Name: 3D-Hydrogel Scaffolds für Articular Chondrozyten-Kultur und Knorpel-Generation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: Erfahren Sie die 3D-Hydrogel-Kultur menschlicher Artikulärer Chondrozyten zur Knorpelregeneration. Diese Methode nutzt biomimetische Hydrogels zur Expansion und Reifung von Zellen für die Geweberegeneration.

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Die Autoren möchten sich bei der Stanford Abteilung für Orthopädische Chirurgie und dem Stanford Coulter Translational Seed Grant für die Finanzierung bedanken. J.H.L. möchte sich bei dem National Science Foundation Graduate Fellowship und dem DARE Doctoral Fellowship für die Unterstützung bedanken.

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit der Stanford University Menschliche Probanden Richtlinien durchgeführt und genehmigt Institutional Review Board-Protokoll. 1. Articular Chondrozyten Isolation <ol><li> Erhalten Knorpel von Gewebe während der Knieendoprothetik verworfen und sezieren wie zuvor 8 beschrieben. </li><li> Visuell wählen Sie die medialen oder lateralen Femurkondylen Knorpelproben für glatte Oberflächen und machen Schnitt an der Oberfläche des Knorpels durch ein Skalpell, um 4-5 mm Knorpelbiopsien, ohne den subchondralen Knochen zu entfernen. </li><li> Isolieren Chondrozyten aus der extrazellulären Matrix durch enzymatische Dissoziation des Gewebes mit O / N Behandlung mit gereinigter Collagenase. Verwendung 1: 1-Verhältnis von Collagenase II (125 U / ml) und Collagenase IV (160 U / ml) in Chondrozyten Wachstumsmedien bei 37 ° C. </li><li> Am folgenden Tag, filtern das verdaute Gewebe, das die dissoziierten Zellen durch eine 70mm Porengröße Nylon-Mesh. Zweimal Waschen mit 20 ml DMEM / F12 und zentrifugiert bei 600 g für 5 min. </li><li> Plate Die isolierten Chondrozyten in einer Dichte von 1 x 10 6 Zellen / 60 mm Kulturschale nach Resuspension in DMEM / F12 mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 25 ug / ml Ascorbat, 2 mM L-Glutamin, antimikrobielle Mittel (100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 0,25 ug / ml Fungizon). Halten die Platten bei 37 ° C und der Primär Chondrozytenkulturen als hochdichten Monoschicht aufrechtzuerhalten vor der Verkapselung in biomimetischen Hydrogelen. </li></ol> 2. Biomimetic Hydrogel Fabrication Hinweis: Dieses Verfahren ermöglicht die Synthese eines biomimetischen Hydrogel Poly (ethylenglykoldiacrylat) (PEGDA, MW 5000 g / mol), Chondroitinsulfat-Methacrylat (CS-MA) in DPBS. Die Zugabe von Photoinitiator ermöglicht photoaktivierten Vernetzung. Die endgültige Hydrogel-Zusammensetzung enthält 7% wiegent / Volumen (w / v) PEGDA, 3% w / v des CS-MA und 0,05% w / v des Photoinitiators. <ol><li> Synthetisieren CS-MA durch Funktionalisierung CS Polymers mit Methacrylatgruppen. <ol><li> Vorbereitung gepufferte Lösung von 50 mM 2-Morpholinoethansulfonsäure (MES) und 0,5 M Natriumchlorid (NaCl) durch Auflösen von 1,952 g MES und 5,84 g NaCl in 200 ml entionisiertem Wasser (DiH 2 O). Aufzulösen 5 g Chondroitinsulfat-Natriumsalz in der gepufferten Lösung. </li><li> Hinzufügen von 0,532 g (4,62 mmol) N-Hydroxysuccinimid (NHS) und 1.771 g (9.24 mmol) 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimid-Hydrochlorid (EDC) (Molverhältnis von NHS-EDC = 1: 2) die Lösung und rühren für 5 min. </li><li> Hinzufügen 0,765 g (4,62 mmol) 2-Aminoethyl-Methacrylat (AEMA) (Molverhältnis von NHS: EDC: AEMA = 1: 2: 1) zu der Lösung und Aufrechterhaltung der Reaktion bei RT für 24 h. </li><li> Reinigt das Gemisch durch Dialyse gegen deionisiertes Wasser (DIH 2 O) für 4 Tage unter Verwendung eines Dialyseschlauches (12-14 kDa MWCO). </li><li> Filtern Sie die purified Lösung durch ein 0,22 um-Filter und setzen Sie die offenen Röhrchen, die die Lösung in dem Exsikkator und Vakuum O / N. Stellen Sie sicher, dass alle Rohre werden vor Licht geschützt. Bewahren Sie die gelösten Polymers bei -20 ° C vor Licht und Feuchtigkeit geschützt. </li></ol></li></ol> 3. Zell Encapsulation <ol><li> Autoklaven werden die PCR Film und zylindrische Stäbe (zum Ausstanzen der zellbeladene Hydrogele 3D) und zu sterilisieren die maßgeschneiderte zylindrischen Gelform durch Eintauchen in 0,2 um gefiltert 70% Ethanol in Gewebekultur Haube unter UV-Licht. </li><li> Verschließen Sie den Boden des Gels Form mit autoklaviert PCR Folie ohne Luftblasen oder Lücken, um Lecks zu verhindern. Halten Sie es in einer sterilen 150 mm Platte. </li><li> Der Tag vor der Verkapselung von Zellen in biomimetischen Hydrogel, distanzieren die High-Density-Chondrozyten-Monoschicht mit O / N-Behandlung in Collagenase II und Collagenase IV-Lösung. Verwenden 125 U / ml Collagenase II und 160 U / ml Kollagenase VI jeweils in Chondrozyten Nährmedienbei 37 ° C. </li><li> Nehmen Sie einen 50-ml-Röhrchen und geben Sie 5% Gewicht / Volumen (w / v) Poly (Ethylenglykoldiacrylat) (PEGDA, MW = 5000 g / mol), 3% w / v Chondroitinsulfat-Methacrylat (CS-MA), und 0,05% w / v-Photoinitiator in DPBS. Das Röhrchen vortexen, um die Lösung zu mischen und halten Sie sie beiseite. Schützen Sie den Schlauch vor Licht. </li><li> Sammeln Sie die dissoziierten Zellen in einem 50 ml Falcon-Röhrchen, zählen und Zentrifuge bei 460 xg für 5 min. Saugen Sie alle Medien aus den Zellen Rohr und fügen Sie die obigen gemischten Gel-Material zu resuspendieren Zellen in einer Dichte von 15 x 10 6 Zellen / ml. Mischen Sie es 30 Mal gründlich unter Vermeidung von Luftblasen-Bildung. </li><li> Pipette 72 ul der Zellsuspension-Hydrogel oder Hydrogel allein in die maßgeschneiderte zylindrischen Gelform an und beeinflussen die Gelierung durch Bestrahlung mit UV-Licht (365 nm Wellenlänge) bei 3 mW / m 2 für 5 min. Bereiten Sie eine Hydrogel-Lösung ohne Zellinhalt. Verwenden Sie diese Konstrukte als Negativkontrollen für die Zukunft biochemische und mechanische Prüfungen. Measure der Intensität der UV-Licht mit einer UV-Intensität Meter. So passen Intensität, ändern Sie den Abstand zwischen der UV-Lichtquelle und dem Hydrogel Gerüst während der Gelierung. HINWEIS: Da das Hydrogel CS wird die azelluläre Beitrag der biochemischen GAG-Gehalt der zellbeladenen Hydrogele abgezogen, um nur die Zell GAG darzustellen. </li><li> Verwenden Sie ein Skalpell, um den Film für leicht entfernen abgeschnitten und ziehen Sie sie vorsichtig. Mit Hilfe der zylindrischen Stangen, Push-out des Gels in einer 6-Well-Platte mit 5 ml sterilem DPBS abzuwaschen nicht polymerisierten Gel und lose Zellen. </li><li> Kultur die Zellbeladene Hydrogele in 24-Well-Platten mit 1,5 ml Knorpelzellwachstumsmedien in jedes Well. Verwenden Sie eine Einweg-Spatel, um die gewaschenen Hydrogele in den Brunnen zu übertragen. </li><li> Beurteilen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen durch Live tot-Färbung von 24 Stunden nach der Einkapselung mit einem Lebensfähigkeit / Zytotoxizität Kit. Kultur die Zellbeladene Hydrogele und die leeren Hydrogele für 3-6 Wochen zu ändern, um frische Chondrozyten growth Medien alle 2 Tage vor der Ernte für Analysen. </li></ol> 4. RNA-Extraktion und Genexpressionsanalysen <ol><li> Die Medien sorgfältig absaugen und legte sterilem PBS 1X auf dem Cell-beladenen als auch die leeren Steuer Hydrogele. </li><li> Mit Hilfe eines sterilen Spatels Übertragung jedes Hydrogel in ein sauberes 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen und füge 250 ul Tri-Reagenz in jedes Röhrchen. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers, um RNA zu isolieren. </li><li> Nach RNA-Isolierung und Quantifizierung Verwendung 1 ug es von jeder Probe und führen Sie eine umgekehrte Transkription in cDNA unter Verwendung des High Capacity cDNA umge Transcription Kit. </li><li> Für die quantitative PCR verwenden TaqMan Gene Expression Arrays zur Untersuchung der Expression von Ihren Genen von Interesse. Normalisieren die Genexpression intern auf GAPDH. </li><li> Für die PCR-Bedingungen sind eine 2-minütige Inkubation bei 50 ° C zur vorherigen Amplicons mit Uracil-DNA-Glycosylase inaktivieren, gefolgt von einer 1060; min Inkubation bei 95 ° C, um die Taq-Polymerase zu aktivieren. Führen dann vierzig Zyklen PCR, bestehend aus 15 Sekunden bei 95 ° C und 1 min bei 60 ° C. </li></ol> 5. Biochemische Analysen <ol><li> Für jede Zelle-Hydrogel-Konstrukte zu quantifizieren DNA und sulfatiertes Glykosaminoglykan (SGAG) Produktion wie folgt. </li><li> Die Medien sorgfältig absaugen und legte sterilem PBS 1X auf dem Cell-beladenen als auch die leeren Steuer Hydrogele. Wiegen Sie eine leere Hülse und legte das Hydrogel im Inneren nach dem Blotten auf Tissue-Papier und das Gewicht aufgezeichnet oder Nassgewicht der Hydrogele. </li><li> Gefriert jedes Hydrogel bei -20 ° C in einem getrennten 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen zur enzymatischen Verdauung und späteren Verwendung ein Aliquot der verdauten Produkt Picogreen Assay (für DNA) und Dimethyl-Methylenblau-Test (GAG) laufen. </li><li> Bereiten Sie die papainase Lösung für die enzymatische Verdauung der Hydrogele. <ol><li> Bereiten Sie zuerst die PBE-Puffer durch Auswiegen 7,1 g Natrium-phosphate zweibasigen (Na 2 HPO 4) und 1,6 g Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz (EDTA-Na 2). Lösen sich in 500 ml dH 2 O, der pH-Wert auf 6,5 eingestellt und filtriert die gereinigte Lösung durch ein 0,22-mm-Filter. </li><li> Aufzulösen 0,035 g L-Cystein in 20 ml PBE Puffer. Die Lösung wird filtriert, und 100 ul steriles Enzym Papain. </li></ol></li><li> Wenn Sie bereit sind, um die Tests durchzuführen, nehmen Sie die Schläuche von -20 ° C und 300 ul der bereit Papain Lösung der eingefrorenen Hydrogele. Crush das Gel mit einem Mörser und Stößel und mischen Sie es gut mit dem Motor Stößel. </li><li> Bringen Sie das Volumen auf 500 ul mit zusätzlichen Papain-Lösung. Führen Sie das gleiche Verfahren für die Steuer Gele. Inkubieren bei 60ºC für 16 Stunden 3,9. Die Lösung, die verdaut Hydrogel kann daher für die DNA- und GAG Quantifizierung verwendet. Messen Sie den DNA-Gehalt unter Verwendung des Picogreen Assay mit Lambda-Phagen-DNA als Standard folgende Hersteller protocol. </li><li> Quantifizierung der sulfatierten-GAG-Gehalt unter Verwendung des 1,9-Dimethylmethylen blau (DMMB) Farbstoffbindungsassay mit Hai Chondroitinsulfat als Standard 10. Bestimmen Sie die GAG-Gehalt durch Division der Menge an GAG für den entsprechenden Nassgewicht. </li></ol> 6. Mechanische Prüfung <ol><li> Führen einaxialen Druckversuche unter Verwendung eines Instron 5944-Testsystem mit einem 10 N Wägezelle ausgestattet. <ol><li> Nach der gewünschten Tagen der in vitro-Kultur, führen Sie den Druckversuch auf dem Cell-Hydrogel-Gerüst und die azellulären Steuer Hydrogele. </li><li> Tauchen Sie die Proben in einem PBS-Bad bei RT und Komprimieren in einer Rate von 1% Dehnung / sec zu einer maximalen Dehnung von 15% 11,12 da die physiologische Belastung von Knorpelgewebe unter Beladungszustand erfahren hat, wurde berichtet, dass 10-20% betragen 13,14. </li></ol></li><li> Erstellen Sie Stress gegen Dehnungskurven und Kurvenanpassung mit einem Polynom dritter Ordnung Gleichung. Bestimmen Sie die comprEssiv Tangentenmodul aus der Kurvengleichung bei Dehnungswerte von 15%. </li></ol>

<ol><li>Roberts, S., Menage, J., Sandell, L. J., Evans, E. H., Richardson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+study+of+collagen+types+I+and+II+and+procollagen+IIA+in+human+cartilage+repair+tissue+following+autologous+chondrocyte+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Knee%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical study of collagen types I and II and procollagen IIA in human cartilage repair tissue following autologous chondrocyte implantation.</a> Knee. 16, 398-404 (2009).</li>
<li>Smeriglio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Potential+of+Juvenile+and+Adult+Human+Articular+Chondrocytes+for+Cartilage+Tissue+Formation+in+Three-Dimensional+Biomimetic+Hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Comparative Potential of Juvenile and Adult Human Articular Chondrocytes for Cartilage Tissue Formation in Three-Dimensional Biomimetic Hydrogels.</a> Tissue engineering. Part A. , (2014).</li>
<li>Lai, J. H., Kajiyama, G., Smith, R. L., Maloney, W., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+catalyze+cartilage+formation+by+neonatal+articular+chondrocytes+in+3D+biomimetic+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Stem cells catalyze cartilage formation by neonatal articular chondrocytes in 3D biomimetic hydrogels.</a> Scientific reports. 3, 3553(2013).</li>
<li>Taipale, J., Keski-Oja, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factors+in+the+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+journal+%3A+official+publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Growth factors in the extracellular matrix.</a> FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 11, 51-59 (1997).</li>
<li>Varghese, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondroitin+sulfate+based+niches+for+chondrogenic+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">Chondroitin sulfate based niches for chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Matrix Biol. 27, 12-21 (2008).</li>
<li>Park, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+matrix+stiffness+on+the+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells+in+response+to+TGF-beta%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of matrix stiffness on the differentiation of mesenchymal stem cells in response to TGF-beta.</a> Biomaterials. 32, 3921-3930 (2011).</li>
<li>Wang, T., Lai, J. H., Han, L. H., Tong, X., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenic+Differentiation+of+Adipose-Derived+Stromal+Cells+in+Combinatorial+Hydrogels+Containing+Cartilage+Matrix+Proteins+with+Decoupled+Mechanical+Stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Chondrogenic Differentiation of Adipose-Derived Stromal Cells in Combinatorial Hydrogels Containing Cartilage Matrix Proteins with Decoupled Mechanical Stiffness.</a> Tissue engineering. Part A. , (2014).</li>
<li>Smith, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+intermittent+hydrostatic+pressure+and+BMP-2+on+osteoarthritic+human+chondrocyte+metabolism+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of intermittent hydrostatic pressure and BMP-2 on osteoarthritic human chondrocyte metabolism in vitro.</a> J Orthop Res. 29, 361-368 (2011).</li>
<li>Buschmann, M. D., Gluzband, Y. A., Grodzinsky, A. J., Kimura, J. H., Hunziker, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrocytes+in+agarose+culture+synthesize+a+mechanically+functional+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Chondrocytes in agarose culture synthesize a mechanically functional extracellular matrix.</a> J Orthop Res. 10, 745-758 (1992).</li>
<li>Farndale, R. W., Buttle, D. J., Barrett, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+quantitation+and+discrimination+of+sulphated+glycosaminoglycans+by+use+of+dimethylmethylene+blue%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Improved quantitation and discrimination of sulphated glycosaminoglycans by use of dimethylmethylene blue.</a> Biochim Biophys Acta. 883, 173-177 (1986).</li>
<li>Lai, J. H., Levenston, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meniscus+and+cartilage+exhibit+distinct+intra-tissue+strain+distributions+under+unconfined+compression%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+cartilage+%2F+OARS%2C+Osteoarthritis+Research+Society%22%5BJournal%5D)">Meniscus and cartilage exhibit distinct intra-tissue strain distributions under unconfined compression.</a> Osteoarthritis and cartilage / OARS, Osteoarthritis Research Society. 18, 1291-1299 (2010).</li>
<li>Li, L. P., Buschmann, M. D., Shirazi-Adl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-rate+dependent+stiffness+of+articular+cartilage+in+unconfined+compression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomechanical+engineering%22%5BJournal%5D)">Strain-rate dependent stiffness of articular cartilage in unconfined compression.</a> Journal of biomechanical engineering. 125, 161-168 (2003).</li>
<li>Armstrong, C. G., Bahrani, A. S., Gardner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+measurement+of+articular+cartilage+deformations+in+the+intact+human+hip+joint+under+load%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+bone+and+joint+surgery.+American%22%5BJournal%5D)">In vitro measurement of articular cartilage deformations in the intact human hip joint under load.</a> The Journal of bone and joint surgery. American. 61, 744-755 (1979).</li>
<li>Macirowski, T., Tepic, S., Mann, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartilage+stresses+in+the+human+hip+joint%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomechanical+engineering%22%5BJournal%5D)">Cartilage stresses in the human hip joint.</a> Journal of biomechanical engineering. 116, 10-18 (1994).</li>
<li>Benya, P. D., Shaffer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dedifferentiated+chondrocytes+reexpress+the+differentiated+collagen+phenotype+when+cultured+in+agarose+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dedifferentiated chondrocytes reexpress the differentiated collagen phenotype when cultured in agarose gels.</a> Cell. 30, 215-224 (1982).</li>
<li>Buckwalter, J. A., Mankin, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Articular+cartilage%3A+tissue+design+and+chondrocyte-matrix+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Instructional+course+lectures%22%5BJournal%5D)">Articular cartilage: tissue design and chondrocyte-matrix interactions.</a> Instructional course lectures. 47, 477-486 (1998).</li>
<li>Wang, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+chondroitin+sulphate+for+cartilage+tissue-biomaterial+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Multifunctional chondroitin sulphate for cartilage tissue-biomaterial integration.</a> Nat Mater. 6, 385-392 (2007).</li>
<li>Simson, J. A., Strehin, I. A., Allen, B. W., Elisseeff, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bonding+and+fusion+of+meniscus+fibrocartilage+using+a+novel+chondroitin+sulfate+bone+marrow+tissue+adhesive%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Bonding and fusion of meniscus fibrocartilage using a novel chondroitin sulfate bone marrow tissue adhesive.</a> Tissue engineering. Part A. 19, 1843-1851 (2013).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Wie in diesem Protokoll angegeben, sind 3D-Hydrogele in der Lage, von Chondrozyten Phänotyp in Kultur zu halten, die Vermeidung der Prozess der Zell Entdifferenzierung in Faserknorpel-Zellen in der Regel mit Monolayer-Kulturen 15 angetroffen. Außerdem Langzeitkulturen der chondrocytes- Hydrogel Konstrukt zeigte eine günstige Umgebung, die die innere Zellfunktionen mit dem Alter und Erkrankung assoziiert beibehält. Die Verwendung eines 3D biomimetischen Hydrogel hat mehrere Vorteile. Erstens ist die Aufnahme von Chondroitinsulfat (CS), eine wichtige Komponente im Gelenkknorpel gefunden, aktivieren Zellen, um die Hydrogelmatrix durch Sekretion von Chondroitinase abbauen und legte sich neu synthetisierte Knorpelextrazellulären Matrix 5, 16. Darüber hinaus CS hat sich gezeigt, In den entzündungshemmenden Eigenschaften im arthritischen Gelenk haben. Die biomimetischen Hydrogel kann auch als Gerüstmaterial für Zellabgabe bei der Knorpelreparatur verwendet werden, und können chemisch modifiziert seinum bessere Gewebe-Biomaterial Integration 17,18 zu erleichtern. Die Verwendung der PEG-CS Hydrogele ermöglicht Langzeitkulturen von Chondrozyten und die Bewertung der biochemischen und mechanischen Eigenschaften. Hier zeigen wir, wie diese Plattform kann nützlich für die vergleichende Analysen der verschiedenen Quellen von differenzierten Chondrozyten, um die optimale Zelltyp für die Knorpeltechnik zu definieren. Interessant ist, dass Chondrozyten in Hydrogele gekapselt lebensfähig bleiben und sich vermehren nach ihrem inneren Fähigkeiten. Hydrogelzusammensetzung Träger, in der Tat, das Wachstum von gesunden jugendlichen und erwachsenen Chondrozyten, wie in Abbildung 2 dargestellt. Die Zusammensetzung und Struktur der beschriebenen Hydrogele fördert auch die Knorpelgewebebildung, wie durch die Abscheidung einer funktionelle extrazelluläre Matrix durch Glycosaminoglycan beurteilt (GAG deutet ) Quantifizierung. Ein zusätzlicher Vorteil ist, dass die Chondrozyten-Hydrogel-Konstruktekönnen für die mechanischen Eigenschaften des neu gebildeten Knorpelgewebe zu bewerten. Beachten Sie, dass der einaxialen Drucktest sollte auf der azellulären Hydrogel zum Vergleich durchgeführt werden. Die Hydrogele in der Tat, eine Eigensteifigkeit auf Grund der Steifigkeit der CS-Einheiten. Einaxialen Druckverformung von 5-20% (bei ​​einer Verformungsgeschwindigkeit 1% / s) kann für die mechanische Prüfung von Knorpelgewebe 11,12, da die physiologische Belastung von Knorpelgewebe unter Beladungszustand erlebt anzuwenden wurde berichtet, dass 10 bis 20 sein 13,14%. Die Reaktion der beiden Zellbeladenen und azellulären Hydrogele mechanische Prüfung wurde bei der Kultur Endpunkt ausgewertet. In dem beschriebenen Beispiel über beobachteten wir eine vergleichbare Steifigkeit der Konstrukte, die bei Erwachsenen und Jugendlichen Chondrozyten in Gegensatz zu der geringeren Steifigkeit der Konstrukte enthaltenden OA Chondrozyten. Solche mechanischen Eigenschaften der zell Hydrogel Konstrukt erlauben die Beurteilung der funktionellen Eigenschaften desgebildete Gewebe geben eine eingehende Analyse der Zellreifung Fähigkeit. Abschließend kann die Verwendung der 3D biomimetischen Hydrogele, um das Potential verschiedener Chondrozytenpopulation studieren, um Knorpelgewebe erzeugen weithin angewandt werden. Neben den hier beschriebenen in vitro-Studien können in vivo Transplantation der Zellen beladene Konstrukten vorgesehen, um die Zellreifung und Regenerationspotential im physiologischen Bereich zu untersuchen. Weitere Modifikationen des Hydrogels Plattform mit zusätzlichen biomimetischen Faktoren können ebenfalls in Betracht gezogen werden, um Chondrozytenproliferation und Reifung zu optimieren.

Mit seinem begrenzten Selbstreparaturpotenzial erleidet der menschliche Gelenkknorpel häufig irreversible Schäden. Umfangreiche Anstrengungen konzentrieren sich derzeit auf die Entwicklung effizienter zellbasierter Ansätze zur Behandlung von Gelenkknorpelverletzungen. Der Erfolg dieser zellbasierten Therapien hängt in hohem Maße von der Auswahl einer optimalen Zellquelle und dem Erhalt ihres regenerativen Potenzials ab. Chondrozyten sind eine häufige Zellquelle für die Knorpelreparatur, aber sie sind nur begrenzt verfügbar und können sich während der In-vitro-Expansion in 2D-Monolayer-Kulturen dedifferenzieren, wodurch die Bildung von hyalinen Knorpeln eingeschränkt wird 1. 
Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine 3-dimensionale Hydrogel-Plattform für eine vergleichende In-vitro-Studie von menschlichen Chondrozyten unterschiedlichen Alters und Krankheitszustands zu etablieren. Im Gegensatz zu herkömmlichen zweidimensionalen (2D) Kulturen ermöglichen dreidimensionale (3D) Hydrogele den Chondrozyten, ihre Morphologie und ihren Phänotyp beizubehalten, und bieten eine physiologisch relevante Umgebung, die es Chondrozyten ermöglicht, Knorpelgewebe zu produzieren 2,3. Hydrogele bieten nicht nur eine physikalische 3D-Struktur für die Chondrozytenkultur, sondern ahmen auch die Funktion der extrazellulären Knorpelmatrix (ECM) des nativen Knorpels nach. Insbesondere stellt der Einschluss von Chondroitinsulfatmethacrylat ein potenzielles Reservoir für sekretierte parakrine Faktoren dar 4 und ermöglicht einen zellvermittelten Abbau und Matrixumsatz 5. Obwohl viele 3D-Hydrogel-Kultursysteme in verschiedenen Studien weit verbreitet waren, einschließlich Agarose- und Alginat-Gelen, haben wir ein biomimetisches 3D-Kultursystem verwendet, das einige deutliche Vorteile für die Chondrozytenkultur bietet. Chondroitinsulfat (CS) ist ein reichlich vorhandener Bestandteil im Gelenkknorpel, und es wurde gezeigt, dass die PEG-CS-Hydrogele den chondrogenen Phänotyp erhalten und sogar verbessern und den zellvermittelten Matrixabbau und -umsatz erleichtern 2,5. Darüber hinaus können die mechanischen Eigenschaften des Hydrogel-Gerüsts durch Änderung der Konzentration von PEG leicht moduliert werden und somit genutzt werden, um das Regenerationspotenzial von Chondrozyten oder einem verwandten Zelltyp weiter zu erhöhen 6,7. PEG/CSMA ist zudem biokompatibel und hat daher das Potenzial für eine direkte klinische Anwendung, z. B. bei Knorpeldefekten. Die Einschränkung für dieses System ist seine Komplexität und die Verwendung von Photopolymerisation, die möglicherweise die Lebensfähigkeit der Zellen im Vergleich zu einfacheren Systemen wie Agarose beeinträchtigen kann, jedoch überwiegen die Vorteile für die Chondrozytenkultur die potenziellen Einschränkungen.
Die 3D-Hydrogelkultur ist kompatibel mit herkömmlichen Assays zur Bewertung des Zellphänotyps (Genexpression, Proteinimmunfärbung) und des funktionellen Ergebnisses (Quantifizierung der Knorpelmatrixproduktion, mechanische Tests). Diese günstige 3D-Umgebung wurde getestet, um das Geweberegenerationspotenzial von menschlichen Chondrozyten aus drei verschiedenen Alterspopulationen in Langzeit-3D-Kulturen zu vergleichen. 
Die Ergebnisse wurden sowohl mit phänotypischen als auch mit funktionellen Assays bewertet. Juvenile, adulte und OA-Chondrozyten zeigten unterschiedliche Reaktionen in der biomimetischen 3D-Hydrogelkultur. Nach 3 und 6 Wochen war die chondrogene Genexpression in juvenilen und adulten Chondrozyten hochreguliert, während sie in OA-Chondrozyten herunterreguliert war. Die Ablagerung von Knorpelgewebekomponenten wie Aggrecan, Typ-II-Kollagen und Glykosaminoglykan (GAG) war bei juvenilen und adulten Chondrozyten hoch, nicht jedoch bei OA-Chondrozyten. Auch die Druckmodule der resultierenden Knorpelkonstrukte zeigten ähnliche Trends. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sowohl juvenile als auch adulte Chondrozyten bis zu 6 Wochen nach 3D-Kultur in Hydrogelen eine chondrogene und knorpelfarbene Matrixdisposition zeigten. Im Gegensatz dazu zeigten osteoarthritische Chondrozyten einen Verlust des Knorpelphänotyps und eine minimale Fähigkeit, robusten Knorpel zu bilden.

<table><tbody><tr><td>juvenile Chondrozyten (Klontics, Normales humanes Chondrozyten-Zellsystem)</td><td>Lonza</td><td>CC-2550</td><td></td></tr><tr><td>adulte Chondrozyten (Klontics: Normales humanes Chondrozyten-Zellsystem)</td><td>Lonza</td><td>CC-2550</td><td></td></tr><tr><td>Poly(ethylenglykoldiacrylat)</td><td>Laysan Bio</td><td>ACRL-PEG-ACRL-1000-1g</td><td></td></tr><tr><td>2-Morpholinethansulfonsäure</td>, <td>Sigma</td><td>M5287</td><td></td></tr><tr><td>Photoinitiator</td><td>Irgacure&nbsp;</td><td>2959</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Chondroitinsulfat-Natriumsalz&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C9819</td><td></td></tr><tr><td>N-Hydroxysuccinimid&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>130672</td><td></td></tr><tr><td>1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimidhydrochlorid</td><td>Sigma</td><td>E1769</td><td></td></tr><tr><td>2-aminoethylmethacrylat</td><td>Sigma</td><td>516155</td><td></td></tr><tr><td>Dialyseschläuche</td><td>Spectrum Laboratories&nbsp;</td><td>132700</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase 2</td><td>Worthington Biochemikalie</td><td></td><td></td>LS004177</tr><tr><td>Kollagenase 4</td><td>Worthington Biochemikalie&nbsp;</td><td></td><td></td>LS004189</tr><tr><td>DMEM/F12-Medien</td><td>HyClone, Thermo Scientific</td><td>SH3002301&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Lebend/Tot-Assay</td><td>Life Technologies</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/L3224">L3224</a></td><td></td></tr><tr><td>Tri-Reagenz</td><td>Life Technologies</td><td>AM9738</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/P11496">P11496</a></td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisch&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure Dinatriumsalz&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>L-Cystein</td><td>Sigma</td><td>C1276</td><td></td></tr><tr><td>1,9-Dimethylmethylen blau&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>341088</td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV-Lichtgeräte - XX-15LW Tischleuchte, 365 nm</td><td>UVP</td><td>95-0042-07</td><td></td></tr><tr><td>Instron 5944 Prüfsystem&nbsp;</td><td>Instron Corporation</td><td>E5940</td><td></td></tr></tbody></table>

3d-hydrogel scaffolds für articular chondrozyten-kultur und knorpel-generation

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

Menschlicher Gelenkknorpel ist sehr anfällig für Schäden und hat ein begrenztes Selbstreparatur- und Regenerationspotenzial. Zellbasierte Strategien zur Veränderung von Knorpelgewebe bieten eine vielversprechende Lösung zur Reparatur von Gelenkknorpel. Um die optimale Zellquelle für die Gewebereparatur auszuwählen, ist es wichtig, eine geeignete Kulturplattform zu entwickeln, um die biologischen und biomechanischen Unterschiede im Tissue-Engineering-Knorpel durch verschiedene Zellquellen systematisch zu untersuchen. Hier haben wir eine dreidimensionale (3D) biomimetische Hydrogel-Kulturplattform eingesetzt, um das Knorpelregenerationspotenzial von juvenilen, adulten und osteoarthritischen (OA) Chondrozyten systematisch zu untersuchen. Das biomimetische 3D-Hydrogel bestand aus der synthetischen Komponente Poly(ethylenglykol) und der bioaktiven Komponente Chondroitinsulfat, die eine physiologisch relevante Mikroumgebung für die In-vitro-Kultur von Chondrozyten bietet. Darüber hinaus kann das Gerüst möglicherweise für die Zellabgabe für die Knorpelreparatur in vivo verwendet werden. Knorpelgewebe, das im Gerüst hergestellt wird, kann durch quantitative Genexpression, Immunfluoreszenzfärbung, biochemische Assays und mechanische Tests bewertet werden. Anhand dieser Ergebnisse konnten wir das differentielle regenerative Potenzial von Chondrozyten unterschiedlichen Alters charakterisieren, sowohl auf der Ebene der Genexpression als auch in den biochemischen und biomechanischen Eigenschaften des manipulierten Knorpelgewebes. Das 3D-Kulturmodell könnte eingesetzt werden, um die molekularen und funktionellen Unterschiede zwischen Chondrozyten und Vorläuferzellen aus verschiedenen Stadien der normalen oder abweichenden Entwicklung zu untersuchen.

Bioaktive Hydrogele, die PEG und CS-Einheiten (Abbildung 1) stellen eine ideale Plattform für Kultur und Reifung von menschlichen Chondrozyten 2,3,5,7. Chondrozyten aus unterschiedlichem Alter und Krankheitszustände können mit dem beschriebenen Verfahren kultiviert und auf ihren Phänotyp, der Genexpression und biochemische und mechanische Eigenschaften des erzeugten Knorpelgewebe zu analysieren. Drei Chondrozyten-Proben, juvenile- 6 Monate, Erwachsenen- 34 Jahre und osteoarthritic- 74 Jahre, wurden nach 3 Wochen Kultur in 3D biomimetische Hydrogele geerntet. Genexpressionsanalysen der normalen Chondrozyten, sowohl jugendlichen und erwachsenen, zeigten einen Anstieg der Expression der Chondrozyten-Genen COL2A1 und Col6a1. Im Gegensatz dazu zeigten erkrankten Chondrozyten eine dramatische Abnahme der COL2A1, während die Expression von Col6a1 (Abbildung 2), die einen Verlust von chondrogenen Phänotyp, obwohl sie in einem günstigen biomimetischen Umgebung kultiviert. Die CS-PEG Hydrogele auch als ein dynamisches Umfeld für die Chondrozyten zur Proliferation zu dienen, verdauen die bereits bestehenden Matrix von PEG und CS und legen ihre perizellulären und der extrazellulären Matrix, die Hauptbestandteile des reifen Knorpelgewebe. Angesichts dieser Möglichkeiten, Chondrozyten Expansion nach 3 Wochen in vitro-Kultur kann durch Quantifizierung der DNA mit dem Picogreen Farbstoff geschätzt werden. Vergleichsanalyse der drei Gruppen von Zellen zeigen, dass die Zelldichte von jugendlichen und erwachsenen Bevölkerung war unverändert, während OA Chondrozyten zeigte einen dramatischen Abfall im Vergleich zu Tag 1 der Kultur. Ein Verlust von DNA-Gehalt wurde auch für OA, aber keine anderen Chondrozyten Eingabe mögliche Zelltod während der Langzeit-Kultur (Abbildung 3) beobachtet. Das sezernierte Matrix wurde als sulfatiertes GAG-Gehalt von DMMB Farbstoffbindungstest am Endpunkt Stufe nach 3 Wochen der Kulturen quantifiziert. GAG-Gehalt wird durch das Feuchtgewicht des Hydrogels als recor normalisiertded vor dem enzymatischen Abbau und dem azellulären Beitrag subtrahiert. Wie in 4 gezeigt, abgeschieden Chondrozyten eine ähnliche signifikante Menge an GAG während 3 Wochen Kultur in 3D Hydrogelen. Die Anwesenheit eines physikalischen Gerüst ermöglicht die Auswertung der biomechanischen Eigenschaften der Proben durch einaxialen Druckversuch 2,3. Während azellulären Hydrogele werden einer Abnahme der Druckmoduln gehalten zellbeladene Konstrukte die Druckmodule nach 3 Wochen in Kultur (Abbildung 4). Die phänotypische, hier beschriebenen biochemischen und biomechanischen Analysen sind daher nützlich für die Bewertung und das Verständnis des Potenzials der verschiedenen Knorpelzellpopulationen für Engineering Knorpel. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53085/53085fig1.jpg" /> Abbildung 1. PEG-CS biomimetische Hydrogele für 3D-Chondrozyten-cultur. Chondrozyten werden in einer Mischung, die Poly (ethylenglykoldiacrylat) (PEGDA) und Chondroitinsulfat-Methacrylat (CS-MA) und in die maßgeschneiderte zylindrischen Gelform gegossen resuspendiert. Nach der UV-Belichtung, verfestigte Gele werden aus den Formen gesammelt und die Lebensfähigkeit der Zellen wird durch Live-tot-Färbung von 24 Stunden nach der Einkapselung bewertet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53085/53085fig2.jpg" /> Abbildung 2. Die Expression von Genen chondrogene in humanen Chondrozyten in 3D biomimetische Hydrogele kultiviert. Quantitative Genexpressionsknorpelmarker COL2A1 und Col6a1 von jugendlichen, erwachsenen und OA Chondrozyten nach 3 Wochen der Kultur in 3D biomimetische Hydrogele. Werte werden auf Genexpressionsebene an Tag 1. Fehler b normiertars stellen Mittelwert ± Standardabweichung. p * &lt;0,05, wie durch einen zweiseitigen Student t-Test bestimmt. Geändert von Smeriglio et al. 2 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53085/53085fig3.jpg" /> Abbildung 3. DNA-Gehalt in humanen Chondrozyten in 3D biomimetische Hydrogele kultiviert. DNA-Quantifizierung durch Picogreen Assay in juvenile, Erwachsenen-und OA Chondrozyten nach 3 Wochen der Kultur in 3D biomimetische Hydrogele. Werte werden auf DNA-Ebene an Tag 1 normiert <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53085/53085fig4.jpg" /> &lt;br /&gt; Abbildung 4. GAG-Gehalt Messung und einaxialen Druckversuch der menschlichen Knorpelzellen an Tag 1 und nach 3 Wochen der Kultur in 3D biomimetische Hydrogele. (A) GAG Quantifizierung durch DMMB Assay in Chondrozyten an Tag 1 und nach 3 Wochen der Kultur in 3D biomimetische Hydrogele. Die Werte sind normiert auf Gewicht (ww) benetzen und ausgedrückt als &amp; mgr; g / g. (B) Druckmodul (kPa) von azellulären und zellbeladene Hydrogele am Tag 1 und nach 3 Wochen Kultur in 3D biomimetische Hydrogele. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um zu sehen eine größere Version dieser Figur.</a>

Die Knorpelreparatur stellt eine ungelöste medizinische Herausforderung dar und zellbasierte Ansätze zur Entwicklung von menschlichem Gelenkknorpel sind eine vielversprechende Lösung. Hier beschreiben wir dreidimensionale (3D) biomimetische Hydrogele als ideales Werkzeug für die Expansion und Reifung menschlicher Gelenkchondrozyten.

3D-Hydrogel Scaffolds für Articular Chondrozyten-Kultur und Knorpel-Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine 3D biomimetische Hydrogel-Kultur durchzuführen, um artikuläre Chondrozyten zu expandieren und menschlichen Gelenkknorpel zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst die aus einer totalen Knieendoprothese gewonnenen femoralen Kondylen präpariert, das Knorpelgewebe vom subchondralen Knochen entfernt und Chondrozyten durch enzymatische Dissoziation aus der extrazellulären Matrix isoliert werden. Der zweite Schritt besteht darin, Chondroitinsulfat-Methacrylat-Polymer für die Herstellung eines biomimetischen Hydrogels zu synthetisieren.Anschließend werden die Chondrozyten in dreidimensionale biomimetische Hydrogels eingekapselt, und die Konstrukte werden drei bis sechs Wochen lang in vitro kultiviert. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die mittels biochemischer und mechanischer Tests das Wachstum und die Reifung artikulärer Chondrozyten belegen. Der Hauptvorteil der Nutzung einer dreidimensionalen biometrischen Hydrogel-Plattform zur Kultivierung von Chondrozyten liegt darin, dass sie eine physiologisch relevante Mikroumgebung bereitstellt, da sie native Bestandteile des Knorpels integriert.Dies ist der Vorteil, dass Chondrozyten ihre Physiologie und ihr Phänotyp über einen längeren Zeitraum aufrechterhalten können. Die Einbindung eines bioaktiven Polymers, der Chondroitinoberfläche, in den dreidimensionalen Matic-Hydrogel ermöglicht chondrozytenvermittelte Metriken und einen Abbauumsatz. Darüber hinaus können die mechanischen und biochemischen Eigenschaften der Hydrogelmatrix leicht modifiziert werden.Diese Technik ist mit herkömmlichen Assays zur Beurteilung des Zellphänotyps und funktioneller Ergebnisse kompatibel. Sie kann verwendet werden, um chondrozytäre intrinsische Merkmale im Zusammenhang mit einem fortgeschrittenen Krankheitsstadium zu untersuchen und die Zellreifung sowie regenerativen Potenziale in einem physiologischen Kontext zu bewerten. Um zu beginnen, bereiten Sie das Dissoziationsmedium vor, indem Sie ein Teil Kollagenase zwei mit 125 Einheiten pro Milliliter mit ein Teil Kollagenase vier mit 160 Einheiten pro Milliliter in Choys Wachstumsmedium kombinieren, unter Verwendung frischen Knorpelgewebes, das typischerweise während einer totalen Kniegelenkprothese verworfen wird.Nehmen Sie ein steriles Skalpell und entnehmen Sie eine Biopsie von der glatten Oberfläche eines der femoralen Kondylen. Anschließend wird die Biopsie in dünne Scheiben rasiert. Geben Sie die Knorpelscheiben im Volumenverhältnis eins zu drei in das kombinierte Dissoziationsmedium und stellen Sie die Schale über Nacht bei 37 Grad Celsius, um am folgenden Tag die Chondrozyten aus der extrazellulären Matrix freizusetzen.Filtern Sie das verdauten Gewebe mit den dissoziierten Zellen durch ein Nylon-Mesh mit einer Porengröße von 70 Mikron. Waschen Sie die Zellen anschließend zweimal mit jeweils 20 Milliliter vorgewärmtem D-M-E-M-F 12-Medium und pelletieren Sie die Zellen bei 600 ×g für fünf Minuten. Zählen Sie danach die isolierten Chondrozyten auf einer Hämozytometerkammer.1 Million Zellen auf eine 60 Millimeter große Kulturschale geben und mit supplementiertem D-M-E-M-F 12 Medium bedecken. Die primären Choy-Kulturen als dichte Monoschicht gemäß den Standardkultivierungstechniken pflegen. Chondroitinsulfatmethacrylat herstellen, indem 1,952 Gramm 2-Morpholinoethansulfonsäure und 5,84 Gramm Natriumchlorid in 200 Milliliter entionisiertem Wasser gegeben und die Lösung vollständig aufgelöst werden lassen.Lösen Sie anschließend fünf Gramm Chondroitinsulfat-Natriumsalz in der gepufferten Lösung auf. Geben Sie dann 0,532 Gramm N-Hydroxy-CIN-Amid und 1,771 Gramm eines Ethyl-3-(3-dimethylamino-propyl)-carbodiimid-Hydrochlorids zur Lösung und rühren Sie fünf Minuten lang. Sobald dies aufgelöst ist, geben Sie 0,765 Gramm 2-Aminoethylmethacrylat zur Lösung und lassen die Reaktion 24 Stunden bei Raumtemperatur unter Aluminiumfolie abgedeckt andauern.Reinigen Sie das endgültige Gemisch durch Dialyse gegen entionisiertes Wasser über vier Tage unter Verwendung von Dialyseschläuchen mit einer Molekulargewichts-Cutoff von 12 bis 14 Kilodalton. Anschließend wird die gereinigte Lösung durch einen 0,22-Mikron-Filter filtriert und bei minus 20 Grad Celsius eingefroren. Stellen Sie die offenen Röhrchen, die die Lösung enthalten, in einen Trockner.Schützen Sie sie vor Licht, indem Sie sie mit Aluminiumfolie abdecken, und ziehen Sie über Nacht ein Vakuum an. Lagern Sie das gelöste Polymer bei minus 20 Grad Celsius in Falcon-Röhrchen, die am Tag vor der Zellverkapselung mit Parafilm und Folie umwickelt werden, um sie vor Licht und Feuchtigkeit zu schützen. Entfernen Sie das Kulturmedium von den kultivierten Zellen und bedecken Sie die Zellen mit einem Dissoziationsmedium. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius in der Kollagenase-Lösung. Autoklavieren Sie PCR-Folie und zylindrische Stäbe und sterilisieren Sie anschließend die selbstgefertigte zylindrische Gelform, indem Sie sie in 0,2 Mikrometer gefiltertes 70 % Ethanol geben, das über Nacht in einer Gewebekulturhaube unter UV-Licht steht. Am folgenden Tag nehmen Sie die Formen aus dem Ethanol heraus und lassen sie innerhalb der Gewebekulturhaube trocknen. Danach stellen Sie die Form in eine sterile 150 Millimeter Petrischale. Versiegeln Sie nach dem Trocknen die Unterseite der Formen mit der autoklavierten PCR-Folie.Vermeiden Sie Luftblasen oder Lücken, um Leckagen zu verhindern. Danach nehmen Sie einen 50-Milliliter-Becher und geben 10 % des hergestellten Chondroitinsulfat-Methacrylats, 10 % Polyethylenglykol-Diacryl und 5 % Gewicht pro Volumen hinzu. Photoinitiator in DPBS zu einer Endkonzentration von jeweils 3–5 % und 0,05 %.Schützen Sie das Röhrchen vor Licht und wirbeln Sie die Mischung kurzzeitig im Vortex. Sammeln Sie die dissoziierten Zellen in einem 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen und zählen Sie sie anschließend mit einem Hämozytometer. Pelletieren Sie die Zellen bei 460 × g für fünf Minuten und resuspendieren Sie sie in dem gemischten Gelmaterial mit einer Dichte von 15 Millionen Zellen pro Milliliter.Mischen Sie die Lösung 30-mal unter Vermeidung von Blasenbildung. Geben Sie anschließend 72 Mikroliter der Zellhydrogel-Suspension oder des Hydrogels allein in die zylindrische Gelform. Lassen Sie die Gelierung durch Bestrahlen der Gele mit UV-Licht von 365 Nanometer bei drei Milliwatt pro Quadratmeter für fünf Minuten eintreten.Wenn der Film erstarrt ist, schneiden Sie ihn mit einem Skalpell durch und entfernen Sie ihn vorsichtig. Mit Hilfe der zylindrischen Stäbe schieben Sie das Gel in eine 6-Loch-Platte mit fünf Milliliter sterilem DPBS, um verbliebenes, nicht polymerisiertes Gel und lose Zellen zu entfernen. Überführen Sie anschließend die gewaschenen Hydrogels in die Vertiefungen einer 24-Loch-Platte, die jeweils 1,5 Milliliter Chondra-Site-Wachstumsmedium enthalten.Die Hydrogele 37 Grad Celsius gut inkubieren und das Medium alle zwei Tage wechseln. Die Zellviabilität 24 Stunden nach der Einschließung mittels Live-Dead-Färbung unter Verwendung standardisierter Techniken beurteilen. Die zellbeladenen Hydrogele und die leeren Hydrogele drei bis sechs Wochen lang kultivieren, bevor sie geerntet und analysiert werden. Nach der gewünschten Anzahl von Tagen der In-vitro-Kultur die Proben aus dem Inkubator entnehmen, um den Kompressionstest an dem zellulären Hydrogelgerüst und den azellulären Kontrollhydrogelen durchzuführen.Platzieren Sie die Proben nacheinander bei Raumtemperatur in das mit einem mechanischen Prüfsystem verbundene PBS-Bad, das mit einer 10-Newton-Kraftmessdose ausgestattet ist, und komprimieren Sie sie mit einer Rate von 1 % Dehnung pro Sekunde bis zu einer maximalen Dehnung von 15 %. Zur Analyse der mechanischen Tests erstellen Sie Spannungs-Dehnungs-Kurven für jede Probe und führen eine Kurvenanpassung durch. Mithilfe einer Polynomgleichung dritten Grades bestimmen Sie das Druck-Tangentenmodul aus der Gleichung der angepassten Kurve bei Dehnungswerten von 15 % nach dreiwöchiger Kultur. Bei der Genexpressionsanalyse normaler Chondrozyten, sowohl juveniler als auch adulten, in 3D-biomimetischen Hydrogelen zeigte sich eine Zunahme der Expression der Chondrozytengene Kollagen zwei A eins und Kollagen sechs A eins. Im Gegensatz dazu zeigten erkrankte Chondrozyten eine dramatische Abnahme von Kollagen zwei A eins, während die Expression von Kollagen sechs A eins aufrechterhalten blieb, was einen Verlust des chondrozytären Phänotyps anzeigt, obwohl sie in einer günstigen biomimetischen Umgebung kultiviert wurden.Die Chondrozytenvermehrung nach dreiwöchiger Kultur kann durch die Quantifizierung der DNA mit dem Pico-Green-Farbstoff abgeschätzt werden. Die vergleichende Analyse der drei Zellgruppen zeigt, dass die Zelldichte der juvenile und adulten Populationen unverändert blieb, während osteoarthritische Chondrozyten im Vergleich zum ersten Kulturtag einen dramatischen Rückgang aufwiesen. Die sezernierte Chondrozytenmatrix wurde nach dreiwöchiger Kultur als Gehalt an sulfatierten GAGs quantifiziert.Wie hier gezeigt, lagerten die Chondrozyten während dreier Kultivierungswochen eine beträchtliche Menge an GAG ab, was zu den verbesserten mechanischen Eigenschaften der zellbeladenen Hydrogelen im Vergleich zu Kontrollen beigetragen haben könnte. Neben der Anwendung dieses Verfahrens für Einzelstudien kann das dreidimensionale biomimetische Hydrogel-Kultivierungsmodell problemlos auf ein Modell eines vollständigen Knorpeldefekts übertragen werden, um funktionelle und biochemische Ergebnisse bei der Langzeitregeneration von Gelenkknorpel zu charakterisieren. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man humane Chondrozyten aus Gelenkkniepräparaten isoliert und dreidimensionale Hydrogel-Scaffolds für die Langzeitkultur von Knorpel und die Erzeugung von Knorpeltransplantaten herstellt. Die Nutzung der 3D-OME-Hydrogels ermöglicht es uns und anderen Forschern, das chondrogene Potenzial verschiedener reifer Chondrozytenpopulationen sowie neuartiger Stamm- und Vorläuferzellpopulationen zu vergleichen.In Zukunft können diese Techniken erweitert werden, um zusätzliche mimetische Faktoren einzubeziehen, um ein optimales Gerüst zu entwickeln, das für die Regeneration und Reparatur von Knorpel verwendet werden kann.

3d-hydrogel-scaffolds-for-articular-chondrocyte-culture-cartilage

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Ein 3D-System zur Kultivierung menschlichen Chondrozyten in ein hohes Maß an Gelenkflüssigkeit beschrieben. Synovialflüssigkeit spiegelt den natürlichen Mikroumgebung für Gelenkknorpel, und kann leicht erreicht werden und gespeichert werden. Dieses System kann daher für die Untersuchung Knorpelregeneration und zum Screening von Therapeutika zur Behandlung von Arthritis verwendet werden.

Ein 3D-System für Züchtung menschlichen Chondrozyten in der Synovialflüssigkeit

Die Biosynthese von knorpeligen extrazellulären Matrix durch Chondrocyten können durch Einwirkung mechanischer Reize beeinflußt werden. Diese Methode beschreibt die Technik der Anwendung dynamisch Druckspannungen zu Chondrozyten in 3D-Konstrukte und die Auswertung der induzierten Veränderungen in Chondrozytenmetabolismus verkapselt.

Mechanische Stimulation der Chondrozyten-Agarose Hydrogele

Ein bioprinter wurde verwendet, um strukturierte Hydrogele auf einem Opfer-Form zu erstellen. Das Poloxamer Form wurde mit einem zweiten Hydrogel verfüllt und dann eluiert, so dass Hohlräume, die mit einem dritten Hydrogel gefüllt wurden. Diese Methode verwendet schnelle Elution und gute Bedruckbarkeit von Poloxamers zu komplexen Architekturen aus Biopolymeren zu generieren.

Drucken Thermoresponsive Reverse-Formen für die Erstellung von Gemusterte Zweikomponenten-Hydrogele für 3D Zellkultur

Die in diesem Beitrag beschriebenen Methoden zeigen, wie ein Handels Tintenstrahldrucker in eine Bioprinter mit gleichzeitiger UV-Polymerisation zu konvertieren. Der Drucker ist in der Lage, 3D-Konstruktion von Gewebestruktur mit Zellen und Biomaterialien. Die Studie zeigte hier konstruierte eine 3D neocartilage.

Menschliches Knorpelgewebe Herstellung unter Verwendung von dreidimensionalen Inkjet-Drucktechnologie

Die Entwicklung und Analyse von tragenden Geweben mit heterogenen Zellpopulationen ist immer noch eine Herausforderung. Hier beschreiben wir eine Methode zur Herstellung von zweischichtigen Alginat-Hydrogel-Scheiben als Plattform für die Co-Kultur verschiedener Zellpopulationen innerhalb eines Konstrukts.

Layered Alginate Konstrukten: Eine Plattform für Co-Kultur von heterogenen Zellpopulationen

Chondrogenese aus Stammzellen erfordert Feinabstimmung der Kulturbedingungen. Hier präsentieren wir einen magnetischen Ansatz für Zellen Kondensation, ein wesentlicher Schritt Chondrogenese zu initiieren. Darüber hinaus zeigen wir, dass dynamische Reifung in einem Bioreaktor mechanische Stimulation auf die Zellkonstrukte und verbessert knorpelige extrazelluläre Matrixproduktion gilt.

3D Magnetic Stem Cell Aggregation und Bioreactor Ausreifung für Knorpelregeneration

Hier beschreiben wir eine einfache Zubereitung von Chitosan-basierten injizierbaren Hydrogele mit dynamischen Imin Chemie. Methoden der Hydrogel mechanische Festigkeit und seine Anwendung in 3D Zellkultur anpassen werden vorgestellt.

Vorbereitung der Chitosan-basierten injizierbaren Hydrogele und deren Anwendung in 3D Zellkultur

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur 3D-Kultur-Systeme selbst Montage Peptid Gerüste zur Förderung der Differenzierung der entdifferenzierten menschlichen Gelenkknorpel Chondrozyten Knorpel-ähnliches Gewebe zu erhalten.

Kultivierung von Säugerzellen in dreidimensionale Peptid Gerüste

Wir stellen detaillierte Methoden zur Generierung von vier Gewebetypen aus humanen mesenchymalen Stammzellen vor, die zur Rekapitulation von Knorpel, Knochen, Fettpolster und Synovia im menschlichen Kniegelenk verwendet werden. Diese vier Gewebe werden in einen maßgeschneiderten Bioreaktor integriert und durch Mikrofluidik miteinander verbunden, so dass ein Kniegelenk-on-a-Chip entsteht.

Erstellung eines Kniegelenk-on-a-Chips zur Modellierung von Gelenkerkrankungen und zur Erprobung von Medikamenten

Die Knochentherapie über endochondrale Ossifikation durch Implantation von künstlichem Knorpelgewebe aus mesenchymalen Stammzellen hat das Potenzial, die Nachteile konventioneller Therapien zu umgehen. Hyaluronsäure-Hydrogele sind wirksam bei der Skalierung gleichmäßig differenzierter Knorpeltransplantate sowie bei der Schaffung von integriertem Knochen mit Vaskularisierung zwischen fusionierten Transplantaten in vivo.

Integrierte Knochenbildung durch in vivo ennochondrale Ossifikation mit mesenchymalen Stammzellen

Diese Studie beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von chondrozytären Sphäroiden, indem Zellen unter Verwendung der Schwerkraft unter Bedingungen mit geringer Adhäsion zu Sphäroiden aggregiert werden, gefolgt von der Kultivierung der resultierenden Sphäroide in Mini-Bioreaktoren.

Erzeugung von Sphäroiden aus verschiedenen Chondrozyten unter Verwendung von niedrigadhäsiven Bedingungen unter Schwerkraft und selbstgemachten Mini-Bioreaktoren

Erfahren Sie die 3D-Hydrogel-Kultur menschlicher Artikulärer Chondrozyten zur Knorpelregeneration. Diese Methode nutzt biomimetische Hydrogels zur Expansion und Reifung von Zellen für die Geweberegeneration.

3D-Hydrogel Scaffolds für Articular Chondrozyten-Kultur und Knorpel-Generation

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