Verbund Scaffolds für Grenzflächen Polyelectrolyte Fasern für zeitlich kontrollierte Freisetzung von Biomolekülen

Gerüste für das Tissue Engineering müssen die komplexe biochemische und biophysikalische Mikroumgebung der zellulären Nische rekapitulieren. Hier zeigen wir die Verwendung von Grenzflächen-Polyelektrolyt-Komplexierungsfasern als Plattform zur Herstellung von zusammengesetzten, mehrkomponentigen Polymergerüsten mit anhaltender biochemischer Freisetzung.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine kontrollierte Biomolekülabgabe mit räumlicher Kontrolle zu ermöglichen, um die zelluläre Nische von hydrophilen oder hydrophoben polymeren Kompositgerüsten nachzuahmen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Opfergerüst aus gewünschten Polymeren geschaffen wird, um die räumliche Anordnung der Biomolekül freisetzenden Fasern, die als Grenzflächen-Polyelektrolyt- oder IPC-Fasern bezeichnet werden, bereitzustellen. Der zweite Schritt besteht darin, IPC-Fasern, die das angestrebte hydrophile Biomolekül enthalten, auf einem Opferrahmen einzubauen.

Als nächstes werden die IPC-Fasern auf Rahmenkonstruktionen unter Verwendung eines Mikromustersubstrats als Gießform in ein größeres Gerüst eingebettet, das topografische Hinweise auf dem Substrat enthält. Der letzte Schritt besteht darin, die vollständige Assimilation der Fasern auf dem Rahmen, den Aufbau und die Verfestigung der Polymere zu ermöglichen, um unstrukturierte oder mikrostrukturierte Substrate zu erzeugen. Letztendlich können Standard-Assays verwendet werden, um die Freisetzungsprofile und die Bioaktivität der Zielmoleküle darzustellen.

Der Hauptvorteil dieser Technik bietet andere bestehende Verfahren wie die Mikroverkapselung, dass der Einbau von hydrophilen Biomolekülen in eine breite Palette von hydrophilen oder hydrophoben Polymergerüsten nun in einem einfachen Einarbeitungs- und Herstellungsprozess möglich ist. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Wirkstoffverabreichung zu beantworten, einschließlich des mehrfach regulierten biochemischen Freisetzungs-biochemischen Gradienten und dieses synergistischen Effekts von topographischen Hinweisen und anhaltender biochemischer Freisetzung auf das Zellverhalten. Die visuelle Demonstration der Polyelektrolytfaserbildung ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte schwer zu erlernen sind.

Die Geschwindigkeit, Konzentration und Reinheit der Polyelektrolytlösung sind alle entscheidend für die stabile Bildung von IPC-Fasern. Zu Beginn mischen Sie Proteine, Wachstumsfaktoren oder andere Biomoleküle von Interesse in 10 bis 20 Mikroliter Aliquots der Polyelektrolytlösungen, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Als nächstes werden kleine 10 bis 20 Mikroliter große Tröpfchen Chitosan und Alginat auf eine stabile ebene Oberfläche aufgetragen, die mit Paraform bedeckt ist. Die Tröpfchen von Chitosan und Alginat sollten in unmittelbarer Nähe, aber nicht in Kontakt miteinander gebracht werden.

Tauchen Sie eine Spitze einer Pinzette leicht in das Sandtröpfchen des Drachens und die andere Spitze in das Alginattröpfchen. Bringen Sie dann die Tröpfchen der Polyelektrolyte zusammen, indem Sie die Pinzette zusammendrücken. Wenn die Tröpfchen miteinander in Kontakt kommen, ziehen Sie die Pinzette langsam vertikal, um die Grenzflächen-Polyelektrolyt-Komplexfaser, die als IPC-Faser bekannt ist, aus der Grenzfläche der beiden Tröpfchen zu ziehen.

Legen Sie das Ende der gezogenen IPC-Faser vorsichtig auf einen Kollektor, der aus einem flachen Polymergerüst besteht, das auf einem rotierenden Dorn befestigt ist. Drehen Sie den Dorn mit einer festen Geschwindigkeit von 10 Millimetern pro Sekunde, um die Bildung gleichmäßiger und raupenloser IPC-Fasern zu ermöglichen. Wenn Sie die Geschwindigkeit des Ziehens der IPC-Fasern erhöhen, bilden sich Perlen, die zu einer geplatzten Freisetzung der eingebauten biochemischen Substanz und einer vorzeitigen Faserbeendigung führen.

In Übereinstimmung mit den Beobachtungen von liao et al. und KO et al. Wenn die Faser endet, verdünnen Sie die verbleibende Flüssigkeit mit 500 Mikrolitern PBS und messen Sie die Konzentration des verbleibenden Protein- oder Wachstumsfaktorgehalts im Rückstand. Um die Einbaueffizienz der Biomoleküle zu bestimmen, wiegen Sie drei Gramm polnisches Polysaccharid ab und fügen Sie es 15 Millilitern destilliertem deionisiertem Wasser hinzu.

Um eine 20%ige wässrige Lösung zu erhalten, mischen Sie die polnische Lösung über Nacht, um am nächsten Tag Homogenität zu gewährleisten. Gießen Sie 15 Milliliter der polnischen Lösung in eine Gewebekultur-Polystyrolschale mit einem Durchmesser von 10 Zentimetern. Trocknen Sie die Lösung über Nacht bei 37 Grad Celsius, sobald sie getrocknet ist, schneiden Sie die Folien in sieben mal sieben Millimeter große quadratische polnische Opferrahmen.

Als nächstes stellen Sie eine 30%ige Lösung der Polysaccharide Polen und Dextrin in destilliertem deionisiertem Wasser im Verhältnis drei zu eins her. Mischen Sie über Nacht, um die Homogenität zu gewährleisten, fügen Sie der Polysaccharidlösung langsam Natriumbicarbonat hinzu, um eine Endkonzentration von 20 % zu erreichenMischen Sie die Lösung über Nacht und lagern Sie die endgültige Polysaccharidlösung bei vier Grad Celsius, bis sie benötigt wird. Befestigen Sie den Opferrahmen aus Polen in der gewünschten Ausrichtung mit einer Krokodilklemme und etwas kunststoffbeschichtetem Klebeband an der drehbaren Mandle.

Drehen Sie den Mandl mit dem aufgeklebten Rahmen mit einer konstanten Geschwindigkeit von 10 Millimetern pro Sekunde. Beginnen Sie dann mit dem Zeichnen der IPC-Fasern, wie im vorherigen Abschnitt gezeigt. Befestigen Sie dieses Mal jedoch das gezogene Ende der IPC-Fasern auf dem rotierenden Polenrahmen.

Warten Sie anschließend auf das Ende der IPC-Faserzeichnung. Trocknen Sie die Fasern auf dem Rahmenkonstrukt über Nacht bei Raumtemperatur. Lösen Sie als Nächstes das Konstrukt von der rotierenden Mandle, indem Sie es von der Krokodilklemme entfernen.

Legen Sie das Konstrukt in eine Mikrozentrifugenröhrchenkappe. Geben Sie dann fünf Gramm der Poland Dextrin-Lösung in ein Becherglas und beginnen Sie mit dem Rühren bei 60 U/min. Fügen Sie mit einer Rührplatte 500 Mikroliter einer 11%igen Natriumtrimphosphatlösung und 500 Mikroliter 10 molare Natriumhydroxid hinzu.

Um die Lösung zu vernetzen. Mischen Sie die Lösung ein bis zwei Minuten lang weiter und gießen Sie dann die viskose Polysaccharidlösung auf die Fasern auf dem Rahmenkonstrukt, um die IPC-Fasern vollständig einzubetten. Inkubieren Sie das Konstrukt 30 Minuten lang bei 60 Grad Celsius, um ein chemisch vernetztes Verbundgerüst zu bilden, das die Porenbildung im Verbundgerüst induziert.

Tauchen Sie das gesamte Gerüst 20 Minuten lang in eine Lösung aus 20%iger Essigsäure. Waschen Sie dann das Gerüst dreimal fünf Minuten lang in PBS, während Sie es bei 100 U/min schütteln. Um alle verbleibenden nicht reaktiven Reagenzien zu entfernen, entfernen Sie das überschüssige PBS und frieren Sie die Verbundgerüste sofort über Nacht bei minus 80 Grad Celsius ein.

Anschließend werden die Gerüste mindestens 24 Stunden lang lyophilisiert, bevor sie in kontrollierten Freisetzungs- oder Bioaktivitätstests verwendet werden. Beginnen Sie mit der Erstellung eines makellosen und gemusterten PDMS-Substrats mit einer gewünschten Topographie unter Verwendung von Standard-Softlithografiemethoden. Bereiten Sie als Nächstes sowohl den Opferrahmen aus PCL für die IPC-Fasersammlung als auch die gemusterte PCL-Basis vor, indem Sie zuerst 0,9 % PCL in Dichlormethan auflösen.

Für jeden Quadratzentimeter Fläche der PDMS-Foliengießform tropfen 500 Mikroliter der 0,9%igen PCL-Lösung auf die Form. Lassen Sie das Lösungsmittel im Abzug vollständig verdampfen und wiederholen Sie dann den Vorgang des Gießens von 0,9 % PCL, um den Film zu verdicken. Bereiten Sie als Nächstes den Opferrahmen vor, indem Sie jeweils 500 Mikroliter der 0,9%igen PCL-Lösung auf ein separates unberührtes PDMS-Substrat geben.

Um eine makellose PCL-Basis zu erhalten, gießen Sie mehrere Schichten PCL, um ein Gerüst mit der gewünschten Dicke zu erhalten. Lassen Sie das gesamte Chlormethanlösungsmittel vollständig im Abzug verdampfen, wenn die gewünschte Dicke erreicht ist. Entfernen Sie die getrocknete PCL-Folie vom makellosen PDMS-Substrat und stanzen Sie mit einem PSAP-Locher ein Loch in den PCL-Rahmen.

Montieren Sie als Nächstes den PCL-Rahmen auf dem Sammeldorn und beginnen Sie, die IPC-Faser wie zuvor beschrieben auf den Rahmen zu zeichnen. Wenn die IPC-Faserzeichnung beendet ist, entfernen Sie die Faser auf dem Rahmenkonstrukt und lassen Sie sie über Nacht bei 25 Grad Celsius trocknen. Legen Sie das Faser-auf-Rahmen-Konstrukt auf die gemusterte PCL-Basis und fügen Sie die 0,9%ige PCL-Lösung mehrmals auf das Faser-auf-Rahmen-Konstrukt hinzu, um die gewünschte Dicke zu erhalten und sicherzustellen, dass die IPC-Fasern vollständig eingebettet sind.

Rinderserumalbumin oder BSA, das aus dem polnischen Dextrin-IPD-Komposit freigesetzt wurde, zeigte eine nahezu lineare Kinetik mit einer anfänglichen abgeschwächten Burst-Freisetzung, gefolgt von einem gleichzeitigen Steady-State. Nach zwei Monaten erreichte die BSA eine Gesamtfreisetzung von 97 %, im Gegensatz dazu zeigten eigenständige IPC-Fasern eine schnelle Freisetzung von 80 % der BSA innerhalb von vier Stunden. Mit diesem Komposit-Gefäßwachstumsfaktor konnte auch nachhaltig aus den Fasern freigesetzt werden, wobei humane Endothelzellen der Nabelschnurvene als Testplattform verwendet wurden.

Es wurde festgestellt, dass der freigesetzte Wachstumsfaktor nach seiner Freisetzung zu jedem Zeitpunkt bioaktiv ist. Punkt. In diesem Beispiel wurde der Nervenwachstumsfaktor über einen Zeitraum von 18 Tagen in die Fasern geladen. Etwa 80 % des beladenen Nervenwachstumsfaktors wurden aus dem P-C-L-I-P-C-Komposit in einer verzögerten linearen Freisetzung unter Verwendung eines PC 12-Neuriten-Outgrowth-Assays freigesetzt.

Die Menge des bioaktiven Nervenwachstumsfaktors, die zu jedem Zeitpunkt aus dem Gerüst in das Medium freigesetzt wurde, hatte eine ähnliche Wirkung auf das Neuritenwachstum wie die Zugabe von 30 Nanogramm pro Milliliter Nervenwachstumsfaktor zu einfachen Medien. P-C-L-I-P-C-Kompositgerüste, die sowohl Topographie als auch kontrollierte Freisetzung von Nervenwachstumsfaktoren enthalten, können einen synergistischen Effekt auf das zelluläre Verhalten haben. Humane mesenchymale Stammzellen, die auf Nanomuster-Kompositgerüste gezüchtet wurden, zeigten ein höheres Maß an neuronaler Differenzierung im Vergleich zu Zellen, die entweder der Topographie oder dem Wachstumsfaktor allein ausgesetzt waren.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, das gewünschte hydrophile Molekül in die Polyelektrolytlösung mit der gleichen Nettoladung zu mischen, um es in die Fasern einzubauen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein Verbundgerüst mit der Fähigkeit zur kontrollierten Freisetzung von Stabmolekülen erstellt. Der große Gewinn in diesem Video sollte es Ihnen ermöglichen, ein Lungengerüst mit der Fähigkeit zur anhaltenden Freisetzung von Wachstumsfaktoren, zur Freisetzung mehrerer Wachstumsfaktoren und zur Schaffung eines Gradienten biochemischer Signale zu erstellen, der die physiologische Nische rekapituliert.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit saurer Säure, Natriumhydroxid und Chlormethan äußerst gefährlich sein kann und bei diesem Verfahren immer Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung von persönlicher Schutzausrüstung und der Filmhaube getroffen werden sollten.