Ferromagnetische Bare Metal Stent für Endothelzellen-Abscheidung und Retention

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, einen ferromagnetischen, unbeschichteten Metallstent zu entwickeln, der magnetisch markierte endotheliale Zellen erfassen und festhalten kann. Dies wird erreicht, indem ein Stent aus dem Werkstoff 2205 Edelstahl mit Hilfe von Computer-Aided Design (CAD) und Finite-Elemente-Analyse (FEA)-Software konstruiert wird, um das mechanische Verhalten von Material und Struktur des Stents während des Zusammenpressens (Crimping) und der Expansion genau zu verstehen. Anschließend wird der hergestellte Stent mechanisch krimpt und expandiert, um dessen mechanische Integrität nachzuweisen, und das Magnetfeld-Rückhaltevermögen des Stents wird untersucht, wodurch das magnetische Verhalten bestätigt wird.

Anschließend werden die Stents in Schweine implantiert, und magnetisch markierte endotheliale Zellen werden appliziert, um die Zellaufnahme und -retention im koronaren Kreislauf zu überprüfen. Die Ergebnisse zeigen, dass der in dieser Studie entwickelte ferromagnetische Stent in der Lage ist, magnetisch markierte endotheliale Zellen basierend auf der histologischen Analyse explantierter Blutgefäße aus In-vivo-Experimenten zu erfassen und zu halten. Die Bedeutung dieser Technik reicht über die Entwicklung verschiedener kardiovaskulärer Vorrichtungen hinaus, da eine schnelle Endothelialisierung die Heilung fördern und die Blutverträglichkeit verbessern kann.

Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, aufgrund der Komplexität der CAD- und FEA-Verfahren, die bei der Stentkonstruktion beteiligt sind, Schwierigkeiten haben; auch die Zellkultur kann für Anfänger eine Herausforderung darstellen. Aufgrund der Notwendigkeit, ein strenges aseptisches Umfeld aufrechtzuerhalten, wollten wir die Heilung von Stents verbessern und entwickelten die Idee, magnetische Kräfte zu nutzen, um lebende Zellen an Stents anzubringen. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Schritte zur Stententwicklung und Zellbesiedlung aufgrund des komplexen Materialverhaltens während des Crimpens und Expandierens sowie der Neuheit der magnetischen Zellauffangmethode am Stent schwer zu erlernen sind.

Beginnen Sie damit, mithilfe einer CAD-Software einen ausgezogenen Hohlzylinder zu erstellen, indem Sie eine ausgezogene Grundkörper- bzw. Aufbaufunktion auswählen, deren Wanddicke der Streben-Dicke des Stents entspricht. Entwerfen Sie ein Stent-Muster auf einer anderen, tangential zum ausgezogenen Zylinder liegenden Skizzierebene. Gestalten Sie die Breite des flachen Musters so, dass sie dem Umfang des ausgezogenen Hohlzylinders entspricht.

Übertragen Sie das flache Mustermuster mithilfe der Umformfunktion auf den Hohlzylinder. Speichern Sie das Bauteil im ursprünglichen Format sowie im ACEs-Format, um es für die FEA zu exportieren. Um die Finite-Elemente-Analyse durchzuführen, importieren Sie die im ACEs-Format gespeicherte Volumengeometrie in das Bauteilmodul der FEA-Software zur weiteren Analyse im Bauteilmodellierer der Software. Erstellen Sie zwei analytische Zylinder koaxial zum Stent. Doppelklicken Sie auf das Instanzen-Baumelement im Baugruppenmodellierer, um die Bauteile in ihre relativen Positionen zusammenzufügen, mit einem Netzmodul der FEA-Software.

Geben Sie das Element an, Typ als 20-Knoten-Hexaeder-Element mit reduzierter Integration. Legen Sie die Elementgröße fest und generieren Sie das Netz für den Stent innerhalb der Interaktionsparameter des Modellbaums. Definieren Sie reibungsfreie starre Kontaktpaare jeweils zwischen dem Stent und den beiden Zylindern.

Weisen Sie dem Stent-Modell das ELA-OPL-Spannungs-Dehnungs-Verhalten von 2205-Edelstahl zu. Definieren Sie Randbedingungen, um zunächst den Außenzylinder auf einen Millimeter einzuziehen, was das Aufbringen simuliert. Entfernen Sie den Außenzylinder, um die Entspannung des aufgebrachten Stents zu simulieren.

Erweitern Sie den inneren Zylinder auf drei Millimeter, um die Expansion zu simulieren, und entfernen Sie abschließend den inneren Zylinder, um den Rückfedervorgang des Stents zu simulieren. Sobald die Simulation abgeschlossen ist, öffnen Sie die Ergebnisdatei und postprozessieren Sie die Ergebnisse, um die Hauptdehnungen zu untersuchen und iterativ vorzugehen. Verbessern Sie das Stent-Design, um eine Hauptdehnung von 20 % zu erreichen, was unterhalb der Bruchgrenze des Materials liegt.

Nachdem die 2205 Edelstahlrohre bezogen und die Stents gemäß dem Textprotokoll unter einem Abzug bei Verwendung geeigneter Schutzausrüstung zugeschnitten wurden, das Stent zur Passivierung der Oberfläche der elektropolierten Stents durch Eintauchen in 50 % Salzsäure für 10 Minuten säurebeizen, gefolgt von 10 % Natriumbicarbonat für weitere 10 Minuten, um die Säurebeizung abzuschließen. Spülen Sie die Stents mit Ethanol und anschließend mit entionisiertem Wasser. Um die Stents auf das Aufschrumpfen zu testen, halten Sie ein Stent und einen dreifachen Ballon.

Drücken Sie in einem handgehaltenen Crimptool den Griff, um den Stent auf dem Ballon zu verjüngen. Nach der Prüfung des verjüngten Stents unter dem Mikroskop auf gleichmäßige Verjüngung und Anzeichen von Beschädigungen erweitern Sie den Stent auf den konstruktiven Durchmesser von drei Millimetern, indem Sie den dreifach gefalteten Ballon mit Wasser unter Druck setzen. Untersuchen Sie die erweiterten Stents mit einem starken Neodym-Magneten auf mikroskopische Risse und gleichmäßige Expansion.

Magnetisieren Sie die Stents diametral, indem Sie den Stent an einer der flachen Flächen halten, wobei sein Durchmesser entlang der magnetischen Feldlinien ausgerichtet ist. Alternativ magnetisieren Sie die Stents axial, indem Sie den Stent neben der zylindrischen Oberfläche halten, wobei seine Achse entlang der magnetischen Feldlinien ausgerichtet ist. Halten Sie den Stent etwa eine Minute lang in die Nähe des starken Magneten.

Montieren Sie die Stents zur Magnetisierung einzeln auf Glasmandreln und setzen Sie diese Glasmandreln anschließend in die Präzisionsfutter der magnetischen Prüfvorrichtung ein. Mithilfe der X-, Y-, Z-Stufen der Montage der magnetischen Prüfvorrichtung wird die magnetische Mikrosensorsonde exakt nahe der Stentoberfläche positioniert, ohne diese zu berühren. Messen Sie den Basiswert des magnetischen Mikrosensors in größerer Entfernung vom Stent und verwenden Sie dann die X-, Y-, Z-Stufen, um die Sonde zu positionieren und das verbleibende Magnetfeld an der Stentoberfläche zu messen.

Nach der Gewinnung von endothelialen Auswuchs-Zellen oder EOCs aus porcinen peripheren Blut, wie im Textprotokoll beschrieben, kultivieren Sie die Zellen in einem T-75-Fläschchen, bis sie etwa 80 % konfluent sind. Nach der Synthese von superparamagnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln oder Pyon geben Sie Pyon in einem Konzentration von 200 Mikrogramm pro Milliliter dem Zellkulturmedium mit den EOCs hinzu. Inkubieren Sie bei 37 °C für 16 Stunden.

Entfernen Sie vorsichtig das Zellkulturmedium und geben Sie 10 Milliliter PBS zum Kolben hinzu. Schwenken Sie vorsichtig und aspirieren Sie anschließend. Geben Sie fünf Mikrogramm pro Milliliter eines fluoreszierenden Farbstoffs wie CM DAI zu 10 Milliliter Kulturmedium, um die Zellen gemäß den Herstelleranweisungen zu färben, und inkubieren Sie 30 Minuten bei 37 Grad Celsius.

Spülen Sie die Zellen wie zuvor vorsichtig mit PBS und geben Sie dann eine 0,25 %ige Trypsin-EDTA-Lösung hinzu. Inkubieren Sie für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius, um die Zellen vom Kolben zu lösen. Überführen Sie die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Konischglas. Füllen Sie mit PBS auf und centrifugieren Sie fünf Minuten bei 500 ×g, um die Zellen als Pellet abzutrennen, nachdem die Überstände dekantiert wurden.

Verwenden Sie PBS, um die Zellen in einer Konzentration von einer bis zwei Millionen Zellen pro Milliliter zu resuspendieren. Entwerfen und fertigen Sie für in vitro-Zellstudien eine einfache Halterung an, um den Stent knapp über der Oberfläche eines Glas-Deckgläschens zu halten. Entmagnetisieren Sie einen Stent mit einem elektromagnetischen Dauer oder magnetisieren Sie einen Stent diametral oder axial, und pipettieren Sie die mit Spy markierten E-Ooc, die in PBS suspendiert sind, in die Schale mit den axial magnetisierten, diametral magnetisierten oder nicht magnetisierten Kontrollstents.

Danach mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop ein Bild aufnehmen und die Stents mit in PBS suspendierten EOCs verwenden, um die Stentimplantation durchzuführen, nachdem bei vier gesunden Yorkshire-Schweinen antiplättchende Medikamente verabreicht und die Tiere gemäß dem im Text beschriebenen Protokoll anästhesiert wurden. Mit einer standardmäßigen kardiologischen Katheterisierungstechnik jeweils einen magnetisierten und einen nicht magnetisierten Stent in die rechte Koronararterie (RCA) implantieren. Nachdem mit einem Führungsdraht der Ballonkatheter und der Stent über einen Draht geführt wurden, den Blutfluss in der RCA proximal zu den implantierten Stents unterbrochen. Anschließend über einen Zeitraum von zwei Minuten etwa 2 Millionen autologe, mit S-Scion markierte EOCs, die in vier Milliliter PBS suspendiert sind, über den zentralen Katheter applizieren. Nach weiteren zwei Minuten der Durchblutungsunterbrechung den Blutfluss in der RCA wiederherstellen, den Stent entnehmen und eine Histologie durchführen. Gemäß dem hier dargestellten Textprotokoll deutete ein iterativer Stent-Designansatz, basierend auf der FEA, auf einen Stent hin, der gefalzt und expandiert werden kann, mit einer Hauptdehnung von 20 %, was unter der maximalen Dehnung von 30 % liegt.

Ein mit einem Laser geschnittener, elektropoliierter Stent, der auf einen Ballonkatheter aufgecrimpt und mithilfe eines Ballons auf drei Millimeter erweitert wurde, wies keine Bruchstellen auf. Aufnahmen des verformten Stents zeigten eine gute Übereinstimmung mit der mittels FEA berechneten Verformung, und auch die Mikroskopaufnahmen zeigten, wie erwartet, keine Brüche basierend auf den Messungen des verbleibenden Magnetfelds. SPY-markierte Zellen wurden bevorzugt von Ben-Segmenten in axial magnetisierten Stents angezogen und gleichmäßiger von geraden Segmenten.

Bei diametral magnetisierten Stents zeigten histologische Aufnahmen Eisenanfärbungen in der Nähe der Stentstreben, was die Anziehung und Retention von EOCs am Stent während des siebentägigen Implantationszeitraums bestätigt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Konzepte der FEA und CAD zu verstehen, da falsche Eingabeparameter zu einem fehlerhaften Stentdesign führen können, das entweder zu steif ist oder eine Neigung zu Stentfrakturen aufweist.

Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie beschleunigte Ermüdungstests und Toxizitätstests durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise nach der Langzeitdauerhaftigkeit und Biokompatibilität der Stents. Nach mehreren Jahren der Entwicklung verfügen wir nun über eine funktionelle Technologie, die in einem Schweinemodell validiert wurde.

Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einen ferromagnetischen Stent entwickelt und die magnetische Markierung sowie die Erfassung und Retention arterieller Zellen testet.