Ein 3D-humanem Lungengewebe Modell für funktionelle Studien auf Mycobacterium tuberculosis Infektions

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein in vitro Lungengewebemodell für Studien zur M-Tuberkulose-Infektion zu konstruieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Fibroblasten-Kollagenmatrix auf den Filter eines Zellkulturplatteneinsatzes geschichtet wird. Im zweiten Schritt werden infizierte Immun- und Lungenepithelzellen auf die Fibroblasten-Kollagenschicht gesetzt.

Das resultierende 3D-Gewebemodell wird dann an der Luft belichtet, um die Schleimsekretion und die Schichtung des Epithels zu erleichtern. Im letzten Schritt wird das Gewebe entnommen und montiert. Letztendlich wird die Immunfluoreszenzmikroskopie verwendet, um die Bildung von M tuberkulose-induzierten frühen Granulomen zu analysieren.

Der Hauptvorteil dieser Technik oder bestehender Methoden, wie z. B. der In-vitro-Monoschicht von Zellen, besteht darin, dass die Zellen in diesem System in einer 3D-Mikroumgebung vorhanden sind, was die Bildung von Granulomen bei einer Infektion mit virulenten Mikrobakterien ermöglicht, die der menschlichen TB ähneln. Zur Herstellung von Kollagen eingebetteten Fibroblasten beginnen Sie mit der Behandlung von Lungenfibroblastenzellen mit Tripsin für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius, wenn sich die Zellen abgelöst haben. Stoppen Sie die Reaktion mit acht Millilitern vollständigem DMEM und schleudern Sie dann die Zellen herunter. Resuspendieren Sie die Pellets bei 230.000 Zellen pro Milliliter in frischem dmm und legen Sie die Zellen auf Eis. Fügen Sie als Nächstes einen Einsatz pro Vertiefung zu einer Sechs hinzu.

Füllen Sie einen Milliliter der frisch zubereiteten Zellschichtmischung gut an und geben Sie sie in jede Einlage, wobei Sie darauf achten müssen, dass die Mischung die gesamte Einlage ohne Luftblasen bedeckt. Legen Sie die Platte dann für 30 Minuten in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Mischen Sie am Ende der Inkubation zwei Milliliter Kollagen mit 615 Mikrolitern Vormischung in einem sterilen konischen Röhrchen auf Eis, um den pH-Wert des Kollagens pro Einsatz zu neutralisieren.

Fügen Sie dann 58 Mikroliter vollständiges dmem und 327 Mikroliter Lungenfibroblasten pro Einlage zur Kollagenmischung hinzu. Pipettieren Sie auf und ab, um die Zellen gleichmäßig in der Mischung zu verteilen. Geben Sie nun schnell drei Milliliter der Zellschicht an der Seite jedes Einsatzes auf jede azelluläre Kollagenschicht.

Achten Sie darauf, Luftblasen zu vermeiden, und stellen Sie die Platte für weitere zwei Stunden in den Zellkultur-Inkubator zurück. Nach der Polymerisation des Kollagens geben Sie zwei Milliliter vollständiges DMEM auf den Boden jeder Vertiefung und stellen Sie die Platte für weitere 24 Stunden in den Inkubator. Heben Sie am nächsten Tag mit einer sauberen Pinzette die Einsätze vorsichtig nacheinander an und saugen Sie das Nährmedium von der Unterseite jedes Inserts ab.

Nun, dann geben Sie zwei Milliliter vollständiges DMM auf den Boden jeder Vertiefung und zwei Milliliter vollständiges DMM auf jeden Einsatz. Wechseln Sie beide Volumina des Mediums jeden zweiten Tag für fünf bis sieben Tage. Um die infizierten Makrophagen vorzubereiten, beginnen Sie mit der vierstündigen Inkubation einer Makrophagenkultur mit virulenter M-Tuberkulose bei einer Infektionsmehrheit von 10.

Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS, um die extrazellulären Bakterien zu entfernen, und behandeln Sie die Makrophagen mit zwei Millimolaren, A DTA für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius. Wenn die Zellen die Reanimation abgelöst haben, suspendieren Sie sie in antibiotikafreiem vollständigem dmm. Aspirieren Sie dann das gesamte Medium aus der Fibroblasten-Kollagen-Matrixplatte und geben Sie 1,5 Milliliter frisches, antibiotikafreies vollständiges DMM in die äußeren Kammern.

Als nächstes mischen Sie fluoreszenzmarkierte Monozyten mit den infizierten Makrophagen im Verhältnis fünf zu eins in 50 Mikrolitern des antibiotikafreien vollständigen DM EM pro Einsatz. Geben Sie dann 50 Mikroliter der Monozyten-Makrophagen-Mischung in die Innenseite jedes Einsatzes und stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator. Nach einer Stunde fügen Sie langsam zwei Milliliter Kultur hinzu, leiten Sie das Medium an den Wänden der Einsätze entlang, um ein Verschieben der Zellen zu vermeiden, und inkubieren Sie die Kulturen für weitere 24 Stunden.

Um die Kulturen mit Lungenepithelzellen zu bepflanzen, fügen Sie 4 Millionen Epithelzellen pro Milliliter in 50 Mikrolitern vollständigem dmm auf die Immunzellfibroblasten-Kollagenmatrizen hinzu. Inkubieren Sie die Zellen zwei Minuten lang bei Raumtemperatur, gefolgt von einer Stunde bei 37 Grad Celsius. Geben Sie dann vorsichtig zwei Milliliter antibiotikafreies, vollständiges DMM zu den Einsätzen, wie gerade gezeigt, und kultivieren Sie die Zellen für weitere drei Tage.

Fünf Tage nach der Aussaat aspirieren die infizierten Makrophagen das gesamte Kulturmedium von der Platte und geben 1,8 Milliliter antibiotikafreies, vollständiges DMM in die äußeren Kammern. Am siebten Tag wurden die 3D-Gewebemodelle dann im Inkubator zwei Tage lang an der Luft belichtet, ohne dem Einsatz Medium hinzuzufügen. Nach der Setzliste.

Entfernen Sie das Medium vollständig von der Platte und mischen Sie die Gewebemodelle 30 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln mit 4%Paraldehyd. Trennen Sie dann mit einem Skalpell die Membranen von den Well-Einsätzen. Entferne dann mit einem sauberen Skalpell vorsichtig die Seiten der Gewebemodelle und schneide jedes Gewebe in vier etwa gleich große quadratische Stücke.

Übertragen Sie die Stücke auf Super Frosts Glasobjektträger und lassen Sie sie fünf Minuten trocknen. Montieren Sie dann die Taschentücher mit fluoreszierender Halterung, einem Medium mit Anti-Fade und dpi, und decken Sie sie mit Deckgläsern ab. Lassen Sie die Dias bei Raumtemperatur im Dunkeln trocknen, bis sie trocken sind, und versiegeln Sie dann die Ränder des Deckglases mit Nagellack.

Wenn der Lack getrocknet ist, tauchen Sie die Objektträger in 70%iges Ethanol für einen Transfer aus der BSL three-Anlage. Um das Gewebe zu visualisieren, erfassen Sie 3D-Bilder von fünf bis 10 verschiedenen Feldern, die das gesamte Gewebestück mit einer Auflösung von 512 x 512 abdecken, wobei Zack eine Dicke von mindestens 20 Mikrometern mit einem Abstand von einem bis 1,5 Mikrometern zwischen den Stapeln auf einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop zur 3D-Quantifizierung der Zellcluster abdeckt. Öffnen Sie die 3D-Bildverarbeitungssoftware und laden Sie das gewünschte Bild.

Passen Sie anschließend mit dem Anzeigeanpassungswerkzeug jeden Kanal für Bild, Kontrast, Helligkeit und Deckkraft der Überblendung an, um die Lautstärkewiedergabe zu optimieren und Rauschstörungen zu minimieren. Um dann die Gewebeoberfläche zu visualisieren, wählen Sie den roten Monozytenkanal aus und stellen Sie mit den Filtern die entsprechenden Schwellenwerte ein, um die Auswahl der roten Monozyten einzuschränken oder den Hintergrund bei Bedarf auszuschließen. Exportieren Sie schließlich die Daten in das entsprechende Tabellenkalkulationsprogramm für die weitere nachgelagerte Analyse.

Am siebten Tag zeigt die konfokale Mikroskopie nach der Aussaat von Tuberkulose-infizierten Zellen eine Häufung von roten Monozyten an der Infektionsstelle, wie das Vorhandensein der grünen Bakterien zeigt, die die Läsionen der menschlichen TB nachahmen, die als Granulom 3D bekannt sind. Die Visualisierung bietet die Flexibilität, verschiedene Merkmale zu interagieren, zu untersuchen und zu quantifizieren. Ein 3D-Bild, z. B. in diesen Bildern, das eine Ansammlung von Monozyten an der Stelle der Emtuberkulose zeigt.

Die räumliche Anordnung von grünen Bakterien und roten Monozytenclustern ist aus der apikalen, rotationalen und lateralen Ansicht zu beobachten. Erwartungsgemäß wurden diese Cluster in den nicht infizierten Geweben nicht beobachtet. Die Quantifizierung der Größe und Anzahl der Monozyten, Zellcluster und M-Tuberkulose-infizierten Gewebe zeigte, dass die Größe der Zellcluster erhöht wurde, während die Anzahl der einzelnen Monozyten im Vergleich zu den nicht infizierten Gewebemodellen verringert wurde.

Zu den potenziellen Nutzern dieses Lungengewebemodells gehören eine Studie über die Rolle verschiedener Immunzellen und der Gewebeimmunität bei TB, die Untersuchung von Mykobakterien-Phänotypen und die Erprobung von Arzneimittelkandidaten, die Mykobakterien im Granulom abtöten.