Sandwichartigen Mikroumgebungen zu nutzen Handy / Material-Interaktionen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, sandwichartige Kulturen zusammenzusetzen, um das Zellverhalten in einer physiologisch relevanteren 3D-Umgebung zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst die ventralen und dorsalen Substrate mit Proteinen wie Fibronektin vorbereitet und beschichtet werden. Als nächstes werden die Zellen ähnlich wie in einer Standard-2D-Kultur platziert.

Dann wird das dorsale Substrat überlagert, so dass die Zellen ventral und dorsal stimuliert werden. Abschließend können Experimente wie z.B. ein Wundheilungsassay durchgeführt werden. Letztendlich werden sandwichartige Kulturen mit Verfahren analysiert, die bereits für Standard-2D-Kulturen entwickelt wurden, wie z. B. Live-Bildgebung, Immunfluoreszenz oder Zellextraktion.

Für weitere Analysen. Der Hauptvorteil dieser Kulturtechnik gegenüber bestehenden dreidimensionalen Systemen besteht darin, dass sie die Untersuchung verschiedener Parameter in materiellen Wechselwirkungen wie Topographie, Chemie, Steifigkeit und Proteingehalt sowohl an der ventralen als auch an der dorsalen Stelle ermöglicht, was ein hohes Maß an Vielseitigkeit bietet. Neben experimentellen Verfahren, die für einige dreidimensionale Systeme wie Lipin, Immunfluoreszenz und zelluläre Extraktionen behindert werden könnten, können leicht durchgeführt werden. Um einen flachen Film aus Polymilchsäure oder PLLA durch Lösungsmittelguss in einem Abzug herzustellen, fügen Sie zwei Gramm PLLA zu 100 Millilitern Chloroform hinzu und rühren Sie bei Raumtemperatur für etwa drei Stunden oder bis es vollständig aufgelöst ist.

Legen Sie die Unterlegscheiben aus Edelstahl auf eine Petrischale aus Glas. Geben Sie dann 200 Mikroliter der PLLA-Lösung in die Waschmaschinen. Decken Sie die Schüssel mit Alufolie mit ein paar Löchern ab und lassen Sie die PLLA 30 Minuten lang bei Raumtemperatur langsam verdampfen.

Erhitzen Sie die Proben anschließend fünf Minuten lang auf 120 Grad Celsius, um alle Spuren von Lösungsmittel zu verdampfen. Nachdem Sie die Proben etwa 30 Minuten lang bei Raumtemperatur abkühlen gelassen haben, verwenden Sie 18,2 Megaohm Zentimeter Wasser, um die Proben in der Schale abzudecken und acht Minuten lang bei Raumtemperatur zu inkubieren. Ziehe nach der Inkubation mit einer Rasierklinge die Unterlegscheiben von der Petrischale.

Entfernen Sie dann mit einer Pinzette alle Unvollkommenheiten am Rand der Waschmaschinen und lassen Sie die Proben an der Luft trocknen. Da PLLA durch Hydrolyse abgebaut werden kann, trocknen die Proben im Vakuum bis zum Tag der Experimente aus. Darüber hinaus können ELLA-Fasern gemäß dem Textprotokoll hergestellt und als dorsales Substrat unter einer sterilen Kulturhaube verwendet werden.

Geben Sie 20 Mikrogramm pro Milliliter FI-Nin in docos PBS oder DPBS mit Calcium und Magnesium zu den Proben und inkubieren Sie sie nach der Proteinbeschichtung eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Verwenden Sie DPBS, um die Proben zweimal zu waschen, und lagern Sie sie in DPBS mit P, Kalzium und Magnesium, bis sie gebrauchsfertig sind. Die nächsten Samenzellen auf dem Glas schieben sich und inkubieren Sie drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid, damit die Zellen am ventralen Substrat haften können. Übertragen Sie dann die Proben in neue Vertiefungen einer 12-Well-Platte.

Legen Sie mit einer Pinzette vorsichtig das dorsale Substrat auf die Zellen. Füge dann einen Milliliter Medium hinzu. Das Gewicht der Unterlegscheibe verhindert, dass das dorsale Substrat schwimmt.

Bringen Sie die Proben mit 5 % Kohlendioxid auf 37 Grad Celsius zurück und wechseln Sie das Medium zweimal pro Woche, um die Zellmigration innerhalb der sandwichartigen Kultur zu untersuchen. Nach der Beschichtung der ventralen und dorsalen Substrate mit Fibronektin, wie bereits gezeigt, gleiten die Samenzellen auf der Glasabdeckung mit hoher Dichte, inkubieren die Proben und lassen die Zellen konfluenz. Verwenden Sie anschließend eine Pipettenspitze, um die Zellmonoschicht zu kratzen, um zwei Zellpopulationen zu erzeugen, die durch einen Spalt getrennt sind.

Legen Sie das ventral sitzende Substrat in eine neue Vertiefung, die für die Zeitrafferaufnahme geeignet und groß genug ist, damit dorsale Substrate hineinpassen. Überlagern Sie dann mit einer Pinzette, wie zuvor gezeigt, das dorsale Substrat auf die Zellen und füllen Sie es mit Medium auf. Legen Sie die Probe unter ein Zeitraffermikroskop und nehmen Sie alle 20 Minuten Bilder des Lückenschlusses auf.

Nutzen Sie eine Software wie mito BO von Image J, um den Lückenschluss im Sandwich zu analysieren. Wie Kultur. Sulfat ist stark abhängig von der Zeit, zu der die dorsalen Rezeptoren stimuliert werden, und von den Eigenschaften der dorsalen Interaktion.

Ähnlich wie bei anderen 3D-Systemen, wie z. B. Hydrogelen, wie hier zu sehen, ermöglichen dorsale elektrogesponnene PLLA-Fasern die direkte Zellausrichtung, wenn sie mit Fibronektin beschichtet sind, aber nicht, wenn sie mit einem nicht-adhäsiven Protein wie BSA beschichtet sind. Zusätzlich lösten sandwichartige Kulturen mit einfacher dorsaler PLLA eine Erhöhung des Myogeneseniveaus mit C zwei C 12-Zellen aus. Dies hängt auch von den dorsalen biologischen Reizen ab.

Da die Interaktion mit verschiedenen dorsalen Proteinen zu unterschiedlichen Differenzierungsraten führt, wie in diesem Video gezeigt, nehmen Fibroblasten, die innerhalb der sandwichartigen Kultur in einem Wundheilungsassay wandern, eine längliche Morphologie an und wandern im Vergleich zu Zellen kürzere Distanzen. Kultiviert auf 2D-Substraten, ähnlich wie 3D-Fibronektin- und Kollagengele. Die Sandwich-ähnliche Kultivierung erhöht die zellvermittelte EZM-Reorganisation im Vergleich zu 2D-Bedingungen.

Dieser Prozess beruht auf den dorsalen mechanischen Reizen und der Stabilität des Zytoskeletts. Da die Verwendung von Kontraktilitätshemmern wie BLEs und Statin den Prozess behinderte S Okay, also sollten Sie nach dem Anschauen dieses Videos ein klares Verständnis davon haben, wie man sandwichartige Kulturen zusammenstellt. Diese Methode kann eine 3D-ähnliche Mikroumgebung für die Reaktion auf Medizin und Krebs entwickeln, einschließlich Anwendungen in Krankheitsmodellen, Entwicklungsstudien und Medikamententests.