kontrolle und steriler Filtration ist für die Kollagenmodifikation notwendig.
- Die Standardisierung zwischen verschiedenen Teams hängt von einer konsistenten Schichtungsdauer und Lösungshandhabung ab, um eine gleichmäßige Dünnfilmbeschichtung sicherzustellen.
- Die Anpassung an andere Zelltypen erfordert die Validierung der Kollagenverträglichkeit und deren Einfluss auf die Phänotypstabilität.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehört die Unverträglichkeit von Hydrogelen mit geschlossenen mikrofluidischen Vorrichtungen mit geringer Kanalhöhe, wie in der Quelle angegeben.
