Name: miRNA-Expressionsanalysen in Prostate Cancer Clinical Tissues (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Lernen Sie eine vereinfachte Arbeitsablauf für miRNA-Expressionsanalysen in archivierten Prostatakrebs-Gewebeproben mittels quantitativer Echtzeit-PCR und in situ-Hybridisierung. Diese Methode ermöglicht präzise Biomarker-Quantifizierung.

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Wir danken Herrn Dr. Roger Erickson für seine Unterstützung und Hilfe bei der Erstellung des Manuskripts. Diese Arbeit wurde von der National Cancer Institute an der National Institutes of Health (Förderkennzeichen RO1CA177984; RO1CA138642), VA-Programm Projekt Prostatakrebs (BX001604).

Formalin-fixierte, in Paraffin eingebettete (FFPE) oder frisch gefrorenem Prostatakrebs Proben wurden aus dem SFVAMC erhalten. Proben wurden von Prostatakrebs-Patienten, die radikale Prostatektomie bei SFVAMC unterzog. Eine schriftliche Einverständniserklärung wurde von allen Patienten erhalten, und die Studie wurde von der UCSF Ausschuss für Menschenforschung genehmigt. Alternativ wurden Prostatakrebs Gewebe-Mikroarrays aus kommerziellen Quellen beschafft und verwendet für die miRNA-Analysen von ISH. Klinisch-pathologischen und Follow-up-Informationen für analysiert Prostatakrebs-Patienten gesammelt. 1. Gewebeproben <ol><li> Geschnitten Prostatakrebs Gewebeproben in 10 um-Schnitte mit einem Mikrotom und Fleck mit H &amp; E folgende Protokoll des Herstellers. </li><li> Überprüfen gefärbten Objektträger für die Identifizierung von Prostatakrebs Herde sowie angrenzenden normalen Drüsenepithel. Hinweis: ein Board Certified Pathologen sollte die H &amp; E-gefärbten Schnitten und ma überprüfenrk für die Tumor-und normalen Bereichen. Verwenden Sie die markierten Folien als Führer in den folgenden Abschnitten für die miRNA-Analysen von Tumor vs normalen Bereichen. </li></ol> 2. miRNA Expressionsanalysen durch quantitative Echtzeit-PCR Hinweis: Dieser Workflow beinhaltet die folgenden Schritte: Laser Mikrodissektion, Isolierung von Gesamt-RNA (einschließlich miRNA und mRNA), Testen von reifen miRNAs mit den TaqMan MicroRNA Expression Assays, wie in den folgenden Abschnitten beschrieben. <ol><li> RNA-Extraktion <ol><li> Isolierung von miRNA aus Prostatakrebs FFPE Gewebe <ol><li> Laser Mikrodissektion (LCM) Hinweis: Führen Sie die Schritte 2.1.1.1.1- 2.1.1.1.4 in einem Chemieabzug benutzen. <ol><li> Bereiten Gewebeschnitten (10 &amp; mgr; m Sektionen) für LCM. Deparrafinize Gewebeschnitten durch Einweichen in Xylol (2x), für jeweils 10 min, dann rehydrieren das Gewebe durch Inkubation der Objektträger für 5 Minuten jeweils in abgestuften Ethanol (100%, 95%, 90%, 80%, 70%), gefolgt von destilliertem Wasser(5 min). </li><li> Nach der Rehydrierung, Flecken Schnitte mit Hämatoxylin für 30 Sekunden, gefolgt von Wasser. </li><li> Ort Geweben in abgestuften Ethanol (70%, 95% 90%, 80%, 70%) (jeweils 5 min) und Xylol (5 min). </li><li> Trockenrutschen in einem Abzug und legen Sie dann in der LCM Instrument zur Mikrodissektion. </li><li> Führen Mikrodissektionen mit dem LCM-System in Übereinstimmung mit den Anweisungen von 24 des Herstellers. Verwendung Pathologen bis gleitet als Führungen für die Identifizierung von Prostatakrebs Brennpunkte sowie angrenzende normale Gewebe markiert. Verwenden des Laserstrahls auf einen um Durchmesser 10-20 Pulsen mit einer Leistung von 70-90 mW. </li><li> Capture-Bereiche von Interesse mit Infrarot-Laserimpulse auf LCM Kappen. Kombinieren Zellen 2-5 Kappen für miRNA-Extraktion pro Probe. Um die Integrität der extrahierten RNA zu gewährleisten, umgehend bearbeiten fangenen Zellen für die miRNA-Extraktion. </li><li> Alternativ lysieren Zellen in der miRNA-Extraktionspuffer (gemäß dem Herstellerprotokoll) und STOWieder Lysate bei -80 ºC. </li></ol></li><li> miRNA Extraktion und Analyse von LCM mikrodissezierten Tissues <ol><li> Extrahieren Gesamt-RNA aus microdissected FFPE-Geweben unter Verwendung eines kommerziellen Kits nach den Anweisungen des Herstellers. Hinweis: Die Ausbeute an RNA von Laser-Capture-miscrodissection typischerweise niedrig ist. Daher wird RNA in geringen Mengen (20-30 ul) eluiert und für die Expression Profiling mit Taqman microRNA Expressionsassays folgenden Herstellerangaben (auch in Abschnitt 2.2 beschrieben) verwendet. Optimierung der Eingangs RNA für Echtzeit-PCR-Nachweis von reifen miRNAs schlägt vor, dass 5 ul der eluierten RNA ist optimal für jedes miRNA-spezifische reverse Transkriptionsreaktion. Als endogene Kontrolle wird RNU48 / RNU24 verwendet. Für Kontrollreaktionen, wurde mit 2 ul der eluierten RNA für die reverse Transkriptionsreaktion verwendet wird. </li></ol></li></ol></li><li> Isolierung von miRNA aus Prostatakrebs Gefrorene Gewebe <ol><li> Homogenisieren froren resezierten Prostatagewebe durch Schleifen die Gewebe in flüssigem Stickstoff mit einem Mörser und Stößel. Übertragen homogenisiertem Gewebe ein Mikrozentrifugenröhrchen unter Verwendung einer gekühlten Spachtel. Pflegen Sie den Mörtel / Stößel und Spachtel auf der gleichen Temperatur durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff so homogenisierte Gewebe können leicht übertragen werden. </li><li> Hinzufügen kommerziellen Guanidinisothiocyanat-Phenol-Reagenz (1 ml / 0,1 g Gewebe) zu der homogenisierten Gewebe und Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min. Hinweis: homogenisierte Gewebe in das Handels Guanidinisothiocyanat-Phenol-Reagenz kann bei -80 ° C mehrere Monate gelagert werden. </li><li> In Chloroform zum Homogenat (0,2 ml Chloroform / ml) und kräftig schütteln für 30 Sekunden. Proben Inkubieren bei Raumtemperatur für 3-5 min, gefolgt von Zentrifugation bei 10.000 × g für 20 min bei 4 ºC. </li><li> Übertragen Sie die obere wässrige Phase in ein frisches steriles RNase-freies 1,5 ml-Tube. </li><li> Hinzufügen eines gleichen Volumens Isopropylalkohol. Mischen und Inkubation für 10 min bei RT, gefolgt von Zentrifugation bei 12.000 xg für 20 min bei 4 ºC, um die RNA zu pelletieren. </li><li> Den Überstand aspirieren und waschen Sie die RNA-Pellet mit 1 ml 70% Ethanol. Zentrifuge bei 12.000 g für 10 min bei 4 ºC. </li><li> Vorsichtig den Überstand aspirieren. Dry RNA-Pellets bei RT für 5-10 min. Lösen sich RNA in 50-100 ul Nuklease-freies Wasser. </li><li> Führen Quantifizierung von RNA unter Verwendung eines Nanodrop Spektralphotometer und festzustellen, RNA-Integrität mit einem Bioanalyzer. Einstellen RNA-Konzentrationen bis 10 ng / &amp; mgr; l. Verwenden Sie 10-50 ng RNA für die miRNA-spezifischen cDNA-Reaktion, gefolgt von Echtzeit-PCR-Analysen (Abschnitt 2.2). </li></ol></li></ol></li><li> Quantitative Real-time PCR zur miRNA-Expressionsanalysen Hinweis: Assay für reife miRNA Verwendung wie unten beschrieben ein zweistufiges RT-PCR-Protokoll. <ol><li> Reverse Transkription (RT) <ol><li> Reverse Transkription von cDNA aus RNA unter Verwendung eines Reverse-Transkriptions-miRNA-Kit gemäß den Anleitungen des Herstellers.Verwenden Sie 10-50 ng Gesamt-RNA mit miRNA spezifische Primer aus der MicroRNA Assays und RT-Kit. Verwenden RNU48 / RNU24 / RNU6B als Kontrollen. Verdünnte cDNA 1: 5 bis 1:10 (in Abhängigkeit von der Fülle der analysierten miRNA) und die Verwendung in Echtzeit-PCR-Nachweis, wie im folgenden Schritt beschrieben. </li></ol></li><li> Real-time PCR zum Nachweis von miRNA Ältere <ol><li> Verstärken PCR-Produkten aus cDNA-Proben unter Verwendung der MicroRNA Assays mit einer Fast-Universal-Master-Mix in Übereinstimmung mit den Anweisungen des Herstellers. Normalisieren Proben RNU48 / RNU24 / RNU6B Kontrolle. Verwenden Sie die Vergleichs Ct (threshold cycle) -Methode, um die relativen Veränderungen in der Genexpression auf der Fast-Echtzeit PCR-System zu berechnen. Analysieren Sie jede Probe in dreifacher Ausfertigung. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. miRNA Expressionsanalysen durch in situ Hybridisierung (ISH) <ol><li> Vorbehandlung von Geweben <ol><li> Schneiden Sie 5 um Abschnitte aus FFPE Prostatakrebsgewebeblöcke mit einem Mikrotom. </li><li&gt; Fix Gewebeschnitten durch Inkubation der Objektträger bei 56 ° C für 1 Stunde. Hinweis: Die Objektträger können bei RT für mehrere Wochen gelagert werden für miRNA-Analysen. </li><li> Deparrafinize der Gewebe durch Einweichen der Folien mit Xylol (2 x), für jeweils 15 min. </li><li> Rehydrieren das Gewebe durch Inkubation der Objektträger für 5 Minuten jeweils in abgestuften Ethanol (100% (2x), 95%, 90%, 80%, 70%), gefolgt von destilliertem Wasser (5 min). </li><li> Befestigen Sie die Objektträger mit 4% Paraformaldehyd in PBS bei Raumtemperatur für 20 min. </li><li> Waschen der Objektträger mit PBS (2x) bei Raumtemperatur für jeweils 5 Minuten. </li><li> Behandeln die Folien mit 10 &amp; mgr; g / ml Proteinase K bei 37 ºC für 10 min in vorgewärmtem Proteinase K-Puffer (5 mM Tris-HCL pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM NaCl). </li><li> Im Anschluss an Proteinase-K-Behandlung, spülen Sie die Folien mit 0,2% Glycin in PBS für 30 Sekunden. </li><li> Waschen Folien in PBS (1x) bei Raumtemperatur für 5 min. </li><li> Befestigen Sie die Objektträger mit 4% Paraformaldehyd in PBS für 15 min. </li><li> Rinse Dias mitPBS für 5 min. </li></ol></li><li> Hybridisierung <ol><li> Vorge hybridisieren die Folien mit Vorhybridisierungslösung für 3-4 h bei 55 ºC in einer befeuchteten Kammer. Benutzen Sie Gewebelaborwischtücher in 50% Formamid / 50% 5x SSC eingeweicht zu halten, der Kammer befeuchtet. </li><li> Benutzen 5&#39;Digoxigenin markierten Sonden in einer Konzentration von 20-50 nM in Hybridisierungspuffer. Verdünnen Sie miRNA-spezifischen Sonde (20-50 nM) und Snrna U6 Kontrollsonde (20 nM), Wärme bei 90 ° C für 4 Minuten, legen Sie es auf Eis und in den kalten Hybridisierungspuffer Eis (2-4 ng / ul ). </li><li> Entfernen Vorhybridisierungslösung, fügen Hybridisierungslösung (Sonde + Hybridisierungspuffer, 100 ul pro Folie), Inkubation für 12-16 Stunden bei sondenspezifischen Hybridisierungstemperatur (Hybridisierungstemperatur = Tm-Sonde-21 ºC). Zuführen Hybridisierungen in einer feuchten Kammer (50% Formamid / 50% 5x SSC). </li></ol></li><li> Waschschritte <ol><li> Waschen Sie die Objektträger mit 2 × SSC für 10 Minuten bei 45 ºC. </li><li> Wash tEr gleitet mit 1,5x SSC für 10 Minuten bei 45 ºC. </li><li> Waschen Sie die Objektträger mit 0,2 × SSC (2x) bei 37 ºC für jede 20 min. </li><li> Objektträger mit 1x Blockierungslösung inkubieren 1-2 Stunden bei Raumtemperatur </li></ol></li><li> Erkennung <ol><li> Die Objektträger mit 1 inkubieren: 100 PBS verdünntes AP-konjugierten Anti-Digoxigenin-Antikörper für 1-4 Stunden oder über Nacht bei 4 ºC. </li><li> Waschen Sie die Objektträger mit PBS (3x) bei Raumtemperatur für jeweils 10 min. </li><li> Für jeweils 5 min Waschen der Objektträger (2x) mit alkalischer Phosphatase-Puffer (100 mM Tris pH 9,5, 50 mM MgCl 2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween-20) bei RT. </li><li> Die Folien in BM Lila AP-Substrat Inkubieren im Dunkeln bei RT 1-20 Std. </li><li> Mit PBS, das 0,1% Tween-20 und Wasch (2x) in Wasser zu spülen Sie die Folien. </li><li> Montieren Sie die Objektträger unter Verwendung einer wässrigen Eindeckmittel und untersuchen unter dem Mikroskop. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben keine finanziellen Angaben.

In diesem Artikel beschreiben wir einen vereinfachten Workflow für die miRNA-Expression Profiling in archivierten FFPE oder gefrorenes Frisch Prostatakrebs klinischen Gewebe. Bei Prostatakrebs, schlagen mehrere Studien eine wichtige Rolle von microRNAs im Prostatakrebs Initiation, Progression und Metastasierung. Allerdings sind widersprüchliche Ergebnisse oft auf einen bestimmten miRNA 22 seit der miRNA-Extraktion erhalten und analysiert Methoden weit auseinander. Im Hinblick auf die Schwellen Nachweise für d...

Krebs der Prostata ist eine häufig diagnostiziert männlicher Bösartigkeit, die eine der führenden Ursachen von Krebs bedingte Sterblichkeit unter den Menschen ist. In US schätzungsweise 220.800 neue Fälle und 27.540 Todesfälle im Jahr 2015 1 gemeldet werden. Prostatakrebs ist eine heterogene Erkrankung mit sehr variablen Krankheits Kurs- Tumoren können indolenten oder sehr aggressiv sein. Eine kritische Herausforderung bei Prostatakrebs klinische Management wird durch die Unzulänglichkeit der derzeit verwendeten Methoden / Biomarker für Krankheiten Screening, Diagnose, Prognose und Behandlung 2 gestellt. Stromscreeningverfahren schließen Prostata-spezifischen Antigens (PSA) und eine digitale rektale Untersuchung (DRU), gefolgt von Prostatabiopsien 3. Prostata-spezifisches Antigen (PSA) ist die am weitesten verbreitete Prostatakrebs-Biomarker, die deutlich revolutioniert hat das Klinikmanagement und verbesserte Überlebensraten 4. Jedoch aufgrund der inhärenten Beschränkungen der PSA einschließlich lack Spezifitäts PSA basierten Screening auf über Diagnose und über die Behandlung der Krankheit geführt. Im Hinblick darauf werden die intensiven Bemühungen in Richtung auf eine Suche nach alternativen Prostatakrebs biomarkers gerichtet, insbesondere solche, die die Aggressivität der Erkrankung vorherzusagen und fahren bessere Behandlungsentscheidungen 4,5 kann. In den letzten Jahren wurden microRNAs (miRNAs) als vielversprechende alternative Prostatakrebs biomarkers entstanden. MicroRNAs (miRNAs) stellen eine evolutionär konservierte Klasse von kleinen nicht-kodierenden RNAs, die die Genexpression über sequenzspezifische Wechselwirkungen mit den 3&#39;-untranslatierten Regionen (UTR) des verwandten mRNA-Ziele zu unterdrücken posttranskriptional. Es wird geschätzt, dass&gt; 60% der mRNAs konserviert Ziele miRNAs 6. miRNA-Gene sind in Intergenregionen oder innerhalb Introns oder Exons von Protein / Nicht-Protein kodierende Gene 7 angeordnet. Diese Gene werden vorzugsweise durch RNA-Polymerase II in prima transkribiertry miRNAs (pri-miRNAs mehrere Kilobasen lang), dass die Form Haarnadel-förmigen Stammschleife Sekundärstrukturen. Diese pri-miRNAs werden in Vorläufer-miRNAs (pre-miRNAs, 60-75 Nukleotide lange), die in das Zytoplasma exportiert und weiter zu reifen miRNAs (18-25 Nukleotide lange) 8-10 verarbeitet verarbeitet. miRNAs regulieren Schlüssel zelluläre Prozesse einschließlich Verbreitung, Entwicklung, Differenzierung und Apoptose 11. Studien legen nahe, eine weit verbreitete Fehlregulation der miRNA-Expressionsprofile in verschiedenen menschlichen Tumoren einschließlich Prostatakrebs 12-15. miRNA-Expressionsprofile wurde berichtet, weit verbreitet in der primären und metastatischen Prostatakrebs fehlreguliert werden. Veränderte miRNA-Expression wurden mit Prostatakrebs Progression, Aggressivität und Rezidivhervorhebung der prognostische Potential von miRNAs 12,14,16-19 Verbindung gebracht worden. Eine wachsende Zahl von Beweisen zeigt, dass miRNAs spielen wichtige mechanistische Rolle bei Prostatakrebs Initiierung, Entwicklung, FortschrittIonen und Metastasierung. Insgesamt miRNAs entstehen als vielversprechende alternative Biomarker für Prostatakrebs Diagnose und Prognose, die zwischen normalen und Krebsgeweben und Hilfe bei der Stratifizierung von Prostata-Tumoren 12 unterscheiden kann. Auch miRNAs sind wichtige Ziele für die Entwicklung wirksamer Therapeutika gegen Prostatakrebs 20. Aufgrund ihrer geringen Größe und der Beständigkeit gegenüber endogenen RNase-Aktivität sind miRNAs stabile Biomarkern, die in Formalin fixierten Geweben 21 und in Prostatabiopsien 22 leicht erkannt werden können. Darüber hinaus haben die Expressionsprofile von miRNAs in gefrorenen und Formalin fixierten Geweben verglichen worden und haben sich als stark korreliert sein 21. Allerdings ist miRNA Expression Profiling bei Prostatakrebs klinischen Geweben oft eine Herausforderung aufgrund Tumorheterogenität, Stichprobenfehler, Stroma-Kontaminationen etc. Die Entwicklung von miRNAs als effektive Biomarker für Prostatakrebs stark relies auf ihre genaue Erfassung der klinischen Gewebe. Hier beschreiben wir einen vereinfachten Workflow in unserem Labor für die miRNA-Expression Profiling in archivierten FFPE oder gefrorenes Frisch Prostatakrebs klinischen Proben verwendet. Wir verwenden eine Kombination quantitativer Echtzeit-PCR und in situ Hybridisierung für miRNA-Analysen von klinischen Proben mit dem früheren Gewinnung quantitativer Informationen und letztere zur Visualisierung der differentiellen Expression potentieller miRNA Biomarkern in einem Array von Geweben. In diesem Workflow optimieren wir die bestehenden Methoden für die miRNA-Extraktion aus FFPE und gefrorenen Prostatagewebe, Analysen Expression durch Taqman-Sonde basiert miRNA RT-PCR und miRNA in situ-Hybridisierungstechnik unter Verwendung gesperrt Nukleinsäure (LNA) -basierte Sonden 23. LNA-basierte Sonden bieten eine erhöhte Sensitivität und Spezifität gegenüber DNA- oder RNA-Sonden basiert und ermöglicht robuste Erkennung aller miRNA-Sequenzen, unabhängig von ihrem GC-Gehalt und erlauben auch Diskriminierungtion der miRNA-Familien. Unsere optimierte miRNA ISH-Protokoll kann zur Prostatakrebsgewebe Dias oder Prostatakrebs Tissue Microarrays (TMA) und bietet das Potenzial, miRNA Biomarkern beschleunigen angewendet werden, wobei die letzteren.

<table><tbody><tr><td>Mikrotom</td><td>Leica Biosystems&nbsp;</td><td>RM2255</td><td></td></tr><tr><td>Arcturus Autopix für LCM</td><td>Arcturus/ Life Technologies</td><td>LCM1621/LCM1110</td><td>Alternativ kann das Arcutus Xt System von Life Technolgies verwendet werden.</td></tr><tr><td>CapSure Macro LCM Caps</td><td>Life Technologies</td><td>LCM0211</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy FFPE Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>217504</td><td></td></tr><tr><td>7500 Schnelles Echtzeit-PCR-System&nbsp;</td><td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td><td>4351106</td><td></td></tr><tr><td>Taqman MicroRNA Reverse Transkriptionskit&nbsp;</td><td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Fast Universal PCR Mastermix&nbsp;</td><td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td><td>4352042 DIG-markierte</td><td></td></tr><tr><td>LNA-Sonde für U6</td><td>Exiqon</td><td>99002-01</td><td></td></tr><tr><td>BM Purple AP-Substrat</td><td>Roche</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>Pre-Hybridisierungslösung&nbsp;</td><td>Biochain</td><td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-1</a></td><td></td></tr><tr><td>Hybridisierungslösung&nbsp;</td><td>Biochain</td><td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-2</a></td><td></td></tr><tr><td>Blockierungslösung&nbsp;</td><td>Biochain</td><td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-8</a></td><td></td></tr><tr><td>AP-konjugierter Anti-Digoxigenin-Antikörper</td><td>Biochain</td><td><a href="http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf">K2191050-7</a></td><td></td></tr><tr><td>Wässrige Eindeckmedien&nbsp;</td><td>Vector Laboratorien&nbsp;</td><td>H-5501&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Trizol (Guanidin-Isothiocyanat-Phenol-Reagenz)&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15596018">15596-018</a>Harris</td><td></td></tr> <tr><td>Hämatoxylin</td><td>Statlab</td><td>SL200</td><td></td></tr><tr><td>Eosin&nbsp;</td><td>Statlab</td><td>SL201&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

mirna-expressionsanalysen in prostate cancer clinical tissues

miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues

Eine kritische Herausforderung bei Prostatakrebs (PCa) klinische Management wird durch die Unzulänglichkeit der derzeit verwendeten Biomarker für Krankheiten Screening, Diagnose, Prognose und Therapie gestellt. In den letzten Jahren microRNAs (miRNAs) als vielversprechende alternative Biomarker für Prostatakrebs Diagnose und Prognose entstanden. Jedoch ist die Entwicklung von miRNAs so wirksam Biomarker für Prostatakrebs in hohem Maße von ihrer genauen Nachweis klinisch Geweben. miRNA-Analysen bei Prostatakrebs klinischen Proben ist häufig eine Herausforderung aufgrund Tumorheterogenität, Stichprobenfehler, Stroma-Kontaminationen etc. Das Ziel dieses Artikels ist es, einen vereinfachten Workflow beschreiben, für die miRNA-Analysen in archivierten FFPE oder gefrorenes Frisch Prostatakrebs klinischen Proben mit einer Kombination aus quantitative Echtzeit-PCR (RT-PCR) und in situ Hybridisierung (ISH). In diesem Workflow optimieren wir die bestehenden Methoden für die miRNA-Extraktion aus FFPE und eingefroren Prostata tissuES und Expressionsanalysen durch Taqman-Sonde basiert miRNA RT-PCR. Darüber hinaus beschreiben wir ein optimiertes Verfahren zur ISH Analysen formiRNA Erkennung in Prostatagewebe mit gesperrten Nukleinsäure (LNA) - basierten Sonden. Unsere optimierte miRNA ISH-Protokoll kann zur Prostatakrebsgewebe Dias oder Prostatakrebs Tissue Microarrays (TMA) angewendet werden.

Expression Profiling von miR-203 in LCM primären Prostatakrebs klinischen Proben durch RT-PCR-Analysen (Abbildung 1) RT-PCR-Analysen von relativen miR-203-Expression in LCM primären Prostatakrebsgewebe und die angepaßten angrenzenden normalen Regionen erfolgt wie in Saini et al. 15 RNU48 beschrieben wurde als eine Kontrolle verwendet wurde. Die folgende Tabelle fasst die relative miR-203 Expression in Prostatakrebstumorgewebe relativ zu benachbarten norma...

Hier beschreiben wir ein vereinfachtes Protokoll für microRNA (miRNA)-Expressionsanalysen in archivierten klinischen Geweben mit Formalin-fixiertem, Paraffin-eingebettetem (FFPE) oder frisch gefrorenem Prostatakrebs (PCa) unter Verwendung von quantitativer Echtzeit-PCR (RT-PCR) und in situ Hybridisierung (ISH).

miRNA-Expressionsanalysen in Prostate Cancer Clinical Tissues

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, ...

Das übergeordnete Ziel dieses Videos ist es, einen vereinfachten Arbeitsablauf für die Analyse von Mikro-RNAs in archivierten klinischen Proben des Prostatakarzinoms zu beschreiben, wobei eine Kombination aus quantitativer Echtzeit-PCR und NC-Zwei-Hybridisierung unter Verwendung von auf gesperrten Nukleinsäuren basierenden Sonden eingesetzt wird. Dies wird erreicht, indem zuerst Gewebe aus FFPE-Schnitten des Prostatakarzinoms mittels Laser-Mikrodissektion isoliert und anschließend eine Mikro-RNA-Extraktion durchgeführt wird. Danach wird eine zweistufige RT-PCR verwendet, um die Mikro-RNA im Gewebe zu quantifizieren, und zur Lokalisierung der Mikro-RNA wird eine Zwei-Hybridisierungsanalyse mit digoxigeninmarkierten LNA-Sonden sowie einem AP-konjugierten Antikörper durchgeführt, der mittels BM-Purple nachgewiesen wird.Die dargestellten Ergebnisse zeigen die Expression eines mikro-RNAs in klinischen Gewebeproben von Prostatakrebs. Mithilfe dieser Techniken haben sich mikro-RNAs kürzlich als vielversprechende alternative Biomarker für Prostatakrebs herauskristallisiert. Die Analyse der mikro-RNA-Expression in klinischen Prostatakrebsproben ist jedoch aufgrund störender Faktoren wie der

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Quantitative Real Time Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) ist eine schnelle und empfindliche Methode, um die Expression verschiedener microRNA (miRNA) Moleküle in Tumorproben zu untersuchen. Unter Verwendung dieses Verfahrens Expression von Hunderten von verschiedenen miRNA-Moleküle können verstärkt, quantifiziert werden, und analysiert die gleiche cDNA-Matrize.

MicroRNA-Detektion in Prostatatumoren durch quantitative real-time PCR (qPCR)

Humanen endogenen Retroviren (HERV), die 8% des menschlichen Genoms zu besetzen, halten knapp Codierung Kapazitäten aber hunderttausend long terminal repeats (LTR). Eine benutzerdefinierte Affymetrix-Microarray wurde entwickelt, um einzelne HERV Expression Ort identifizieren und wurde auf Prostata-Krebsgewebe als Proof of Concept für zukünftige klinische Studien verwendet.

Microarray-basierte Identifizierung von Einzel HERV Expression Loci: Anwendung auf Biomarker Discovery in Prostatakrebs

Molekulare Signal sowohl durch Östrogen und microRNAs sind entscheidend bei Brustkrebs Entwicklung und Wachstum. Östrogen aktiviert die Östrogen-Rezeptoren, die Transkriptionsfaktoren sind. Viele Transkriptionsfaktoren die Expression von microRNAs regulieren und Östrogen-regulierten microRNAs kann mit verschiedenen Groß Techniken profiliert werden.

Profiling von Östrogen-regulierte MicroRNAs in Brustkrebszellen

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Laser-Capture-Mikrodissektion als effektive Methode zur Isolierung reiner Populationen von Zelltypen aus heterogenem Prostatagewebe für die nachgeschaltete RNA-Analyse zu verwenden.

Laser-Mikrodissektion für Menschen Prostataepithel für die RNA-Analyse

Immunhistochemie ist eine leistungsfähige Labortechnik zur Bewertung der Proteinlokalisierung und -expression in Geweben. Aktuelle halbautomatische Methoden zur Quantifizierung führen zu Subjektivität und führen oft zu nicht reproduzierbaren Ergebnissen. Darin beschreiben wir Methoden zur Multiplex-Immunhistochemie und zur objektiven Quantifizierung der Proteinexpression und Co-Lokalisierung mittels multispektraler Bildgebung.

Die Quantifizierung der Proteinexpression und Co-Lokalisation Mit Multiplexed immunhistochemischen Anfärbung und Multispektraltechnik

Hier präsentieren wir ein Protokoll zum Nachweis der miRNA-Expression in Brustkrebspatientinnenproben mittels miRNA-in-situ-Hybridisierung.

Clinicopathological Analyse von miRNA Expression in Mammakarzinomen von miRNA Verwendung<em&gt; In Situ</em&gt; Die Hybridisierung

Dieses modifizierte Extraktionsprotokoll verbessert RNA und DNA-Ausbeuten von gezieltere Regionen von Interesse in histopathologischen Gewebeblöcke.

Herstellung von Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten Gewebe Cores sowohl für RNA und DNA-Extraktion

Nukleinsäure-Abbau im Archiv Gewebe, Tumor Heterogenität und einen Mangel an frischen gefrorene Gewebeproben kann negative Auswirkungen auf Krebs-Diagnose-Services in Pathologie Laboren weltweit. Dieses Manuskript beschreibt die Optimierung eines Panels von Biomarkern, die mit einen multiplex magnetischer Wulst-Assay, um Brustkrebs zu klassifizieren.

Optimierung eines Multiplex-RNA-basierten Ausdruck-Assays mit Brust-Krebs-Archivmaterial

Wir präsentieren ein Protokoll, um den Ausdruck-Niveau der zirkulierenden MicroRNA (MiRNAs) bewerten in Plasma-Proben von Krebspatienten. Insbesondere haben wir einen im Handel erhältlichen Bausatz für zirkulierende MiRNA Extraktion und reversen Transkription verwendet. Zu guter Letzt haben wir eine Gruppe von 24 ausgewählten MiRNAs, die unter Verwendung der benutzerdefinierten Platten in Echtzeit vorab gefleckte Sonde analysiert.

Erkennung eines zirkulierenden MicroRNA Custom Panels bei Patienten mit metastasiertem kolorektalen Karzinom

Therapieresistenz entwickelt sich oft bei Patienten mit fortgeschrittenem Prostatakrebs, und in einigen Fällen entwickelt sich Krebs zu einem tödlichen Subtyp namens neuroendokrine minale Prostatakrebs. Die Bewertung der kleinen nicht-kodierenden RNA-vermittelten molekularen Veränderungen, die diesen Übergang erleichtern, würde eine bessere Krankheitsschichtung und Identifizierung von kausalen Mechanismen ermöglichen, die zur Entwicklung von neuroendokrinem Prostatakrebs führen.

Sequenzierung kleiner nicht-kodierender RNA aus formalinfixierten Geweben und Serum-abgeleiteten Exosomen von kastrationsresistenten Prostatakrebspatienten

Das Protokoll beschreibt einen Tandem-Immunfluoreszenz-Hybridisierungsassay mit formalinfixiertem, paraffineingebettetem Gewebe zum gleichzeitigen Nachweis und zur Quantifizierung von microRNA und Multiplexproteinen.

MicroRNA-Amplifikation und -Erkennung durch In-situ-Hybridisierung mit gesperrten Nukleinsäuren als neuartige Detektions- und Quantifizierungsmethode

Lernen Sie eine vereinfachte Arbeitsablauf für miRNA-Expressionsanalysen in archivierten Prostatakrebs-Gewebeproben mittels quantitativer Echtzeit-PCR und in situ-Hybridisierung. Diese Methode ermöglicht präzise Biomarker-Quantifizierung.

miRNA-Expressionsanalysen in Prostate Cancer Clinical Tissues

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