Name: Ein 3D-humanem Lungengewebe Modell für funktionelle Studien auf Mycobacterium tuberculosis Infektions (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-05T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Lernen Sie die Konstruktion eines 3D-Lungengewebemodells zur Untersuchung von Mycobacterium tuberculosis-Infektionen. Diese Methode ermöglicht die Analyse früher Granulombildung und Immunzellmigration in vitro.

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Die Autoren danken der Mikroskopie-Kerneinrichtung an der Fakultät für Gesundheitswissenschaften der Universität Linköping für den Zugang zu fortschrittlichen Bildgebungssystemen; Karl-Eric Magnusson (emeritierter Wissenschaftler) an der Abteilung für klinische und experimentelle Medizin der Universität Linköping für den Zugang zur Imaris 3D/4D-Bildverarbeitungssoftware (Bitplane, Schweiz); und S. Braian für seine Hilfe bei dem Lungenmodell-Cartoon. Diese Arbeit wurde mit Mitteln des Schwedischen Forschungsrats (Alternativen zum Tierversuch, 2012-1951) und des Schwedischen Forschungsrats (2012-3349) an M.L. und die Schwedische Stiftung für strategische Forschung an S.B. S.B. erhält Zuschüsse vom Karolinska Institutet, dem Schwedischen Forschungsrat, der Schwedischen Agentur für internationale Entwicklungszusammenarbeit (Sida) und der Schwedischen Agentur für zivile Notfälle (MSB) sowie der Schwedischen Herz- und Lungenstiftung (HLF). M.S. erhielt Stipendien des Karolinska Institutet und des Stockholmer Kreisrates.

Hinweis: Menschliche periphere Blut von gesunden Blutspendern anonym an der Blutbank der Linköping University Hospital gekauft wurde Schweden als Quelle der Immunzellen für diese Studie verwendet. Dieses Protokoll wird für 24 mm 6-Well-Platte Einsätze konzipiert. Direkte Anpassung an andere Formate auch nicht, da die Gewebemusterverträge vertikal und horizontal während der Entwicklung empfohlen. 1. Herstellung von Materialien, Medien und Kultur der Bakterien / Zelllinien <ol><li> Bakterienkultur: <ol><li> Wachsen die Mykobakterien-Stamm M. tuberculosis H37Rv tragenden pFPV2 Plasmid zu exprimieren konstitutiv das grün fluoreszierende Protein (GFP), in Middlebrook 7H9-Medium, das 0,05% Tween-80, 0,5% Glycerin, Kanamycin (20 ug / ml), ergänzt mit Middle Albumin, Dextrose und Anreicherung Katalase ( Middle ADC Enrichment), bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 7-10 Tage. Hinweis: Alle Versuchsschritts mit Live-virulenten M. tuberculosis-Stämme sollten in einem BSL-3-Anlage durchgeführt werden. </li></ol></li><li> Vorbereitung 1x Dulbecco-modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) vollständigem Medium (ergänzt mit 1 mM Natriumpyruvat, 2 mM L-Glutamin, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 10 mM HEPES, 0,1 mM nicht-essentielle Aminosäuren und 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS)). Bereiten Sie auch antibiotikafreies DMEM Vollmedium. </li><li> 1fach Minimum Essential Medium (MEM) vollständigem Medium (1 mM Natriumpyruvat, 2 mM L-Glutamin, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 10 mM HEPES, 0,1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren und 10% hitze inaktiviertes fötales Rinderserum (FBS)). </li><li> Herstellung von Fibronektin / Collagen-beschichteten Kolben (insgesamt 10 ml): <ol><li> Pipette 8,8 ml sterile 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in ein sauberes Röhrchen. 1 ml Rinderserumalbumin (1 mg / ml), 100 ul Typ I Rinderkollagen (3 mg / ml) und 100 ul rekombinanter human Fibronectin (1 mg / ml). </li><li> Mischen Sie die Lösung durch Drehen des Rohres Upside-Down-5-mal. Kolben werden mit Fibronectin / Kollagen-Lösung (für eine T-25 und 2 ml für eine T-75-Kolben 1 ml) beschichtet. Lassen Sie es O / N bei 37 ° C. Nach der Inkubation, entfernen Sie die Lösung und speichern die beschichteten Kolben bei RT. Anmerkung: Die gesammelte Lösung kann bei 4 ° C gelagert und dreimal wiederverwendet werden. Lagerung für mehr als 2 Wochen können die Flüssigkeits bis braun (Kristallbildung), wobei auf sie weggeworfen werden muß drehen. </li></ol></li><li> Kultur von Fibroblasten: <ol><li> Aufbau und zur Pflege MRC-5, (eine humane Lungenfibroblasten-Zelllinie von normalem Lungengewebe eines 14 Wochen alten männlichen Fötus stammen), in vollständigem DMEM in 5% CO 2 bei 37 ° C. Verwenden Sie die Fibroblasten an Passagen 24-26 und wachsen, bis 70-80% konfluent. Hinweis: MRC-5-Zelllinie bei Durchgang&gt; 30 sind in der Regel, um die Morphologie zu verlieren und ist nicht für die Verwendung in der Gewebemodell empfohlen. </li></ol></li><li> Kultur von Epithelzellen:<ol><li> Erhalten 16HBE14o- (16HBE), einer immortalisierten menschlichen bronchialen Epithelzellen Zelllinie, die das differenzierte Morphologie und Funktion des normalen menschlichen Atemwegsepithelien behält, (dies war ein Geschenk von Dr. Dieter Gruenert, Mt. Zion Cancer Center, University of California, San Francisco , USA. 10). Kultur 16HBE Zellen in Fibronectin / Collagen-beschichteten Kolben und Aufrechterhaltung der Zellen in komplettem MEM in 5% CO 2 bei 37 ° C. </li></ol></li><li> Herstellung von 5x DMEM <ol><li> Vorbereitung 5x DMEM durch Auflösen von 13,4 g DMEM-Pulver und 3,7 g Natriumbicarbonat in 150 ml steriles destilliertes Wasser. Der pH-Wert des Mediums auf 7,3, auf ein Volumen von 200 ml und filtern es mit 0,22 um Membranfilter. Sammeln des gefilterten Mediums in einem sterilen Behälter und bis zur Verwendung bei Raumtemperatur gelagert. </li></ol></li></ol> 2. Herstellung von Kollagen eingebetteten Fibroblasten <ol><li> Tauwetter gefrorenen Teilmengen von FBS und L-Glutamin in einem 37 ° C Wasserbad.Nach dem Auftauen halten die Proben auf Eis. Platzieren Natriumbicarbonat (71,2 mg / ml) und Gentamicin (50 mg / ml) bei 4 ° C. Pre-cool 50 ml Zentrifugenröhrchen und 10 ml sterilen Pipetten bis 4 ° C. Anmerkung: Alle eingesetzten (mit Ausnahme des 5x DMEM) Materialien werden auf Eis vor der Verwendung gekühlt und alle Schritte werden auf Eis durchgeführt. Typ-I-Kollagen (1,1 mg / ml) muß kühl gehalten werden, da dies verhindert, dass die Verfestigung des Kollagens. </li><li> Bereiten Sie die Fibroblasten: <ol><li> Warm Trypsin in einem 37 ° C Wasserbad inkubieren ausreichender Menge mit Lungenfibroblasten (MRC-5-Zellen) für 10 min bei 5% CO 2 bei 37 ° C. Neutralisieren die Trypsin durch Zugabe von DMEM 1x komplett. Saugen Sie das Zellsuspension und Zentrifuge bei 300 xg für 5 min. Aspiration des Überstands und Resuspendieren der Zellen bei 2,3 × 10 5 Zellen / ml in DMEM-Voll. Legen Sie die Zellen auf Eis bis zum Gebrauch. </li></ol></li><li> Bereiten Sie die Pre-Mix: <ol><li> Fügen Sie den folgenden in ein Röhrchen &quot;Pre-Mix&quot; gekennzeichnet; 395ul 5x DMEM, 40 &amp; mgr; L-Glutamin, 120 &amp; mgr; l NaHCO 3 (71,2 mg / ml), 440 ul FBS, 5 &amp; mgr; l Gentamicin (50 mg / ml), Volumen gesamt 1.000 &amp; mgr; l, dann wirbeln die Vormischung gut und legte auf Eis. Hinweis: Die angegebenen Volumina sind für einen 24 mm 6-Well-Kultureinsatzes. Berechnen Sie die für die Gesamtzahl der Einsätze erforderlichen spezifischen Mengen, aber fügen Sie eine zusätzliche, um sicher zu sein, ist genug Vormischung vorbereitet. </li></ol></li><li> Bereiten Sie die azellulären Kollagenmischung: <ol><li> Zu jeder Kultur 1 ml azellulären Kollagenmischung. Fügen Sie den folgenden, um einen 50 ml konischen Röhrchen auf Eis in der angegebenen Reihenfolge; 686 &amp; mgr; l von 1,1 mg / ml Kollagen, 250 ul Pre-Mix und 64 ul 1x komplettem DMEM zu einem Gesamtvolumen von 1000 &amp; mgr; l. Mischen Sie die Lösung auch die Gewährleistung und keine Luftblasen. Arbeiten Sie schnell und fügen Sie die Collagen an der Wand der Röhre, um Luftblasen zu vermeiden. </li><li> 1 ml des zellfreien Schichtmischung an dem Einsatz in der Platte mit 6 Vertiefungen gelegt. Nicht jedes Medium zu der auch hinzufügen nicht außerhalb des Einsatzes. Imcubate für 30 min in einem 37 ° C Inkubator. Stellen Sie sicher, die azellulären Mischung umfasst den gesamten Einsatz ohne Luftblasen. </li></ol></li><li> Bereiten Sie das Mobil Kollagen-Mischung: <ol><li> Mischungskomponenten der Zellschicht in einem 50 ml konischen Röhrchen auf Eis in der folgenden Reihenfolge gehalten werden; 2 ml Collagen, 615 &amp; mgr; Pre-Mix, 58 &amp; mgr; l 1x komplettes DMEM und 327 &amp; mgr; l Zellsuspension Lungenfibroblasten (MRC-5) bis zu 3.000 ul bilden das Gesamtvolumen. Jede Kultur erfordert 3 ml der Zell Kollagen-Mischung. Entscheidender Schritt: Stellen Sie sicher, das Kollagen und Vormischung sorgfältig vor Zugabe der Zellsuspension mischen. Dadurch wird der pH-Wert der Kollagen neutralisieren toxische Wirkung auf die Fibroblasten zu vermeiden. </li><li> Hinzufügen der Zellschicht (3 ml) auf der Oberseite des azelluläre Kollagenschicht und Inkubation für 2 Stunden in einem 37 ° C Inkubator. Arbeiten Sie schnell und fügen Sie die Collagen an der Wand der Röhre, um Luftblasen zu vermeiden. </li><li> Nach der Polymerisation 2 ml DMEM Komplett bis ter unten auf der 6-Well-Platte (unter der Einlage) und 24 h inkubiert. HINWEIS: Wenn die Polymerisation trat nicht auf, entsorgen Sie die Platteneinsätze, die das Fibroblasten-Kollagenmatrix und Inbetriebnahme immer wieder. Der wahrscheinlichste Grund ein Fehler in der Addition oder falscher Volumen von einem der oben genannten Reagenzien. </li></ol></li></ol> 3. Kontinuierliche Kultur des Fibroblasten-Kollagenmatrix <ol><li> Heben Sie den Einsatz mit einem sauberen Pinzette und saugen Sie den Kulturmedien aus dem Boden des Bohrlochs. 2 ml komplettem DMEM mit dem Boden der Vertiefung, gefolgt von 2 ml komplettem DMEM innerhalb des Einsatzes. Vermeidung der Einführung von Luftblasen unter dem Einsatz, da dies die Diffusion von Nährstoffen zwischen den äußeren und inneren Kammern zu verhindern. Entfernen Sie Luftblasen mit einer Mikropipettenspitze. </li><li> Ändern Sie den Kulturmedien (innerhalb und unterhalb des Einsatzes) jeden zweiten Tag und Kultur für etwa 5-7 Tage. Achten Sie darauf, in der Sie das Medium aus dem Einsatz. Um zu vermeiden, contact mit dem Fibroblasten-Kollagenmatrix, leicht kippen Sie den Einsatz mit einem sauberen Pinzette und saugen Sie den Datenträger aus den Einsatzwänden. Entscheidenden Schritt: Die Fibroblasten in der Kollagenmatrix sollte eine längliche Phänotyp zu bekommen, und renovieren das Kollagen, die dann Aufträge. In etwa 5-7 Tagen hat sich die Matrix zusammengezogen, um eine Plattform (10-14 mm im Durchmesser) in der Mitte des Einsatzes zu bilden. Die vertraglich Matrix ist bereit für den Einsatz in der nächsten Schritt. Um eine gleichmäßige Kontraktion der Matrix ist es entscheidend, zu erhalten, dass die Fibroblasten sind gut mit dem Kollagen vor der Aussaat (Schritt 2.6.1) gemischt. </li></ol> 4. Setzen von Immunzellen (Infizierte / Nicht infizierte Monozyten-Makrophagen-Gemisch) Hinweis: Die folgenden experimentellen Schritte beinhalten virulenten Mykobakterien und müssen daher in einer BSL-3-Anlage durchgeführt werden. <ol><li> Herstellung von primären Monozyten und Makrophagen: <ol><li> Isolieren Monozyten im peripheren Blut von Spenderblut mit Hilfe eines establiSchuppen-Protokoll. Isolieren Monozyten am selben Tag wie die Einrichtung des Gewebemodells und Kultur und differenzieren sich zu Makrophagen etwa 7 Tage vor der Infektion mit M. Tuberkulose. HINWEIS: Dadurch wird sichergestellt, sowohl die Makrophagen und die vertraglich Fibroblasten-Kollagenmatrix sind nach 7 Tagen zur Verfügung. Auch isolieren frischen Monocyten, die zusammen mit den infizierten Makrophagen aufgenommen wird. </li></ol></li><li> Herstellung von M. Tuberkulose infizierten Makrophagen <ol><li> Ernten Sie die kultivierten Bakterien, wäscht mit 1x PBS mit 0,05% Tween-80, resuspendieren in antibiotikafreiem DMEM komplette, durchlaufen einen abgeschnittenen sterile 27 G-Nadel, um bakterielle Klumpen zu zerstreuen und messen die optische Dichte. Hinweis: Pre-Bestimmung der M. tuberculosis koloniebildende Einheit Mittel der optischen Dichte im Labor. Dies gibt eine Schätzung der Anzahl der Bakterien, für Infektion verwendet werden. </li><li> Die Makrophagen Inkubieren für 4 Stunden mit &lt;em&gt; M. Tuberkulose beim Multiplizität der Infektion (MOI) 10). Nach der Infektion waschen 3x mit 1x PBS, um die extrazelluläre Bakterien zu entfernen. Verwenden uninfizierten Makrophagen in der gleichen Weise, aber ohne M. kultiviert Tuberkulose, als Kontrolle. </li><li> Trennen der mit Makrophagen von der Kulturplatte durch Behandlung mit 2 mM EDTA für 10 Minuten bei 37 ° C resuspendiert und die Zellen in antibiotikafreiem komplettem DMEM. </li></ol></li><li> Kennzeichnung von Monozyten Hinweis: Isolierung und Markierung von Monozyten in der BSL-2 Bank durchgeführt werden und dann in BSL-3 zur weiteren Verarbeitung entnommen. <ol><li> Fleck frisch hergestellten Monozyten (2 x 10 7 Zellen) mit einer Endkonzentration von 2 uM PKH26-Farbstoff für 5 min, nach den Anweisungen des Herstellers. Waschen 3x und Resuspendieren der Zellen, die mit antibiotikafreiem komplettem DMEM mit einer Dichte von 1 x 10 7 Zellen / ml. </li></ol></li><li> Zugabe von Immunzellen Fibroblasten Kollagenmatrix <ol><li> EINfter 5-7 Tagen Kultur der Fibroblasten-Kollagenmatrix absaugen Kulturmedien aus den äußeren und inneren Kammern und 1,5 ml frischer antibiotikafreies DMEM-Voll in die äußere Kammer. </li><li> Vorbereitung eines markierten Monozyten-Makrophagen (nichtinfizierten / infizierten) in Mischung mit einem Verhältnis von MO: MQ (5: 1) in 50 &amp; mgr; l DMEM-Voll. Für 50.000 Makrophagen zu nehmen 250000 markierten Monozyten. </li><li> Dann werden 50 ul MO: MQ Mischung auf die Fibroblasten-Kollagen-Matrix und Inkubation für 1 Stunde in 5% CO 2 bei 37 ° C. Nach der Inkubation vorsichtig 2 ml Kulturmedium in den Einsatz und Inkubation für weitere 24 h in 5% CO 2 bei 37 ° C. Hinweis: Da Zellen gegeben sind lose befestigt ist, sollte die Zugabe von Medien langsam durch vorsichtiges Hinzufügen von an den Wänden des Einsatzes sein. </li></ol></li></ol> 5. Setzen von Lungenepithelzellen (16HBE) Hinweis: Die folgenden Schritte müssen in einer Anlage BSL-3 durchgeführt werden. <ol><li> Seed Lungen epithelial Zellen (16HBE) auf der Oberseite der MO: MQ-Fibroblasten-Kollagenschicht. Um dies durchzuführen, erste dissoziieren 16HBE Zellen aus dem Kolben durch Behandlung mit Trypsin (wie in 2.2.1.) Und resuspendieren in 4 × 10 6 Zellen / ml in antibiotikafreiem DMEM. </li><li> Saugt den Kulturmedien innerhalb und außerhalb des Einsatzes. Dann fügen Sie 1,5 ml antibiotikafreies DMEM Komplett im Boden der Vertiefung außerhalb des Einsatzes. </li><li> Dann werden 50 ul 16HBE oben auf der Immunzelle-Fibroblasten Kollagenmatrix. Lassen Sie für 2 min in der Haube und Inkubation für 1 h bei 37 ° C Inkubator mit 5% CO 2. Nach Inkubation geben vorsichtig 2 ml antibiotikafreies DMEM-Voll innerhalb des Einsatzes und die Kultur bei 37 ° C für 3 Tage. Die Kulturschritt erleichtert Proliferation von Epithelzellen in der Gewebemodell. Hinweis: Da Zellen gegeben sind lose befestigt ist, sollte die Zugabe von Medien langsam und sanft durch Gleiten durch die Wände des Einsatzes sein. </li></ol> 6. Luftexposition des 3D-LungModell Hinweis: Nach Tag 5 nach Zugabe von infizierten Makrophagen sind die Gewebemodelle Luft ausgesetzten und die folgenden Schritte müssen in einer Anlage BSL-3 durchgeführt werden. <ol><li> Saugt den Kulturmedien innerhalb und außerhalb des Einsatzes. Anmerkung: In diesem Schritt können die Überstände zum Nachweis von sezernierten Faktoren gesammelt werden. Zentrifuge, sterile Filter und speichern Überstände bei -70ºC. </li><li> Hinzuzufügen 1,8 ml antibiotikafreies DMEM-Voll in der äußeren Kammer und inkubiere in 5% CO 2 bei 37 ° C Inkubator für 2 Tage. Haben Kulturmedien hinzuzufügen nicht innerhalb des Einsatzes. HINWEIS: Die Luft Anheben des Gewebemodells erleichtert die Bildung von geschichteten Epithelien und Schleimsekretion, die die Festigkeit des Gewebes und physiologische Ähnlichkeit mit humanem Lungengewebe liefert. </li></ol> 7. Ernte und Montage des 3D Lungengewebemodell Hinweis: Die folgenden Schritte müssen in einer Anlage BSL-3 durchgeführt werden.<ol><li> Am Tag 7 nach der Implantation von infizierten Makrophagen sind die Gewebemodelle bereit für die Ernte. Entfernen Sie die Kulturmedien vollständig aus dem Gewebemodell. Befestigen Sie die Gewebemodell mit 4% Paraformaldehyd für 30 Minuten im Dunkeln bei RT. Dieser Schritt tötet die Bakterien und fixiert das Gewebe / Zellmorphologie zur weiteren Verarbeitung. </li><li> Mit einem Skalpell, trennen Sie die Membran aus dem Brunnen Einsatz. Übertragen Sie die Membran in das Gewebe zu einer gut aus 1x PBS mit. </li><li> Schneiden Sie und entfernen Sie die Seiten des Gewebemodell mit einem sauberen Skalpell. Dann schneiden Sie die Gewebemodell in 4 ungefähr gleich große quadratische Stücke. Bringen Sie ein Stück Gewebe auf einen Glasobjektträger Superfrost. Die Gewebestücke in 1x PBS bei 4 ° C. </li><li> Trocknen Sie das Gewebe 5 min und montieren mit ProLong Gold-Antifade mit DAPI und Deckglas. Lassen Sie die Folien, ohne in der Dunkelheit zu stören bei RT bis trocken. Hinweis: Die Dicke des Gewebes zwischen dem Zentrum und Peripherie zu variieren, was zu leichten Tilting des Deckglases. Um dies zu vermeiden, kann ein Abstandshalter (zum Beispiel Parafilm) auf der Ecke des Deckglases gebracht wird. </li><li> Bewerben Nagellack auf die Ränder des Deckglases und trocknen lassen. Tauchen Sie die Objektträger in 70% Ethanol sie sicher aus dem BSL-3-Anlage zu bringen, um zu machen. </li></ol> 8. Visualisierung, Erfassung und Quantitative 3D Analyse <ol><li> Visualisieren die Gewebeschnitte mit einem konfokalen Mikroskopsystem mit Lasern bei 488 nm für die Anregung von GFP (grün-Kanal), 420 nm für DAPI (blau) und 555 nm für die PKH26-markierten Monozyten (rot) auf. </li><li> Erwerben 3D-Bilder mit einer Auflösung von 512x512 mit Z-Stapel abdeckt bei einem Minimum von 20 um Dicke und mit 1 bis 1,5 &amp; mgr; m Abstand zwischen den Stapeln. Erwerben 5-10 verschiedenen Bereichen, die den gesamten Gewebestück. Hinweis: Verwenden Sie die Konfiguration wie Nyqvist zur optimalen Einstellung der optischen Auflösung (Wellenlänge, Laserleistung / Belichtung, Pixelgröße und Zoom). Vermeiden Sie unDer oder Übersättigung von Pixeln. </li><li> Analysieren Sie die konfokale Bilder mit 3D-Bildverarbeitungs-Software. Für 3D-Quantifizierung von Zellclustern, werden die folgenden Schritte für eine optimale Analyse empfohlen. </li><li> Öffnen Sie die 3D-Bildverarbeitungs-Software, und laden Sie das Bild. Messung der Dimensionen von Objekten in dem Bild untersucht werden, beispielsweise die Größe eines Nukleus, individuelle Monozyten- und einzelne Bakterien. Diese Beobachtungen sind nützlich für die Definition oder Filterung der Objekte. </li><li> Wenn ein Wiedergabeanpassungstool optimieren Volume Rendering indem jeder Kanal für Bildkontrast, Helligkeit und Opazität zu mischen. Dieser Schritt ist, die Interferenz von Rauschen in Volume Rendering minimieren. Anmerkung: Die Gammakorrektur kann die Manipulation von Bildern führen und sollten daher vermieden werden. </li><li> Erstellen Sie Flächen, indem Sie den roten Kanal (Monozyten) und stellen Sie die Schwelle (automatische oder manuelle Auswahl). Falls erforderlich, verwenden Sie Filter, um die Auswahl von roten Monozyten zu beschränken oder die b auszuschließenintergrund. Ebenso erstellen Flächen für grün (M. tuberculosis) und Blau (Kerne) Kanäle, wie oben beschrieben. </li><li> Exportieren Sie die Daten in MS-Excel-Dateien. Es ist möglich, einen bestimmten Parameter oder alle Daten zu exportieren. Die Parameter, die für die Analyse von Zellclusterbildung relevant sind, sind Volumen, Intensität, Anzahl der Objekte, Anzahl der Voxel und Kugelgestalt. </li><li> Speichert und exportiert die Bilder in einem geeigneten Bildformat TIFF bevorzugt. HINWEIS: Animationen können auch mit dem Animationsmenü vorgenommen und als Medien-Datei gespeichert werden. </li><li> Speichern Sie die Analyse-Einstellungen der einzelnen Kanäle mit der Option Parameter hinzufügen und können später mit der Rebuild-Funktion abgerufen werden. Gleichzeitig analysiert mehrere Dateien mit Hilfe der Batch-Verarbeitung-Tool. Anmerkung: Alle zu vergleichenden Bilder erworben werden müssen, verarbeitet und in der gleichen Weise analysiert werden. Beispielsweise ein 8 Bit-Bild (256 integer) sollte nicht mit einem 12-Bit-Bild (4096 integer) verglichen werden. </li></ol>

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<li>Lin, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor+neutralization+results+in+disseminated+disease+in+acute+and+latent+Mycobacterium+tuberculosis+infection+with+normal+granuloma+structure+in+a+cynomolgus+macaque+model%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor neutralization results in disseminated disease in acute and latent Mycobacterium tuberculosis infection with normal granuloma structure in a cynomolgus macaque model.</a> Arthritis Rheum. 62, 340-350 (2010).</li>
<li>Rahman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+of+immune+responses+in+human+tuberculosis%3A+few+CD8%2B+effector+T+cells+but+elevated+levels+of+FoxP3%2B+regulatory+t+cells+in+the+granulomatous+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization of immune responses in human tuberculosis: few CD8+ effector T cells but elevated levels of FoxP3+ regulatory t cells in the granulomatous lesions.</a> Am J Pathol. 174, 2211-2224 (2009).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Die Fähigkeit, organisierte Zellcluster am Ort der Infektion zu rekrutieren und zu bilden, ist das Kennzeichen der menschlichen TB 11. Diese dynamischen Strukturen, die als Tuberkelgranulome bekannt sind, bestehen hauptsächlich aus Immunzellen (Makrophagen, Monozyten, T-Zellen und B-Zellen) und mehrkernigen Riesenzellen, die M. tuberculosis umgeben. Die Rolle des Granuloms wurde lange Zeit als Abschottung der Infektion angesehen und die lokale Ausbreitung von Bakterien verhindert. Neuere Studien zeigen jedoch, dass die Bildung von Granulomen für das frühe Überleben, Wachstum und die Ausbreitung von Bakterien entscheidend ist 12. Eine Strategie neuer Studien besteht darin, Moleküle oder Signalwege zu identifizieren, die effizient angesteuert werden könnten, um die zelluläre Migration bei der Granulombildung und/oder TB-Verbreitung zu hemmen. 
Ein Vorbehalt für neuartige Studien zu TB ist der Mangel an Modellen, die die menschliche TB rekapitulieren. Die am häufigsten verwendeten Versuchstiere bilden bei einer Infektion mit M. tuberculosis kein echtes Granulom und sind daher keine geeignete Wahl für Studien mit TB 13-16. Nicht-menschliche Primaten haben die größte Ähnlichkeit mit menschlicher TB 17, sind aber aufgrund hoher Betriebskosten und ethischer Fragen nicht die bevorzugte Wahl. Die Tuberkulose beim Menschen ist ein komplexer immunologischer Prozess und in vitro schwer zu modellieren. Zellkulturen aus Monolayern oder Co-Kulturen fehlen die 3D-Umgebung und die Gewebereaktionen. Aus diesem Grund haben wir ein innovatives Lungengewebemodell entwickelt, das auf humanen primären Immunzellen und humanen lungenspezifischen Zelllinien basiert 8,9. Das Modell zeigt charakteristische Merkmale des menschlichen Lungengewebes, darunter Epithelien mit gleichmäßig integrierten Makrophagen, die Bildung extrazellulärer Matrix, geschichtete Epithelien und Schleimsekretion 9. 
Das 3D-Modell des menschlichen Lungengewebes hat mehrere Vorteile gegenüber den in vitro Einzel- oder Co-Kulturen, die auf Gewebekulturplatten oder Transwell-Einsätzen ausgesät werden. Erstens werden die humanen lungenspezifischen Zellen (Fibroblasten und Epithelzellen) in der Regel nicht in die in vitro Einzel- oder Cokulturen eingeschlossen. Zweitens werden die Immunzellen und lungenspezifischen Zellen in einen physiologischen 3D-Kontext eingebettet (kollagenreiche extrazelluläre Matrixprodukte). Die Reaktion von Zellen auf einen Reiz/eine Infektion und das Migrationsverhalten von Zellen, z.B. die Bildung eines Granuloms, unterscheiden sich signifikant zwischen einer 2D- und einer 3D-Umgebung. Darüber hinaus ermöglicht das beschriebene Verfahren die 3D-Visualisierung und robuste quantitative 3D-Analyse, die zentrale Informationen über die räumliche Verteilung und komplizierte zelluläre Interaktionen liefert. 
Eine experimentelle Infektion im Modellgewebe mit M. tuberculosis führte zu einer Häufung von Makrophagen an der Infektionsstelle, die an ein frühes TB-Granulom erinnert (Abbildung 2 und 3). Wir haben kürzlich gezeigt, dass mutierte Stämme, die nicht in der Lage sind, den Virulenzfaktor ESAT-6 zu sezernieren, oder Mycobacterium bovis BCG, dem ESAT-6 fehlt, im Gegensatz zum virulenten M. tuberculosis 9 keine Clusterbildung von Monozyten (kein frühes Granulom) induzierten. Diese Daten stimmen mit den Beobachtungen von Mycobacterium marinum-infizierten Zebrafischembryonen überein, deren Transparenz eine elegante Live-Abbildung der Granulombildung ermöglicht 12. Da es kein Goldstandard-Modell für TB gibt, nutzten wir die chirurgisch resezierten Gewebebiopsien von TB-Patienten zur Validierung der Methode 9. Unser In-vitro-Gewebemodell weist mehrere Merkmale mit den Lungen- und Lymphknotenbiopsien von TB-Patienten auf, darunter die Aggregation von Makrophagen im Granulom, das Vorhandensein von intra- und extrazellulären Bakterien 18 und die Induktion von Nekrosen 11. 
Obwohl das beschriebene Modell physiologische Relevanz für die humane TB hat und mehrere Vorteile gegenüber anderen in vitro Modellen hat, weist es einige Einschränkungen auf. Zum Beispiel wird von mehr als 20 Kollagenproteinen, die beim Menschen identifiziert wurden, nur Typ I in das Modell aufgenommen, um die extrazelluläre Matrix nachzuahmen. Kollagen Typ I ist jedoch eine komplexe Mischung aus extrazellulären Matrixprodukten und ist das am häufigsten vorkommende Kollagen im menschlichen Körper. Darüber hinaus haben wir das Vorhandensein von Kollagen IV und mehreren extrazellulären Matrixproteinen wie Tropoelastin, Vimentin und Laminin nachgewiesen, die von den Epithelzellen und Fibroblasten im Gewebemodell produziert werden, was auf die Synthese von neuem Kollagen hinweist 8. Derzeit gibt es im Lungengewebemodell neben lungenspezifischen Zellen nur Monozyten und Makrophagen. Es fehlen Neutrophile und Lymphozyten, von denen bekannt ist, dass sie auch im Granulom vorhanden sind. Bemerkenswert ist, dass das Modell nicht auf die Einführung zusätzlicher Immunzellen beschränkt ist, sondern von Interesse ist, um zu untersuchen, wie sie zu den komplexen zellulären Interaktionen bei menschlicher TB beitragen. Die Implantation von primären Alveolarmakrophagen, hautspezifischen Zellen und Lungenkarzinomzellen wurde bereits im Modell getestet. Da unser Ziel darin bestand, ein Modell zu verwenden, das der menschlichen TB sehr ähnlich ist, wurde die Einführung von Mauszellen nicht versucht.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Lungengewebemodell Auswirkungen sowohl auf grundlegende mechanistische als auch auf angewandte Studien hat. Zu den möglichen Anwendungen des Lungenmodells gehören die Untersuchung der angeborenen Immunität, die Untersuchung mechanistischer Aspekte der Wirtsabwehr wie phagosomale Reifung, Autophagie, Produktion von Zytokinen, Chemokinen und antimikrobiellen Peptiden sowie die funktionelle Charakterisierung einzelner Zelltypen. Auffällig ist, dass das In-vitro-Gewebemodell die Manipulation eines oder mehrerer Zelltypen ermöglicht und eine relevante Gewebemikroumgebung bietet, nicht nur für Studien über TB, sondern auch für eine Vielzahl von infektiösen und nicht-infektiösen Krankheiten, die die Lunge betreffen.

Bei Menschen, Antworten auf eine Infektion, Entzündung im Gewebe, Zellrekrutierung, Gewebeumbau und die Regulierung der Gewebehomöostase sind komplexe Veranstaltungen mit verschiedenen Zelltypen. Daher sind diese Verfahren am besten in der lokalen Gewebeumgebung untersucht. Bisher hat dies vor allem möglich unter Verwendung von experimentellen Tiermodellen. Jedoch die weit verbreiteten Versuchstieren halten viele Grenzen, da sie oft zu antworten Pathogenen in einer anderen Weise als Menschen und auch einen anderen Verlauf der Erkrankung 1 anzuzeigen. Ein menschlicher Lunge in vitro Gewebemodell hält der Möglichkeiten, um spezifische Immunantworten in der menschlichen Lunge zu untersuchen. Menschlicher Tuberkuloseinfektion (TB) ist hauptsächlich eine Erkrankung der Lunge. Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), den Erreger der Tuberkulose, die Lunge über Aerosol-Tröpfchen, die an den Alveolarraum, wobei die Bakterien durch Lungen dendri verschlungen transportiert werden erreichttic Zellen und Alveolarmakrophagen als Teil der angeborenen Immunantwort auf die Infektion 2,3. Phagozytose der Erreger führt zur Abschottung des Fehlers innerhalb eines Phagosom und führt zur Neutralisation und Tötung des Erregers durch die Phagozyten ideal. Bis zu 50% der Personen, um M. ausgesetzt Tuberkulose wird angenommen, dass in der Lage, die Infektion durch die angeborene Immunantwort 4 klar sein. Weitere Ergebnisse der Infektion sind Freigabe durch das adaptive Immunsystem in einem späteren Stadium, latente Infektion oder im schlimmsten Fall chronisch aktiver Erkrankung 5. Zuvor gab es für das Studium der menschlichen TB wurden keine In-vitro-Gewebemodelle. Einzelzellkulturen von menschlichen Makrophagen oder andere Zellen des peripheren Blutes wurden häufig verwendet 6,7. Der Nachteil dieses Ansatzes ist, dass sie die Bewegungen der verschiedenen Zelltypen gleichzeitig zusammen in einem Lungengewebe zu M. ausgesetzt gewesen sein kann Tuberkulose </em&gt;. Somit besteht ein Bedarf nach einem in vitro-Modell, um funktionelle und mechanistische Studien über TB auszuführen. Die zellbasierten in vitro hier beschriebenen menschlichen Lungengewebe-Modell wurde ursprünglich von unserer Gruppe für Studien über dendritische Zellfunktionen 8 etabliert. Wir haben dieses Verfahren für die Untersuchung von TB angepasst. Das menschliche Lungengewebe Modell hier präsentierten aus gewebespezifischer Epithelzellen und Fibroblasten 8. Diese Zellen sind in einer Matrix aus Kollagen auf der Oberseite der porösen Membran in einem Transwell-Einsatz und bilden Strukturen ähnlich normalen menschlichen Lungengewebes (1) kultiviert. An der Luft beginnen die Zellen, um Schleim in der apikalen Seite 8 sekretieren. Durch Implantation von humanen primären Makrophagen, die mit M. infiziert tuberculosis zum Modell haben wir beobachtet, wie die Immunzellen wandern in das Gewebe und frühen Stadien der TB Granulome 9 bilden. Dies ist die erste menschliche Gewebemodell described für TB, und es stellt ein vielversprechendes Werkzeug für die Untersuchung angeborenen Immunantwort auf Tuberkulose und anderen Erkrankungen der Lunge. Bisher haben wir nur Monozyten und Makrophagen als Immunzellen im Modell verwendet, aber der Grad der Komplexität kann durch Aufnahme zusätzlicher relevanter Zelltypen erhöht werden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53084/53084fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung des Lungengewebes Modell. (A) wird das Modell der menschlichen Lunge spezifische Epithelzellen besteht, M. Tuberkulose infizierten primären Makrophagen und roten Farbstoff markiert Monozyten auf Kollagen eingebetteten Fibroblasten auf einem Transwell-Filter hergestellt ausgesät. Exposition der Gewebemodell, um Luft initiiert Produktion von extrazellulären Matrixproteinen, Schleimabsonderung und Schichtung nach dem Epithel. Das so entwickelte 3D-Gewebemodell ist ein nützliches Tool, um M. studieren tuberculosis-Infektion in einer Umgebung, die closely ähnelt einem menschlichen Lunge. (B) Repräsentative mikroskopische Bilder der verschiedenen Schritte bei der Herstellung der Gewebemodell. (C) die komplette Struktur des Lungenmodell Gewebeschnitt. Scale -. 100 &amp; mgr; m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53084/53084fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

<table><tbody><tr><td>Zellkultureinsätze</td><td>BD Falcon</td><td>353092</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Kulturplatten</td><td>BD Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>MRC-5-Zellen, Lungenfibroblasten</td><td></td><td></td><td>ATCC#CCL-171</td></tr><tr><td>16HBE-Zellen, Lungenepithelzellen</td><td></td><td></td><td>Geschenk von Dr. Dieter Gruenert, Mt. Zion Cancer Center, University of California, San Fransisco, USA&nbsp;</td></tr><tr><td>5 x Dulbecco' s modifizierter Eagle" s medium (5 x DMEM)</td><td>Gibco</td><td>12800-082</td><td>Hergestellt aus Pulver, aber mit 5-mal weniger Wasser. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,3 ein und filtern Sie ihn mit einem 0,2 & Mikro; m Filter.</td></tr><tr><td>Dulbecco' s modifizierter Eagle" s Medium mit Glukose (DMEM) 1x</td><td>Gibco</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium (MEM) 1x mit Earle' s Salze</td><td>Sigma</td><td>M4655</td><td></td></tr><tr><td>Nicht-essentielle Aminosäuren Lösung, 100x</td><td>Life</td> Technologies <td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin 200 mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Life Technologies</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3 (71,2 mg/ml)</td><td></td><td></td><td>Im Haus hergestellt</td></tr><tr><td>Hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>Läufig inaktiviert für 30 min, 56 &de; C</td></tr><tr><td>Gentamicin (50 mg/ml)</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Hepespuffer Lösung 1M</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin (Pen Streptomycin)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Axis-Shield</td><td>7801</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure 0,5 M EDTA</td><td>Gibco</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>Rinderkollagen PA behandelt (500 ml)</td><td>Organogenesis</td><td>200-055</td><td></td></tr><tr><td>Reine col-gereinigte Rinderkollagenlösung (100 ml)</td><td>Fortschrittliche Biomatrix</td><td>5005-B</td><td></td></tr><tr><td>Extrazelluläres Matrixprotein, Fibronektin (1 mg)</td><td>BD</td><td>354008</td><td></td></tr><tr><td>Primäre humane Monozyten/Makrophagen</td><td></td><td></td><td>Isoliert aus menschlichem Vollblut oder Buffy-Coats.</td></tr><tr><td>PKH26 Rot fluoreszierender Zelllinker</td><td>Sigma</td><td>MINI26</td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium tuberculosis H37Rv, das grün fluoreszierendes Protein</td><td></td><td></td><td>M. tuberculosis H37Rv Wildtyp wurde mit dem pFPV2-Plasmid transformiert, das konstitutiv GFP exprimiert.</td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9 mittelgroß&nbsp;</td><td>Difco</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>BBL Middlebrook ADC-Anreicherung</td><td>BBL</td><td>211887</td><td></td></tr><tr><td>Tween-80</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, Kanamycin, B-Sulfat (20 &; Mikro; g/ml)</td><td>Sigma</td><td>B5264</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Anti=-Fade Reagenz mit DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin -EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM700 Konfokales Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iMaris Scientific 3D/4D Bildverarbeitungssoftware, Version 7.6.8</td><td>Bitplane AG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ein 3d-humanem lungengewebe modell für funktionelle studien auf<em&gt; mycobacterium tuberculosis</em&gt; infektions

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Tuberkulose (TB) hält immer noch eine große Bedrohung für die Gesundheit der Menschen weltweit, und es besteht ein Bedarf an kostengünstigen, aber zuverlässigen Modelle, die uns helfen zu verstehen, die Krankheitsmechanismen und vorab die Entdeckung neuer Behandlungsmöglichkeiten. In-vitro-Zellkulturen von Monoschichten oder Co-Kulturen fehlen die dreidimensionale (3D) Umgebung und Gewebereaktionen. Hier beschreiben wir eine innovative In-vitro-Modell eines menschlichen Lungengewebe, das Versprechen hält, um ein wirkungsvolles Werkzeug für die Untersuchung der komplexen Ereignisse, die während einer Infektion mit Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) auftreten. Das Gewebemodell 3D besteht aus gewebespezifischer Epithelzellen und Fibroblasten, die in einer Matrix aus Kollagen auf der Oberseite einer porösen Membran kultiviert werden. Bei Lufteinwirkung die Epithelzellen stratify und sezer Schleim an der apikalen Seite. Durch die Einführung von primären humanen Makrophagen, die mit M. infiziert tuberculosis zur Gewebemodusl, haben wir gezeigt, dass die Immunzellen wandern in das infizierte Gewebe und frühen Stadien der TB Granulome bilden. Diese Strukturen rekapitulieren die besonderes Merkmal der menschlichen Tuberkulose, der Granulom, die sich grundlegend oder nicht gewöhnlich in weit verbreiteten experimentellen Tiermodellen festgestellt ist. Das organotypische Kultur Verfahren ermöglicht die 3D-Visualisierung und robuste quantitative Analyse, die entscheidenden Informationen über räumliche und zeitliche Merkmale der Wirtszelle-Pathogen-Interaktionen bietet. Zusammengenommen bietet das Lungengewebe-Modell einen physiologisch relevanten Gewebemikroumgebung für Untersuchungen an TB. Somit hat das Lungengewebe-Modell möglichen Auswirkungen auf sowohl grundlegende mechanistische und angewandten Studien. Wichtiger ist, ermöglicht das Modell zusätzlich oder Manipulation einzelner Zelltypen, die dadurch ihre Verwendung aufweitet zum Modellieren einer Vielzahl von Infektionskrankheiten der Lungen auf.

Ein 3D-Lungengewebe Modell für menschliche TB effektiv genutzt, um die Wirt-Pathogen-Interaktionen in M. zu studieren Tuberkulose-Infektion. Die grundlegenden Schritte dieses Verfahrens werden repräsentative mikroskopische Bilder verschiedener Stufen und einer Gesamt mikroskopische Struktur einer Gewebeschnitt in 1 dargestellt. Das Modell besteht aus mehreren Komponenten von humanem Lungengewebe, einschließlich Lungenfibroblasten, bronchiale Epithelzellen und primäre Monozyten / Makrophagen in der 3D-Gewebeumgebung eingebettet. Neben der Einbeziehung Komponenten der menschlichen Lungengewebe, das Modell ähnelt physiologischen Bedingungen zwar Schichtung der Epithelien und Schleimabsonderung. Ein Beispiel für die Verwendung des Lungengewebes Modell bei der Überwachung einer TB-Infektion ist in Abbildung 2 dargestellt. Zur Visualisierung der M. Tuberkulose-Immun-Zell-Migration und Interaktion führten wir Makrophagen, die mit M. infiziert Tuberkulose, die GFP exprimieren(grün) zusammen mit den frisch isolierten PKH26-markierten Monozyten (rot) in das Gewebe-Modell (blau, befleckt DAPI für Kerne). Am Tag 7 nach der Zugabe von M. Tuberkulose infizierten Zellen an den Gewebemodell, zeigt konfokale Mikroskopie Clustering von roten Monozyten an den Ort der Infektion (grün) (Abbildung 2), die das Markenzeichen Läsionen des menschlichen TB 9 nachahmt. Eine Reihe von repräsentativen Bildern für die 3D-Visualisierung von M. Tuberkulose infizierten Gewebemodell und Quantifizierung von Zellclustern ist in Abbildung 3 dargestellt. Die 3D-Visualisierung gibt dem Benutzer die Flexibilität, zu interagieren, zu untersuchen und zu quantifizieren, mehrere Funktionen in einem 3D-Bild. Die räumliche Anordnung der grünen und roten Bakterien Monozyten Cluster von der apikalen, Dreh- und Seitenansicht gesehen, wie in 3B, die Clusterbildung von Monozyten an der Stelle zeigt, M. illustriert Tuberkulose. Die Cluster nicht OBbei nicht infizierten Geweben (3A) serviert. Quantifizierten wir die Größe und Anzahl der Monozyten Zellcluster und festgestellt, dass die Größe (Volumen) von Zellclustern verbessert (p &lt;0,001), während die Anzahl der Einzel Monozyten verringert (p &lt;0,01) in M. Tuberkulose infizierten Geweben im Vergleich zu nicht infizierten Gewebemodelle (3C und 3D). Diese Daten bestätigt unsere frühere Feststellung der frühen Granulombildung in M. im Lungengewebe-Modelle in 2D Gewebeschnitte 9 analysiert Tuberkulose-Infektion beobachtet. Unsere Daten weisen darauf hin, dass die Gewebemodell bietet eine natürliche 3D-Lebensraum zu untersuchen, die komplexe Host-Zell-M. tuberculosis Kommunikationsnetz. Wir fanden auch, dass 3D-Visualisierung und quantitativen Analyse sind bessere Werkzeuge für die Untersuchung der Funktionen im Gewebe-Modell (Abbildung 3). Die Quantifizierung der Zellcluster (Granulom zum Beispiel) oft stretc<html> hes zu mehreren Zellschichten und kann vollständig durch eine quantitative 3D-Analyse erfasst werden. Außerdem Visualisierung der genauen räumlichen und zeitlichen Eigenschaften einzelner Zellen oder Bakterien im Modell ermöglichen Live-Bildgebung, Migration und Tracking-Studien in einem autorisierten Labor. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53084/53084fig2.jpg" /> Abbildung 2. Monozyten im Gewebemodell Cluster rund virulenten M. Tuberkulose. Repräsentative konfokale Bilder von nicht infizierten und M. tuberculosis infiziert Gewebemodell wird vorgestellt. Panels von grün (M. tuberkulose- GFP), rot (PKH26-markierten Monozyten), blau (DAPI-gefärbten Zellkernen) und fusionierte Kanäle zeigen die Rekrutierung von Monozyten im infizierten Gewebe im Vergleich zu nicht infizierten Gewebe. Scale - 100 um.large.jpg &quot;style =&quot; font-size: 14px; line-height: 28px; &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53084/53084fig3.jpg" /> Abbildung 3. 3D-Visualisierung und quantitativen Analyse von Gewebemodell nützliche Informationen. Repräsentative Bilder der 3D-Visualisierung des gesamten Gewebemodell (A) nicht infizierten Gewebe, (B) mit M. infiziert Tuberkulose, durch optische Schnitte mit Zeiss LSM700 konfokalen Mikroskop und quantitative Analyse von Imaris Bildverarbeitungs-Software (Version 7.6.8). Diese Bilder wurden bei 20-facher Vergrößerung erworben, 14 Z-Stapel bedeckt eine Gewebedicke von 19,5 &amp; mgr; m mit 1,5 um Abstand, so dass die Visualisierung von apikal, Rotations horizontale Dreh vertikale und seitliche Ansicht (A und B). (C) QuaGröße ntitative Analyse der Monozyten-Zellcluster offenbaren verbesserte (p &lt;0,0001) der frühen Granulom Clustern nach M. Tuberkulose-Infektion im Vergleich zur Abwesenheit von Infektion. (D) Quantifizierung der Zahl der Monozyten zeigten eine Abnahme (p &lt;0,01) im infizierten Gewebe im Vergleich zu nicht infizierten Gewebe wiederholte mehrere Cluster im infizierten Gewebe. Green - M. Tuberkulose -GFP, Rot - PKH26-markierten Monozyten, Blue - Zellkernen, Scale -. 100 &amp; mgr; m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53084/53084fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Die Tuberkuloseinfektion beim Menschen ist ein komplexer Prozess, der in vitro schwer zu modellieren ist. Hier beschreiben wir ein neuartiges 3D-Modell des menschlichen Lungengewebes, das die Dynamik rekapituliert, die während der Infektion auftritt, einschließlich der Migration von Immunzellen und der frühen Granulombildung in einer physiologischen Umgebung.

Ein 3D-humanem Lungengewebe Modell für funktionelle Studien auf<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Infektions

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein in-vitro-Lungengewebsmodell für Untersuchungen der Infektion mit M. tuberculosis zu erstellen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Fibroblasten-Kollagen-Matrix auf den Filter eines Zellkulturplatten-Einsatzes aufgebracht wird. Im zweiten Schritt werden infizierte Immunzellen und Lungenepithelzellen auf die Fibroblasten-Kollagen-Schicht gegeben.Das resultierende 3D-Gewebemodell wird anschließend der Luft ausgesetzt, um die Schleimsekretion und die Schichtung des Epithels zu fördern. Im letzten Schritt wird das Gewebe entnommen und präpariert. Abschließend kommt die Immunfluoreszenzmikroskopie zum Einsatz, um die Bildung von durch M. tuberculosis induzierten frühen Granulomen zu analysieren.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie der in-vitro-Monolayer-Kultur von Zellen, besteht darin, dass die Zellen in diesem System in einer dreidimensionalen Mikroumgebung vorliegen, wodurch nach einer Infektion mit virulenten Mykobakterien die Bildung von Granulomen ermöglicht wird, die der humanen Tuberkulose ähneln. Um kollageneingebettete Fibroblasten vorzubereiten, behandeln Sie Lungenfibroblasten zunächst 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit Trypsin. Sobald sich die Zellen gelöst haben, beenden Sie die Reaktion mit acht Millilitern komplettem DMEM und zentrifugieren Sie die Zellen anschließend. Resuspendieren Sie das Zellpellet in frischem DMEM mit einer Dichte von 230.000 Zellen pro Milliliter und stellen Sie die Zellen auf Eis. Fügen Sie danach je einen Insert pro Vertiefung in eine Sechs-Well-Platte ein.Geben Sie eine Milliliter frisch zubereitete, azelluläre Schichtmischung in jede Einlage einer Mehrlochplatte, wobei sichergestellt werden muss, dass die Mischung die gesamte Einlage vollständig ohne Luftblasen bedeckt. Anschließend wird die Platte für 30 Minuten in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius gestellt. Am Ende der Inkubation werden zwei Milliliter Kollagen mit 615 Mikrolitern Premix in einem sterilen kegelförmigen Gefäß auf Eis gemischt, um den pH-Wert des Kollagens pro Einlage zu neutralisieren.Fügen Sie dann 58 µL vollständiges DMEM und 327 µL Lungenfibroblasten pro Insert der Kollagenmischung hinzu. Pipettieren Sie mehrmals auf und ab, um die Zellen gleichmäßig in der Mischung zu verteilen. Geben Sie nun schnell je drei mL der zellulären Schicht an der Seite jedes Inserts auf die jeweilige azelluläre Kollagenschicht.Beachten Sie, dass keine Luftblasen entstehen, und stellen Sie die Platte für weitere zwei Stunden in den Zellkultur-Inkubator zurück. Nach der Polymerisation des Kollagens geben Sie zwei Milliliter komplettes DMEM auf den Boden jedes Wells und stellen die Platte erneut für 24 Stunden in den Inkubator. Am nächsten Tag heben Sie die Inserts einzeln vorsichtig mit einer sauberen Pinzette an und aspirieren das Kulturmedium von der Unterseite jedes Wells. Fügen Sie dann zwei Milliliter komplettes DMM auf den Boden jedes Wells und zwei Milliliter komplettes DMM in jeden Insert hinzu. Wechseln Sie die beiden Medienmengen alle zwei Tage über einen Zeitraum von fünf bis sieben Tagen. Um die infizierten Makrophagen vorzubereiten, inkubieren Sie zunächst eine Makrophagenkultur vier Stunden lang mit virulentem M tuberculosis bei einer Multiplizität der Infektion von 10.Am Ende der Inkubation die Zellen dreimal mit PBS waschen, um die extrazellulären Bakterien zu entfernen, und die Makrophagen 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit zwei Millimolar A DTA behandeln. Sobald sich die Zellen gelöst haben, sie in antibiotikafreiem vollständigem DMM suspendieren. Anschließend das gesamte Medium von der Fibroblasten-Kollagen-Matrix-Platte absaugen und 1,5 Milliliter frisches, antibiotikafreies, vollständiges DMM in die äußeren Kammern geben.Mischen Sie anschließend fluoreszenzmarkierte Monozyten mit den infizierten Makrophagen im Verhältnis fünf zu eins in 50 Mikrolitern des antibiotikafreien vollständigen DMEM pro Insert. Geben Sie danach 50 Mikroliter der Monozyten-Makrophagen-Mischung in das Innere jedes Inserts und stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator. Nach einer Stunde fügen Sie langsam zwei Milliliter Kulturmedium an den Wänden der Inserts entlang hinzu, um ein Ablösen der Zellen zu vermeiden, und inkubieren Sie die Kulturen weitere 24 Stunden.Um die Kulturen mit Lungenepithelzellen zu besiedeln, geben Sie 4 Millionen Epithelzellen pro Milliliter in 50 Mikroliter vollständigem DMM auf die Kollagenmatrizen aus Immunzellen und Fibroblasten. Inkubieren Sie die Zellen zwei Minuten bei Raumtemperatur, gefolgt von einer Stunde bei 37 Grad Celsius. Fügen Sie dann vorsichtig zwei Milliliter antibiotikafreies, vollständiges DMM zu den Inserts hinzu, wie gerade gezeigt, und kultivieren Sie die Zellen weitere drei Tage.Fünf Tage nach der Aussaat saugt man das gesamte Kulturmedium von der Platte ab und gibt 1,8 Milliliter antibiotikafreies, vollständiges DMM in die äußeren Kammern. Anschließend belüftet man die 3D-Gewebemodelle in den Brutschrank für zwei Tage, ohne am siebten Tag nach der Aussaat Medium in das Insert zu geben.Entfernen Sie das Medium vollständig von der Platte und mischen Sie die Gewebemodelle mit 4 % Paraldehyd für 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Trennen Sie anschließend mithilfe eines Skalpells die Membranen von den Einlegehülsen der Vertiefungen. Verwenden Sie danach ein sauberes Skalpell, um vorsichtig die Seiten der Gewebemodelle zu entfernen, und schneiden Sie jedes Gewebe in vier annähernd gleich große quadratische Stücke.Überführen Sie die Stücke auf Super-Frost-Glasobjektträger und lassen Sie sie fünf Minuten trocknen. Anschließend werden die Gewebeproben mit einem fluoreszierenden Eindeckmedium, das Anti-Fade und DAPI enthält, aufgebracht und mit Deckgläsern abgedeckt. Belassen Sie die Objektträger bei Raumtemperatur im Dunkeln, bis sie trocken sind, und verschließen Sie danach die Ränder der Deckgläser mit Nagellack.Wenn der Lack getrocknet ist, tauchen Sie die Objektträger zur Entnahme aus der BSL-Stufe-3-Einrichtung in 70 % Ethanol ein. Um die Gewebe sichtbar zu machen, fertigen Sie 3D-Bilder von fünf bis zehn verschiedenen Feldern an, die das gesamte Gewebestück bei einer Auflösung von 512 mal 512 mit Zack-Abdeckung abdecken, wobei eine Mindestdicke von 20 Mikrometern und ein Abstand zwischen den Schichten von einem bis 1,5 Mikrometern auf einem fluoreszierenden konfokalen Mikroskop für die 3D-Quantifizierung der Zellcluster erforderlich ist. Öffnen Sie die 3D-Bildverarbeitungssoftware, und laden Sie das gewünschte Bild.Danach mithilfe des Anzeigeeinstellungswerkzeugs jeden Kanal für Bild, Kontrast, Helligkeit und Mischungsdeckkraft anpassen, um die Volumenrendering zu optimieren und die Störgeräusche so weit wie möglich zu minimieren. Anschließend zur Visualisierung der Gewebeoberfläche den roten Monozytenkanal auswählen und mithilfe der Filter geeignete Schwellenwerte festlegen, um die Auswahl der roten Monozyten einzuschränken oder den Hintergrund nach Bedarf auszuschließen. Schließlich die Daten in das geeignete Tabellenkalkulationsprogramm exportieren, um weitere nachgeschaltete Analysen durchzuführen.Am siebten Tag nach der Aussaat infizierter Zellen mit M. tuberculosis zeigt die konfokale Mikroskopie eine Ansammlung roter Monozyten am Infektionsort, erkennbar an der Präsenz der grünen Bakterien, die den bei menschlicher Tuberkulose bekannten, als Granulom bezeichneten Läsionen im 3D-Modell entspricht. Die Visualisierung ermöglicht eine flexible Interaktion, Untersuchung und Quantifizierung mehrerer Merkmale. Ein 3D-Bild beispielsweise, wie in diesen Aufnahmen, zeigt einen Verbund von Monozyten am Ort der Infektion mit M. tuberculosis.Die räumliche Anordnung der grünen Bakterien und roten Monozyten-Cluster kann aus apikaler, rotatorischer und lateraler Sicht beobachtet werden. Wie erwartet wurden diese Cluster in nicht infizierten Geweben nicht beobachtet. Die Quantifizierung der Größe und Anzahl von Monozyten, Zellclustern und mit M. tuberculosis infizierten Geweben zeigte, dass die Größe der Zellcluster vergrößert ist, während die Anzahl einzelner Monozyten im Vergleich zu den nicht infizierten Gewebemodellen verringert ist.Mögliche Anwender dieses Lungenmodells sind die Untersuchung der Rolle verschiedener Immunzellen und der Gewebeimmunität bei Tuberkulose, die Untersuchung von Mykobakterien-Phänotypen sowie die Testung von Wirkstoffkandidaten, die Mykobakterien innerhalb des Granuloms abtöten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Quelle: Mueller, A., et al. Ein experimentelles Modell zur Untersuchung der Tuberkulose-Malaria-Koinfektion bei natürlicher Übertragung von Mycobacterium tuberculosis und Plasmodium berghei. J. Vis. Exp. (2014)Dieses Video demonstriert die Aerosolabgabe von Mycobacterium tuberculosis (Mtb) an Mäuse mittels eines verneblerbasierten Kammersystems, um eine lungenartige Infektion zu induzieren, und bietet ein kontrolliertes und reproduzierbares Modell zur Untersuchung der luftübertragenen...

Aerosolabgabe von Mycobacterium tuberculosis bei Lungeninfektion in einem Mausmodell

Tuberkulose und Malaria sind zwei der häufigsten Infektionen bei Menschen und die Hauptursachen für Morbidität und Mortalität bei der verarmten Bevölkerung in den Tropen. Wir gründeten eine experimentelle Modellsystem, um Ergebnisse der Malaria-Tuberkulose-Koinfektion bei Mäusen nach der Infektion mit beiden Erregern über ihre natürlichen Infektionsweg zu studieren.

Eine experimentelle Modell zum Studium Tuberkulose-Koinfektion auf Natur Malaria Übertragung von Mycobacterium tuberculosis Und Plasmodium berghei</i

Wir präsentieren ein dreidimensionales (3D) Lungenkrebsmodell, das auf einem biologischen Kollagengerüst basiert, um die Empfindlichkeit gegenüber nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC)-zielgerichteten Therapien zu untersuchen. Wir demonstrieren verschiedene Auslesetechniken zur Bestimmung des Proliferationsindex, der Apoptose und des epithelial-mesenchymalen Übergangsstatus (EMT). Die gesammelten Daten werden in ein in silico-Modell zur Vorhersage der Arzneimittelsensitivität integriert.

Ein kombiniertes 3D-Gewebezüchtungen<em&gt; In Vitro</em&gt; /<em&gt; In Silico</em&gt; Lungentumormodell für Hintergründe in bestimmten Mutations Drug Wirksamkeit vorhersagen

Wir haben für die Entdeckung neuer Verbindungen gegen Mycobacterium tuberculosis ein modulares Hochdurchsatz - Screening - System entwickelt, und die intrazelluläre Targeting-Brühe in Bakterien sowie Zytotoxizität gegen die Säuger - Wirtszelle wächst.

System zur Wirksamkeit und Zytotoxizität Screening von Inhibitoren Targeting intrazellulärer<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Analyse der 18F-FDG-PET/CT-Bildgebung bei nichtmenschlichen Primaten zu beschreiben, die mit Mycobacterium Tuberculosis , Krankheitsverlauf, medikamentöse Behandlung und Krankheit Reaktivierung zu studieren infiziert wurden.

Analyse der 18FDG PET/CT Imaging als Werkzeug für Studium Mycobacterium-Tuberkulose -Infektion und Behandlung bei nicht-menschlichen Primaten

Wir beschreiben die optische Bildgebung von Mäusen mit Mycobacterium Tuberculosis (Mycobacterium Tuberculosis) mit Reporter Enzym Fluoreszenz (REF) infiziert. Dieses Protokoll ermöglicht den sensitiver und spezifischen Nachweis von Mycobacterium Tuberculosis in präklinischen Tiermodellen für die Pathogenese, Therapie und Impfstoff-Forschung.

Mycobacterium Tuberculosis in Mäusen mit Reporter Enzym Fluoreszenz Imaging

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Vorbereitung der Agarose-gefüllte menschlichen präzise geschliffenen Lunge Scheiben aus resezierten Patienten Gewebe, die für die Erzeugung von 3D Lunge Gewebekulturen, Modell menschlichen Lungenerkrankungen in biologischen und biomedizinischen Studien eignen.

Generation von menschlichen 3D Lungengewebe Kulturen (3D-LTCs) für Krankheit Modellierung

Galleria mellonella wurde vor kurzem als reproduzierbares, billiges und ethisch akzeptables Infektionsmodell für den Mycobacterium tuberculosis-Komplex etabliert. Hier beschreiben und zeigen wir die Schritte, die unternommen wurden, um eine erfolgreiche Infektion von G. mellonella mit biolumineszierendem Mycobacterium bovis BCG lux zu etablieren.

Verwendung der wirbellosen Galleria mellonella als Infektionsmodell zur Untersuchung des Mycobacterium tuberculosis Complex

Wir beschreiben ein Protokoll für ein dreidimensionales Co-Kultur-Modell infizierter Atemwege, mit CFBE41o- Zellen, THP-1 Makrophagen und Pseudomonas aeruginosa, die an der Luft-Flüssig-Schnittstelle eingerichtet wurden. Dieses Modell bietet eine neue Plattform, um gleichzeitig die Wirksamkeit von Antibiotika, die Epithelbarrierefunktion und entzündungshemmende Marker zu testen.

P. aeruginosa Infizierte 3D-Co-Kultur von Bronchialepithelzellen und Makrophagen an der Luft-Flüssig-Schnittstelle zur präklinischen Bewertung von Anti-Infektivika

Lung-on-Chip-Modelle übertreffen herkömmliche 2D-Kulturen, indem sie die Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche und die Perfusion der Endothelzellen nachahmen und den Blutfluss und den Nährstoffaustausch simulieren, die für lungenphysiologische Studien entscheidend sind. Dies erhöht die Relevanz der Lungenforschung und bietet eine dynamische, physiologisch genaue Umgebung, um das Verständnis und die Behandlung von Atemwegsinfektionen zu verbessern.

Immunkompetentes Alveolen-on-Chip-Modell zur Untersuchung der Immunantworten der Alveolarschleimhaut

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die intravitale Bildgebung einer abgeschwächten, BSL-2-zugelassenen Mycobacterium tuberculosis. Spannung in der Mauslunge unter Verwendung eines permanenten Lungenfensters. Dieser Ansatz ermöglicht eine longitudinale, einzelzellige Auflösungsanalyse früher Wirts-Pathogen-Interaktionen, einschließlich bacillärer Lokalisation, vaskulärer Dynamik und Makrophagenaufnahme innerhalb derselben Lungenmikroumgebung.

Intravitale Bildgebung der abgeschwächten auxotrophen Mycobacterium tuberculosis in der Mauslunge während früher intravaskulärer Infektion

Lernen Sie die Konstruktion eines 3D-Lungengewebemodells zur Untersuchung von Mycobacterium tuberculosis-Infektionen. Diese Methode ermöglicht die Analyse früher Granulombildung und Immunzellmigration in vitro.

Ein 3D-humanem Lungengewebe Modell für funktionelle Studien auf

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