Die Maus Round-Fenster-Ansatz für Ototoxische Agent-Lieferung: eine schnelle und zuverlässige Technik zur Induktion Cochlear Zelldegeneration

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein Modell für eine Innenohrverletzung zu etablieren, indem ototoxische Substanzen gezielt in die Rundfensternische des Mauscochleae appliziert werden. Dies wird erreicht, indem zunächst die subkutane Fettschicht präpariert und der Muskelkörper vorsichtig zurückgezogen wird, um das Periost der tympanalen Bulla freizulegen. Der zweite Schritt besteht darin, die Bulla durch schrittweises Entfernen von Knochenfragmenten zu öffnen, bis die Rundfensternische sichtbar ist.

Anschließend wird die sichtbare Flüssigkeit im Mittelohr und im Runden-Fenster-Nischenbereich vollständig getrocknet, um eine optimale Sicht auf die Runde-Fenster-Nische zu ermöglichen. Der letzte Schritt besteht darin, die Runde-Fenster-Nische mit dem ausgewählten ototoxischen Wirkstoff zu füllen, ohne die Arteria stapedialis (STA) am Fußplatte zu verletzen, gefolgt von entsprechenden Wiederholungen gemäß den Spezifikationen des Wirkstoffs. Abschließend werden funktionelle Verfahren, einschließlich der auditorischen Hirnstammantwort, sowie morphologische Untersuchungen verwendet, um die selektive Erhaltung oder Degeneration der mikroskopischen Architektur der Cochlea darzustellen.

Der Hauptvorteil dieser Technik, unserer bestehenden Methode, liegt darin, dass dieses Verfahren eine hervorragende Exposition der Fenster-Nische und des Gehörs ermöglicht, sodass eine selektive, direkte Anwendung der toxischen Alterung erfolgen kann. Zu den Vorteilen dieser Technik zählen die Erhaltung der Mikroarchitektur des Innenohrs, die Vermeidung systemischer Toxizität, ein schneller Wirkungseintritt, die selektive Degeneration bestimmter Zelltypen der Cochlea sowie reproduzierbare Ergebnisse. Diese Technik kann mit nur geringen Modifikationen auch auf andere Nagetierarten angewandt werden, einschließlich Ratten, Meerschweinchen und Wüstenrennmäuse.

Nun werde ich das Verfahren in meinem Labor demonstrieren. Alle Aspekte der Tierversuche wurden gemäß den Richtlinien des zuständigen institutionellen Tierversuchsausschusses durchgeführt. Alle hier beschriebenen experimentellen Verfahren an Wirbeln wurden gemäß den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee der Medizinischen Universität von South Carolina genehmigt.

Nach der Anästhesie des Tieres gemäß den genehmigten Verfahren verabreichen Sie ein präoperatives Analgetikum in einer Dosis von 0,1 Milligramm pro Kilogramm. Hier wird Buprenorphin verwendet. Überprüfen Sie, ob das Tier eine operative Anästhesietiefe erreicht hat.

Es sollte keine Reaktion auf einen Zehenquetscher geben, und der Schreibreflex sollte – wie hier zu sehen – bei Mäusen fehlen. Ziehen Sie 0,2 Milliliter einer wässrigen Lösung, die den ausgewählten ototoxischen Wirkstoff enthält, in eine Ein-Milliliter-Tuberkulinspritze mit einer stumpfen 28-Gauge-Halbzoll-Nadel auf und entfernen Sie jegliche Luft in der Spritze, da Blasen eine korrekte Applikation des Wirkstoffs verhindern können. Verwenden Sie elektrische Schermaschinen, um das Fell im Bereich von der achselhöhlenfernen Furche bis zum Schultergürtel kaudal zu entfernen.

Verlängern Sie die Haarentfernung von der dorsalen sagittalen Mittellinie bis zum Unterkieferwinkel seitlich. Verwenden Sie ein Einweg-Rasiermesser, um eine sauber rasierte Präparation sicherzustellen. Desinfizieren Sie die Haut des präparierten Bereichs gemäß den institutionellen Protokollen.

Hier wird zweimal zwei Minuten lang im kreisförmigen Muster topisch Betadine abwechselnd mit Ethanol aufgetragen. Legen Sie eine kleine Heizplatte unter den Körper, um die Körpertemperatur des Tieres aufrechtzuerhalten. Sichern Sie den Kopf des Tieres bei 36 bis 38 Grad Celsius mithilfe einer Haltevorrichtung für den Kopf.

Ziehen Sie vorsichtig eine kleine Klemme über den Rücken der Schnauze des Tieres, um es an Ort und Stelle zu fixieren. Stellen Sie sicher, dass der Kopfhalter fest mit der Mitte eines U-förmigen Gelenkarms verbunden ist. Befestigen Sie einen einen Zentimeter breiten Stab am linken Arm des U-förmigen Arms als linken Kopfstütz, um Zugang zur rechten Seite zu ermöglichen.

Wenn die Maus sicher im Kopfhalter befestigt ist, bringen Sie sie in eine linke Seitenlage. Positionieren Sie den Körper sorgfältig auf der flachen Operationsfläche, um eine stabile Lage während des gesamten Eingriffs zu gewährleisten und übermäßige Torsionsbelastung der Halswirbel zu vermeiden. Stellen Sie ein Operationsmikroskop, das eine 10×- und 20×-Vergrößerung ermöglicht, über das Operationsfeld.

Stellen Sie sicher, dass das Mikroskop seine Position berührungsfrei beibehalten kann, sodass beide Hände während des chirurgischen Eingriffs unter mikroskopischer Vergrößerung frei zur Verfügung stehen. Verwenden Sie eine scharfe Schere oder eine Skalpellklinge, um einen ein bis 1,5 cm langen postaurikulären Schnitt etwa sechs bis acht Millimeter kaudal zur aurikulären zephalen Hautfalte anzulegen. Vermeiden Sie tiefe Schnitte, um die darunterliegenden Gefäßstrukturen zu erhalten.

Lösen Sie vorsichtig durch die subkutane Fettschicht. Bei einer Dissektion von ventral nach medial achten Sie darauf, die Vena jugularis externa zu schonen. Tritt Blutung auf, verwenden Sie resorbierbare Gelatineschwämme oder Wattebällchen, um die Blutung zu stillen.

Nachdem die Fettschicht ordnungsgemäß geteilt ist, legen Sie die Halsmuskulatur frei. Ein wichtiges Orientierungsmal ist ein kleiner Nervenzweig des Hirnnervs 11, der sich um den hinteren Rand des C-CTO-Mastoids zieht. Um sich in Richtung des Ohrmuschelrandes fortzubewegen, verwenden Sie einen selbsthaltenden Retraktor, um den Muskelkörper der CTO-Mastoiditis vorsichtig nach posterior zu reträktieren.

Teilen Sie vorsichtig die durchsichtige Faszie, die den Muskelkörper umgibt. Ziehen Sie außerdem die Ohrspeicheldrüse und die Vena jugularis externa sanft in die entgegengesetzte Richtung zurück. Bei guter Retraktion des Muskelkörpers des Musculus CTO Masto ist die glänzende Kuppel des Periosts der Paukenblase an der kudalen Seite der Bulla sichtbar, der Ansatz eines tiefer liegenden Halsmuskels.

Die Sterno-Mastoiditis wird sichtbar. Platzieren Sie einen selbsthaltenden Retraktor, um das CTO-Mastoid mit einer Zwei-Hand-Technik auseinanderzuhalten, und verwenden Sie vorsichtig bipolare Diathermie, um das Bullenperiost zu teilen und den darunterliegenden Knochen freizulegen. Anschließend heben Sie mit einer Pinzette oder einem otologischen Kürett das Periost vorsichtig an und schieben es in peripherer Richtung, um die Bullenkalotte vollständig freizulegen.

Verwenden Sie nun einen riemengetriebenen zahnärztlichen Handbohrer mit einem ein- oder zweimillimeterigen konischen Bohrer, um vorsichtig ein zwei Millimeter großes Führungsloch durch den Bullaknochen zu bohren. Bohren Sie zwischen dem Coddle-Rand der Kuppel und der sichtbar undurchsichtigen Linie, die sich über die rostrale Seite des Bulla erstreckt. Anschließend bohren Sie vorsichtig ein zweites Führungsloch in der Nähe, um das Abdecken des Bullaknochens mithilfe einer feinen Pinzette mit nadelspitzen Backen zu erleichtern. Entfernen Sie den Bullaknochen in dorsaler und coddle-gerichteter Richtung.

Achten Sie darauf, die direkt unter der Bullenkappe liegende EDL-Arterie nicht zu verletzen. Entfernen Sie so wenig Knochen wie möglich, um eine übermäßige Flüssigkeitsansammlung im Mittelohr vor der Applikation des Wirkstoffs zu verhindern. Verwenden Sie einen Papierwickel, um alle sichtbaren Flüssigkeitsansammlungen im Mittelohr und im Runden-Fenster-Nischenbereich zu entfernen, bis trockener Knochen sichtbar ist.

Dieser Schritt ist entscheidend für den Erfolg des Protokolls. Unter maximaler Vergrößerung eine feine Nadel an einer Ein-Milliliter-Tuberkulinspritze verwenden, um einen Tropfen ototoxisches Mittel direkt in die Rundfensternische zu geben und diese vollständig zu füllen. Das Mittel für 10 Minuten in der Rundfensternische einwirken lassen.

In den frühen Stadien achten Sie genau darauf, wann sich eine kleine helle Reflexion an der Basis der trockenen Nische in einen stumpfen und trüben Flüssigkeitsmeniskus verwandelt. Dies zeigt an, dass die Nische sich ordnungsgemäß füllt. Nach Ablauf von 10 Minuten entfernen Sie das Mittel vollständig mit einem Docht und ersetzen es durch eine neue Applikation desselben Mittels.

Die Anzahl der Applikationen hängt vom verwendeten Wirkstoff ab. Die Einwirkzeit liegt typischerweise zwischen 30 und 60 Minuten. Lassen Sie nach der letzten Applikation die Kappe beim Bullen abgenommen und schließen Sie das Weichgewebe über der Operationsstelle mit einer Pinzette.

Verschließen Sie die Haut über der Operationsstelle mit einer nicht resorbierbaren Monofileinheftung (4-0). Lassen Sie das Tier in einem sauberen Heimkäfig, der mit Einstreu und weicher Nahrung ausgestattet sein sollte, von der Anästhesie aufwachen. Überwachen Sie die Tiere täglich bis zur Tötung und Entnahme des Cochleagewebes von erwachsenen C-B-A-C-A-J-Tieren.

Mäuse beider Geschlechter wurden dem ototoxischen Wirkstoff Hept-Ethanol ausgesetzt. Die Diffusion über das Rundfenster. Signifikante Anstiege der BR-Schwellen wurden bei mit Hept behandelten Mäusen vom ersten bis zum 14. Tag nach der Operation beobachtet, im Vergleich zu Kontrolltieren, die eine Scheinoperation erhielten und statt Hept Kochsalzlösung verabreicht bekamen.

Bei keiner getesteten Frequenz zeigte Ethanol signifikante Schwellenverschiebungen. Eine Immunfärbung gegen einen inkward-gerichteten Kaliumkanal, dargestellt in Grün, diente als indirekte Methode zur Visualisierung der Schädigung und Regeneration cochleärer Strukturen. Die Färbungsintensität war innerhalb der Theria-Vais deutlich verringert.

Am ersten postoperativen Tag zeigte die kernrote Gegenfärbung Hinweise auf gestörte Kernintegrität und chromosomale Kondensation, typisch für zelluläre Apoptose. Bei Quantifizierung der Kaliumkanal-Färbungsintensität in den behandelten Bereichen der Strati zeigte sich ein initialer Tiefpunkt, gefolgt von einer signifikanten Rückkehr zur Kontrollintensität sieben Tage nach Hept-Exposition, wobei die Erholung danach anhielt. Sobald man die Methode beherrscht, kann sie innerhalb von 30 bis 60 Minuten durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird.

Es ist wichtig zu bedenken, dass zusätzliche Exposition oder Auffüllung helfen können, eine unerwünschte Verdünnung des autotoxischen Wirkstoffs durch Blutkondensation oder interstitielle Flüssigkeit zu vermeiden. Bei diesem Vorgehen ist jedoch Vorsicht geboten, da dadurch das Risiko steigt, die Arteria cedal versehentlich zu verletzen oder interstitielle Flüssigkeit in die Rundfensternische einzubringen. Diese minimalinvasive Technik ermöglicht eine detaillierte Untersuchung empfindlicher biochemischer Prozesse und hat wesentlich dazu beigetragen, unsere Forschung zum Verständnis des cochleären Regenerationspotenzials in vivo voranzutreiben.