Name: In-situ-Mapping der mechanischen Eigenschaften von Biofilmen durch Partikel-Tracking Mikrorheologie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie die viskoelastischen Eigenschaften von Bakterien-Biofilmen durch Partikel-Tracking-Mikrorheologie in situ messen. Diese zerstörungsfreie Methode ermöglicht die Analyse von Kriechverhalten und Matrixkomponenten.

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Diese Forschung wird von der National Research Foundation und Bildungsministerium Singapur unter seinem Forschungszentrum der Excellence-Programm unterstützt, das Start-up Grants (M4330002.C70) aus Nanyang Technological University und ACRF Tier 2 (MOE2014-T2-2-172) vom Ministerium für Bildung, Singapur. Die Autoren danken Joey Yam Kuok Hoong für die Teilnahme an der Demonstration dieses Protokolls.

1. Biofilm Anbau <ol><li> Zubereitung von Bakterienstämmen <ol><li> 1 Tag vor Biofilm Anbau, vorzubereiten planktonischen Bakterienkulturen durch Inokulation von 2 ml geeigneten Wachstumsmedium aus gefrorenem Bakterienkultur. Verwenden Luria-Broth-Medium (10 g L -1 NaCl, 10 g L -1 Hefeextrakt und 10 g L -1 Trypton) zum mucoid P. aeruginosa und dessen Δ pel und Δ psl Defektmutanten. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C und 200 rpm schütteln Bedingungen. Verdünnte-Nacht-Kulturen auf eine OD600 von 0,40 unter Verwendung eines Spektrophotometers. </li><li> Montieren Flusszelle Setup, die zuvor beschrieben worden, 14 hat, vorzugsweise auf einer Mobilstation oder Wagen, die in das Mikroskop Raum zur Abbildung des Flusszelle ohne Demontage gebracht werden kann. </li><li> Bereiten Sie sterile Wachstumsmedium in 2 l oder 5 l-Flaschen für jeden Durchflusszelle. Verwenden Minimalmedium M9 (48 mM Na 2 HPO 4, 22 mMKH 2 PO 4, 19 mM NH 4 Cl, 9 mM NaCl, 2 mM MgSO 4 und 0,1 mM CaCl 2) mit 0,04% Glucose (G / V) und 0,2% (G / V) Casaminosäuren) von P. ergänzt aeruginosa Flusszelle Biofilmen. </li><li> Aliquot fluoreszierende Mikrosphären in Mikrozentrifugenröhrchen und Spin-down in sterilem H 2 O für 5 min in Zentrifuge bei 9,391.2 g. Überstand abnehmen und resuspendieren in 1 ml Wachstumsmedium zu Natriumazid (Desinfektionsmittel) vor der Zugabe zum Kulturmedium in 2 L oder 5 L-Medium Flaschen zu entfernen. HINWEIS: Verschiedene Größen der Mikrokugeln in verschiedenen Konzentrationen und sollte entsprechend den Anweisungen verdünnt werden. Beispielsweise dispergieren 120 ul von 1,0 um Mikrokügelchen Durchmesser von 15 &amp; mgr; l von 0,5 um Mikrokügelchen Durchmesser und 0,96 &amp; mgr; l von 0,2 um Mikrokügelchen Durchmesser in 2 l Wachstumsmedium auf 2,18 × 10 6 ml -1 Mikrokügelchen für jede Partikelgröße zu ergeben. </li><li> Bringen Medium Flasche UpstRies Flusszelle und lassen Wachstumsmedium durch gesamte Setup. Gasaustritt stoppen und injizieren verdünnten Übernachtkulturen in Flusszelle Kammern. Dass Bakterien auf das Deckerde für 1 h vor dem kontinuierlichen Fluss von Wachstumsmedium bei einer Flussrate von etwa 5,5 x 10 -3 m sec -1 oder 8 min mit einer peristaltischen Pumpe zu befestigen. HINWEIS: Biofilme werden gewöhnlich bei Raumtemperatur (25 ° C) für 3-7 Tage gezüchtet. </li><li> Alternativ zur statischen Kultur Setup, verdünnte Übernachtkulturen 100-fach in Mikrozentrifugenröhrchen durch Zugabe von 10 ul der Übernachtkultur auf 1 ml Wachstumsmedium mit Partikeln. Erhöhung der Partikelkonzentration im Wachstumsmedium für die statische Anzucht von etwa 500-fache im Vergleich zu derjenigen für die Strömung von Biofilmen (zB waschen und resuspendieren, 600 &amp; mgr; l von 1,0 um Kugeln mit einem Durchmesser von 10 ml Wachstumsmedium), wie Durchflußzelle Biofilme ständig nachgefüllt Partikel, aber statischen Kulturen sind es nicht. <ol><li> In 2001; l des verdünnten Übernachtkultur mit Partikeln in die Kammern 8 und Folien. Inkubieren bei 37 ° C unter statischen Bedingungen. Biofilme sind in der Regel für 1 Tag gewachsen. Ersetzen Sie verbrauchte Nährmedium täglich mit frischem Wachstumsmedium mit Partikeln, wenn Biofilm ist für mehr als 1 Tag gewachsen. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Mikroskopie <ol><li> An Tag 3 und 5, schalten Sie Flow aus der Schlauchpumpe und bringen Flusszelle Setup in die Mikroskopie Raum. Clamp Schlauch nahe dem Eingang und Ausgang der Durchflusszelle Kammern Drift (eine systematische Fehlerursache durch Veränderungen in der Umwelt) vom Fluss zu verhindern. Setzen Sie die Durchflusszelle auf den Mikroskoptisch von einem aufrechten Mikroskop. HINWEIS: Verwenden Sie ein umgekehrtes Mikroskop zur Abbildung von Mikrovertiefungen. </li><li> Verwenden Fluoreszenzmikroskopie mit 40x Öl-Objektiv, um Videos von Mikrosphärenbewegung im Biofilm an verschiedenen Standorten (Mikrokolonien und Flach undifferenzierten Schichten) eingebettet und in unterschiedlichen Tagen (Tag 3 und 5), um zu nehmenzeitliche und räumliche Untersuchungen. Nehmen Sie kürzere Videos mit höheren Bildrate, um Ereignisse in kurzen Zeitskalen auftreten untersuchen (zB 1,5 bis 3 min Video Framerate von 25-50 Frames pro Sekunde für schnelle Dynamik) und längere Videos mit niedriger Bildrate, um Ereignisse über längere Zeit zu untersuchen Waagen (zB 15-30 min Video Bildrate von 2,5 bis 5 Bilder / s für langsamere Dynamik). HINWEIS: Ein Video enthält typischerweise 5-10 Partikel und ist in der Regel von 1,0 bis 2,5 GB in der Dateigröße. Größere Mikrokolonien können mehr Teilchen zu halten. Nehmen Sie 5-10 Videos für die einzelnen Kategorien (zB 5-10 Videos von verschiedenen Mikrokolonien und von verschiedenen Orten in flachen undifferenzierten Schichten). Der Biofilm hat eine heterogene Architektur, die von Mikrokolonien, Kanäle, Hohlräume und Flach undifferenzierten Schichten bestehen kann. </li><li> Speichern Sie Ihre Videos in geeigneten Format, das von Fiji / ImageJ gelesen werden können (zB CZI, tif). </li><li> Überprüfen Sie Videos für Drift durch Scrollen durch fertige video und der Beobachtung, dass die Partikel nicht in derselben Richtung gleichzeitig zu bewegen. Drift kann durch z-Tischbewegung, Ströme in der Strömungszelle, Ungleichgewicht der Antischwingungstisch, Luftdruck- oder Temperaturänderungen hervorgerufen werden. Correct kleinere treiben mit Post-Processing-Techniken in der Regel mit Mikroskop-Software zur Verfügung gestellt. Entsorgen Sie alle Videos, bei Drift kann nicht korrigiert werden. Nehmen Sie die folgenden Parameter, die während der Particle Tracking-Analyse erforderlich sind: Auflösung (Pixel / um), Anzahl der Frames, Dauer. </li><li> Entfernen Sie Durchflusszelle von Mikroskoptisch, und starten peristaltische Pumpe weiter Kultivieren des Biofilms. </li></ol> 3. Particle Tracking Analysis <ol><li> Erhalten Teilchenbahnen mit Hilfe des Plug-in-Trackmate in Open Source Software (ImageJ). Laden Fiji bei <a href="http://fiji.sc/Fiji">http://fiji.sc/Fiji.</a> Öffnen Sie das Video mit Fidschi und unter dem Plugins-Menü Verfolgung und Trackmate. </li><li> Prüfen oder Einstellungen anzupassen in thE-Fenster darauf hindeutet anfänglichen Kalibrierungseinstellungen, um die Videoparametern entsprechen, wie in Schritt 2.4 aufgezeichnet. </li><li> Detect Partikel in Trackmate mit ImageJ. <ol><li> Wählen Sie &#39;Log-Detektor &quot;, Eingangspartikeldurchmesser und Schwellenwert (zB 1000). Blättern Sie durch das Video, während Sie auf &#39;Vorschau&#39;, um zu überprüfen, dass die lila Kreise folgen Sie den Teilchen in der gesamten Video. Passen Sie die Werte Durchmesser und Schwellen wie nötig: Erhöhung des Schwellenwerts, wenn lila Kreise in den leeren Raum angezeigt. Reduzieren Sie den Schwellenwert, wenn nicht genug Partikel festgestellt werden. Klicken Sie auf Weiter, um den Nachweis führen Sie die Partikel. </li><li> Klicken Sie auf Weiter, wenn mit der Option präsentiert, um hinzuzufügen oder Partikel in &#39;Initial Schwellen&#39; erkannt zu entfernen, &#39;Wählen Sie eine Ansicht &quot;und&quot; Wählen Sie einen Filter &quot;Fenster, um ohne Einstellung fortzusetzen, wenn anfängliche Partikeldetektion war zufriedenstellend. </li><li> Wählen Sie &quot;Einfache LAP-Tracker&quot; in der optiauf Leiste &#39;Wählen Sie ein Tracker-Methode &quot;Fenster als Partikel nur selten aus der Schwerpunkt in den Biofilm zu bewegen und sind leicht verfolgt. Verwenden Sie die vorgeschlagenen oder niedrigen Verknüpfung und Lückenschließung max Abstandswerte, und klicken Sie auf Weiter. </li><li> Überprüfen Sie, dass Partikelverfolgung ist durch Scrollen durch das Video zu sehen, dass Partikel folgen Sie den von Trackmate gezogen Tracks, und dass es keine unerwünschten oder fehlende Tracks zufriedenstellend. Überspringen Sie die verschiedenen Filterschritte. Zum letzten Fenster &quot;Wählen Sie eine Aktion&quot;. Wählen Sie &quot;Export Tracks auf XML-Datei&quot; aus dem Dropdown-Menü aus und klicken Sie auf &quot;Ausführen&quot;. Wählen Sie einen Ordner, um die Titel zu speichern. HINWEIS: Es gibt verschiedene Programme zur Verfügung, in der Öffentlichkeit für die Analyse der Partikelbahnen und die Verwendung von Mikrorheologie. msdanalyzer und TrackArt sind Beispiele für Partikel-Tracking-Analyse-Programme, die in der Matlab-Umgebung ausgeführt werden. </li></ol></li><li> Bereiten Matlab, um die Partikelbahnen in den XML-Dateien, indem Sie im Menü des importierenMatlab Datei&gt; Pfad ... und fügen Sie die Skripts Ordner mit der Fidschi-Paket. </li><li> Um die Partikelbahnen mit msdanalyzer analysieren, laden Sie den Link auf die ZIP-Datei oder tar.gz-Datei at <a href="http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories">http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories</a> . <ol><li> Entpacken Sie diemsdanalyzer Ordner 15 und legen Sie sie in einem Ordner, auf die Matlab Pfad gehört (zB C: Dokumente und Einstellungen &lt;Benutzername&gt; Eigene Dateien Matlab). Starten Sie Matlab und initiieren den Analysator durch Eingabe von: ma = msdanalyzer (2, &#39;um&#39;, &#39;s&#39;) wo um und s sind die physikalischen Raum und Zeiteinheiten in dem Video. <ol><li> Importieren Sie die Teilchenbahnen durch Eingabe von: [Titel, md] = importTrackMateTracks (&#39;filename.xml&#39;, &#39;clipZ&#39;; &quot;SCALET &#39;) ma = ma.addAll (Tracks); wo &#39;clipZ&#39; entfernt die z-Dimension für ein 2D-Video und &#39;SCALET&#39;. </li><li> Zeichnen Sie die Trajektorien auf Graphen mit: ma.plotTracks; ma.labelPlotTracks; </li><li> Berechnen Sie die MSE der Partikel mit: ma = ma.computeMSD; ma.msd </li><li> Zeichnen Sie die Muskel- und Skeletterkrankungen jedes Teilchens: Abbildung ma.plotMSD </li><li> Kombinieren Teilchenbahnen von anderen Videos der gleichen categery (zB Partikel im Wildtyp-Mikrokolonien am Tag 3 embedded) durch Wiederholen 3.5.1.1 bis 3.5.1.4). </li><li> Zeichnen Sie die Ensemblemittel oder die Mittel über alle Kurven: ma.plotMeanMSD Ändern Sie den y- und x-Achse von linear zu logarithmisch. Bei langen Verzögerungszeiten, die MSD-Kurven werden durch unzureichende Statistiken auf längeren Zeitskalen laut. Die MSD-Kurven können auch stark ansteigen aufgrund dynamischer Fehler. Diese Bereiche der Kurve kann mit dem Pinsel-Werkzeug entfernt werdenum das Ende der Kurve auswählen und Auswahl von &#39;Bürsten&#39;&gt; &#39;entfernen Unbrushed&#39; im Menü Extras. </li></ol></li><li> Laden Sie Ezyfit bei <a href="http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/">http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/</a> und fügen Ezyfit in einen Ordner mit dem Matlab Pfad gehören (zB C: Dokumente und Einstellungen &lt;Benutzername&gt; Eigene Dateien Matlab). Installieren Sie die Ezyfit Menü, indem Sie in MATLAB-Workspace efmenu installieren. Starten Sie MATLAB mit Ezyfit Menü in der Abbildung Fenster. Montieren Sie die MSD-Kurven mit dem Potenzgesetz, indem Sie in der Ezyfit Menü &#39;Show Fit&#39;&gt; &#39;Power&#39;&gt; &#39;a * x ^ n&#39; waren n ist der geschätzte diffusive Exponenten α. HINWEIS: msdanalyzer bedarf der Curve Fitting Toolbox in Matlab für die Montage der MSD-Kurven. Ezyfit ist eine Alternative und kostenlose Software, die Kurvenanpassung durchführen. </li><li> Klar aktuellen Partikelbahnen und Muskel- und Skeletterkrankungen, neue Partikel Muskel- und Skeletterkrankungen an anderen Standorten oder Zeit zu berechnen: klar </li&gt; <li> Nach der Berechnung der verschiedenen mittleren MSD Kurven von Partikeln im Medium (Kontrolle) und Mikrokolonien und undifferenzierte Bereichen verschiedener Stämme, kopieren und fügen Sie die Kurven in einem Diagramm zum Vergleich. Probensteifigkeit und Vernetzungs Anstieg mit niedrigeren MSD-Werte. Flache Kurven unteren α und Proben elastischer als steilere Kurven mit höheren α. </li><li> Wählen Sie die Kurve und gehen Sie auf &quot;Extras&quot;, um auf die Daten Statistiken, wie der Median und Bereich zu suchen. Die MSD des Wulstes ist proportional der Kriechnachgiebigkeit J (t) des Materials, in welchem ​​der Wulst nach der Beziehung eingebettet <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/53093/53093eq1.jpg" /> wobei J = Kriechnachgiebigkeit, d = Teilchendurchmesser, k B = Boltzmann-Konstante, T = Temperatur und t = Zeit. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Mikrorheologie ist ein nützliches Instrument für die lokale rheologischen Messungen in heterogenen Systemen, wie mikrobielle Biofilmen. Es ist eine zerstörungsfreie Technik, so dass der Echtzeit-Überwachung der rheologischen Veränderungen innerhalb der gleichen biologischen Probe über mehrere Zeitpunkte. In diesem Protokoll wurde partikel Tracking Mikrorheologie um Pel und Psl Exopolysaccharid Mutanten in Reihenfolge angewendet, um zu untersuchen, wie sie die Elastizität und die effektive Vernetzung des Biofilmmatrix be...

Die meisten Bakterienzellen sind in der Lage, sowohl planktonischen (frei lebende) und oberflächengebundenen (sessile) Modi des Wachstum 1 einzusetzen. In der Oberfläche gebundenen Modus des Wachstums von Bakterienzellen zu sekretieren und umhüllen sich in großen Mengen von extrazellulären polymeren Substanzen (EPS), Biofilme bilden. Die EPS besteht hauptsächlich aus Proteinen, Exopolysaccharid, extrazelluläre DNA und ist wichtig, um die Biofilmbildung 2. Sie dient als physikalische Gerüst durch die Bakterien nutzen können, um räumlich unterscheiden und schützt die Bakterien vor schädlichen Umweltbedingungen und Wirtsreaktionen. Verschiedenen Bestandteile EPS haben verschiedene Rollen in der Biofilmbildung 3 und Veränderungen in der Expression von EPS Komponenten drastisch umzuBiofilmStrukturen 4. EPS-Komponenten können auch als Signalmoleküle 5 und neuere Studien hat bestimmte EPS wirkenden Komponenten mit mikrobiellen Zellen gezeigt, ihre Migration und Biofilm diff Führungserentiation 6-8. Forschung an der EPS hat stark erweiterte auf die morphologische Analysen von Biofilmen von Mutanten in einer bestimmten Komponente der EPS 9,10 defekte produziert basiert. Darüber hinaus wird die EPS üblicherweise am Makromaßstab (bulk Charakterisierung) 11 gekennzeichnet. Morphologische Analyse kann jedoch quantitative Detail und Groß Charakterisierung, die Durchschnittswerte zurückkehrt, verliert den Details, die in der Heterogenität des Biofilms besteht fehlt. Es gibt nun eine steigende Tendenz auf Echtzeit-Charakterisierung der mechanischen Eigenschaften von EPS im Mikromaßstab fortschreiten. Dieses Protokoll zeigt, wie partikel Tracking Mikrorheologie Lage ist, die Raumzeit-Wirkungen von Matrixkomponenten Pel und Psl Exopolysaccharide an die Viskoelastizität und eine effektive Vernetzung von Pseudomonas aeruginosa Biofilm 4 bestimmen. Passive Mikrorheologie ist eine einfache und kostengünstige rheology Methode, die den höchsten Durchsatz räumlicher microrheological Abtastung eines Materials Datum 12,13 bildet. In passiven Mikrorheologie werden Sonden Kugeln in der Probe platziert und deren Brownsche Bewegung, die durch thermische Energie (k B T) angetrieben wird durch Videomikroskopie verfolgt. Mehrere Teilchen gleichzeitig verfolgt werden, und die zeitabhängigen Koordinaten der Partikel folgen einer herkömmlichen Zufallsbewegung. Im Mittel also, bleiben die Teilchen an der gleichen Position. Ist die Standardabweichung der Verschiebungen oder der mittlere quadratische Verschiebung jedoch (MSD) der Partikel, nicht Null ist. Seit viskosen Flüssigkeiten fließen, die Partikel MSD in einem viskosen Fluid wächst linear fortschreitender Zeit. Im Gegensatz dazu ist das polymere Vernetzung in viskoelastischen gefunden oder elastische Stoffe helfen ihnen, Strömung zu widerstehen, und Partikel werden in ihrer begrenzten Verschiebung, was zu Hochebenen in der MSD-Kurve (Abbildung 1A). Diese Beobachtung folgt die Beziehung MSDαt <sbis&gt; α, wobei α die diffusive Exponenten zusammenhängt Verhältnis der elastischen und viskosen Beitrag der Substanz. Für Teilchen, die sich in viskosen Fluiden α = 1, viskoelastischen Stoffen 0 &lt;α &lt;1 ist, und in elastischen Stoffen α = 0. Der MSD können auch verwendet werden, um die Zeitstand, welche die Neigung des Materials zum permanent über verformen berechnen Zeit und schätzt, wie leicht ein Material ausbreitet. Die Grße, Dichte und Oberflächenchemie der Partikel sind für die korrekte Anwendung der microrheological Experiment und sind mit Bezug auf das untersuchte System gewählt (in diesem Fall können die Polymere der Biofilmmatrix siehe 1B). Zunächst misst die Partikel die Rheologie der Substanz mit Strukturen, die viel kleiner als die Teilchen selbst sind. Wenn der Substanz Strukturen sind in ähnlicher Größenordnung an das Teilchen, die Bewegung des parkel wird durch die Form und Ausrichtung der einzelnen Strukturen gestört. Wenn die Strukturen das Teilchen umgebenden viel kleiner sind, jedoch ist dieser Effekt klein und ausgemittelt werden, präsentiert eine homogene Umgebung an das Teilchen (1B). Zweitens sollte die Dichte der Teilchen ähnlich wie das Medium (1,05 g ml -1 für wässrige Medien) sein, dass die Sedimentation vermieden wird, und die Trägheitskräfte vernachlässigbar sind. Die meisten Partikel mit Polystyrol-Gittern die genannten Kriterien erfüllen. Idealerweise hat das Teilchen nicht mit den Polymeren der Biofilmmatrix interagieren, wie die rheologischen Auslegung des Partikel MSD ist nur gültig, wenn eine Bewegung zufällig ist, durch thermische Energie und eine Kollision mit Substanz Strukturen angetrieben. Dies kann durch Prüfen, ob die Sonde Teilchen dazu neigt, zu binden oder abprallen die Oberfläche eines vorge gewachsenen Biofilm beobachtet werden. Trotz des Fehlens von Anziehung zu dem Biofilm, müssen die Partikel in der Lage, in die Matrix eingebaut werden kann.Darüber hinaus kann die physikochemischen Heterogenität des Biofilms in verschiedenen Teilchen mehr als Sonden in den verschiedenen Regionen des Biofilms geeignetes führen. Daher sollte von Partikeln unterschiedlicher Größe und Oberflächenchemie zum Biofilm angewendet werden. Als solches ist die Partikel MSD in der Lage, nützliche Informationen über die verschiedenen Komponenten beitragen, die Rheologie und die Ausbreitung des Biofilms ist. Weiterhin ermöglicht die Verwendung von verschiedenen Sonden, um eine Information über die räumliche physikochemischen Heterogenität des Biofilms abzuleiten. Dieses Verfahren auf gemischter Arten Biofilmen verwendet werden, um die Wirkung antimikrobiellen Behandlung auf die mechanischen Eigenschaften des Biofilms zu testen, oder aufgebracht zu untersuchen, wie sich die mechanischen Eigenschaften des Biofilms werden aus der Einführung einer anderen Spezies verändert. Partikel MSD können auch nützlich für die Charakterisierung von Biofilm dispersal. Solche Studien wäre hilfreich, in unserem Verständnis von Biofilmen, die möglicherweise verbessern Biofilm-Behandlungen einnd Engineering von Biofilmen für nützliche Tätigkeiten.

<table><tbody><tr><td>Fluorsphären</td><td>Invitrogen</td><td>F-8821</td><td>1.0 &#956; m rot fluoreszierende (580/605) Mikrosphären mit Carboxylatmodifikation</td></tr><tr><td>Zeiss Axio Imager M1</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Epifluoreszenzmikroskop</td></tr><tr><td>Masterflex L/S Digital Drive 07523-80</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07523-80</td><td>Peristaltische Pumpe</td></tr><tr><td>Durchflusszellenkammern</td><td>Technische Universität Dänemark</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bubble Trap</td><td>Technische Universität Dänemark</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silikonschlauch</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>3 mm Außendurchmesser, 1&nbsp; mm Innendurchmesser</td></tr><tr><td>Durchsichtige Polypropylen-Kunststoffverbinder&nbsp;</td><td>Cole Parmer</td><td>06365-83</td><td>1/16 Zoll (1.588 mm)</td></tr><tr><td>Bindeklammern</td><td></td><td></td><td>Zum Klemmen von Schläuchen</td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>Thermo Scientific&trade; Nunc&Handel;</td><td>50 x 24 mm</td><td></td></tr><tr><td>Spritze 3 ml</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>27 &nbsp; G Nadel</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 &nbsp; L Lager-/Medienflaschen</td><td>VWR&reg;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wagen</td><td></td><td></td><td>zum Halten des Biofilm-Setups</td></tr></tbody></table>

in-situ-mapping der mechanischen eigenschaften von biofilmen durch partikel-tracking mikrorheologie

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Bakterienzellen sind in der Lage, oberflächengebundene Biofilmgemeinschaften zu bilden, die als Biofilme bekannt sind, indem sie sich in extrazelluläre polymere Substanzen (EPS) einhüllen. Das EPS dient als physikalisches und schützendes Gerüst, das die Bakterienzellen beherbergt und aus einer Vielzahl von Materialien besteht, darunter Proteine, Exopolysaccharide und DNA. Die Zusammensetzung des EPS kann sich ändern, wodurch die mechanischen Eigenschaften des Biofilms umgestaltet werden, um alternative Biofilmstrukturen, wie z. B. Streamer, als Reaktion auf Umwelteinflüsse weiterzuentwickeln oder zu unterstützen. Trotzdem gibt es nur wenige quantitative Beschreibungen darüber, wie EPS-Komponenten zu den mechanischen Eigenschaften und der Funktion von Biofilmen beitragen. Die Rheologie, die Lehre von der Stoffströmung, ist für Biofilme von besonderer Bedeutung, da viele Biofilme unter Strömungsbedingungen wachsen und ständig Scherspannungen ausgesetzt sind. Es bietet auch Messungen und Einblicke in die Ausbreitung des Biofilms auf einer Oberfläche. Hier wird die partikelverfolgende Mikrorheologie eingesetzt, um die Viskoelastizität und die effektive Vernetzungsrolle verschiedener Matrixkomponenten in verschiedenen Teilen des Biofilms während der Entwicklung zu untersuchen. Dieser Ansatz ermöglicht es den Forschern, die mechanischen Eigenschaften von Biofilmen auf der Mikroskala zu messen, was nützliche Informationen für die Kontrolle und Konstruktion von Biofilmen liefern könnte.

Die lokalen viskoelastischen Eigenschaften des Biofilms in verschiedenen Regionen des Biofilms, der die Hohlräume (mittel über dem Biofilm), Ebenen (undifferenzierte flachen Schicht von Zellen) und Mikrokolonien (siehe Etiketten in 2A) aufgenommen wurden untersucht. Die zeitlichen Änderungen der viskoelastischen Eigenschaften des Biofilms während der Reifung von den Tagen 3 bis 5 wurden ebenfalls bestimmt. Der MSD der Partikel in den Hohlräumen wurde als Kontrolle und vergleichbar mit dem MSD von Partik...

Die partikelnachfolgende Mikrorheologie untersucht die Viskoelastizität von Materialien. Hier wird die Technik verwendet, um die Viskoelastizität, die Kriechnachgiebigkeit und die effektive Vernetzungsrolle verschiedener Matrixkomponenten eines bakteriellen Biofilms zu bestimmen. Die Matrix besteht aus polymeren Substanzen, die von den Bakterien sezerniert werden, und ihre Bestandteile bestimmen die Struktur des Biofilms und die mechanischen Eigenschaften.

In-situ-Mapping der mechanischen Eigenschaften von Biofilmen durch Partikel-Tracking Mikrorheologie

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik besteht darin, zu zeigen, wie die tatsächlichen logischen Eigenschaften innerhalb der mikroskopischen Bereiche heterogener Durchflusszellen und statischer Biofilme gemessen werden können. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Biofilmbiologie zu beantworten, beispielsweise wie bestimmte metrische Parameter, verschiedene Arten oder Verbindungen die Biofilmbiologie beeinflussen und wie die Reaktion auf mechanische Kräfte wie Scherkräfte getestet werden kann. Dabei handelt es sich um eine nicht-destruktive Technik mit hoher räumlicher Auflösung, die mit für biologische Labore standardmäßig vorhandener Ausrüstung durchgeführt werden kann.Nach der Vorbereitung der bakteriellen Übernachtkulturen sowie der benötigten Hilfsmittel und des Mediums für den Flusskammer-Aufbau gemäß dem Textprotokoll, aliquotieren Sie fluoreszierende Mikrokügelchen in sterilem Wasser in Mikrozentrifugenröhrchen, um das Natriumazid zu entfernen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen fünf Minuten lang unter sterilen Bedingungen, beispielsweise in einer Flusshaube, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Mikrokügelchen in einem Milliliter Wachstumsmedium. Geben Sie anschließend die Mikrokügelchen zum restlichen Wachstumsmedium für die Flusskammerkultur hinzu. Richten Sie die Flusskammerkultur gemäß dem Textprotokoll für einen statischen Kulturansatz ein, um Biofilme in Mikrobrutschalen zu züchten. Verdünnen Sie die Übernachtkulturen in Mikrozentrifugenröhrchen 100-fach, indem Sie 10 Mikroliter Übernachtkultur zu einem Milliliter Wachstumsmedium hinzufügen.Mittel, das Mikrokügelchen enthält. Verwenden Sie dann die verdünnten Kulturen, um die Mikrobrunnenkammern zu füllen, und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius unter statischen Bedingungen. Am dritten und fünften Tag schalten Sie die Zufuhr der peristaltischen Pumpe ab und bringen die Durchflusszelleinrichtung in den Mikroskopieraum.Dann klemmen Sie den Schlauch in der Nähe des Ein- und Ausgangs der Durchflusskammer ab, um eine Drift durch Fluss zu verhindern. Platzieren Sie die Durchflusskammer auf dem Objektträger eines aufrechten Mikroskops und nehmen Sie mit einem 40x-Öl-Objektiv und Fluoreszenzmikroskopie die Bewegung der in den Biofilm eingebetteten Mikrokügelchen an verschiedenen Stellen wie Mikrokolonien und flachen undifferenzierten Schichten für zeitliche und räumliche Untersuchungen auf. Für Ereignisse, die innerhalb kurzer Zeitskalen auftreten, zeichnen Sie kürzere Videos mit höherer Bildrate zur Erfassung schneller Dynamiken auf. Für längere Ereignisse nehmen Sie längere Videos mit niedrigerer Bildrate auf.Für langsamere Dynamiken speichern Sie die Videos in einem geeigneten Format, das von Fiji ImageJ gelesen werden kann, beispielsweise CZI oder Tiff. Überprüfen Sie, ob kein Drift auftritt. Durch das Durchblättern eines fertigen Videos und die Bestätigung, dass sich die Partikel nicht gleichzeitig in dieselbe Richtung bewegen, sondern dass die Bewegung zufällig ist.Entfernen Sie die Durchflusszelle vom Mikroskopständer und starten Sie die peristaltische Pumpe erneut, um den Biofilm weiter zu kultivieren. Um Partikel-Tracking-Trajektorien aus den aufgezeichneten Videos zu erhalten, öffnen Sie Fiji und laden Sie eine Datei. Wählen Sie im Menü „Plugins“ die Option „Tracking“ und dann „TrackMate“. Überprüfen oder passen Sie in den anfänglichen Kalibrierungseinstellungen die Auflösung und Bildrate so an, dass sie den Videoparametern entsprechen. Um Partikel zu detektieren, wählen Sie den LOG-Detektor aus und geben Sie den Partikeldurchmesser sowie den Schwellenwert ein.Zum Beispiel 1000. Überprüfen Sie die Vorschau-Schaltfläche und blättern Sie durch das Video, um sicherzustellen, dass die violetten Kreise die Teilchen während des gesamten Videos verfolgen. Erhöhen Sie den Schwellenwert.Wenn der violette Kreis im leeren Bereich erscheint, verringern Sie den Schwellenwert. Wenn nicht genügend Partikel erkannt werden, klicken Sie auf die Schaltfläche „Weiter“, um die Partikelerkennung abzuschließen. Wenn die anfängliche Partikelerkennung zufriedenstellend war und keine Partikel hinzugefügt oder entfernt werden müssen, klicken Sie auf die Schaltfläche „Weiter“. Wählen Sie für die nächsten drei Fenster bei der anfänglichen Schwellenwertbestimmung eine Ansicht aus und wählen Sie einen Filter ohne Anpassung.Als Nächstes im Optionsfeld des Fensters „Select a tracker method“ den einfachen LAP-Tracker auswählen. Da sich Partikel im Biofilm selten aus dem Fokus bewegen und leicht verfolgt werden können, die vorgeschlagenen oder niedrigen Werte für die maximale Verknüpfungs- und Lückenschlussdistanz verwenden und auf „Weiter“ klicken. Überprüfen, ob die Partikelverfolgung zufriedenstellend ist, indem man durch das Video scrollt, um sicherzustellen, dass die Partikel den von TrackMate erstellten Spuren folgen und keine unerwünschten oder fehlenden Spuren vorhanden sind.Es stehen verschiedene Filter zur Verfügung, um Partikel basierend auf ihren individuellen Verfolgungsergebnissen auszuschließen. Falls dies nicht erforderlich ist, wechseln Sie zum letzten Fenster, wählen Sie in der Dropdown-Liste unter Aktion „Export tracks to XML file“ aus und klicken Sie auf „Execute“. Wählen Sie einen Ordner aus und speichern Sie die Spuren in Matlab.Bereiten Sie den Import der XML-Dateien mit Partikeltrajektorien vor, indem Sie den Dateisatzpfad auswählen und den Skripte-Ordner, der im Fiji-Paket enthalten ist, hinzufügen, um die Analyse von Partikeltrajektorien durchzuführen. Beginnen Sie mit dem Herunterladen des MSD-Analysators. Extrahieren Sie den Ordner „at msd analyzer“ und verschieben Sie ihn in einen Ordner, der zum MATLAB-Pfad gehört.Starten Sie MATLAB und initiieren Sie den Analysator, indem Sie Folgendes eingeben, wobei Mikrometer und Sekunden die physikalischen Einheiten für Raum und Zeit im Video sind. Importieren Sie anschließend die Partikeltrajektorien, indem Sie Folgendes eingeben, wobei der Clip Z die Z-Dimension entfernt. Für ein 2D-Video skaliert S den Maßstab, T skaliert die Einheiten in der Zeitdimension von Einzelbildern auf Sekunden, und fügen Sie die Spuren hinzu, um die Partikeltrajektorien darzustellen.Geben Sie Folgendes ein und berechnen Sie die mittlere quadratische Verschiebung oder MSDS der Teilchen mithilfe der hier gezeigten Befehle. Um die MSDS jedes Teilchens grafisch darzustellen, verwenden Sie „figure“ und „MA dot plot msd“. Kombinieren Sie anschließend die Trajektorien der Teilchen aus anderen Videos derselben Kategorie.Indem Sie die Trajektorien mithilfe des Befehls „Import-Trajektorie“ importieren, anschließend plotten und die mittlere quadratische Verschiebung wie gerade gezeigt berechnen, um den Ensemblemittelwert oder die durchschnittlichen Gesamtkurven darzustellen. Geben Sie Folgendes ein. Danach ändern Sie die Y- und X-Achse von linear auf logarithmische Skala.Um Bereiche der Kurve mit langen Lag-Phasen oder steilem Anstieg aufgrund dynamischer Fehler zu entfernen, verwenden Sie das Pinselwerkzeug, um das Ende der Kurve auszuwählen. Gehen Sie dann im Werkzeugmenü zu „Brushing“. Entfernen Sie „unbred“, nachdem Sie easy FITT installiert und MATLAB mit dem easy-Menü im Figure-Fenster neu gestartet haben.Gemäß dem Textprotokoll passen Sie die MSD-Kurven an das Potenzgesetz an, indem Sie „show fit power A times X to the N“ auswählen, wobei N der geschätzte diffusive Exponent alpha ist. Um anschließend neue Partikel-MSDs an anderen Orten oder Zeitpunkten zu berechnen, geben Sie „clear“ ein, um die aktuellen Partikeltrajektorien und MSDs zu verwerfen. Nachdem verschiedene MSD-Kurven für die Partikel an unterschiedlichen Positionen verschiedener Biofilmstämme und zu verschiedenen Zeitpunkten berechnet wurden, kopieren Sie die Kurven und fügen Sie in einem Diagramm zusammen.Zum Vergleich die Kurve auswählen und zu „Werkzeuge“ gehen, um die Datenstatistiken wie den Medianbereich anzusehen. Die mittlere quadratische Verschiebung der Kugel ist proportional zur Kriechflussfähigkeit JFT des Materials, in dem sich die Kugel befindet, gemäß der in dieser Formel dargestellten Beziehung, wobei J der Kriechflussfähigkeit entspricht. D entspricht dem Partikeldurchmesser, KB entspricht Boltzmanns Konstante.Konstantes Großbuchstabe T entspricht der Temperatur und Kleinbuchstabe t entspricht der Zeit. In diesen Experimenten wurden die viskoelastischen Eigenschaften verschiedener Biofilmregionen von Wildtyp P. arosa und delta PE A-Mutantenstämmen, einschließlich Hohlräume, Ebenen und Mikrokolonien, untersucht. Die mittlere quadratische Verschiebung (MSD) von Partikeln im Hohlraum diente als Kontrolle und war vergleichbar mit der MSD von Partikeln im reinen Medium.Im Gegensatz dazu vibrierten die in dem Biofilm eingefangenen Teilchen an festen Positionen, und die MSD-Werte reichten von typischen Werten viskoelastischer Materialien bis hin zu stark elastischen Gele in Biofilmen, die von den Stämmen des Wildtyps und des Delta-Pele gebildet wurden. Bei den Mikrokolonien des dritten Tages war die MSD der Teilchen unabhängig von der Zeit für Zeitspannen von 0,1 Sekunden bis 10 Sekunden, was darauf hindeutet, dass die Mikrokolonien elastisch waren. Die aus den entsprechenden Teilchen-MSDs berechneten medianen Kriechnachgiebigkeiten betrugen jeweils 4,3 × 10⁻² Pa⁻¹ und 3,6 × 10⁻² Pa⁻¹.Am fünften Tag stieg die Kriechkompliance der Mikrokolonien des Wildtyp-Stamms auf 2,5 mal 10 zur negativen eins, Pascal zur negativen eins, was auf eine Verringerung der effektiven Vernetzung innerhalb der Matrix hindeutet. Biofilme, die vom delta P-S-L-B-C-D-Mutantenstamm gebildet wurden, wiesen eine geringere Differenzierung auf und zeigten eine verzögerte Entwicklung mit dicken Schichten, die erst nach dem dritten Tag Mikrokolonien ausbildeten. Aus den MSD-Werten ergab sich, dass die Biofilme deutlich weniger effektiv vernetzt waren als die des Wildtyps und der delta Pele-Stämme. Ausreichend viele Daten werden aus dem Mikrobereich gewonnen, sobald die Analyse weiterer Videos keine neuen Informationen zur MSD-Kurve beiträgt.Es ist wichtig, die Mikrobiologie unter Verwendung einer breiten Palette von Partikeln mit unterschiedlicher Oberflächenchemie und Größe durchzuführen. Weitere Experimente können dem Verfahren hinzugefügt werden, um die Gesundheit zu untersuchen. Physikalische Kräfte, wie Scherkräfte oder chemische Behandlungen, beeinflussen die Biofilmradiologie. Die Mikrobiologie extrahiert strukturelle Informationen, die auf mikrometrischer Skala mit anderen Methoden nur schwer zugänglich sind.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Partikel verfolgt, ihre msds analysiert und diffusive Exponenten von Biofilmen erhält. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit bakteriellen Pathogenen gefährlich sein kann. Alle Abfälle müssen autoklaviert und ordnungsgemäß entsorgt werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Quelle: Kurz, D. L., et al. Mikrofluidische Plattform zur Untersuchung von Bioverstopfungen in porösen Medien. J. Vis. Exp. (2022)Das Video demonstriert den Einsatz eines mikrofluidischen Geräts zur Untersuchung der Biofilmbildung. Eine bakterielle Suspension wird in den Mikrokanal eingeführt, gefolgt von einer Inkubation, um die Entwicklung von Biofilmen zu ermöglichen. Anschließend wird der Fluss wieder aufgenommen, und Drucküberwachung zusammen mit Bildgebung wird eingesetzt, um...

Ein mikrofluidisches Gerät für Echtzeitbildgebung und Druckverfolgung während der Biofilmbildung

Dieses Papier zeigt eine einzigartige Methodik auf der Fernbetätigung in einem bakteriellen Biofilm und die Entwicklung von speziellen magnetischen Pinzette, um in-situ-Messung der lokalen mechanischen Eigenschaften des Komplexes lebendiges Material durch Mikroorganismen an Grenzflächen gebaut ausgesät magnetischen Partikeln.

Fern Magnetische Betätigung des Mikrometrische Sonden für<em&gt; In situ</em&gt; 3D-Mapping der bakteriellen Biofilm Physikalische Eigenschaften

Partikel-Tracking Mikrorheologie können zerstörungs quantifizieren und räumlich zuordnen Veränderungen in der extrazellulären Matrix mechanische Eigenschaften im 3D-Tumormodelle verwendet werden.

Längs Messung der extrazellulären Matrix Steifigkeit in 3D Tumormodelle mit Particle-Tracking Mikrorheologie

Biofilme haben komplexe Wechselwirkungen mit ihrer Umgebung. Um Biofilm-Umwelt-Wechselwirkungen umfassend zu untersuchen, stellen wir hier eine Reihe von Methoden vor, um eine heterogene chemische Umgebung für die Biofilmentwicklung zu schaffen, die lokale Strömungsgeschwindigkeit zu quantifizieren und den Stofftransport in und um Biofilmkolonien zu analysieren.

Methoden zur Charakterisierung des Co-Entwicklung von Biofilm und Habitat Heterogenität

Dieser Artikel stellt eine Methode für den Anbau eines Biofilms für in Situ Time-of-Flight secondary Ion Massenspektrometrie für chemische Zuordnung im hydratisierten Zustand durch einen mikrofluidischen Reaktor, System zur Analyse an der flüssigen Vakuum-Schnittstelle aktiviert. Die Shewanella Oneidensis MR-1 mit grünen Fluoreszenz-Protein wurde als Modell verwendet.

In Situ Charakterisierung von Shewanella Oneidensis MR1 Biofilmen von SALVI und ToF-SIMS

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Automatisierte 3D-Optische Kohärenztomographie zur Aufklärung der Biofilmmorphogenese über große räumliche Skalen

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In-situ-Mapping der mechanischen Eigenschaften von Biofilmen durch Partikel-Tracking Mikrorheologie

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