miRNA-Expressionsanalysen in Prostate Cancer Clinical Tissues

Das übergeordnete Ziel dieses Videos ist es, einen vereinfachten Arbeitsablauf für die Analyse von Mikro-RNAs in archivierten klinischen Proben des Prostatakarzinoms zu beschreiben, wobei eine Kombination aus quantitativer Echtzeit-PCR und NC-Zwei-Hybridisierung unter Verwendung von auf gesperrten Nukleinsäuren basierenden Sonden eingesetzt wird. Dies wird erreicht, indem zuerst Gewebe aus FFPE-Schnitten des Prostatakarzinoms mittels Laser-Mikrodissektion isoliert und anschließend eine Mikro-RNA-Extraktion durchgeführt wird. Danach wird eine zweistufige RT-PCR verwendet, um die Mikro-RNA im Gewebe zu quantifizieren, und zur Lokalisierung der Mikro-RNA wird eine Zwei-Hybridisierungsanalyse mit digoxigeninmarkierten LNA-Sonden sowie einem AP-konjugierten Antikörper durchgeführt, der mittels BM-Purple nachgewiesen wird.

Die dargestellten Ergebnisse zeigen die Expression eines mikro-RNAs in klinischen Gewebeproben von Prostatakrebs. Mithilfe dieser Techniken haben sich mikro-RNAs kürzlich als vielversprechende alternative Biomarker für Prostatakrebs herauskristallisiert. Die Analyse der mikro-RNA-Expression in klinischen Prostatakrebsproben ist jedoch aufgrund störender Faktoren wie der Heterogenität von Prostatatumoren und Faktoren wie stromaler Kontamination oft herausfordernd.

Wir arbeiten seit den letzten 10 Jahren im Bereich der mikroRNA und der nichtcodierenden RNA. Wir haben die Bedingungen für die Expression von mikroRNA in verschiedenen Stadien des Prostatakarzinoms optimiert. Wir sind der Ansicht, dass die Expression von mikroRNA als diagnostischer und prognostischer Biomarker verwendet werden kann, da sie mit dem klinischen Verlauf des Prostatakarzinoms korreliert.

Wir sind außerdem der Ansicht, dass Mikro-RNA mithilfe der Nanopartikeltechnologie zur Behandlung von Prostatakrebs eingesetzt werden kann. Eine genaue Expressionsprofilerstellung beim Prostatakarzinom wird häufig durch die Heterogenität der Läsionen erschwert. Dieses Problem wird teilweise durch den Einsatz der Laser-Kapture-Mikrodissektion oder LCM überwunden, um reine gutartige oder bösartige epitheliale Zellen zu gewinnen und deren Vermischung mit Stroma-Zellen zu verringern.

Laser-Mikrodissektion archivierter FFP-Gewebeproben, gefolgt von der Mikro-RNA-Expressionsprofilierung, hat sich als empfindliche, zuverlässige und kosteneffiziente Methode erwiesen, die als ergänzende Technik optimiert wurde. Die Hybridisierung auf C zwei bietet einen Überblick darüber, wo die Mikro-RNAs exprimiert werden. Sobald die Gewebeproben gesammelt und in 10-Mikrometer-Schnitte aufgeteilt wurden, entfernen Sie das Paraffin in einem Abzug, indem Sie die Objektträger zwei Mal je 10 Minuten in Xylol einlegen und anschließend das Gewebe durch sukzessive alkoholische Bäder mit zunehmendem Wasseranteil rehydrieren. Danach wenden Sie eine Hämatoxylin-Färbung für 30 Sekunden an und spülen die Objektträger mit Wasser ab.

Nun rehydrieren Sie die Gewebe durch eine weitere alkoholische Abstufung, beginnend mit 70 %. Danach spülen Sie die Schnitte fünf Minuten lang in Xylol und lassen sie an der Luft trocknen. Bringen Sie die getrockneten Objektträger zum Laser-Mikrodissektionsgerät. Verwenden Sie vom Pathologen markierte Objektträger, um die Herde des Prostatakarzinoms sowie benigne beziehungsweise normale Bereiche zu identifizieren.

Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für die Durchführung der Laser-Mikrodissektion. Stellen Sie die Strahlbreite auf 10 bis 20 Mikrometer ein und pulsieren Sie mit 70 bis 90 Milliwatt. Verwenden Sie Infrarotpulse, um interessierende Bereiche auf Laser-Mikrodissektionskappen zu übertragen.

Fügen Sie für jede Probe den Inhalt der Kappe einem Sammelröhrchen hinzu und verarbeiten Sie die Zellen unverzüglich zur Extraktion von mikro-RNA. Extrahieren Sie die gesamte RNA mithilfe eines kommerziellen Kits gemäß den Herstelleranweisungen. Eluieren Sie die RNA in 20 bis 30 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser und fahren Sie zügig fort.

Verwenden Sie anschließend ein Reverse-Transkriptase-Reaktionskit, um cDNAs unter Verwendung spezifischer Primer für mikro-RNA herzustellen. Richten Sie jede Reaktion mit 10 bis 100 Nanogramm Gesamt-RNA ein. Verdünnen Sie die cDNA nach der Gewinnung um einen Faktor von fünf bis 10, um eine Konzentration von etwa einem bis 20 Nanogramm zu erreichen.

Richten Sie nun die PCR-Reaktionen in Dreifachbestimmung aus der CDNA mit Mikro-RNA-Assays unter Verwendung eines schnellen universellen Mastermixes für die Kontrolle ein. Verwenden Sie RNU 48 als Vorlage, um die relative Änderung der Genexpression zu berechnen. Wenden Sie die vergleichende CT-Methode an, um die fünf Mikrometer dicken Gewebeschnitte vorzubehandeln.

Fixieren Sie die Objektträger eine Stunde lang bei 56 Grad Celsius. Danach führen Sie eine Entparaffinierung der Objektträger mit zwei Xylolbädern bei Raumtemperatur durch, jedes Bad dauert 15 Minuten. Anschließend rehydrieren Sie das Gewebe durch eine abgestufte Ethanolreihe. Danach lassen Sie das Gewebe fünf Minuten lang in Wasser einweichen.

Als Nächstes fixieren Sie die Gewebe mit 4 % PFA in PBS bei Raumtemperatur für 20 Minuten. Spülen Sie das Fixativ mit zwei fünfundzwanzigminütigen Waschungen in PBS ab. Geben Sie nun potente Proteinase K mit 10 Mikrogramm pro Milliliter in vorgewärmten Proteinase-K-Puffer oben hinzu und inkubieren Sie die Gewebe bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten.

Nach der Behandlung die Objektträger 30 Sekunden lang mit 0,2 % Glycin in PBS spülen und anschließend fünf Minuten bei Raumtemperatur in PBS waschen. Danach erneut 15 Minuten in 4 % PFA einweichen. Abschließend den Fixator erneut mit zwei fünfundzwanzigminütigen PBS-Bädern abwaschen.

Die Gewebe sind nun bereit für die Hybridisierung. Ziehen Sie zunächst mit einem Markierstift einen hydrophoben Kreis um das Gewebe, damit die Lösung in den folgenden Schritten auf dem Gewebeschnitt verbleibt. Inkubieren Sie die Gewebe drei bis vier Stunden lang bei 55 Grad Celsius in Puffer für die Vorhybridisierung.

Führen Sie dies in einer Kammer durch, die durch mit 50 % Formamid und 50 % 5× SSC-Lösung getränkte Tücher befeuchtet ist. Bereiten Sie nun die Digoxigenin-markierte, mikro-RNA-spezifische Sonde sowie die Kontrollsonde vor. Planen Sie eine Verdünnung von 20 bis 50 Nanomolar ein, verdünnen Sie die Sonden jedoch zunächst mit nur 25 Mikrolitern Hybridisierungspuffer, also weniger als für die endgültige Verdünnung benötigt. Erhitzen Sie anschließend die Sonden auf 90 Grad Celsius für etwa vier Minuten.

Dann legen Sie die Sonden auf Eis. Verdünnen Sie die Sonden abschließend mit eiskaltem Hybridisierungspuffer auf ihre endgültigen Konzentrationen von 20 bis 50 Nanomolar. Geben Sie nun 100 bis 400 Mikroliter der Sondenlösung auf jeden Objektträger.

Anschließend 12 bis 16 Stunden bei der geeigneten Hybridisierungstemperatur inkubieren. Am nächsten Tag eine SSC-Lösungswaschung in mehreren Schritten nach den Waschungen durchführen. Die Objektträger nach der Blockierung eine bis zwei Stunden bei Raumtemperatur in der Blockierungslösung inkubieren.

Befeuchten Sie die Gewebe mit einer Verdünnung von 1:100 des AP-konjugierten Antikörpers gegen Genin in PBS. Führen Sie dies für eine bis vier Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius durch. Entfernen Sie anschließend den überschüssigen Antikörper durch drei Waschungen mit PBS, jeweils zehn Minuten lang.

Führen Sie zwei fünfundzwanzigminütige Waschungen in einem Puffer auf Basis von Urin bei Raumtemperatur durch. Anschließend inkubieren Sie die Objektträger ein bis zwanzig Stunden lang in BM Purple, AP-Substrat, lichtgeschützt bei Raumtemperatur. Am nächsten Tag entfernen Sie das BM Purple durch Spülen mit 0,1 % zwischen 20 in PBS.

Anschließend zwei Mal mit Wasser waschen und mit wässrigen Eindeckmedien nach der beschriebenen Protokoll zur Mikro-RNA-Extraktion und RT-PCR eindecken. Mikro-RNA-203 wurde in Prostatakarzinom- und normalen angrenzenden Geweben untersucht. Die relative Expression variierte in einem erheblichen Anteil der Gewebe.

RNU 48 wurde als Kontrolle verwendet. Prostatatumorgewebe wurde entweder mikroskopisch mikrodisseziert oder LCM unterzogen und anschließend die relative Mikro-RNA-Expression von miR-383 im Tumorgewebe mit den entsprechenden normalen Kontrollen verglichen.

LCM-behandeltes Gewebe wies eine zuverlässigere Detektion der Mikro-RNA-Expression auf. In C erfolgte die Hybridisierung an Mikro-RNA-2-0-3 in normalem und knöchernem metastasiertem Prostatatumorgewebe. U sechs.

Die RNA-Detektion wurde basierend auf der Färbungsintensität als Kontrolle verwendet. Die Expression von microRNA 203 wurde in den Zellen jedes Gewebes von eins bis vier bewertet. Die Expression erwies sich somit als statistisch niedriger im Knochenmetastasengewebe.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Expression von Mikro-RNAs in klinischen Proben von Prostatakrebs bewertet werden kann. Während des gesamten Arbeitsablaufs ist es äußerst wichtig, eine RNA-freie Umgebung aufrechtzuerhalten. Außerdem kann die Arbeit mit Paraformaldehyd und Kochsalzlösung äußerst gefährlich sein, und es sollten stets Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, beispielsweise die Arbeit in einem Abzug und das Tragen persönlicher Schutzausrüstung, während dieses Verfahren durchgeführt wird.

Nach diesem Verfahren führen wir eine statistische Analyse durch, um zu beurteilen, ob Mikro-Expressionsmuster mit den klinisch-pathologischen Variablen der Erkrankung korrelieren, was uns hilft, zentrale Fragen zu beantworten, beispielsweise, ob die Expression eines bestimmten Mikro-RNAs ein assoziiertes prognostisches oder diagnostisches Potenzial aufweist. Unser optimiertes Mikro-RNA-in-C-zwei-Hybridisierungsprotokoll kann auf Prostatakarzinom-Gewebeschnitten oder Prostatakarzinom-Gewebemikroarrays angewendet werden. Dieses Protokoll kann nach Optimierung auch auf andere Gewebetypen angewendet werden.