Name: Verbund Scaffolds für Grenzflächen Polyelectrolyte Fasern für zeitlich kontrollierte Freisetzung von Biomolekülen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie IPC-Fasern in polymere Scaffolds einbetten, um Biomoleküle zeitlich kontrolliert freizusetzen. Diese Methode ermöglicht räumlich gezielte Freisetzung für Tissue-Engineering-Anwendungen.

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Diese Arbeit wurde von der Singapore National Research Foundation von einem seiner Research Centers of Excellence, die Mechanobiologie Institute, Singapur verabreicht unterstützt. MFAC wird von der Agentur für Wissenschaft, Technologie und Forschung (Singapur) und Nationalen Forschungsagentur (Frankreich) gemeinsame Programm unter Projektnummer 1122703037. Bkkt wird durch die Mechanobiologie Institute unterstützt unterstützt. Wir danken Herrn Daniel Wong HC für das Korrekturlesen des Manuskripts und Frau Morgendämmerung JH Neo zur Unterstützung bei der Videoproduktion.

1. Herstellung von Polyelektrolytlösungen <ol><li> Reinige Chitosan, wie in Liao et al beschrieben. Kurz gesagt, erstellen Sie eine 1% (w / v) Lösung von Chitosan in 2% (v / v) Essigsäure und Vakuumfilter mit Grad 93-Filterpapier. Neutralisiert das Filtrat mit 5 M NaOH, bis der pH-Wert stabilisiert bis 7. Zentrifugieren Sie das ausgefallene Chitosan bei 1.200 × g für 10 min. Überstand dekantieren und fügen VE-Wasser, um das Chitosan zu waschen. Wiederholen Sie die Zentrifugation und Waschschritt noch zweimal. Einfrieren der ausgefallene Chitosan bei -80 ° C und lyophilisiere O / N, um die gereinigte Form zu erhalten. Bewahren Sie gereinigte Chitosan in einem entfeuchteten Schrank. </li><li> Abwiegen 1 g gereinigtes Chitosan in eine sterile Gewebekulturschale. Platzieren des Chitosans in der Gewebekulturschale so nahe wie möglich an der UV-Lampe in der Sicherheitswerkbank und freizulegen, um UV-Licht für 15 min. Mit einer sterilen Pinzette, legen Sie die sterilisiert Chitosan in einen Glasbehälter. Chitosan aufzulösen Verwendung gefiltert 0.15M Essigsäure bis zu einer Endkonzentration zwischen 0,5% und 1% (w / v). </li><li> Abwiegen 0,1 g Alginsäure-Natriumsalz und lösen sich in 10 ml destilliertem entionisiertem (DDI) Wasser, um eine 1% (w / v) Lösung zu erhalten. Mischen Sie die Alginsäurenatriumsalz für mindestens 2 Stunden auf dem Vortex-Mischer, um eine vollständige Auflösung zu gewährleisten. Filtern der Alginatlösung durch 0,2 &amp; mgr; m-Spritzenfilter. Bewahren Sie die Alginat-Lösung bei 4 ° C. </li><li> Rekonstituieren humanen rekombinanten Wachstumsfaktoren, wie den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) oder &amp; beta; - Nervenwachstumsfaktor (NGF), wie vom Hersteller empfohlen. </li></ol> 2. Zeichnung der IPC Fibers <ol><li> Mischen Sie Proteine, Wachstumsfaktoren oder andere Biomoleküle in 10-20 ul-Aliquot der Polyelektrolyt-Lösung, die eine ähnliche Nettoladung hat. Biologische Moleküle mit negativen Nettoladung (zB Rinderserumalbumin [BSA]) sollte mit Alginat-Lösung gemischt werden. Biologische Moleküle mit positiven Nettoladung (zB VEGF) sollte mit gemischt werdenChitosan-Lösung. </li><li> Legen Sie kleine Teilmengen (10-20 ul) von Chitosan und Alginat auf eine stabile ebene Fläche, die mit Parafilm abgedeckt ist. Die Tröpfchen aus Chitosan und Alginat sollte in enger Nachbarschaft angeordnet werden, jedoch nicht in Kontakt miteinander. </li><li> Leicht tauchen jede Spitze auf einer Pinzette in die Chitosan und Alginat-Tröpfchen. Bringen Sie die Tropfen von Polyelektrolyten zusammen durch Kneifen der Zange. Wenn die Tröpfchen in Kontakt miteinander kommen, die Zange langsam senkrecht nach oben zu ziehen, um die IPC-Faser von der Schnittstelle der beiden Tröpfchen (1A) ziehen. </li><li> Legen Sie das Ende des gezogenen IPC Faser an der Zange auf einem Kollektor, wie eine flache Polymergerüst auf einem rotierenden Dorn befestigt (siehe Kapitel 3 und 4). Drehen des Dorns mit einer festen Geschwindigkeit von 10 mm / s, um die Bildung einer einheitlichen und wulstfreie IPC Fasern ermöglichen. Die Erhöhung der Geschwindigkeit des Ziehens der Fasern IPC Kügelchen bilden, die eine schlagartige Freisetzung des eingearbeiteten verursachenbiochemischen und vorzeitige Beendigung Faser. 10 </li><li> Um zu bestimmen Einbaueffizienz, sammeln alle verbleibenden Flüssigkeiten links auf dem Parafilm durch Verdünnen mit 500 ul 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Messung der Faktor-Inhalts Protein oder das Wachstum in dem Rückstand durch BCA-Assay (für BSA), ELISA (für VEGF und NGF) oder einem entsprechenden Assay eingebaut Biomolekül detektieren. </li></ol> 3. Herstellung von Verbund Hydrogel Gerüst Pullulan-Dextran (PD) Polysaccharide und IPC Fibers <ol><li> Herstellung Opfer Pullulan Rahmen für IPC Fasersammel <ol><li> Abwiegen Pullulan Polysaccharid und mischen mit destilliertem deionisiertem (DDI) Wasser, um eine 20% erstellen (w / v) wässrigen Lösung. Mischen Sie die Pullulanlösung O / N, um die Homogenität zu gewährleisten. </li><li> Guss 15 g Pullulan-Lösung in einen Durchmesser von 10 cm Gewebekultur Polystyrol (TCPS) Gericht. Trocknen Sie die Pullulanlösung O / N bei 37 ° C. Schneiden Sie die Pullulan Filme in 7mm x 7 mm quadratische Rahmen. </li></ol></li><li> Vorbereiten Pullulan-Dextran Polysaccharidlösung <ol><li> Erstellen Sie eine 30% (w / v) Lösung der Polysaccharide Pullulan und Dextran (3: 1-Verhältnis) in DDI Wasser. Mischungs O / N um die Homogenität der Polysaccharidlösung gewährleisten. Langsame Zugabe von Natriumhydrogencarbonat zu der Polysaccharid-Lösung bis zu einer Endkonzentration von 20% zu erreichen (w / v). Mischungs O / N, um die Homogenität der Lösung sicherzustellen. Lagern Sie das Polysaccharid-Lösung bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Sammeln IPC Fasern auf Pullulan Rahmen <ol><li> Befestigen Sie das Opfer Pullulan Rahmen (Abschnitt 3.1) mit einem Krokodilklemme. Haften die Krokodilklemme und Pullulan Rahmen auf dem Ende des sich drehenden Dorn mit Kunststoff beschichtetes Klebeband. Drehen des Dorns mit dem befestigten Rahmen mit einer konstanten Geschwindigkeit von 10 mm / sec. Pullulan Rahmen kann auf den sich drehenden Dorn in gewünschten Orientierungen befestigt werden. </li></ol></li><li> Zeichnen Sie die IPC-Fasern mit einer Pinzette (Abschnitt 1) ​​und attach das gezogene Ende der IPC-Fasern auf die rotierende Pullulan Rahmen. Ziehen die IPC Fasern mit einer konstanten Geschwindigkeit. Bei Erreichen der terminalen Ende der IPC Faser, trockne die Fasern gegenüber dem Trägerrahmen die O / N bei RT. </li><li> Einbetten IPC Fasern in PD Hydrogel Gerüst </li><li> Um jedes Gramm Pullulan-Dextran-Lösung zu vernetzen, werden 100 &amp; mgr; l von 11% (w / v) Natrium-Trimetaphosphat wässrige Lösung und 100 ul 10 M Natriumhydroxid. 7 Mischen der Lösung bei 60 UpM unter Verwendung einer Rührplatte für 1 bis 2 min. Nach der Zugabe von Natriumtrimetaphosphat und Natriumhydroxid wird die Polysaccharid-Lösung fast sofort zu vernetzen. Gießen Sie die viskose Polysaccharid-Lösung auf die Fasern-on-Frame-Konstrukt, um die IPC-Fasern vollständig einzubetten. Inkubieren der kombinierten Pullulan-Dextran-IPC Fasern (PD-IPC) bei 60 ° C für 30 min, um eine chemisch vernetzte Verbundgerüste (1B) zu bilden. </li><li> ACHTUNG: Führen Sie Schritt 3.3.2 in der Abzugshaube und verwenden Sie geeignete Schutz equipment wie Essigsäure ist eine aggressive und brennbare. </li><li> Zur Porenbildung in der PD-IPC Gerüst induzieren, tauchen die ganze Gerüst in 20% (w / v) Essigsäure für 20 min. </li><li> Entfernen nicht umgesetzten Reagenzien durch Waschen PD-IPC Gerüste in 1X PBS für 5 min unter Schütteln bei 100 Umdrehungen pro Minute. Wiederholen Sie diesen Schritt 2 mal. </li><li> Entfernen Sie das überschüssige PBS und unverzüglich sperren PD-IPC Gerüste bei -80 ° CO / N. Lyophilisieren die Gerüste mindestens 24 Stunden vor der Verwendung in allen kontrollierten Freisetzung oder Bioaktivitätstests. </li></ol> 4. Herstellung von Verbundgerüst von PCL und IPC Fibers ACHTUNG: Dichlormethan ist ein Gefahrstoff. Verwenden Sie den Abzug und persönliche Schutzausrüstung beim Umgang mit Dichlormethan. <ol><li> Erstellen unberührten und gemusterten PDMS Substrate <ol><li> Erstellen Sie eine neue, unberührte Polydimethylsiloxan (PDMS) Elastomer-Substrat mit einem Stück TCPS der gewünschten Abmessung mit weichen Lithographieprozess. Erstellen patteingeschaltet PDMS Substrate durch Verwendung von Standard-Weichlithographieverfahren von Poly (methylmethacrylat) Vorlagen mit der gewünschten Topographie. 12 </li></ol></li><li> Herstellung Opfer PCL Rahmen für IPC Fasersammel <ol><li> Abwiegen PCL und lösen in Dichlormethan, um eine 0,9% (w / v) Lösung zu schaffen. Für jede 1 cm 2 Fläche des PDMS-Substrat, fallen 500 ul 0,9% PCL-Lösung. Lassen Sie das gesamte Lösungsmittel Dichlormethan vollständig in der Abzugshaube verdampfen. Wiederholen den Vorgang des Gießens 0,9% PCL, um die Folie auf die gewünschte Dicke zu verdicken. Entfernen Sie die getrockneten PCL-Film aus der PDMS-Substrat. Erstellen Sie ein Loch in der PCL-Rahmen mit einem angemessen dimensionierten Puncher. 2 </li></ol></li><li> Sammeln IPC Fasern auf der PCL-Rahmen <ol><li> Befestigen Sie das Opfer PCL Rahmen mit Loch (von 4.2.1) auf einer Krokodilklemme. Halten Sie die Krokodilklemme auf den sich drehenden Dorn unter Verwendung kunststoffbeschichteten Klebeband. Befestigen Sie den gezogenen Ende des IPC Faser auf die PCL frame vor dem Start der Drehung mit einer konstanten Geschwindigkeit von 10 mm / s (Abschnitt 2). Nach dem Ende der IPC Faserziehen, Trocknen der Faser-on-Frame-Konstrukt O / N bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Einbetten von Faser-on-Frame-Konstrukts in gemusterten PCL Substrat <ol><li> Drop 500 ul 0,9% PCL-Lösung auf das PDMS-Substrat, um eine unberührte oder gemusterten PCL Basis zu schaffen, je nach Bedarf. Guss mehrere Schichten von 0,9% PCL-Lösung ein Gerüst mit der gewünschten Dicke zu erhalten. Lassen Sie das gesamte Lösungsmittel Dichlormethan vollständig in der Abzugshaube verdampfen. </li><li> Legen Sie die Faser-on-Frame-Konstrukt (Abschnitt 4.3.1) auf der Oberseite des Basis PCL. In 0,9% PCL-Lösung auf die Faser-auf-Rahmen zu konstruieren mehrmals, um die gewünschte Dicke zu erhalten und vollständig einzubetten die IPC-Fasern, Herstellen einer PCL-IPC Verbundgerüst (Abbildung 1c). </li></ol></li></ol> 5. Messung der Freisetzung biologischer Stoffe aus Verbund IPC Gerüste <ol><li> Zeigen Verbund PD-IPC oderPCL-IPC Gerüsten und Stand-alone-IPC Fasern getrennt in einer 24-Well-Platte. </li><li> Tauchen Sie das Gerüst und Standalone-IPC-Fasern mit 500 ul 1X PBS. Die Proben bei 37 ° C inkubiert. Sammeln PBS zu verschiedenen Zeitpunkten (Release-Medien) und ersetzen mit 500 ul 1X PBS. </li><li> Messen der Menge an Protein oder Wachstumsfaktor in den Freisetzungsmedien mit einem BCA-Test (BSA), ELISA (VEGF und NGF) oder anderen geeigneten Assays für das kumulative Freisetzungsprofil für den einge Biomolekül berechnen. </li></ol> 6. Seeding von Zellen auf Composite-IPC Gerüste auf der freigegeben Biologische Arbeitsstoffe Testen Bioaktivität <ol><li> Sterilisieren Sie die lyophilisierten PD-IPC oder PCL-IPC Verbund Gerüste mit UV-Licht in der biologischen Sicherheitswerkbank für mindestens 20 min. </li><li> Verwenden Standardzellkulturtechniken, um eine Zellsuspension von 2 x 10 5 Zellen in 200 &amp; mgr; l Wachstumsmedium zu erhalten. Samen der konzentrierten Zellsuspension auf die Verbund Gerüste. After 20 min, top-up das Volumen des Wachstumsmediums, um die Gerüste vollständig untertauchen. </li><li> Messen der Zellaktivität, durch Standardtechniken, wie Alamar Blau metabolischen Aktivitätstest PC12 Neuritenwachstum Assay oder Immunfluoreszenz. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

IPC Fasern durch die Interaktion von zwei entgegengesetzt geladenen Polyelektrolyten gebildet sind. Das Verfahren nutzt die Gewinnung des Komplexes aus der Schnittstelle der Polyelektrolyte, einen Selbstorganisationsprozess für stabile Faserbildung erleichtert wird. Der Mechanismus der IPC Faserbildung sorgt dafür, dass jedes Biomolekül ergänzt in einen ähnlich geladenen Polyelektrolyten während der Komplexbildung eingearbeitet werden. 10,11 umge Zugabe eines Biomoleküls in die entgegengesetzt geladenen Polye...

Die extrazelluläre Matrix hat inhärente biochemische und biophysikalische Hinweise, die das Verhalten der Zellen steuern. Die Nachahmung dieser physiologischen dreidimensionalen (3D) Mikroumgebung ist eine weit verbreitete Strategie für Anwendungen in der regenerativen Medizin und im Tissue Engineering. Zum Beispiel wurden sowohl natürlich gewonnene als auch synthetische Substrate mit topographischen Hinweisen modifiziert, um die biophysikalische zelluläre Umgebung nachzuahmen. 1 Zum Beispiel können Polycaprolacton (PCL)-Gerüste leicht strukturiert werden, indem auf gemusterte PDMS-Substrate gegossen wird. 2 Die meisten synthetischen Gerüste rekapitulieren jedoch die kontrollierte biochemische Umgebung in vivo nur unzureichend.Die Massen- oder Oberflächenmodifikation von synthetischen Materialien bietet nur biochemische Signale für die Zellanhaftung, aber es fehlt noch eine zeitliche Regulierung der biochemischen Verabreichung. 3 Daher besteht ein Bedarf an optimalen Gerüsten, die das zeitlich regulierte biochemische Verabreichungssystem der extrazellulären Matrix nachahmen können. 
Biochemische Verabreichungssysteme wie Mikrosphären werden aufgrund der Schwere und Komplexität des mehrstufigen Syntheseprozesses von Problemen des Verlusts der Bioaktivität und der geringen Inkorporationseffizienz geplagt. 4-6 Alternative Methoden, die eine einstufige Herstellungs- und Einbaumethode verwenden, haben nachweislich ein hervorragendes Potenzial, eine günstige biochemische Mikroumgebung zu schaffen, ohne die damit einhergehende Ineffizienz beim Einbau und Verlust der Bioaktivität. Eine praktikable Lösung ist die Verwendung von Grenzflächenfasern mit Polyelektrolytkomplexierung (IPC), um biologische Wirkstoffe zu transportieren und zu schützen. Wenn zwei gegensätzlich geladene wässrige Polyelektrolytlösungen zusammengebracht werden, können IPC-Fasern aus der Grenzfläche herausgezogen werden. Praktisch jede Art von hydrophlischem Biomolekül in wässriger Lösung kann entweder in die negativ oder positiv geladene Polyelektrolytlösung gegeben werden, wodurch der Einbau nützlicher Biomoleküle in die IPC-Faser während des Komplexierungsprozesses erleichtert wird. Darüber hinaus sind für dieses Verfahren nur Wasser- und Umgebungsbedingungen erforderlich, wodurch das Risiko eines Verlusts der Bioaktivität verringert wird. Mit dieser Methode wurden aktive Wachstumsfaktoren2,7 sogar Zellen8,9 erfolgreich abgegeben. Darüber hinaus ermöglicht die einfache Methode der Formung von IPC-Fasern das Formen in jede Form und Ausrichtung. Die Stabilität solcher Fasern hat sich als vorteilhaft erwiesen, da sie sowohl in hydrophobe2 als auch in hydrophile Polymere7 eingebaut wurden, um Verbundgerüste herzustellen. Diese Verbundgerüste mit IPC-Fasern sind vorteilhaft, um eine physiologisch relevante biochemische Umgebung zu schaffen und gleichzeitig eine physikalische Verankerung für Zellen zu bieten. 
In dieser Studie zeigen wir eine Methode, um IPC-Fasern in ein hydrophiles und ein hydrophobes Gerüst mit Topographie für eine kontrollierte Freisetzung aktiver Biomoleküle einzubauen. Als Proof-of-Concept integrieren wir IPC-Fasern aus Chitosan und Alginat in das biokompatible, nicht-immunogene und nicht-antigene hydrophile Pullulan-Dextran-Hydrogel oder das biokompatible hydrophobe Polycaprolacton-Gerüst.

<table><tbody><tr><td>Pullulan&nbsp;</td><td>Hayashibara Inc, Okayama, Japan, Molekulargewicht</td><td></td><td>(MW): 200 kDa. Bei diesem Material handelt es sich um Pullulan in pharmazeutischer Qualität, das zur Herstellung von Pullulan-Rahmen und PD-IPC-Gerüsten verwendet wird.</td></tr><tr><td>Dextran</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D1037</td><td>MW 500 kDa. Dieses Material wird von Sigma Aldrich nicht mehr hergestellt. Alternativ wird die Katalognummer 31392 (Sigma Aldrich) vorgeschlagen. Dieses Material wird zur Herstellung von PD-IPC-Gerüsten verwendet.</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td>Natriumbicarbonat muss langsam zur Pullulan-Dextran-Polysaccharidlösung zugegeben werden. Die schnelle Zugabe von Natriumbikarbonat führt zu Ausfällungen.</td></tr><tr><td>Natriumtrimetaphosphat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T5508</td><td>Diese Chemikalie ist hygroskopisch und muss im Entfeuchtungsschrank gelagert werden. Wässrige Lösung von Natriumtrimetaphosphat muss immer frisch gemacht werden.</td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5881</td><td>Dieses Material ist gefährlich und muss mit geeigneter Schutzausrüstung wie Nitrilhandschuhen gehandhabt werden.</td></tr><tr><td>Chitosan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>448877</td><td>MW 190-310 kDa. Acetylierungsgrad von 75 % bis 85 %. Die Reinigung von Chitosan ist erforderlich, um stabile IPC-Fasern zu erzeugen.</td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Merck</td><td></td><td>Diese kann durch einen anderen Markentyp ersetzt werden. Dieses Material ist korrosiv und brennbar. Schutzausrüstung wie Gesichtsschutz, Nitrilhandschuhe, Laborkittel und Schuhüberzieher müssen getragen werden, wenn diese Chemikalie im Abzug gehandhabt wird.</td></tr><tr><td>Alginsäure-Natriumsalz aus Braunalgen, niedrigviskos</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2158</td><td>Über Nacht in Wasser auflösen. Filtrieren Sie durch steril 0,2&nbsp; &Mikro; m Spritzenvorsatzfilter vor dem Gebrauch. Bei 4 °C lagern.</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz</td><td></td><td>In sterilem PBS auflösen und mit 0,2 & Mikro filtrieren; m Spritzenvorsatzfilter vor dem Gebrauch.&nbsp;</td></tr><tr><td>BCA-Assay-Kit</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td>Dieses Kit wurde zur Messung der BSA-Freisetzung aus PD-IPC-Gerüsten verwendet.</td></tr><tr><td>Humaner rekombinanter vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor</td><td>R& D systems</td><td>293-VE</td><td>Wachstumsfaktor in 0,2%iger Heparinlösung auf eine Endkonzentration von 5&nbsp; mg/ml.</td></tr><tr><td>Heparin-Natriumsalz vom Schwein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3393</td><td>Dies kann durch einen anderen Markentyp ersetzt werden. Heparinsalz in sterilem Wasser bei einer Endkonzentration von 1 % auflösen und durch 0,2 & Mikro filtrieren; m Spritzenvorsatzfilter vor dem Gebrauch.&nbsp;</td></tr><tr><td>Humane Nabelvenen-Endothelzellen (HUVEC)</td><td>Lonza</td><td>C2517A</td><td>Dieser primäre Zelltyp wurde im Assay zur Bestimmung der VEGF-Bioaktivität nach Freisetzung aus PD-IPC-Gerüsten verwendet.</td></tr><tr><td>Alamar blue</td><td>Life Technologies</td><td>DAL1025</td><td>Dies wird verwendet, um die Stoffwechselaktivität von Zellen zu messen. Inkubieren Sie Alamar Blue mit Zellen und halten Sie es 2 bis 4 Stunden lang unter Standard-Zellkulturbedingungen. Messen Sie die Absorption bei 570 nm, um die prozentuale Reduktion von Alamar-Blau zu bestimmen, die mit der Zellaktivität korreliert.</td></tr><tr><td>ScanVac Coolsafe Gefriertrockner</td><td>Labogene</td><td>7.001.200.060</td><td>Dies ist ein nicht programmierbarer Gefriertrockner, der bei -105 bis -110&nbsp; arbeitet &deg;C. Dieser kann durch andere Standard-Labor-Lyophilisierer ersetzt werden.</td></tr><tr><td>Polycaprolacton (PCL)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>181609</td><td>MW 65 kDa. Diese wird von Sigma Aldrich nicht mehr hergestellt. Diese kann durch die Sigma Aldrich Katalognummer 704105 ersetzt werden.</td></tr><tr><td>Dichlormethan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V800151</td><td>Dieser kann durch einen anderen Markentyp ersetzt werden. Dieses Material ist gefährlich und muss im Abzug gehandhabt werden. Beim Umgang mit dieser Chemikalie muss jederzeit Schutzausrüstung getragen werden.</td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxan (PDMS; 184 Silikonelastomer-Kit)</td><td>Dow Corning</td><td>(240)4019862</td><td>Das Elastomer-Kit wird mit Polymerbasis und Vernetzer geliefert. Das Mischen der Polymerbasis und des Vernetzers in unterschiedlichen Verhältnissen führt zu einer unterschiedlichen Steifigkeit des PDMS.</td></tr><tr><td>Humaner rekombinanter Beta-Nerven-Wachstumsfaktor (NGF)</td><td>R& D-Systeme</td><td>256-GF</td><td>Rekonstituiert in sterilem Wasser mit VE bis zu einer Endkonzentration von 100 μd.M. &Mikro; g&#8288;/&#8288;ml. Aliquotieren und lagern in -20 & Grad; C bis zum Gebrauch.</td></tr><tr><td>Humane mesenchymale Stammzellen (hMSC)</td><td>Cambrex</td><td></td><td>Dieser Zelltyp wurde im Assay verwendet, um den synergistischen Effekt von NGF und Nanotopographie zu bestimmen.</td></tr><tr><td>Ratte PC12 Phäochromozytom-Zellen&nbsp;</td><td>ATCC</td><td></td><td>Dieser Zelltyp wurde im Neuriten-Outgrowth-Assay verwendet, um die Bioaktivität von NGF zu bestimmen. Messen Sie nach der Exposition gegenüber Freisetzungsmedien mit NGF die Anzahl der Zellen mit Neuritenerweiterungen und normalisieren Sie sie auf die Gesamtzahl der Zellen.</td></tr><tr><td>Filterpapier der Güteklasse 93</td><td>Whatman</td><td>Z699675</td><td>Es wird zur Reinigung von Chitosan nach dessen Ausfällung mit Natriumhydroxid bei einem pH-Wert von 7 verwendet.</td></tr><tr><td>Schwenkschaufelzentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>Zur Verwendung bei der Reinigung von Chitosan mit einer Geschwindigkeit von 1.200 x g.</td></tr><tr><td>Motor mit Dorn, der sich mit konstanter Drehzahl dreht</td><td>Rhymebus</td><td>RM5E</td><td>Der Motor wird für die Herstellung von IPC-Fasern auf Pullulan- oder PCL-Rahmen verwendet.</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>FirstBase</td><td></td><td>Sterilize durch Filtration (0,2 &; Mikro; M-Filter) und Autoklav.&nbsp;</td></tr><tr><td>Gewebekultur-Polystyrolschale (TCPS) mit 10 mm DurchmesserGreiner</td><td></td><td></td> <td>Die TCPS-Schale wird zum Gießen von Pullulanrahmen verwendet.</td></tr><tr><td>Humanes VEGF-ELISA-Kit</td><td>R& D systems</td><td>DVE00</td><td>Das ELISA-Kit dient zur Detektion von VEGF im Freisetzungsmedium.</td></tr><tr><td>Humanes NGF-ELISA-Kit</td><td>R& D systems</td><td>DY256</td><td>Das ELISA-Kit wird zum Nachweis von NGF im Freisetzungsmedium verwendet.</td></tr><tr><td>Kunststoffbeschichtetes Klebeband</td><td>Bel-Art</td><td>9040336</td><td>Das Klebeband dient dazu, die Krokodilklemme sicher auf den rotierenden Dorn zu kleben</td></tr></tbody></table>

verbund scaffolds für grenzflächen polyelectrolyte fasern für zeitlich kontrollierte freisetzung von biomolekülen

Composite Scaffolds of Interfacial Polyelectrolyte Fibers for Temporally Controlled Release of Biomolecules

Verschiedene Gerüste, die im Tissue Engineering verwendet werden, benötigen eine kontrollierte biochemische Umgebung, um die physiologische Zellnische nachzuahmen. Grenzflächen-Polyelektrolyt-Komplexierungsfasern (IPC) können für die kontrollierte Abgabe verschiedener biologischer Wirkstoffe wie niedermolekulare Medikamente, Zellen, Proteine und Wachstumsfaktoren verwendet werden. Die Einfachheit der Methodik bei der Herstellung von IPC-Fasern bietet Flexibilität bei der Anwendung für die kontrollierte Verabreichung von Biomolekülen. Hier beschreiben wir ein Verfahren zum Einbau von IPC-Fasern in zwei verschiedene polymere Gerüste, hydrophiles Polysaccharid und hydrophobes Polycaprolacton, um ein Mehrkomponenten-Verbundgerüst zu schaffen. Wir haben gezeigt, dass IPC-Fasern leicht in diese Polymerstrukturen eingebettet werden können, was die Fähigkeit zur verzögerten Freisetzung und verbesserten Konservierung von Biomolekülen verbessert. Wir haben auch ein zusammengesetztes Polymergerüst mit topographischen Hinweisen und anhaltender biochemischer Freisetzung entwickelt, die synergistische Effekte auf das Zellverhalten haben können. Verbundpolymere Gerüste mit IPC-Fasern stellen eine neuartige und einfache Methode dar, um die zelluläre Nische nachzubilden.

In diesem Artikel haben wir versucht, Verbund Gerüste mit IPC-Fasern für die verzögerte Freisetzung verschiedener Biomoleküle zu schaffen. Eigenschaften der in dieser Studie verwendeten Biomoleküle sind in Tabelle 1 gefunden. IPC Faser wurde in eine hydrophile PD Hydrogel eingebettet ist, um einen PD-IPC Verbundgerüst (1B) zu schaffen. Modellmolekuls BSA wurde zuerst untersucht, um die Durchführbarkeit der Verwendung eines Verbundgerüst zur kontrollierten Freisetzung Biomoleküls zu best...

Gerüste für das Tissue Engineering müssen die komplexe biochemische und biophysikalische Mikroumgebung der zellulären Nische rekapitulieren. Hier zeigen wir die Verwendung von Grenzflächen-Polyelektrolyt-Komplexierungsfasern als Plattform zur Herstellung von zusammengesetzten, mehrkomponentigen Polymergerüsten mit anhaltender biochemischer Freisetzung.

Verbund Scaffolds für Grenzflächen Polyelectrolyte Fasern für zeitlich kontrollierte Freisetzung von Biomolekülen

Various scaffolds used in tissue engineering require a controlled biochemical environment to mimic the physiological cell niche. Interfacial ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine kontrollierte Abgabe von Biomolekülen mit räumlicher Steuerung zu ermöglichen, um die zelluläre Nische aus hydrophilen oder hydrophoben polymeren Verbundgerüsten nachzuahmen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein opferbares Gerüst aus gewünschten Polymeren erzeugt wird, das die räumliche Anordnung der Biomolekül-freisetzenden Fasern – sogenannte interfacial poly electrolyte (IPC)-Fasern – vorgibt. Der zweite Schritt besteht darin, IPC-Fasern, die das gezielte hydrophile Biomolekül enthalten, in ein opferbares Gerüst einzubinden.Anschließend werden die IPC-Fasern auf Rahmenkonstrukten mithilfe eines mikrostrukturierten Substrats als Gussform, das topographische Hinweise auf dem Substrat enthält, in ein größeres Gerüst eingebettet. Der letzte Schritt besteht darin, die vollständige Assimilation der Fasern auf dem Rahmen, die Konstruktion und die Aushärtung der Polymere zu ermöglichen, um unstrukturierte oder mikrostrukturierte Substrate herzustellen. Letztendlich können Standardtests verwendet werden, um die Freisetzungsprofile und die Bioaktivität der Zielmoleküle nachzuweisen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen bestehenden Methoden wie der Mikroverkapselung besteht darin, dass die Einbindung hydrophiler Biomoleküle in eine breite Palette hydrophiler oder hydrophober Polymerscaffolds nun über einen einfachen Einbindungs- und Herstellungsprozess möglich ist. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Arzneimittelabgabe zu beantworten, darunter die mehrfach regulierte biochemische Freisetzung, biochemische Gradienten sowie der synergistische Effekt topographischer Signale und einer kontinuierlichen biochemischen Freisetzung auf das Zellverhalten. Eine visuelle Demonstration der Bildung von Polyelektrolyt-Fasern ist entscheidend, da die Schritte schwer zu erlernen sind.Die Geschwindigkeit, die Konzentration und die Reinheit der Polyelektrolytlösung sind alle entscheidend für die stabile Bildung von IPC-Fasern. Geben Sie zunächst Proteine, Wachstumsfaktoren oder andere gewünschte Biomoleküle gemäß dem begleitenden textlichen Protokoll in Aliquots von 10 bis 20 Mikroliter der Polyelektrolytlösung. Anschließend geben Sie kleine Tropfen von jeweils 10 bis 20 Mikroliter Chitosan und Alginsäure auf eine stabile, flache Oberfläche, die mit Paraform bedeckt ist. Die Tropfen aus Chitosan und Alginsäure sollten nahe beieinander, aber nicht in Kontakt miteinander platziert werden.Tauchen Sie eine Spitze eines Paars Pinzetten leicht in den Kites-Sand-Tropfen und die andere Spitze in den Alginate-Tropfen. Bringen Sie dann die Polyelektrolyt-Tropfen durch Zusammendrücken der Pinzette zusammen. Wenn die Tropfen miteinander in Kontakt kommen, ziehen Sie die Pinzette langsam vertikal, um die an der Grenzfläche gebildete Polyelektrolyt-Komplexfaser, bekannt als IPC-Faser, aus der Grenzfläche der beiden Tropfen zu ziehen.Platzieren Sie vorsichtig das Ende der gezogenen IPC-Faser auf einem Kollektor, der aus einem flachen, polymeren Gerüst besteht, das auf einer rotierenden Walze befestigt ist. Drehen Sie die Walze mit einer konstanten Geschwindigkeit von 10 Millimetern pro Sekunde, um die Bildung gleichmäßiger und perlenfreier IPC-Fasern zu ermöglichen. Eine Erhöhung der Ziehgeschwindigkeit der IPC-Fasern führt zur Bildung von Perlen, was eine Burst-Freisetzung der eingebauten biochemischen Substanzen und ein vorzeitiges Abbruch der Fasern verursacht.In Übereinstimmung mit der Beobachtung von Liao et al. und KO et al.: Wenn die Faser endet, verdünnen Sie die restliche Flüssigkeit mit 500 µL PBS und messen Sie die Konzentration des verbleibenden Proteins oder Wachstumsfaktors im Rückstand. Um die Einbaueffizienz der Biomoleküle zu bestimmen, wiegen Sie drei Gramm Polander-Polysaccharid ab und geben Sie es zu 15 mL destilliertem, entionisiertem Wasser hinzu.Um eine 20%ige wässrige Lösung herzustellen, mischen Sie die Poland-Lösung über Nacht, um am nächsten Tag eine homogene Mischung zu gewährleisten. Geben Sie 15 Milliliter der Poland-Lösung in eine Gewebekultur-Polystyrolschale mit einem Durchmesser von 10 Zentimetern. Lassen Sie die Lösung über Nacht bei 37 Grad Celsius trocknen und schneiden Sie danach die Filme in sieben Millimeter mal sieben Millimeter große quadratische, opferbare Poland-Rahmen. Als Nächstes stellen Sie eine 30%ige Lösung der Polysaccharide Poland und Dextrin in dreifachem Verhältnis zueinander in destilliertem, deionisiertem Wasser her. Mischen Sie die Lösung über Nacht, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten, und geben Sie langsam Natriumbicarbonat zur Polysaccharidlösung hinzu, um eine Endkonzentration von 20 % zu erreichen. Rühren Sie die Lösung erneut über Nacht und lagern Sie die fertige Polysaccharidlösung bei vier Grad Celsius, bis sie benötigt wird. Befestigen Sie den opferbaren Poland-Rahmen mit einer Krokodilklemme und etwas kunststoffbeschichtetem Klebeband in der gewünschten Ausrichtung an der rotierenden Mandrel.Drehen Sie den Mandrel mit dem befestigten Rahmen mit einer konstanten Geschwindigkeit von 10 Millimetern pro Sekunde. Beginnen Sie dann, die IPC-Fasern wie im vorherigen Abschnitt gezeigt zu ziehen. Befestigen Sie diesmal jedoch das gezogene Ende der IPC-Fasern am rotierenden Poland-Rahmen.Warten Sie anschließend auf das Ende des IPC-Faserziehens. Trocknen Sie die Fasern über Nacht bei Raumtemperatur an der Rahmenkonstruktion. Danach lösen Sie die Konstruktion von der rotierenden Dornspindel, indem Sie sie aus der Krokodilklemme entfernen.Stellen Sie die Konstruktion in eine Mikrozentrifugenröhrchenkappe. Geben Sie anschließend fünf Gramm der Polnischen Dextrinlösung in ein Becherglas und beginnen Sie, diese mit 60 U/min umzurühren. Fügen Sie mithilfe eines Rührplattens 500 Mikroliter einer 11%igen Natriumtrimetaphosphatlösung und 500 Mikroliter einer 10-molaren Natriumhydroxidlösung hinzu.Um die Lösung zu vernetzen. Mischen Sie die Lösung weitere ein bis zwei Minuten und gießen Sie dann die viskose Polysaccharidlösung auf die Fasern des Rahmenkonstrukts, um die IPC-Fasern vollständig einzubetten. Inkubieren Sie die Konstruktion bei 60 Grad Celsius für 30 Minuten, um einen chemisch vernetzten Verbundträger zu bilden und die Porenbildung im Verbundträger zu induzieren.Das gesamte Gerüst 20 Minuten lang in eine Lösung mit 20 % Essigsäure eintauchen. Anschließend das Gerüst dreimal jeweils fünf Minuten lang unter Schütteln bei 100 U/min in PBS waschen. Um alle verbliebenen nicht umgesetzten Reagenzien zu entfernen, das überschüssige PBS abnehmen und die Verbundgerüste unverzüglich über Nacht bei minus 80 Grad Celsius einfrieren.Als Nächstes lyophilisieren Sie die Gerüste mindestens 24 Stunden, bevor sie in Freisetzungsstudien oder Bioaktivitätsassays verwendet werden. Erstellen Sie zunächst ein makelloses und strukturiertes PDMS-Substrat mit der gewünschten Topographie mithilfe etablierter Methoden der weichen Lithographie. Bereiten Sie danach sowohl den opfern PCL-Rahmen zur Sammlung der IPC-Fasern als auch die strukturierte PCL-Basis vor, indem Sie 0,9 % PCL in Dichlormethan auflösen.Für jeden Quadratzentimeter Fläche der PDMS-Folienform 500 Mikroliter der 0,9 %igen PCL-Lösung auf die Form geben. Den Lösungsmittel vollständig in der Abzugshaube verdunsten lassen und dann den Gießvorgang der 0,9 %igen PCL-Lösung wiederholen, um die Folie zu verdicken. Als Nächstes den opferbaren Rahmen vorbereiten, indem jeweils 500 Mikroliter der 0,9 %igen PCL-Lösung auf ein separates, makelloses PDMS-Substrat gegeben werden.Um eine makellose PCL-Basisschicht zu erzeugen, mehrere Schichten aus PCL auftragen, um ein Gerüst mit der gewünschten Dicke zu erhalten. Den gesamten Chloromethan-Lösungsmittel vollständig in der Abzugshaube verdunsten lassen, sobald die gewünschte Dicke erreicht ist. Den getrockneten PCL-Film vom makellosen PDMS-Substrat entfernen und mit einem auf PSAP-Größe abgestimmten Locher ein Loch in den PCL-Rahmen stanzen.Als Nächstes montieren Sie den PCL-Rahmen auf den Sammelmandrel und beginnen Sie, wie zuvor beschrieben, die IPC-Faser auf den Rahmen aufzuziehen. Wenn das Ziehen der IPC-Faser beendet ist, nehmen Sie die Faser-auf-Rahmen-Konstruktion ab und lassen Sie sie über Nacht bei 25 Grad Celsius trocknen. Stellen Sie die Faser-auf-Rahmen-Konstruktion auf die strukturierte PCL-Basis und geben Sie mehrmals die 0,9 %-PCL-Lösung auf die Faser-auf-Rahmen-Konstruktion, um die gewünschte Dicke zu erreichen und sicherzustellen, dass die IPC-Fasern vollständig eingebettet sind.Das aus dem Polen-Dextrin-IPD-Verbund freigesetzte Rinderserumalbumin oder BSA zeigte eine nahezu lineare Kinetik mit einer anfänglich abgeschwächten Burst-Freisetzung, gefolgt von einem gleichzeitigen stationären Zustand. Nach zwei Monaten wurde eine Gesamtfreisetzung von 97 % des BSA erreicht. Im Gegensatz dazu wiesen allein stehende IPC-Fasern eine schnelle Freisetzung von 80 % des BSA innerhalb von vier Stunden auf. Unter Verwendung desselben Verbunds konnte auch ein vaskulärer Wachstumsfaktor nachhaltig aus den Fasern freigesetzt werden, wobei humane Nabelvenenendothelzellen als Testplattform dienten.Der freigesetzte Wachstumsfaktor erwies sich nach seiner Freisetzung zu jedem Zeitpunkt als bioaktiv. In diesem Beispiel wurde Nervenwachstumsfaktor über einen Zeitraum von 18 Tagen in die Fasern geladen. Mithilfe eines PC-12-Neuriten-Auswuchs-Assays wurde gezeigt, dass etwa 80 % des geladenen Nervenwachstumsfaktors aus dem P-C-L-I-P-C-Verbund in kontinuierlicher, linearer Freisetzung freigesetzt wurde.Die Menge an bioaktivem Nervenwachstumsfaktor, die zu jedem Zeitpunkt aus dem Gerüst in das Medium freigesetzt wurde, hatte einen ähnlichen Effekt auf das Neuritenwachstum wie die Zugabe von 30 Nanogramm pro Milliliter Nervenwachstumsfaktor zu einem einfachen Medium. P-C-L-I-P-C-Verbundgerüste, die sowohl Topographie als auch eine kontrollierte Freisetzung von Nervenwachstumsfaktor enthalten, könnten einen synergistischen Effekt auf das zelluläre Verhalten haben. Menschliche mesenchymale Stammzellen, die auf nanostrukturierten Verbundgerüsten kultiviert wurden, zeigten ein höheres Maß an neuronalen Differenzierung im Vergleich zu Zellen, die entweder allein der Topographie oder dem Wachstumsfaktor ausgesetzt waren.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, das gewünschte hydrophile Molekül in die Polyelektrolytlösung mit derselben Nettoladung einzumischen, um es in die Fasern einzubinden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einen zusammengesetzten Polymerscaffold herstellt, der die kontrollierte Freisetzung von Wirkstoffmolekülen ermöglicht. Der wesentliche Erkenntnisgewinn aus diesem Video sollte es Ihnen ermöglichen, einen pulmonalen Scaffold herzustellen, der die langsame Freisetzung von Wachstumsfaktoren, die Freisetzung mehrerer Wachstumsfaktoren sowie die Erzeugung eines Gradienten biochemischer Signale ermöglicht, um die physiologische Nische nachzubilden.Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit Essigsäure, Natronlauge und Chlormethan äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung von persönlicher Schutzausrüstung sowie die Absaughaube stets beachtet werden sollten, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

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