Name: miRNA-Expressionsanalysen in Prostate Cancer Clinical Tissues (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Lernen Sie eine vereinfachte Arbeitsablauf für miRNA-Expressionsanalysen in archivierten Prostatakrebs-Gewebeproben mittels quantitativer Echtzeit-PCR und in situ-Hybridisierung. Diese Methode ermöglicht präzise Biomarker-Quantifizierung.

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Wir danken Herrn Dr. Roger Erickson für seine Unterstützung und Hilfe bei der Erstellung des Manuskripts. Diese Arbeit wurde von der National Cancer Institute an der National Institutes of Health (Förderkennzeichen RO1CA177984; RO1CA138642), VA-Programm Projekt Prostatakrebs (BX001604).

Formalin-fixierte, in Paraffin eingebettete (FFPE) oder frisch gefrorenem Prostatakrebs Proben wurden aus dem SFVAMC erhalten. Proben wurden von Prostatakrebs-Patienten, die radikale Prostatektomie bei SFVAMC unterzog. Eine schriftliche Einverständniserklärung wurde von allen Patienten erhalten, und die Studie wurde von der UCSF Ausschuss für Menschenforschung genehmigt. Alternativ wurden Prostatakrebs Gewebe-Mikroarrays aus kommerziellen Quellen beschafft und verwendet für die miRNA-Analysen von ISH. Klinisch-pathologischen und Follow-up-Informationen für analysiert Prostatakrebs-Patienten gesammelt. 1. Gewebeproben <ol><li> Geschnitten Prostatakrebs Gewebeproben in 10 um-Schnitte mit einem Mikrotom und Fleck mit H &amp; E folgende Protokoll des Herstellers. </li><li> Überprüfen gefärbten Objektträger für die Identifizierung von Prostatakrebs Herde sowie angrenzenden normalen Drüsenepithel. Hinweis: ein Board Certified Pathologen sollte die H &amp; E-gefärbten Schnitten und ma überprüfenrk für die Tumor-und normalen Bereichen. Verwenden Sie die markierten Folien als Führer in den folgenden Abschnitten für die miRNA-Analysen von Tumor vs normalen Bereichen. </li></ol> 2. miRNA Expressionsanalysen durch quantitative Echtzeit-PCR Hinweis: Dieser Workflow beinhaltet die folgenden Schritte: Laser Mikrodissektion, Isolierung von Gesamt-RNA (einschließlich miRNA und mRNA), Testen von reifen miRNAs mit den TaqMan MicroRNA Expression Assays, wie in den folgenden Abschnitten beschrieben. <ol><li> RNA-Extraktion <ol><li> Isolierung von miRNA aus Prostatakrebs FFPE Gewebe <ol><li> Laser Mikrodissektion (LCM) Hinweis: Führen Sie die Schritte 2.1.1.1.1- 2.1.1.1.4 in einem Chemieabzug benutzen. <ol><li> Bereiten Gewebeschnitten (10 &amp; mgr; m Sektionen) für LCM. Deparrafinize Gewebeschnitten durch Einweichen in Xylol (2x), für jeweils 10 min, dann rehydrieren das Gewebe durch Inkubation der Objektträger für 5 Minuten jeweils in abgestuften Ethanol (100%, 95%, 90%, 80%, 70%), gefolgt von destilliertem Wasser(5 min). </li><li> Nach der Rehydrierung, Flecken Schnitte mit Hämatoxylin für 30 Sekunden, gefolgt von Wasser. </li><li> Ort Geweben in abgestuften Ethanol (70%, 95% 90%, 80%, 70%) (jeweils 5 min) und Xylol (5 min). </li><li> Trockenrutschen in einem Abzug und legen Sie dann in der LCM Instrument zur Mikrodissektion. </li><li> Führen Mikrodissektionen mit dem LCM-System in Übereinstimmung mit den Anweisungen von 24 des Herstellers. Verwendung Pathologen bis gleitet als Führungen für die Identifizierung von Prostatakrebs Brennpunkte sowie angrenzende normale Gewebe markiert. Verwenden des Laserstrahls auf einen um Durchmesser 10-20 Pulsen mit einer Leistung von 70-90 mW. </li><li> Capture-Bereiche von Interesse mit Infrarot-Laserimpulse auf LCM Kappen. Kombinieren Zellen 2-5 Kappen für miRNA-Extraktion pro Probe. Um die Integrität der extrahierten RNA zu gewährleisten, umgehend bearbeiten fangenen Zellen für die miRNA-Extraktion. </li><li> Alternativ lysieren Zellen in der miRNA-Extraktionspuffer (gemäß dem Herstellerprotokoll) und STOWieder Lysate bei -80 ºC. </li></ol></li><li> miRNA Extraktion und Analyse von LCM mikrodissezierten Tissues <ol><li> Extrahieren Gesamt-RNA aus microdissected FFPE-Geweben unter Verwendung eines kommerziellen Kits nach den Anweisungen des Herstellers. Hinweis: Die Ausbeute an RNA von Laser-Capture-miscrodissection typischerweise niedrig ist. Daher wird RNA in geringen Mengen (20-30 ul) eluiert und für die Expression Profiling mit Taqman microRNA Expressionsassays folgenden Herstellerangaben (auch in Abschnitt 2.2 beschrieben) verwendet. Optimierung der Eingangs RNA für Echtzeit-PCR-Nachweis von reifen miRNAs schlägt vor, dass 5 ul der eluierten RNA ist optimal für jedes miRNA-spezifische reverse Transkriptionsreaktion. Als endogene Kontrolle wird RNU48 / RNU24 verwendet. Für Kontrollreaktionen, wurde mit 2 ul der eluierten RNA für die reverse Transkriptionsreaktion verwendet wird. </li></ol></li></ol></li><li> Isolierung von miRNA aus Prostatakrebs Gefrorene Gewebe <ol><li> Homogenisieren froren resezierten Prostatagewebe durch Schleifen die Gewebe in flüssigem Stickstoff mit einem Mörser und Stößel. Übertragen homogenisiertem Gewebe ein Mikrozentrifugenröhrchen unter Verwendung einer gekühlten Spachtel. Pflegen Sie den Mörtel / Stößel und Spachtel auf der gleichen Temperatur durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff so homogenisierte Gewebe können leicht übertragen werden. </li><li> Hinzufügen kommerziellen Guanidinisothiocyanat-Phenol-Reagenz (1 ml / 0,1 g Gewebe) zu der homogenisierten Gewebe und Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min. Hinweis: homogenisierte Gewebe in das Handels Guanidinisothiocyanat-Phenol-Reagenz kann bei -80 ° C mehrere Monate gelagert werden. </li><li> In Chloroform zum Homogenat (0,2 ml Chloroform / ml) und kräftig schütteln für 30 Sekunden. Proben Inkubieren bei Raumtemperatur für 3-5 min, gefolgt von Zentrifugation bei 10.000 × g für 20 min bei 4 ºC. </li><li> Übertragen Sie die obere wässrige Phase in ein frisches steriles RNase-freies 1,5 ml-Tube. </li><li> Hinzufügen eines gleichen Volumens Isopropylalkohol. Mischen und Inkubation für 10 min bei RT, gefolgt von Zentrifugation bei 12.000 xg für 20 min bei 4 ºC, um die RNA zu pelletieren. </li><li> Den Überstand aspirieren und waschen Sie die RNA-Pellet mit 1 ml 70% Ethanol. Zentrifuge bei 12.000 g für 10 min bei 4 ºC. </li><li> Vorsichtig den Überstand aspirieren. Dry RNA-Pellets bei RT für 5-10 min. Lösen sich RNA in 50-100 ul Nuklease-freies Wasser. </li><li> Führen Quantifizierung von RNA unter Verwendung eines Nanodrop Spektralphotometer und festzustellen, RNA-Integrität mit einem Bioanalyzer. Einstellen RNA-Konzentrationen bis 10 ng / &amp; mgr; l. Verwenden Sie 10-50 ng RNA für die miRNA-spezifischen cDNA-Reaktion, gefolgt von Echtzeit-PCR-Analysen (Abschnitt 2.2). </li></ol></li></ol></li><li> Quantitative Real-time PCR zur miRNA-Expressionsanalysen Hinweis: Assay für reife miRNA Verwendung wie unten beschrieben ein zweistufiges RT-PCR-Protokoll. <ol><li> Reverse Transkription (RT) <ol><li> Reverse Transkription von cDNA aus RNA unter Verwendung eines Reverse-Transkriptions-miRNA-Kit gemäß den Anleitungen des Herstellers.Verwenden Sie 10-50 ng Gesamt-RNA mit miRNA spezifische Primer aus der MicroRNA Assays und RT-Kit. Verwenden RNU48 / RNU24 / RNU6B als Kontrollen. Verdünnte cDNA 1: 5 bis 1:10 (in Abhängigkeit von der Fülle der analysierten miRNA) und die Verwendung in Echtzeit-PCR-Nachweis, wie im folgenden Schritt beschrieben. </li></ol></li><li> Real-time PCR zum Nachweis von miRNA Ältere <ol><li> Verstärken PCR-Produkten aus cDNA-Proben unter Verwendung der MicroRNA Assays mit einer Fast-Universal-Master-Mix in Übereinstimmung mit den Anweisungen des Herstellers. Normalisieren Proben RNU48 / RNU24 / RNU6B Kontrolle. Verwenden Sie die Vergleichs Ct (threshold cycle) -Methode, um die relativen Veränderungen in der Genexpression auf der Fast-Echtzeit PCR-System zu berechnen. Analysieren Sie jede Probe in dreifacher Ausfertigung. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. miRNA Expressionsanalysen durch in situ Hybridisierung (ISH) <ol><li> Vorbehandlung von Geweben <ol><li> Schneiden Sie 5 um Abschnitte aus FFPE Prostatakrebsgewebeblöcke mit einem Mikrotom. </li><li&gt; Fix Gewebeschnitten durch Inkubation der Objektträger bei 56 ° C für 1 Stunde. Hinweis: Die Objektträger können bei RT für mehrere Wochen gelagert werden für miRNA-Analysen. </li><li> Deparrafinize der Gewebe durch Einweichen der Folien mit Xylol (2 x), für jeweils 15 min. </li><li> Rehydrieren das Gewebe durch Inkubation der Objektträger für 5 Minuten jeweils in abgestuften Ethanol (100% (2x), 95%, 90%, 80%, 70%), gefolgt von destilliertem Wasser (5 min). </li><li> Befestigen Sie die Objektträger mit 4% Paraformaldehyd in PBS bei Raumtemperatur für 20 min. </li><li> Waschen der Objektträger mit PBS (2x) bei Raumtemperatur für jeweils 5 Minuten. </li><li> Behandeln die Folien mit 10 &amp; mgr; g / ml Proteinase K bei 37 ºC für 10 min in vorgewärmtem Proteinase K-Puffer (5 mM Tris-HCL pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM NaCl). </li><li> Im Anschluss an Proteinase-K-Behandlung, spülen Sie die Folien mit 0,2% Glycin in PBS für 30 Sekunden. </li><li> Waschen Folien in PBS (1x) bei Raumtemperatur für 5 min. </li><li> Befestigen Sie die Objektträger mit 4% Paraformaldehyd in PBS für 15 min. </li><li> Rinse Dias mitPBS für 5 min. </li></ol></li><li> Hybridisierung <ol><li> Vorge hybridisieren die Folien mit Vorhybridisierungslösung für 3-4 h bei 55 ºC in einer befeuchteten Kammer. Benutzen Sie Gewebelaborwischtücher in 50% Formamid / 50% 5x SSC eingeweicht zu halten, der Kammer befeuchtet. </li><li> Benutzen 5&#39;Digoxigenin markierten Sonden in einer Konzentration von 20-50 nM in Hybridisierungspuffer. Verdünnen Sie miRNA-spezifischen Sonde (20-50 nM) und Snrna U6 Kontrollsonde (20 nM), Wärme bei 90 ° C für 4 Minuten, legen Sie es auf Eis und in den kalten Hybridisierungspuffer Eis (2-4 ng / ul ). </li><li> Entfernen Vorhybridisierungslösung, fügen Hybridisierungslösung (Sonde + Hybridisierungspuffer, 100 ul pro Folie), Inkubation für 12-16 Stunden bei sondenspezifischen Hybridisierungstemperatur (Hybridisierungstemperatur = Tm-Sonde-21 ºC). Zuführen Hybridisierungen in einer feuchten Kammer (50% Formamid / 50% 5x SSC). </li></ol></li><li> Waschschritte <ol><li> Waschen Sie die Objektträger mit 2 × SSC für 10 Minuten bei 45 ºC. </li><li> Wash tEr gleitet mit 1,5x SSC für 10 Minuten bei 45 ºC. </li><li> Waschen Sie die Objektträger mit 0,2 × SSC (2x) bei 37 ºC für jede 20 min. </li><li> Objektträger mit 1x Blockierungslösung inkubieren 1-2 Stunden bei Raumtemperatur </li></ol></li><li> Erkennung <ol><li> Die Objektträger mit 1 inkubieren: 100 PBS verdünntes AP-konjugierten Anti-Digoxigenin-Antikörper für 1-4 Stunden oder über Nacht bei 4 ºC. </li><li> Waschen Sie die Objektträger mit PBS (3x) bei Raumtemperatur für jeweils 10 min. </li><li> Für jeweils 5 min Waschen der Objektträger (2x) mit alkalischer Phosphatase-Puffer (100 mM Tris pH 9,5, 50 mM MgCl 2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween-20) bei RT. </li><li> Die Folien in BM Lila AP-Substrat Inkubieren im Dunkeln bei RT 1-20 Std. </li><li> Mit PBS, das 0,1% Tween-20 und Wasch (2x) in Wasser zu spülen Sie die Folien. </li><li> Montieren Sie die Objektträger unter Verwendung einer wässrigen Eindeckmittel und untersuchen unter dem Mikroskop. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben keine finanziellen Angaben.

In diesem Artikel beschreiben wir einen vereinfachten Workflow für die miRNA-Expression Profiling in archivierten FFPE oder gefrorenes Frisch Prostatakrebs klinischen Gewebe. Bei Prostatakrebs, schlagen mehrere Studien eine wichtige Rolle von microRNAs im Prostatakrebs Initiation, Progression und Metastasierung. Allerdings sind widersprüchliche Ergebnisse oft auf einen bestimmten miRNA 22 seit der miRNA-Extraktion erhalten und analysiert Methoden weit auseinander. Im Hinblick auf die Schwellen Nachweise für d...

Krebs der Prostata ist eine häufig diagnostiziert männlicher Bösartigkeit, die eine der führenden Ursachen von Krebs bedingte Sterblichkeit unter den Menschen ist. In US schätzungsweise 220.800 neue Fälle und 27.540 Todesfälle im Jahr 2015 1 gemeldet werden. Prostatakrebs ist eine heterogene Erkrankung mit sehr variablen Krankheits Kurs- Tumoren können indolenten oder sehr aggressiv sein. Eine kritische Herausforderung bei Prostatakrebs klinische Management wird durch die Unzulänglichkeit der derzeit verwendeten Methoden / Biomarker für Krankheiten Screening, Diagnose, Prognose und Behandlung 2 gestellt. Stromscreeningverfahren schließen Prostata-spezifischen Antigens (PSA) und eine digitale rektale Untersuchung (DRU), gefolgt von Prostatabiopsien 3. Prostata-spezifisches Antigen (PSA) ist die am weitesten verbreitete Prostatakrebs-Biomarker, die deutlich revolutioniert hat das Klinikmanagement und verbesserte Überlebensraten 4. Jedoch aufgrund der inhärenten Beschränkungen der PSA einschließlich lack Spezifitäts PSA basierten Screening auf über Diagnose und über die Behandlung der Krankheit geführt. Im Hinblick darauf werden die intensiven Bemühungen in Richtung auf eine Suche nach alternativen Prostatakrebs biomarkers gerichtet, insbesondere solche, die die Aggressivität der Erkrankung vorherzusagen und fahren bessere Behandlungsentscheidungen 4,5 kann. In den letzten Jahren wurden microRNAs (miRNAs) als vielversprechende alternative Prostatakrebs biomarkers entstanden. MicroRNAs (miRNAs) stellen eine evolutionär konservierte Klasse von kleinen nicht-kodierenden RNAs, die die Genexpression über sequenzspezifische Wechselwirkungen mit den 3&#39;-untranslatierten Regionen (UTR) des verwandten mRNA-Ziele zu unterdrücken posttranskriptional. Es wird geschätzt, dass&gt; 60% der mRNAs konserviert Ziele miRNAs 6. miRNA-Gene sind in Intergenregionen oder innerhalb Introns oder Exons von Protein / Nicht-Protein kodierende Gene 7 angeordnet. Diese Gene werden vorzugsweise durch RNA-Polymerase II in prima transkribiertry miRNAs (pri-miRNAs mehrere Kilobasen lang), dass die Form Haarnadel-förmigen Stammschleife Sekundärstrukturen. Diese pri-miRNAs werden in Vorläufer-miRNAs (pre-miRNAs, 60-75 Nukleotide lange), die in das Zytoplasma exportiert und weiter zu reifen miRNAs (18-25 Nukleotide lange) 8-10 verarbeitet verarbeitet. miRNAs regulieren Schlüssel zelluläre Prozesse einschließlich Verbreitung, Entwicklung, Differenzierung und Apoptose 11. Studien legen nahe, eine weit verbreitete Fehlregulation der miRNA-Expressionsprofile in verschiedenen menschlichen Tumoren einschließlich Prostatakrebs 12-15. miRNA-Expressionsprofile wurde berichtet, weit verbreitet in der primären und metastatischen Prostatakrebs fehlreguliert werden. Veränderte miRNA-Expression wurden mit Prostatakrebs Progression, Aggressivität und Rezidivhervorhebung der prognostische Potential von miRNAs 12,14,16-19 Verbindung gebracht worden. Eine wachsende Zahl von Beweisen zeigt, dass miRNAs spielen wichtige mechanistische Rolle bei Prostatakrebs Initiierung, Entwicklung, FortschrittIonen und Metastasierung. Insgesamt miRNAs entstehen als vielversprechende alternative Biomarker für Prostatakrebs Diagnose und Prognose, die zwischen normalen und Krebsgeweben und Hilfe bei der Stratifizierung von Prostata-Tumoren 12 unterscheiden kann. Auch miRNAs sind wichtige Ziele für die Entwicklung wirksamer Therapeutika gegen Prostatakrebs 20. Aufgrund ihrer geringen Größe und der Beständigkeit gegenüber endogenen RNase-Aktivität sind miRNAs stabile Biomarkern, die in Formalin fixierten Geweben 21 und in Prostatabiopsien 22 leicht erkannt werden können. Darüber hinaus haben die Expressionsprofile von miRNAs in gefrorenen und Formalin fixierten Geweben verglichen worden und haben sich als stark korreliert sein 21. Allerdings ist miRNA Expression Profiling bei Prostatakrebs klinischen Geweben oft eine Herausforderung aufgrund Tumorheterogenität, Stichprobenfehler, Stroma-Kontaminationen etc. Die Entwicklung von miRNAs als effektive Biomarker für Prostatakrebs stark relies auf ihre genaue Erfassung der klinischen Gewebe. Hier beschreiben wir einen vereinfachten Workflow in unserem Labor für die miRNA-Expression Profiling in archivierten FFPE oder gefrorenes Frisch Prostatakrebs klinischen Proben verwendet. Wir verwenden eine Kombination quantitativer Echtzeit-PCR und in situ Hybridisierung für miRNA-Analysen von klinischen Proben mit dem früheren Gewinnung quantitativer Informationen und letztere zur Visualisierung der differentiellen Expression potentieller miRNA Biomarkern in einem Array von Geweben. In diesem Workflow optimieren wir die bestehenden Methoden für die miRNA-Extraktion aus FFPE und gefrorenen Prostatagewebe, Analysen Expression durch Taqman-Sonde basiert miRNA RT-PCR und miRNA in situ-Hybridisierungstechnik unter Verwendung gesperrt Nukleinsäure (LNA) -basierte Sonden 23. LNA-basierte Sonden bieten eine erhöhte Sensitivität und Spezifität gegenüber DNA- oder RNA-Sonden basiert und ermöglicht robuste Erkennung aller miRNA-Sequenzen, unabhängig von ihrem GC-Gehalt und erlauben auch Diskriminierungtion der miRNA-Familien. Unsere optimierte miRNA ISH-Protokoll kann zur Prostatakrebsgewebe Dias oder Prostatakrebs Tissue Microarrays (TMA) und bietet das Potenzial, miRNA Biomarkern beschleunigen angewendet werden, wobei die letzteren.

<table><tbody><tr><td>Mikrotom</td><td>Leica Biosystems&nbsp;</td><td>RM2255</td><td></td></tr><tr><td>Arcturus Autopix für LCM</td><td>Arcturus/ Life Technologies</td><td>LCM1621/LCM1110</td><td>Alternativ kann das Arcutus Xt System von Life Technolgies verwendet werden.</td></tr><tr><td>CapSure Macro LCM Caps</td><td>Life Technologies</td><td>LCM0211</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy FFPE Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>217504</td><td></td></tr><tr><td>7500 Schnelles Echtzeit-PCR-System&nbsp;</td><td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td><td>4351106</td><td></td></tr><tr><td>Taqman MicroRNA Reverse Transkriptionskit&nbsp;</td><td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Fast Universal PCR Mastermix&nbsp;</td><td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td><td>4352042 DIG-markierte</td><td></td></tr><tr><td>LNA-Sonde für U6</td><td>Exiqon</td><td>99002-01</td><td></td></tr><tr><td>BM Purple AP-Substrat</td><td>Roche</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>Pre-Hybridisierungslösung&nbsp;</td><td>Biochain</td><td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-1</a></td><td></td></tr><tr><td>Hybridisierungslösung&nbsp;</td><td>Biochain</td><td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-2</a></td><td></td></tr><tr><td>Blockierungslösung&nbsp;</td><td>Biochain</td><td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-8</a></td><td></td></tr><tr><td>AP-konjugierter Anti-Digoxigenin-Antikörper</td><td>Biochain</td><td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-7</a></td><td></td></tr><tr><td>Wässrige Eindeckmedien&nbsp;</td><td>Vector Laboratorien&nbsp;</td><td>H-5501&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Trizol (Guanidin-Isothiocyanat-Phenol-Reagenz)&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15596018">15596-018</a>Harris</td><td></td></tr> <tr><td>Hämatoxylin</td><td>Statlab</td><td>SL200</td><td></td></tr><tr><td>Eosin&nbsp;</td><td>Statlab</td><td>SL201&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

mirna-expressionsanalysen in prostate cancer clinical tissues

miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues

Eine kritische Herausforderung bei Prostatakrebs (PCa) klinische Management wird durch die Unzulänglichkeit der derzeit verwendeten Biomarker für Krankheiten Screening, Diagnose, Prognose und Therapie gestellt. In den letzten Jahren microRNAs (miRNAs) als vielversprechende alternative Biomarker für Prostatakrebs Diagnose und Prognose entstanden. Jedoch ist die Entwicklung von miRNAs so wirksam Biomarker für Prostatakrebs in hohem Maße von ihrer genauen Nachweis klinisch Geweben. miRNA-Analysen bei Prostatakrebs klinischen Proben ist häufig eine Herausforderung aufgrund Tumorheterogenität, Stichprobenfehler, Stroma-Kontaminationen etc. Das Ziel dieses Artikels ist es, einen vereinfachten Workflow beschreiben, für die miRNA-Analysen in archivierten FFPE oder gefrorenes Frisch Prostatakrebs klinischen Proben mit einer Kombination aus quantitative Echtzeit-PCR (RT-PCR) und in situ Hybridisierung (ISH). In diesem Workflow optimieren wir die bestehenden Methoden für die miRNA-Extraktion aus FFPE und eingefroren Prostata tissuES und Expressionsanalysen durch Taqman-Sonde basiert miRNA RT-PCR. Darüber hinaus beschreiben wir ein optimiertes Verfahren zur ISH Analysen formiRNA Erkennung in Prostatagewebe mit gesperrten Nukleinsäure (LNA) - basierten Sonden. Unsere optimierte miRNA ISH-Protokoll kann zur Prostatakrebsgewebe Dias oder Prostatakrebs Tissue Microarrays (TMA) angewendet werden.

Expression Profiling von miR-203 in LCM primären Prostatakrebs klinischen Proben durch RT-PCR-Analysen (Abbildung 1) RT-PCR-Analysen von relativen miR-203-Expression in LCM primären Prostatakrebsgewebe und die angepaßten angrenzenden normalen Regionen erfolgt wie in Saini et al. 15 RNU48 beschrieben wurde als eine Kontrolle verwendet wurde. Die folgende Tabelle fasst die relative miR-203 Expression in Prostatakrebstumorgewebe relativ zu benachbarten norma...

Hier beschreiben wir ein vereinfachtes Protokoll für microRNA (miRNA)-Expressionsanalysen in archivierten klinischen Geweben mit Formalin-fixiertem, Paraffin-eingebettetem (FFPE) oder frisch gefrorenem Prostatakrebs (PCa) unter Verwendung von quantitativer Echtzeit-PCR (RT-PCR) und in situ Hybridisierung (ISH).

miRNA-Expressionsanalysen in Prostate Cancer Clinical Tissues

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, ...

Das übergeordnete Ziel dieses Videos ist es, einen vereinfachten Arbeitsablauf für die Analyse von Mikro-RNAs in archivierten klinischen Proben des Prostatakarzinoms zu beschreiben, wobei eine Kombination aus quantitativer Echtzeit-PCR und NC-Zwei-Hybridisierung unter Verwendung von auf gesperrten Nukleinsäuren basierenden Sonden eingesetzt wird. Dies wird erreicht, indem zuerst Gewebe aus FFPE-Schnitten des Prostatakarzinoms mittels Laser-Mikrodissektion isoliert und anschließend eine Mikro-RNA-Extraktion durchgeführt wird. Danach wird eine zweistufige RT-PCR verwendet, um die Mikro-RNA im Gewebe zu quantifizieren, und zur Lokalisierung der Mikro-RNA wird eine Zwei-Hybridisierungsanalyse mit digoxigeninmarkierten LNA-Sonden sowie einem AP-konjugierten Antikörper durchgeführt, der mittels BM-Purple nachgewiesen wird.Die dargestellten Ergebnisse zeigen die Expression eines mikro-RNAs in klinischen Gewebeproben von Prostatakrebs. Mithilfe dieser Techniken haben sich mikro-RNAs kürzlich als vielversprechende alternative Biomarker für Prostatakrebs herauskristallisiert. Die Analyse der mikro-RNA-Expression in klinischen Prostatakrebsproben ist jedoch aufgrund störender Faktoren wie der Heterogenität von Prostatatumoren und Faktoren wie stromaler Kontamination oft herausfordernd.Wir arbeiten seit den letzten 10 Jahren im Bereich der mikroRNA und der nichtcodierenden RNA. Wir haben die Bedingungen für die Expression von mikroRNA in verschiedenen Stadien des Prostatakarzinoms optimiert. Wir sind der Ansicht, dass die Expression von mikroRNA als diagnostischer und prognostischer Biomarker verwendet werden kann, da sie mit dem klinischen Verlauf des Prostatakarzinoms korreliert.Wir sind außerdem der Ansicht, dass Mikro-RNA mithilfe der Nanopartikeltechnologie zur Behandlung von Prostatakrebs eingesetzt werden kann. Eine genaue Expressionsprofilerstellung beim Prostatakarzinom wird häufig durch die Heterogenität der Läsionen erschwert. Dieses Problem wird teilweise durch den Einsatz der Laser-Kapture-Mikrodissektion oder LCM überwunden, um reine gutartige oder bösartige epitheliale Zellen zu gewinnen und deren Vermischung mit Stroma-Zellen zu verringern.Laser-Mikrodissektion archivierter FFP-Gewebeproben, gefolgt von der Mikro-RNA-Expressionsprofilierung, hat sich als empfindliche, zuverlässige und kosteneffiziente Methode erwiesen, die als ergänzende Technik optimiert wurde. Die Hybridisierung auf C zwei bietet einen Überblick darüber, wo die Mikro-RNAs exprimiert werden. Sobald die Gewebeproben gesammelt und in 10-Mikrometer-Schnitte aufgeteilt wurden, entfernen Sie das Paraffin in einem Abzug, indem Sie die Objektträger zwei Mal je 10 Minuten in Xylol einlegen und anschließend das Gewebe durch sukzessive alkoholische Bäder mit zunehmendem Wasseranteil rehydrieren. Danach wenden Sie eine Hämatoxylin-Färbung für 30 Sekunden an und spülen die Objektträger mit Wasser ab.Nun rehydrieren Sie die Gewebe durch eine weitere alkoholische Abstufung, beginnend mit 70 %. Danach spülen Sie die Schnitte fünf Minuten lang in Xylol und lassen sie an der Luft trocknen. Bringen Sie die getrockneten Objektträger zum Laser-Mikrodissektionsgerät. Verwenden Sie vom Pathologen markierte Objektträger, um die Herde des Prostatakarzinoms sowie benigne beziehungsweise normale Bereiche zu identifizieren.Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für die Durchführung der Laser-Mikrodissektion. Stellen Sie die Strahlbreite auf 10 bis 20 Mikrometer ein und pulsieren Sie mit 70 bis 90 Milliwatt. Verwenden Sie Infrarotpulse, um interessierende Bereiche auf Laser-Mikrodissektionskappen zu übertragen.Fügen Sie für jede Probe den Inhalt der Kappe einem Sammelröhrchen hinzu und verarbeiten Sie die Zellen unverzüglich zur Extraktion von mikro-RNA. Extrahieren Sie die gesamte RNA mithilfe eines kommerziellen Kits gemäß den Herstelleranweisungen. Eluieren Sie die RNA in 20 bis 30 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser und fahren Sie zügig fort.Verwenden Sie anschließend ein Reverse-Transkriptase-Reaktionskit, um cDNAs unter Verwendung spezifischer Primer für mikro-RNA herzustellen. Richten Sie jede Reaktion mit 10 bis 100 Nanogramm Gesamt-RNA ein. Verdünnen Sie die cDNA nach der Gewinnung um einen Faktor von fünf bis 10, um eine Konzentration von etwa einem bis 20 Nanogramm zu erreichen.Richten Sie nun die PCR-Reaktionen in Dreifachbestimmung aus der CDNA mit Mikro-RNA-Assays unter Verwendung eines schnellen universellen Mastermixes für die Kontrolle ein. Verwenden Sie RNU 48 als Vorlage, um die relative Änderung der Genexpression zu berechnen. Wenden Sie die vergleichende CT-Methode an, um die fünf Mikrometer dicken Gewebeschnitte vorzubehandeln.Fixieren Sie die Objektträger eine Stunde lang bei 56 Grad Celsius. Danach führen Sie eine Entparaffinierung der Objektträger mit zwei Xylolbädern bei Raumtemperatur durch, jedes Bad dauert 15 Minuten. Anschließend rehydrieren Sie das Gewebe durch eine abgestufte Ethanolreihe. Danach lassen Sie das Gewebe fünf Minuten lang in Wasser einweichen.Als Nächstes fixieren Sie die Gewebe mit 4 % PFA in PBS bei Raumtemperatur für 20 Minuten. Spülen Sie das Fixativ mit zwei fünfundzwanzigminütigen Waschungen in PBS ab. Geben Sie nun potente Proteinase K mit 10 Mikrogramm pro Milliliter in vorgewärmten Proteinase-K-Puffer oben hinzu und inkubieren Sie die Gewebe bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten.Nach der Behandlung die Objektträger 30 Sekunden lang mit 0,2 % Glycin in PBS spülen und anschließend fünf Minuten bei Raumtemperatur in PBS waschen. Danach erneut 15 Minuten in 4 % PFA einweichen. Abschließend den Fixator erneut mit zwei fünfundzwanzigminütigen PBS-Bädern abwaschen.Die Gewebe sind nun bereit für die Hybridisierung. Ziehen Sie zunächst mit einem Markierstift einen hydrophoben Kreis um das Gewebe, damit die Lösung in den folgenden Schritten auf dem Gewebeschnitt verbleibt. Inkubieren Sie die Gewebe drei bis vier Stunden lang bei 55 Grad Celsius in Puffer für die Vorhybridisierung.Führen Sie dies in einer Kammer durch, die durch mit 50 % Formamid und 50 % 5× SSC-Lösung getränkte Tücher befeuchtet ist. Bereiten Sie nun die Digoxigenin-markierte, mikro-RNA-spezifische Sonde sowie die Kontrollsonde vor. Planen Sie eine Verdünnung von 20 bis 50 Nanomolar ein, verdünnen Sie die Sonden jedoch zunächst mit nur 25 Mikrolitern Hybridisierungspuffer, also weniger als für die endgültige Verdünnung benötigt. Erhitzen Sie anschließend die Sonden auf 90 Grad Celsius für etwa vier Minuten.Dann legen Sie die Sonden auf Eis. Verdünnen Sie die Sonden abschließend mit eiskaltem Hybridisierungspuffer auf ihre endgültigen Konzentrationen von 20 bis 50 Nanomolar. Geben Sie nun 100 bis 400 Mikroliter der Sondenlösung auf jeden Objektträger.Anschließend 12 bis 16 Stunden bei der geeigneten Hybridisierungstemperatur inkubieren. Am nächsten Tag eine SSC-Lösungswaschung in mehreren Schritten nach den Waschungen durchführen. Die Objektträger nach der Blockierung eine bis zwei Stunden bei Raumtemperatur in der Blockierungslösung inkubieren.Befeuchten Sie die Gewebe mit einer Verdünnung von 1:100 des AP-konjugierten Antikörpers gegen Genin in PBS. Führen Sie dies für eine bis vier Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius durch. Entfernen Sie anschließend den überschüssigen Antikörper durch drei Waschungen mit PBS, jeweils zehn Minuten lang.Führen Sie zwei fünfundzwanzigminütige Waschungen in einem Puffer auf Basis von Urin bei Raumtemperatur durch. Anschließend inkubieren Sie die Objektträger ein bis zwanzig Stunden lang in BM Purple, AP-Substrat, lichtgeschützt bei Raumtemperatur. Am nächsten Tag entfernen Sie das BM Purple durch Spülen mit 0,1 % zwischen 20 in PBS.Anschließend zwei Mal mit Wasser waschen und mit wässrigen Eindeckmedien nach der beschriebenen Protokoll zur Mikro-RNA-Extraktion und RT-PCR eindecken. Mikro-RNA-203 wurde in Prostatakarzinom- und normalen angrenzenden Geweben untersucht. Die relative Expression variierte in einem erheblichen Anteil der Gewebe.RNU 48 wurde als Kontrolle verwendet. Prostatatumorgewebe wurde entweder mikroskopisch mikrodisseziert oder LCM unterzogen und anschließend die relative Mikro-RNA-Expression von miR-383 im Tumorgewebe mit den entsprechenden normalen Kontrollen verglichen.LCM-behandeltes Gewebe wies eine zuverlässigere Detektion der Mikro-RNA-Expression auf. In C erfolgte die Hybridisierung an Mikro-RNA-2-0-3 in normalem und knöchernem metastasiertem Prostatatumorgewebe. U sechs.Die RNA-Detektion wurde basierend auf der Färbungsintensität als Kontrolle verwendet. Die Expression von microRNA 203 wurde in den Zellen jedes Gewebes von eins bis vier bewertet. Die Expression erwies sich somit als statistisch niedriger im Knochenmetastasengewebe.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Expression von Mikro-RNAs in klinischen Proben von Prostatakrebs bewertet werden kann. Während des gesamten Arbeitsablaufs ist es äußerst wichtig, eine RNA-freie Umgebung aufrechtzuerhalten. Außerdem kann die Arbeit mit Paraformaldehyd und Kochsalzlösung äußerst gefährlich sein, und es sollten stets Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, beispielsweise die Arbeit in einem Abzug und das Tragen persönlicher Schutzausrüstung, während dieses Verfahren durchgeführt wird.Nach diesem Verfahren führen wir eine statistische Analyse durch, um zu beurteilen, ob Mikro-Expressionsmuster mit den klinisch-pathologischen Variablen der Erkrankung korrelieren, was uns hilft, zentrale Fragen zu beantworten, beispielsweise, ob die Expression eines bestimmten Mikro-RNAs ein assoziiertes prognostisches oder diagnostisches Potenzial aufweist. Unser optimiertes Mikro-RNA-in-C-zwei-Hybridisierungsprotokoll kann auf Prostatakarzinom-Gewebeschnitten oder Prostatakarzinom-Gewebemikroarrays angewendet werden. Dieses Protokoll kann nach Optimierung auch auf andere Gewebetypen angewendet werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Quantitative Real Time Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) ist eine schnelle und empfindliche Methode, um die Expression verschiedener microRNA (miRNA) Moleküle in Tumorproben zu untersuchen. Unter Verwendung dieses Verfahrens Expression von Hunderten von verschiedenen miRNA-Moleküle können verstärkt, quantifiziert werden, und analysiert die gleiche cDNA-Matrize.

MicroRNA-Detektion in Prostatatumoren durch quantitative real-time PCR (qPCR)

Humanen endogenen Retroviren (HERV), die 8% des menschlichen Genoms zu besetzen, halten knapp Codierung Kapazitäten aber hunderttausend long terminal repeats (LTR). Eine benutzerdefinierte Affymetrix-Microarray wurde entwickelt, um einzelne HERV Expression Ort identifizieren und wurde auf Prostata-Krebsgewebe als Proof of Concept für zukünftige klinische Studien verwendet.

Microarray-basierte Identifizierung von Einzel HERV Expression Loci: Anwendung auf Biomarker Discovery in Prostatakrebs

Molekulare Signal sowohl durch Östrogen und microRNAs sind entscheidend bei Brustkrebs Entwicklung und Wachstum. Östrogen aktiviert die Östrogen-Rezeptoren, die Transkriptionsfaktoren sind. Viele Transkriptionsfaktoren die Expression von microRNAs regulieren und Östrogen-regulierten microRNAs kann mit verschiedenen Groß Techniken profiliert werden.

Profiling von Östrogen-regulierte MicroRNAs in Brustkrebszellen

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Laser-Capture-Mikrodissektion als effektive Methode zur Isolierung reiner Populationen von Zelltypen aus heterogenem Prostatagewebe für die nachgeschaltete RNA-Analyse zu verwenden.

Laser-Mikrodissektion für Menschen Prostataepithel für die RNA-Analyse

Immunhistochemie ist eine leistungsfähige Labortechnik zur Bewertung der Proteinlokalisierung und -expression in Geweben. Aktuelle halbautomatische Methoden zur Quantifizierung führen zu Subjektivität und führen oft zu nicht reproduzierbaren Ergebnissen. Darin beschreiben wir Methoden zur Multiplex-Immunhistochemie und zur objektiven Quantifizierung der Proteinexpression und Co-Lokalisierung mittels multispektraler Bildgebung.

Die Quantifizierung der Proteinexpression und Co-Lokalisation Mit Multiplexed immunhistochemischen Anfärbung und Multispektraltechnik

Hier präsentieren wir ein Protokoll zum Nachweis der miRNA-Expression in Brustkrebspatientinnenproben mittels miRNA-in-situ-Hybridisierung.

Clinicopathological Analyse von miRNA Expression in Mammakarzinomen von miRNA Verwendung<em&gt; In Situ</em&gt; Die Hybridisierung

Dieses modifizierte Extraktionsprotokoll verbessert RNA und DNA-Ausbeuten von gezieltere Regionen von Interesse in histopathologischen Gewebeblöcke.

Herstellung von Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten Gewebe Cores sowohl für RNA und DNA-Extraktion

Nukleinsäure-Abbau im Archiv Gewebe, Tumor Heterogenität und einen Mangel an frischen gefrorene Gewebeproben kann negative Auswirkungen auf Krebs-Diagnose-Services in Pathologie Laboren weltweit. Dieses Manuskript beschreibt die Optimierung eines Panels von Biomarkern, die mit einen multiplex magnetischer Wulst-Assay, um Brustkrebs zu klassifizieren.

Optimierung eines Multiplex-RNA-basierten Ausdruck-Assays mit Brust-Krebs-Archivmaterial

Wir präsentieren ein Protokoll, um den Ausdruck-Niveau der zirkulierenden MicroRNA (MiRNAs) bewerten in Plasma-Proben von Krebspatienten. Insbesondere haben wir einen im Handel erhältlichen Bausatz für zirkulierende MiRNA Extraktion und reversen Transkription verwendet. Zu guter Letzt haben wir eine Gruppe von 24 ausgewählten MiRNAs, die unter Verwendung der benutzerdefinierten Platten in Echtzeit vorab gefleckte Sonde analysiert.

Erkennung eines zirkulierenden MicroRNA Custom Panels bei Patienten mit metastasiertem kolorektalen Karzinom

Therapieresistenz entwickelt sich oft bei Patienten mit fortgeschrittenem Prostatakrebs, und in einigen Fällen entwickelt sich Krebs zu einem tödlichen Subtyp namens neuroendokrine minale Prostatakrebs. Die Bewertung der kleinen nicht-kodierenden RNA-vermittelten molekularen Veränderungen, die diesen Übergang erleichtern, würde eine bessere Krankheitsschichtung und Identifizierung von kausalen Mechanismen ermöglichen, die zur Entwicklung von neuroendokrinem Prostatakrebs führen.

Sequenzierung kleiner nicht-kodierender RNA aus formalinfixierten Geweben und Serum-abgeleiteten Exosomen von kastrationsresistenten Prostatakrebspatienten

Das Protokoll beschreibt einen Tandem-Immunfluoreszenz-Hybridisierungsassay mit formalinfixiertem, paraffineingebettetem Gewebe zum gleichzeitigen Nachweis und zur Quantifizierung von microRNA und Multiplexproteinen.

MicroRNA-Amplifikation und -Erkennung durch In-situ-Hybridisierung mit gesperrten Nukleinsäuren als neuartige Detektions- und Quantifizierungsmethode

Lernen Sie eine vereinfachte Arbeitsablauf für miRNA-Expressionsanalysen in archivierten Prostatakrebs-Gewebeproben mittels quantitativer Echtzeit-PCR und in situ-Hybridisierung. Diese Methode ermöglicht präzise Biomarker-Quantifizierung.

miRNA-Expressionsanalysen in Prostate Cancer Clinical Tissues

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