Name: Verbund Scaffolds für Grenzflächen Polyelectrolyte Fasern für zeitlich kontrollierte Freisetzung von Biomolekülen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie IPC-Fasern in polymere Scaffolds einbetten, um Biomoleküle zeitlich kontrolliert freizusetzen. Diese Methode ermöglicht räumlich gezielte Freisetzung für Tissue-Engineering-Anwendungen.

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Diese Arbeit wurde von der Singapore National Research Foundation von einem seiner Research Centers of Excellence, die Mechanobiologie Institute, Singapur verabreicht unterstützt. MFAC wird von der Agentur für Wissenschaft, Technologie und Forschung (Singapur) und Nationalen Forschungsagentur (Frankreich) gemeinsame Programm unter Projektnummer 1122703037. Bkkt wird durch die Mechanobiologie Institute unterstützt unterstützt. Wir danken Herrn Daniel Wong HC für das Korrekturlesen des Manuskripts und Frau Morgendämmerung JH Neo zur Unterstützung bei der Videoproduktion.

1. Herstellung von Polyelektrolytlösungen <ol><li> Reinige Chitosan, wie in Liao et al beschrieben. Kurz gesagt, erstellen Sie eine 1% (w / v) Lösung von Chitosan in 2% (v / v) Essigsäure und Vakuumfilter mit Grad 93-Filterpapier. Neutralisiert das Filtrat mit 5 M NaOH, bis der pH-Wert stabilisiert bis 7. Zentrifugieren Sie das ausgefallene Chitosan bei 1.200 × g für 10 min. Überstand dekantieren und fügen VE-Wasser, um das Chitosan zu waschen. Wiederholen Sie die Zentrifugation und Waschschritt noch zweimal. Einfrieren der ausgefallene Chitosan bei -80 ° C und lyophilisiere O / N, um die gereinigte Form zu erhalten. Bewahren Sie gereinigte Chitosan in einem entfeuchteten Schrank. </li><li> Abwiegen 1 g gereinigtes Chitosan in eine sterile Gewebekulturschale. Platzieren des Chitosans in der Gewebekulturschale so nahe wie möglich an der UV-Lampe in der Sicherheitswerkbank und freizulegen, um UV-Licht für 15 min. Mit einer sterilen Pinzette, legen Sie die sterilisiert Chitosan in einen Glasbehälter. Chitosan aufzulösen Verwendung gefiltert 0.15M Essigsäure bis zu einer Endkonzentration zwischen 0,5% und 1% (w / v). </li><li> Abwiegen 0,1 g Alginsäure-Natriumsalz und lösen sich in 10 ml destilliertem entionisiertem (DDI) Wasser, um eine 1% (w / v) Lösung zu erhalten. Mischen Sie die Alginsäurenatriumsalz für mindestens 2 Stunden auf dem Vortex-Mischer, um eine vollständige Auflösung zu gewährleisten. Filtern der Alginatlösung durch 0,2 &amp; mgr; m-Spritzenfilter. Bewahren Sie die Alginat-Lösung bei 4 ° C. </li><li> Rekonstituieren humanen rekombinanten Wachstumsfaktoren, wie den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) oder &amp; beta; - Nervenwachstumsfaktor (NGF), wie vom Hersteller empfohlen. </li></ol> 2. Zeichnung der IPC Fibers <ol><li> Mischen Sie Proteine, Wachstumsfaktoren oder andere Biomoleküle in 10-20 ul-Aliquot der Polyelektrolyt-Lösung, die eine ähnliche Nettoladung hat. Biologische Moleküle mit negativen Nettoladung (zB Rinderserumalbumin [BSA]) sollte mit Alginat-Lösung gemischt werden. Biologische Moleküle mit positiven Nettoladung (zB VEGF) sollte mit gemischt werdenChitosan-Lösung. </li><li> Legen Sie kleine Teilmengen (10-20 ul) von Chitosan und Alginat auf eine stabile ebene Fläche, die mit Parafilm abgedeckt ist. Die Tröpfchen aus Chitosan und Alginat sollte in enger Nachbarschaft angeordnet werden, jedoch nicht in Kontakt miteinander. </li><li> Leicht tauchen jede Spitze auf einer Pinzette in die Chitosan und Alginat-Tröpfchen. Bringen Sie die Tropfen von Polyelektrolyten zusammen durch Kneifen der Zange. Wenn die Tröpfchen in Kontakt miteinander kommen, die Zange langsam senkrecht nach oben zu ziehen, um die IPC-Faser von der Schnittstelle der beiden Tröpfchen (1A) ziehen. </li><li> Legen Sie das Ende des gezogenen IPC Faser an der Zange auf einem Kollektor, wie eine flache Polymergerüst auf einem rotierenden Dorn befestigt (siehe Kapitel 3 und 4). Drehen des Dorns mit einer festen Geschwindigkeit von 10 mm / s, um die Bildung einer einheitlichen und wulstfreie IPC Fasern ermöglichen. Die Erhöhung der Geschwindigkeit des Ziehens der Fasern IPC Kügelchen bilden, die eine schlagartige Freisetzung des eingearbeiteten verursachenbiochemischen und vorzeitige Beendigung Faser. 10 </li><li> Um zu bestimmen Einbaueffizienz, sammeln alle verbleibenden Flüssigkeiten links auf dem Parafilm durch Verdünnen mit 500 ul 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Messung der Faktor-Inhalts Protein oder das Wachstum in dem Rückstand durch BCA-Assay (für BSA), ELISA (für VEGF und NGF) oder einem entsprechenden Assay eingebaut Biomolekül detektieren. </li></ol> 3. Herstellung von Verbund Hydrogel Gerüst Pullulan-Dextran (PD) Polysaccharide und IPC Fibers <ol><li> Herstellung Opfer Pullulan Rahmen für IPC Fasersammel <ol><li> Abwiegen Pullulan Polysaccharid und mischen mit destilliertem deionisiertem (DDI) Wasser, um eine 20% erstellen (w / v) wässrigen Lösung. Mischen Sie die Pullulanlösung O / N, um die Homogenität zu gewährleisten. </li><li> Guss 15 g Pullulan-Lösung in einen Durchmesser von 10 cm Gewebekultur Polystyrol (TCPS) Gericht. Trocknen Sie die Pullulanlösung O / N bei 37 ° C. Schneiden Sie die Pullulan Filme in 7mm x 7 mm quadratische Rahmen. </li></ol></li><li> Vorbereiten Pullulan-Dextran Polysaccharidlösung <ol><li> Erstellen Sie eine 30% (w / v) Lösung der Polysaccharide Pullulan und Dextran (3: 1-Verhältnis) in DDI Wasser. Mischungs O / N um die Homogenität der Polysaccharidlösung gewährleisten. Langsame Zugabe von Natriumhydrogencarbonat zu der Polysaccharid-Lösung bis zu einer Endkonzentration von 20% zu erreichen (w / v). Mischungs O / N, um die Homogenität der Lösung sicherzustellen. Lagern Sie das Polysaccharid-Lösung bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Sammeln IPC Fasern auf Pullulan Rahmen <ol><li> Befestigen Sie das Opfer Pullulan Rahmen (Abschnitt 3.1) mit einem Krokodilklemme. Haften die Krokodilklemme und Pullulan Rahmen auf dem Ende des sich drehenden Dorn mit Kunststoff beschichtetes Klebeband. Drehen des Dorns mit dem befestigten Rahmen mit einer konstanten Geschwindigkeit von 10 mm / sec. Pullulan Rahmen kann auf den sich drehenden Dorn in gewünschten Orientierungen befestigt werden. </li></ol></li><li> Zeichnen Sie die IPC-Fasern mit einer Pinzette (Abschnitt 1) ​​und attach das gezogene Ende der IPC-Fasern auf die rotierende Pullulan Rahmen. Ziehen die IPC Fasern mit einer konstanten Geschwindigkeit. Bei Erreichen der terminalen Ende der IPC Faser, trockne die Fasern gegenüber dem Trägerrahmen die O / N bei RT. </li><li> Einbetten IPC Fasern in PD Hydrogel Gerüst </li><li> Um jedes Gramm Pullulan-Dextran-Lösung zu vernetzen, werden 100 &amp; mgr; l von 11% (w / v) Natrium-Trimetaphosphat wässrige Lösung und 100 ul 10 M Natriumhydroxid. 7 Mischen der Lösung bei 60 UpM unter Verwendung einer Rührplatte für 1 bis 2 min. Nach der Zugabe von Natriumtrimetaphosphat und Natriumhydroxid wird die Polysaccharid-Lösung fast sofort zu vernetzen. Gießen Sie die viskose Polysaccharid-Lösung auf die Fasern-on-Frame-Konstrukt, um die IPC-Fasern vollständig einzubetten. Inkubieren der kombinierten Pullulan-Dextran-IPC Fasern (PD-IPC) bei 60 ° C für 30 min, um eine chemisch vernetzte Verbundgerüste (1B) zu bilden. </li><li> ACHTUNG: Führen Sie Schritt 3.3.2 in der Abzugshaube und verwenden Sie geeignete Schutz equipment wie Essigsäure ist eine aggressive und brennbare. </li><li> Zur Porenbildung in der PD-IPC Gerüst induzieren, tauchen die ganze Gerüst in 20% (w / v) Essigsäure für 20 min. </li><li> Entfernen nicht umgesetzten Reagenzien durch Waschen PD-IPC Gerüste in 1X PBS für 5 min unter Schütteln bei 100 Umdrehungen pro Minute. Wiederholen Sie diesen Schritt 2 mal. </li><li> Entfernen Sie das überschüssige PBS und unverzüglich sperren PD-IPC Gerüste bei -80 ° CO / N. Lyophilisieren die Gerüste mindestens 24 Stunden vor der Verwendung in allen kontrollierten Freisetzung oder Bioaktivitätstests. </li></ol> 4. Herstellung von Verbundgerüst von PCL und IPC Fibers ACHTUNG: Dichlormethan ist ein Gefahrstoff. Verwenden Sie den Abzug und persönliche Schutzausrüstung beim Umgang mit Dichlormethan. <ol><li> Erstellen unberührten und gemusterten PDMS Substrate <ol><li> Erstellen Sie eine neue, unberührte Polydimethylsiloxan (PDMS) Elastomer-Substrat mit einem Stück TCPS der gewünschten Abmessung mit weichen Lithographieprozess. Erstellen patteingeschaltet PDMS Substrate durch Verwendung von Standard-Weichlithographieverfahren von Poly (methylmethacrylat) Vorlagen mit der gewünschten Topographie. 12 </li></ol></li><li> Herstellung Opfer PCL Rahmen für IPC Fasersammel <ol><li> Abwiegen PCL und lösen in Dichlormethan, um eine 0,9% (w / v) Lösung zu schaffen. Für jede 1 cm 2 Fläche des PDMS-Substrat, fallen 500 ul 0,9% PCL-Lösung. Lassen Sie das gesamte Lösungsmittel Dichlormethan vollständig in der Abzugshaube verdampfen. Wiederholen den Vorgang des Gießens 0,9% PCL, um die Folie auf die gewünschte Dicke zu verdicken. Entfernen Sie die getrockneten PCL-Film aus der PDMS-Substrat. Erstellen Sie ein Loch in der PCL-Rahmen mit einem angemessen dimensionierten Puncher. 2 </li></ol></li><li> Sammeln IPC Fasern auf der PCL-Rahmen <ol><li> Befestigen Sie das Opfer PCL Rahmen mit Loch (von 4.2.1) auf einer Krokodilklemme. Halten Sie die Krokodilklemme auf den sich drehenden Dorn unter Verwendung kunststoffbeschichteten Klebeband. Befestigen Sie den gezogenen Ende des IPC Faser auf die PCL frame vor dem Start der Drehung mit einer konstanten Geschwindigkeit von 10 mm / s (Abschnitt 2). Nach dem Ende der IPC Faserziehen, Trocknen der Faser-on-Frame-Konstrukt O / N bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Einbetten von Faser-on-Frame-Konstrukts in gemusterten PCL Substrat <ol><li> Drop 500 ul 0,9% PCL-Lösung auf das PDMS-Substrat, um eine unberührte oder gemusterten PCL Basis zu schaffen, je nach Bedarf. Guss mehrere Schichten von 0,9% PCL-Lösung ein Gerüst mit der gewünschten Dicke zu erhalten. Lassen Sie das gesamte Lösungsmittel Dichlormethan vollständig in der Abzugshaube verdampfen. </li><li> Legen Sie die Faser-on-Frame-Konstrukt (Abschnitt 4.3.1) auf der Oberseite des Basis PCL. In 0,9% PCL-Lösung auf die Faser-auf-Rahmen zu konstruieren mehrmals, um die gewünschte Dicke zu erhalten und vollständig einzubetten die IPC-Fasern, Herstellen einer PCL-IPC Verbundgerüst (Abbildung 1c). </li></ol></li></ol> 5. Messung der Freisetzung biologischer Stoffe aus Verbund IPC Gerüste <ol><li> Zeigen Verbund PD-IPC oderPCL-IPC Gerüsten und Stand-alone-IPC Fasern getrennt in einer 24-Well-Platte. </li><li> Tauchen Sie das Gerüst und Standalone-IPC-Fasern mit 500 ul 1X PBS. Die Proben bei 37 ° C inkubiert. Sammeln PBS zu verschiedenen Zeitpunkten (Release-Medien) und ersetzen mit 500 ul 1X PBS. </li><li> Messen der Menge an Protein oder Wachstumsfaktor in den Freisetzungsmedien mit einem BCA-Test (BSA), ELISA (VEGF und NGF) oder anderen geeigneten Assays für das kumulative Freisetzungsprofil für den einge Biomolekül berechnen. </li></ol> 6. Seeding von Zellen auf Composite-IPC Gerüste auf der freigegeben Biologische Arbeitsstoffe Testen Bioaktivität <ol><li> Sterilisieren Sie die lyophilisierten PD-IPC oder PCL-IPC Verbund Gerüste mit UV-Licht in der biologischen Sicherheitswerkbank für mindestens 20 min. </li><li> Verwenden Standardzellkulturtechniken, um eine Zellsuspension von 2 x 10 5 Zellen in 200 &amp; mgr; l Wachstumsmedium zu erhalten. Samen der konzentrierten Zellsuspension auf die Verbund Gerüste. After 20 min, top-up das Volumen des Wachstumsmediums, um die Gerüste vollständig untertauchen. </li><li> Messen der Zellaktivität, durch Standardtechniken, wie Alamar Blau metabolischen Aktivitätstest PC12 Neuritenwachstum Assay oder Immunfluoreszenz. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

IPC Fasern durch die Interaktion von zwei entgegengesetzt geladenen Polyelektrolyten gebildet sind. Das Verfahren nutzt die Gewinnung des Komplexes aus der Schnittstelle der Polyelektrolyte, einen Selbstorganisationsprozess für stabile Faserbildung erleichtert wird. Der Mechanismus der IPC Faserbildung sorgt dafür, dass jedes Biomolekül ergänzt in einen ähnlich geladenen Polyelektrolyten während der Komplexbildung eingearbeitet werden. 10,11 umge Zugabe eines Biomoleküls in die entgegengesetzt geladenen Polye...

Die extrazelluläre Matrix hat inhärente biochemische und biophysikalische Hinweise, die das Verhalten der Zellen steuern. Die Nachahmung dieser physiologischen dreidimensionalen (3D) Mikroumgebung ist eine weit verbreitete Strategie für Anwendungen in der regenerativen Medizin und im Tissue Engineering. Zum Beispiel wurden sowohl natürlich gewonnene als auch synthetische Substrate mit topographischen Hinweisen modifiziert, um die biophysikalische zelluläre Umgebung nachzuahmen. 1 Zum Beispiel können Polycaprolacton (PCL)-Gerüste leicht strukturiert werden, indem auf gemusterte PDMS-Substrate gegossen wird. 2 Die meisten synthetischen Gerüste rekapitulieren jedoch die kontrollierte biochemische Umgebung in vivo nur unzureichend.Die Massen- oder Oberflächenmodifikation von synthetischen Materialien bietet nur biochemische Signale für die Zellanhaftung, aber es fehlt noch eine zeitliche Regulierung der biochemischen Verabreichung. 3 Daher besteht ein Bedarf an optimalen Gerüsten, die das zeitlich regulierte biochemische Verabreichungssystem der extrazellulären Matrix nachahmen können. 
Biochemische Verabreichungssysteme wie Mikrosphären werden aufgrund der Schwere und Komplexität des mehrstufigen Syntheseprozesses von Problemen des Verlusts der Bioaktivität und der geringen Inkorporationseffizienz geplagt. 4-6 Alternative Methoden, die eine einstufige Herstellungs- und Einbaumethode verwenden, haben nachweislich ein hervorragendes Potenzial, eine günstige biochemische Mikroumgebung zu schaffen, ohne die damit einhergehende Ineffizienz beim Einbau und Verlust der Bioaktivität. Eine praktikable Lösung ist die Verwendung von Grenzflächenfasern mit Polyelektrolytkomplexierung (IPC), um biologische Wirkstoffe zu transportieren und zu schützen. Wenn zwei gegensätzlich geladene wässrige Polyelektrolytlösungen zusammengebracht werden, können IPC-Fasern aus der Grenzfläche herausgezogen werden. Praktisch jede Art von hydrophlischem Biomolekül in wässriger Lösung kann entweder in die negativ oder positiv geladene Polyelektrolytlösung gegeben werden, wodurch der Einbau nützlicher Biomoleküle in die IPC-Faser während des Komplexierungsprozesses erleichtert wird. Darüber hinaus sind für dieses Verfahren nur Wasser- und Umgebungsbedingungen erforderlich, wodurch das Risiko eines Verlusts der Bioaktivität verringert wird. Mit dieser Methode wurden aktive Wachstumsfaktoren2,7 sogar Zellen8,9 erfolgreich abgegeben. Darüber hinaus ermöglicht die einfache Methode der Formung von IPC-Fasern das Formen in jede Form und Ausrichtung. Die Stabilität solcher Fasern hat sich als vorteilhaft erwiesen, da sie sowohl in hydrophobe2 als auch in hydrophile Polymere7 eingebaut wurden, um Verbundgerüste herzustellen. Diese Verbundgerüste mit IPC-Fasern sind vorteilhaft, um eine physiologisch relevante biochemische Umgebung zu schaffen und gleichzeitig eine physikalische Verankerung für Zellen zu bieten. 
In dieser Studie zeigen wir eine Methode, um IPC-Fasern in ein hydrophiles und ein hydrophobes Gerüst mit Topographie für eine kontrollierte Freisetzung aktiver Biomoleküle einzubauen. Als Proof-of-Concept integrieren wir IPC-Fasern aus Chitosan und Alginat in das biokompatible, nicht-immunogene und nicht-antigene hydrophile Pullulan-Dextran-Hydrogel oder das biokompatible hydrophobe Polycaprolacton-Gerüst.

<table><tbody><tr><td>Pullulan&nbsp;</td><td>Hayashibara Inc, Okayama, Japan, Molekulargewicht</td><td></td><td>(MW): 200 kDa. Bei diesem Material handelt es sich um Pullulan in pharmazeutischer Qualität, das zur Herstellung von Pullulan-Rahmen und PD-IPC-Gerüsten verwendet wird.</td></tr><tr><td>Dextran</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D1037</td><td>MW 500 kDa. Dieses Material wird von Sigma Aldrich nicht mehr hergestellt. Alternativ wird die Katalognummer 31392 (Sigma Aldrich) vorgeschlagen. Dieses Material wird zur Herstellung von PD-IPC-Gerüsten verwendet.</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td>Natriumbicarbonat muss langsam zur Pullulan-Dextran-Polysaccharidlösung zugegeben werden. Die schnelle Zugabe von Natriumbikarbonat führt zu Ausfällungen.</td></tr><tr><td>Natriumtrimetaphosphat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T5508</td><td>Diese Chemikalie ist hygroskopisch und muss im Entfeuchtungsschrank gelagert werden. Wässrige Lösung von Natriumtrimetaphosphat muss immer frisch gemacht werden.</td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5881</td><td>Dieses Material ist gefährlich und muss mit geeigneter Schutzausrüstung wie Nitrilhandschuhen gehandhabt werden.</td></tr><tr><td>Chitosan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>448877</td><td>MW 190-310 kDa. Acetylierungsgrad von 75 % bis 85 %. Die Reinigung von Chitosan ist erforderlich, um stabile IPC-Fasern zu erzeugen.</td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Merck</td><td></td><td>Diese kann durch einen anderen Markentyp ersetzt werden. Dieses Material ist korrosiv und brennbar. Schutzausrüstung wie Gesichtsschutz, Nitrilhandschuhe, Laborkittel und Schuhüberzieher müssen getragen werden, wenn diese Chemikalie im Abzug gehandhabt wird.</td></tr><tr><td>Alginsäure-Natriumsalz aus Braunalgen, niedrigviskos</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2158</td><td>Über Nacht in Wasser auflösen. Filtrieren Sie durch steril 0,2&nbsp; &Mikro; m Spritzenvorsatzfilter vor dem Gebrauch. Bei 4 °C lagern.</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz</td><td></td><td>In sterilem PBS auflösen und mit 0,2 & Mikro filtrieren; m Spritzenvorsatzfilter vor dem Gebrauch.&nbsp;</td></tr><tr><td>BCA-Assay-Kit</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td>Dieses Kit wurde zur Messung der BSA-Freisetzung aus PD-IPC-Gerüsten verwendet.</td></tr><tr><td>Humaner rekombinanter vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor</td><td>R& D systems</td><td>293-VE</td><td>Wachstumsfaktor in 0,2%iger Heparinlösung auf eine Endkonzentration von 5&nbsp; mg/ml.</td></tr><tr><td>Heparin-Natriumsalz vom Schwein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3393</td><td>Dies kann durch einen anderen Markentyp ersetzt werden. Heparinsalz in sterilem Wasser bei einer Endkonzentration von 1 % auflösen und durch 0,2 & Mikro filtrieren; m Spritzenvorsatzfilter vor dem Gebrauch.&nbsp;</td></tr><tr><td>Humane Nabelvenen-Endothelzellen (HUVEC)</td><td>Lonza</td><td>C2517A</td><td>Dieser primäre Zelltyp wurde im Assay zur Bestimmung der VEGF-Bioaktivität nach Freisetzung aus PD-IPC-Gerüsten verwendet.</td></tr><tr><td>Alamar blue</td><td>Life Technologies</td><td>DAL1025</td><td>Dies wird verwendet, um die Stoffwechselaktivität von Zellen zu messen. Inkubieren Sie Alamar Blue mit Zellen und halten Sie es 2 bis 4 Stunden lang unter Standard-Zellkulturbedingungen. Messen Sie die Absorption bei 570 nm, um die prozentuale Reduktion von Alamar-Blau zu bestimmen, die mit der Zellaktivität korreliert.</td></tr><tr><td>ScanVac Coolsafe Gefriertrockner</td><td>Labogene</td><td>7.001.200.060</td><td>Dies ist ein nicht programmierbarer Gefriertrockner, der bei -105 bis -110&nbsp; arbeitet &deg;C. Dieser kann durch andere Standard-Labor-Lyophilisierer ersetzt werden.</td></tr><tr><td>Polycaprolacton (PCL)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>181609</td><td>MW 65 kDa. Diese wird von Sigma Aldrich nicht mehr hergestellt. Diese kann durch die Sigma Aldrich Katalognummer 704105 ersetzt werden.</td></tr><tr><td>Dichlormethan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V800151</td><td>Dieser kann durch einen anderen Markentyp ersetzt werden. Dieses Material ist gefährlich und muss im Abzug gehandhabt werden. Beim Umgang mit dieser Chemikalie muss jederzeit Schutzausrüstung getragen werden.</td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxan (PDMS; 184 Silikonelastomer-Kit)</td><td>Dow Corning</td><td>(240)4019862</td><td>Das Elastomer-Kit wird mit Polymerbasis und Vernetzer geliefert. Das Mischen der Polymerbasis und des Vernetzers in unterschiedlichen Verhältnissen führt zu einer unterschiedlichen Steifigkeit des PDMS.</td></tr><tr><td>Humaner rekombinanter Beta-Nerven-Wachstumsfaktor (NGF)</td><td>R& D-Systeme</td><td>256-GF</td><td>Rekonstituiert in sterilem Wasser mit VE bis zu einer Endkonzentration von 100 μd.M. &Mikro; g&#8288;/&#8288;ml. Aliquotieren und lagern in -20 & Grad; C bis zum Gebrauch.</td></tr><tr><td>Humane mesenchymale Stammzellen (hMSC)</td><td>Cambrex</td><td></td><td>Dieser Zelltyp wurde im Assay verwendet, um den synergistischen Effekt von NGF und Nanotopographie zu bestimmen.</td></tr><tr><td>Ratte PC12 Phäochromozytom-Zellen&nbsp;</td><td>ATCC</td><td></td><td>Dieser Zelltyp wurde im Neuriten-Outgrowth-Assay verwendet, um die Bioaktivität von NGF zu bestimmen. Messen Sie nach der Exposition gegenüber Freisetzungsmedien mit NGF die Anzahl der Zellen mit Neuritenerweiterungen und normalisieren Sie sie auf die Gesamtzahl der Zellen.</td></tr><tr><td>Filterpapier der Güteklasse 93</td><td>Whatman</td><td>Z699675</td><td>Es wird zur Reinigung von Chitosan nach dessen Ausfällung mit Natriumhydroxid bei einem pH-Wert von 7 verwendet.</td></tr><tr><td>Schwenkschaufelzentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>Zur Verwendung bei der Reinigung von Chitosan mit einer Geschwindigkeit von 1.200 x g.</td></tr><tr><td>Motor mit Dorn, der sich mit konstanter Drehzahl dreht</td><td>Rhymebus</td><td>RM5E</td><td>Der Motor wird für die Herstellung von IPC-Fasern auf Pullulan- oder PCL-Rahmen verwendet.</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>FirstBase</td><td></td><td>Sterilize durch Filtration (0,2 &; Mikro; M-Filter) und Autoklav.&nbsp;</td></tr><tr><td>Gewebekultur-Polystyrolschale (TCPS) mit 10 mm DurchmesserGreiner</td><td></td><td></td> <td>Die TCPS-Schale wird zum Gießen von Pullulanrahmen verwendet.</td></tr><tr><td>Humanes VEGF-ELISA-Kit</td><td>R& D systems</td><td>DVE00</td><td>Das ELISA-Kit dient zur Detektion von VEGF im Freisetzungsmedium.</td></tr><tr><td>Humanes NGF-ELISA-Kit</td><td>R& D systems</td><td>DY256</td><td>Das ELISA-Kit wird zum Nachweis von NGF im Freisetzungsmedium verwendet.</td></tr><tr><td>Kunststoffbeschichtetes Klebeband</td><td>Bel-Art</td><td>9040336</td><td>Das Klebeband dient dazu, die Krokodilklemme sicher auf den rotierenden Dorn zu kleben</td></tr></tbody></table>

verbund scaffolds für grenzflächen polyelectrolyte fasern für zeitlich kontrollierte freisetzung von biomolekülen

Composite Scaffolds of Interfacial Polyelectrolyte Fibers for Temporally Controlled Release of Biomolecules

Verschiedene Gerüste, die im Tissue Engineering verwendet werden, benötigen eine kontrollierte biochemische Umgebung, um die physiologische Zellnische nachzuahmen. Grenzflächen-Polyelektrolyt-Komplexierungsfasern (IPC) können für die kontrollierte Abgabe verschiedener biologischer Wirkstoffe wie niedermolekulare Medikamente, Zellen, Proteine und Wachstumsfaktoren verwendet werden. Die Einfachheit der Methodik bei der Herstellung von IPC-Fasern bietet Flexibilität bei der Anwendung für die kontrollierte Verabreichung von Biomolekülen. Hier beschreiben wir ein Verfahren zum Einbau von IPC-Fasern in zwei verschiedene polymere Gerüste, hydrophiles Polysaccharid und hydrophobes Polycaprolacton, um ein Mehrkomponenten-Verbundgerüst zu schaffen. Wir haben gezeigt, dass IPC-Fasern leicht in diese Polymerstrukturen eingebettet werden können, was die Fähigkeit zur verzögerten Freisetzung und verbesserten Konservierung von Biomolekülen verbessert. Wir haben auch ein zusammengesetztes Polymergerüst mit topographischen Hinweisen und anhaltender biochemischer Freisetzung entwickelt, die synergistische Effekte auf das Zellverhalten haben können. Verbundpolymere Gerüste mit IPC-Fasern stellen eine neuartige und einfache Methode dar, um die zelluläre Nische nachzubilden.

In diesem Artikel haben wir versucht, Verbund Gerüste mit IPC-Fasern für die verzögerte Freisetzung verschiedener Biomoleküle zu schaffen. Eigenschaften der in dieser Studie verwendeten Biomoleküle sind in Tabelle 1 gefunden. IPC Faser wurde in eine hydrophile PD Hydrogel eingebettet ist, um einen PD-IPC Verbundgerüst (1B) zu schaffen. Modellmolekuls BSA wurde zuerst untersucht, um die Durchführbarkeit der Verwendung eines Verbundgerüst zur kontrollierten Freisetzung Biomoleküls zu best...

Gerüste für das Tissue Engineering müssen die komplexe biochemische und biophysikalische Mikroumgebung der zellulären Nische rekapitulieren. Hier zeigen wir die Verwendung von Grenzflächen-Polyelektrolyt-Komplexierungsfasern als Plattform zur Herstellung von zusammengesetzten, mehrkomponentigen Polymergerüsten mit anhaltender biochemischer Freisetzung.

Verbund Scaffolds für Grenzflächen Polyelectrolyte Fasern für zeitlich kontrollierte Freisetzung von Biomolekülen

Various scaffolds used in tissue engineering require a controlled biochemical environment to mimic the physiological cell niche. Interfacial ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine kontrollierte Abgabe von Biomolekülen mit räumlicher Steuerung zu ermöglichen, um die zelluläre Nische aus hydrophilen oder hydrophoben polymeren Verbundgerüsten nachzuahmen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein opferbares Gerüst aus gewünschten Polymeren erzeugt wird, das die räumliche Anordnung der Biomolekül-freisetzenden Fasern – sogenannte interfacial poly electrolyte (IPC)-Fasern – vorgibt. Der zweite Schritt besteht darin, IPC-Fasern, die das gezielte hydrophile Biomolekül enthalten, in ein opferbares Gerüst einzubinden.Anschließend werden die IPC-Fasern auf Rahmenkonstrukten mithilfe eines mikrostrukturierten Substrats als Gussform, das topographische Hinweise auf dem Substrat enthält, in ein größeres Gerüst eingebettet. Der letzte Schritt besteht darin, die vollständige Assimilation der Fasern auf dem Rahmen, die Konstruktion und die Aushärtung der Polymere zu ermöglichen, um unstrukturierte oder mikrostrukturierte Substrate herzustellen. Letztendlich können Standardtests verwendet werden, um die Freisetzungsprofile und die Bioaktivität der Zielmoleküle nachzuweisen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber and

composite-scaffolds-interfacial-polyelectrolyte-fibers-for-temporally

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Der Prozess der Elektrospinnen Polymere für Tissue Engineering und Zellkulturen ist in diesem Artikel behandelt. Insbesondere wird das Elektrospinnen von photoreaktiven Makromere mit zusätzlichen Verarbeitungsmöglichkeiten Photostrukturierungsverfahren und Multi-Polymer-Elektrospinnen beschrieben.

Elektrospinnen Faserige Polymer Gerüste für Tissue Engineering und Cell Culture

Elektrogesponnene Gerüste können Post-Production für das Tissue Engineering-Anwendungen verarbeitet werden. Hier beschreiben wir Methoden für die Spinnerei komplexe Gerüste (durch aufeinander folgende Spinning), für die Herstellung dicker Gerüste (durch Multi-Schichtung mit Hitze und Dunst Glühen), für das Erreichen Sterilität (aseptische Produktion oder Postproduktion Sterilisation) und für die Erreichung entsprechenden biomechanischen Eigenschaften.

Postproduction Verarbeitung von Elektrogesponnene Fasern für Tissue Engineering

Hier beschreiben wir ein einzigartiges Strategie zur Erzeugung biokompatiblen, schichtförmige Matrices mit kontinuierlicher Schnittstellen zwischen unterschiedlichen Schichten für das Tissue Engineering. Ein solches Gerüst könnte eine ideale anpassbare Umgebung zu modulieren Zellverhalten durch verschiedene biologische, chemische oder mechanische...

Density Gradient Multilayered Polymerisation (DGMP): A Novel Technique für das Erstellen von Multi-Fach, Anpassbare Scaffolds für das Tissue Engineering

In diesem Video zeigen wir Ihnen, Modifikation Techniken für poröse metallische Implantate, um ihre Funktionalität zu verbessern und die Zellwanderung steuern. Techniken umfassen die Entwicklung von Poren Gradienten zu Zelle Bewegung in 3D und Produktion von Basalmembran imitiert zu Zelle Bewegung in 2-D zu steuern. Auch ist eine HPLC-Methode zur Überwachung Implantatintegration in-vivo durch eine Analyse von Blut Proteine ​​beschrieben.

Multi-Skala Modifikation von metallischen Implantaten mit Pore Farbverläufe, Polyelektrolyte und ihre indirekte Überwachung<em&gt; In vivo</em

Dieses Protokoll kombiniert Elektrospinnen und Mikrosphären, um Gewebegerüste zu entwickeln, die Neuronen lenken. Der Nervenwachstumsfaktor wurde in PLGA-Mikrosphären eingekapselt und in faserige Gerüste aus Hyaluronsäure (HA) elektrogesponnen.  Die Proteinbioaktivität wurde getestet, indem die Gerüste mit den Spinalwurzelganglien des Primärkükens besät und 4-6 Tage lang kultiviert wurden.

Elektro Growth Factor Releasing Mikrosphären in Fasergerüste

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur elektroNanoFaserGerüste mit abgestuften Organisation der Fasern herzustellen und zu erforschen ihre Anwendungen bei der Regulierung der Zellmorphologie / Ausrichtung. Farbverläufe in Bezug auf physikalische und chemische Eigenschaften der Nanofasergerüste bieten eine Vielzahl von Anwendungen im Bereich der Biomedizin.

Elektronanofasergerüste mit Abstufungen in Fiber-Organisation

Gerüste, die in kranio-maxillofaziale (CMF) Knochendefekte passen können und gleichzeitig Osteokonduktivität und Bioaktivität aufweisen, sind von Interesse. Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung eines Formgedächtnisgerüsts auf der Basis von Polycaprolactondiacrylat (PCL-DA) unter Verwendung eines Lösungsmittelguss-Partikelauslaugungsverfahrens (SCPL) unter Verwendung einer geschmolzenen Salzschablone und des Aufbringens einer bioaktiven Polydopaminbeschichtung.

Herstellung eines bioaktiven, PCL-basierte &quot;Self-Montage&quot; Formgedächtnispolymer Scaffold

Zwei- und dreidimensionale superhydrophobe Polymermaterialien werden durch Elektrospinnen oder Elektrospritzen biologisch abbaubarer Polymere hergestellt, die mit einem Polymer mit niedrigerer Oberflächenenergie ähnlicher Zusammensetzung gemischt werden.

Herstellung Superhydrophobe Polymere Materialien für biomedizinische Anwendungen

In dieser Arbeit wurden Gerüste aus Poly(milchsäure)/Polyethylenglykol (PLA/PEG) mit einer Kombination aus Schmelzemischen und selektiver Laugung hergestellt. Das hierin diskutierte Verfahren ermöglichte die Entwicklung von dreischichtigen Gerüsten durch hochgradige Kontrolle sowohl der Porosität als auch der Porengröße. Die mechanischen Eigenschaften wurden auch in einer physiologischen Umgebung bewertet.

Ein Facile und umweltfreundliche Weg zu fabrizieren Poly (Milchsäure) Scaffolds mit Graded Porengröße

Dieser Artikel beschreibt die Technik der Expansion einer traditionellen, zwei-Dimension (2D) Electrospun Nanofaser-Matte in leska 3 Dimension (3D) durch die Druckentlastung der unterkritischen CO2 Flüssigkeit. Diese erweiterte Gerüste sind 3D, eng mimischen zellulären Nanotopographic Hinweise, und bewahren die Funktionen der biologischen Moleküle innerhalb der Nanofasern gekapselt.

Expansion des zwei-Dimension Electrospun Nanofaser Matten in drei Dimension Gerüste

Mikrogelstäbchen mit komplementären reaktiven Gruppen werden durch Mikrofluidik mit der Fähigkeit hergestellt, sich in wässriger Lösung zu vernetzen. Die anisometrischen Mikrogele klemmen und verbinden sich zu stabilen Konstrukten mit größeren Poren im Vergleich zu sphärischen Systemen. Mit GRGDS-PC modifizierte Mikrogele bilden makroporöse 3D-Konstrukte, die für die Zellkultur verwendet werden können.

Vernetzte makroporöse 3D-Gerüste aus Mikrogelstäben

Erfahren Sie, wie Sie IPC-Fasern in polymere Scaffolds einbetten, um Biomoleküle zeitlich kontrolliert freizusetzen. Diese Methode ermöglicht räumlich gezielte Freisetzung für Tissue-Engineering-Anwendungen.

Verbund Scaffolds für Grenzflächen Polyelectrolyte Fasern für zeitlich kontrollierte Freisetzung von Biomolekülen

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