Name: Photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie mit Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (BIFC-PALM) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Erfahren Sie, wie BiFC-PALM Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Zellen auf Einzelmolekül- und Nanometerskala visualisiert. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Ras-Raf-Komplexen in U2OS-Zellen.

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Die Autoren danken Dr. Steven Chu und Dr. Joe W. Gray für hilfreiche Diskussionen, Henry Marr für seine anfängliche Arbeit am BiFC-PALM-Projekt und Alexis Shoemaker für ihre technische Unterstützung. Diese Arbeit wird durch Startkapital für X.N. von OHSU unterstützt. Die Forschung im Nan-Labor wurde auch von NIH 5U54CA143836-05, der Damon Runyon Cancer Research Foundation, dem M. J. Murdock Charitable Trust und der Firma FEI unterstützt.

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

BiFC hat eine allgemein verwendete Technik zur Erfassung und Visualisierung PPIs in Zellen, während PALM ist ein neues einzelnes Molekül Auflösungs Mikroskopietechnik, die nanoskalige Abbildungs ​​intakter biologischer Proben ermöglicht. Die Kombination von BIFC mit PALM erreicht selektiven Abbildung von PPI in einer Zelle mit Nanometer-Ortsauflösung und Einzelmolekülempfindlichkeit. BIFC-PALM erweitert den Nutzen der beiden Techniken, und wie in dieser Arbeit gezeigt, ist äußerst viel versprechend bei der Aufdeckung de...

Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs) sind grundlegende Biologie 1 und dicht über Raum-Zeit-Mechanismen über viele Zeit- und Längenskalen geregelt. Untersuchungen an Zellsignal auf der Zellmembran beispielsweise mit dynamischen nanoskaliger Orts Kompartimente spezifischen PPI und zelluläre Prozesse 2 zu erleichtern enthüllt. Daher ist die Fähigkeit, die PPI in biologischen Systemen mit ausreichender räumlicher und zeitlicher Auflösung, hohe Spezifität und eine hohe Empfindlichkeit Sonde Schlüssel zu einem mechanistischen Verständnis der Biologie. Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (BIFC) ist einer der wenigen vorhandenen Werkzeugen zur Visualisierung von PPI in einer Zelle mit subzellulärer Auflösung und Live-Zellverträglichkeit 3-5. Die Technik ist relativ einfach und erfordert Aufspaltung eines fluoreszierenden Proteins in zwei nicht-fluoreszierenden Fragmente; wenn genetisch mit zwei interagierende Proteine ​​markiert undin die Nähe gebracht wird, können die Fragmente zu rekonstituieren, um eine vollständige fluoreszierende Protein zu bilden, wodurch Fluoreszenzsignal. Wenn sie richtig entworfen, sollte BIFC Sonden nicht spontan Rekonstitution in Abwesenheit von PPI. Als solches wird das Fluoreszenz-Signal in einem BiFC Assay nur in Gegenwart von PPI, der die direkte Visualisierung von EPI mit hoher Spezifität ermöglicht auftreten. Zusätzliche Vorteile der Verwendung von Fluoreszenz als Auslese sind hohe Empfindlichkeit, subzelluläre Auflösung, und die Kompatibilität mit hohem Durchsatz und hohem Gehalt Screening-Assays, unter anderem. Für diesen Vorteilen eine Reihe von BiFC Sonden basierend auf unterschiedlichen Mutter fluoreszierenden Proteinen entwickelt worden. Wie in allen anderen Detektionsverfahren auf der Basis konventioneller Lichtmikroskopie ist jedoch die räumliche Auflösung der BiFC auf ~ 250 nm durch die Beugung des Lichts begrenzt. Dies macht es eine Herausforderung für die Regulierung der PPI im Nanobereich, die, wie bereits angedeutet und durch Lipid Rafts 6 eine beispielhaft zu studierennd Ras Nanocluster 7, ist eine kritische Längenskala für das Verständnis vieler zellulärer Prozesse wie Signalisierung. BIFC mit photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM) 8,9 kombiniert, um diese Grenze der räumlichen Auflösung für die Abbildung PPI 10 zu überwinden. PALM ist eine neue Superresolution Mikroskopie-Technik, die die Beugungsgrenze in der Fluoreszenzbildgebung durch stochastische Aktivierung und subdiffractive Lokalisierung der einzelnen fluoreszierenden Molekülen umgeht. In jedem Aktivierungszyklus emittiert ein fluoreszierendes Molekül zu einigen tausend Photonen einige hundert und führt zu einem einzigen Molekül Bild auf dem Detektor. Während das Bild beugungsbegrenzt (~ 250 nm in der Breite), dessen Schwerpunkt mit einer wesentlich höheren Genauigkeit typischerweise in der Größenordnung von 10-50 nm in Abhängigkeit von der Anzahl der detektierten Photonen bestimmt werden. Durch Aktivieren und Lokalisieren jedes Fluoreszenzmolekül in der Probe kann eine hohe Bildauflösung zu rekonstruieren. Performed auf lebende Zellen, einzelnes Molekül Verfolgung (SMT-) PALM gestattet weiterhin Erwerb der Tausende von Proteindiffusionsbahnen von einer einzelnen Zelle 11. Wichtig ist, verwendet PALM Fachfluoreszenzsonden wie photoaktivierbare fluoreszierende Proteine ​​(PA-RP), um stochastische Aktivierung zu erreichen. Da sowohl BIFC und PALM Verwendung fluoreszierender Proteine, werden sie durch die Spaltung von PAmCherry1, eine häufig verwendete PA-FP für PALM, in zwei Fragmente zwischen den Aminosäuren 159 und 160 zusammengefasst wurden. Die BIFC System auf Basis von Split PAmCherry1 zeigt geringe Hintergrundsignal von spontanen Wiederherstellung der beiden Fragmente. Bei genetisch an ein Paar von interagierenden Proteinen markiert, die beiden Fragmente (RN = Reste 1-159; RC = Met + Reste 160-236) effizient rekonstituiert, um eine vollständige PAmCherry1 Proteine ​​auch bei 37 ° C und ohne Inkubation bei niedrigeren Temperaturen zu bilden, die nicht der Fall für andere BiFC Paare 12 wie der Mutter mCherry 13. Furthermore, die rekonstituierte PAmCherry1 Protein behielt die photophysikalischen Eigenschaften der Mutter PAmCherry1 wie hohes Kontrastverhältnis, mittlere Photonenausbeute, und schnelle Photoaktivierung, unter anderem, die entscheidend für eine genaue Einzelmolekül-Lokalisierung und hochauflösende Bildgebung PALM sind. In diesem Protokoll die Verwendung BiFC-PALM zum Abbilden Ras-Raf-Interaktionen in U2OS-Zellen unter Verwendung von geteilten PAmCherry1 (1A) beschrieben wird. Der erste Schritt besteht darin, die Konstrukte für die Expression von Fusionsproteinen zwischen PAmCherry1 Fragmente (dh, RN, RC) und die Proteine ​​von Interesse zu entwerfen. Theoretisch für jedes Paar von Kandidatenproteinen (A und B) gibt es acht Paare von Fusionsproteinen getestet: RN-A / RC-B; RN-A / B-RC; RC-A / RN-B; RC-A / B-RN; A-RN / RC-B; A-RN / B-RC; A-RC / RN-B; und A-RC / B-RN. Dieser Prozess kann oft unter Berücksichtigung der strukturellen oder biochemischen Eigenschaften der Kandidatenproteine ​​vereinfacht werden. Im Fall der Ras ist das Proteinpost-translational an dem C-terminal modifizierten CAAX-Box (C = Cys ist, A = aliphatische, X = beliebiger), wonach der AAX-Motiv abgespalten. Daher RN oder RC kann nur an den N-Terminus von Ras kondensiert sein kann; Dies reduziert die Anzahl der Fusionsprotein-Paare zu vier (1B). Für Raf, die Ras-Bindungsdomäne (RBD; Reste 51-131) verwendet und kann an beiden Enden versehen werden. Diese vier Fusionskonfigurationen generiert: RN-KRAS / RC-Raf RBD; RN-KRAS / Raf-RBD RC; RC-KRAS / RN-Raf RBD; und RC-KRAS / Raf RBD-RN. Zusätzlich wird der Linker zwischen den Fragmenten und den interessierenden Proteine ​​zu berücksichtigen. Ein flexibler Linker von etwa zehn Aminosäuren wird häufig verwendet, da es eine ausreichende Freiheit für die Komplementierung auftreten. Einen solchen Linker (GGGGS) x2, obwohl es viele andere, die erfolgreich eingesetzt worden sind, einschließlich der Zufallsfolgen von einer multiplen Klonierungsstelle (MCS) 14 erzeugt wird. Die Länge der Linker können müssen dependin optimiertg von der Grße der interessierenden Proteine ​​und ihre Orientierungen bei der Interaktion. Die PAmCherry1 Fragmente werden in einem kleinen Klonen Backbone mit flankierenden MCSs enthalten (siehe Materialliste). Gene von Interesse kann über die Restriktionsschnittstellen oder einem ligationsunabhängiges Verfahren eingefügt werden. Nach der Klonierung und Sequenzüberprüfung wird die Expressionskassette ein Expressionsvektor unter Verwendung eines Rekombinase-Reaktion, ein Klonierungsverfahren mit hoher Genauigkeit und hoher Effizienz übertragen. Als nächstes wurden die resultierenden Expressionskonstrukte werden in das Zielzelllinie oder zur Infektion der Zielzelle transfiziert, wenn eine stabile Zelllinie zu erzeugen, in Lentivirus verpackt. Transiente Transfektion ermöglicht eine schnelle Validierung der BIFC Konfigurationen, aber mögliche Probleme zu beachten. Transfektion unter Verwendung von Chemikalien oft betont, die Zellen, was zu hohen Eigenfluoreszenz; während die Verwendung von interner Totalreflexion Fluoreszenz (TIRF) microscopy können dieses Hintergrundsignal zu mildern durch Begrenzung der Beleuchtungsvolumen, TIRF ideal, wenn die PPI auf der Zellmembran statt. Zusätzlich transienten Transfektionen führen oft zu hohe Proteinexpressionsniveaus, die weit über denen der endogene Proteine, die Artefakte bei der Erfassung der PPIs verursachen können. Daher ist es empfehlenswert, dass stabile Zelllinien etabliert, nachdem ein geeigneter BiFC Konfiguration hat erste Test wurde bestimmt. Stabile Zelllinien haben auch das Potenzial für durchstimmbare Expression über Doxycyclin Induktions 15. Nach der Infektion werden die Zellen mit Antibiotika ausgewählt, typischerweise Puromycin und Neomycin, eine für jedes Konstrukt. Die nachfolgenden Schritte für die Probenvorbereitung, Bildaufnahme und Datenanalyse wird im Detail in den Protokollen beschrieben. Mit diesem Ansatz werden die Bildung von Nanoclustern in BiFC-Handabdrücken von Ras-Raf RBD routinemßig beobachtet (2A &lt;/ strong&gt;). Konsequent, smt-PALM Flugbahnen von Ras-Raf-RBD zeigen eine heterogene Verteilung der Diffusionszustände (2B-D). Diese Ergebnisse legen nahe, dass Ras-Raf-Komplexe existieren in mehreren Staaten an der Zellmembran, vermutlich als Monomere und Clustern, mit möglichen biologischen Auswirkungen. Diese Arbeit zeigt die Macht der BIFC-PALM in selektiven Abbildung von PPI in Zellen mit Nanometer-Ortsauflösung und Einzelmolekül-Empfindlichkeit, die nur schwer mit herkömmlichen BIFC, Fluoreszenz-Co-Lokalisation, oder Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer (FRET) erhalten würde. Bei der Gestaltung BIFC Experimente und der Interpretation der Ergebnisse ist es wichtig zu beachten, dass die BIFC Vorgang ist irreversibel in den meisten Fällen, einschließlich Split PAmCherry1 halten. Sobald die beiden Fragmente kombiniert und bilden eine komplette PAmCherry1 Protein, die Bindung zwischen den beiden Fragmenten und damit die PPI permanent wird. Dies schränkt die Verwendung von BIFC und BIFC-PALM für die Überwachung der Dynamik der PPI (dh Bindungskinetik und nicht die Diffusion Dynamik des Proteinkomplexes, sobald sie gebildet ist) und manchmal sogar zu Fehllokalisation der PPI-Komplexe führen. Ein weiterer zu berücksichtigender Faktor bei der Gestaltung BIFC-PALM-Experimente ist die Verzögerung bei der Chromophor Reifung, die innewohnende fluoreszierende Proteine ​​ist. Einmal zwei Proteine ​​interagieren, und die FP-Fragmenten zusammenkommen, werden sie rückfalten typischerweise in der Größenordnung von Sekunden (Halbwertszeit von 60 sec für EYFP 3). , Anschließende Chromophor Reifung und Fluoreszenzsignal zu entwickeln jedoch in der Größenordnung von Minuten. Während Fluoreszenz nachweisbar innerhalb von 10 Minuten nach Rekonstitution des Split-Venus, einer schnell Falten YFP-Variante zu sein, ist die Halbwertszeit für die Reifung im Allgemeinen oft rund 60 min 16. Split-PAmCherry1 beobachtet ähnliche Preise haben. Daher BIFC und BIFC-PALM liegen noch schlechte Wahl für die Überwachung der Echtzeit-PPI-Kinetik; andere michthoden wie FRET und einem kürzlich entwickelten Dimerisierung abhängigen Fluoreszenzprotein 17 kann mehr für diesen Zweck geeignet sein.

<table><tbody><tr><td>Mikroskoprahmen</td><td>Nikon</td><td>Ti-U</td><td></td></tr><tr><td>60X Ölimmersions-TIRF-Objektiv mit 1,49 NA</td><td>Nikon</td><td>CFI Apo TIRF 60x H</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD-Kamera</td><td>Andor</td><td>iXon Ultra 897</td><td></td></tr><tr><td>561 nm Laser</td><td>Opto Engine</td><td>MGL-FN-561</td><td></td></tr><tr><td>405 nm Laser</td><td>Coherent</td><td>CUBE-405 50mW</td><td></td></tr><tr><td>561 nm dichroitischer Spiegel</td><td>Semrock</td><td>&nbsp; Di01-R405/488/561/635-25x36</td><td></td></tr><tr><td>561 nm Filter</td><td>Semrock</td><td>FF01-525/45-25</td><td></td></tr><tr><td>405/561 nm Kerbfilter</td><td>Semrock</td><td>NF01-405/488/568-25</td><td></td></tr><tr><td>Temperatur und CO2 kontrollierter Tisch</td><td>Tokai Hit</td><td>INUBG2ATW-PLAM</td><td></td></tr><tr><td>pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCS</td><td>Addgene</td><td>60545</td><td></td></tr><tr><td>pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCS</td><td>Addgene</td><td>60546</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.2-DEST</td><td>Life Technologies</td><td>12489-019</td><td></td></tr><tr><td>pLenti-DEST</td><td>Addgene</td><td></td> http://www.addgene.org/Eric_Campeau/ <td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>F-531</td><td></td></tr><tr><td>In-Fusion HD Klonierung</td><td>Clontech</td><td>639649</td><td></td></tr><tr><td>LR Clonase</td><td>Life Technologies</td><td>11791</td><td></td></tr><tr><td>Vira Power Lentivirus Verpackung</td><td>Life Technologies</td><td>K497500</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE Transfektionsreagenz</td><td>Roche</td><td>13873800</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Tek II Kammer-Deckglas</td><td>Thermo Scientific</td><td>155409</td><td>#1,5 Glasbodenschalen</td></tr><tr><td>U2OS-Zellen</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>293T/17 Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>DMEM mit Phenolrot</td><td>Life Technologies</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>DMEM ohne Phenolrot</td><td>Life Technologies</td><td>21063</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Life Technologies</td><td>10082</td><td></td></tr><tr><td>Leibovit's L-15, ohne Phenolrot</td><td>Life Technologies</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>Reduziertes Serummedium</td><td>Life Technologies</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Life Technologies</td><td>14040</td><td></td></tr><tr><td>Spritze</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenfilter</td><td>Millipore</td><td>SLHV033RB</td><td></td></tr><tr><td>Lentiviraler Konzentrator</td><td>Clontech</td><td>631231</td><td></td></tr><tr><td>Retroviraler Konzentrator</td><td>Clontech</td><td>631455</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Kultur Schale</td><td>BD Biosciences</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Kulturplatte</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Life Technologies</td><td>A11138</td><td></td></tr><tr><td>G-418</td><td>Calbiochem</td><td>345812</td><td>Neomycin</td></tr><tr><td>Doxycylin</td><td>Fisher</td><td>BP2653</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Fisher</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyd</td><td>Sigma</td><td>G6257</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>3777</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumhydroxid</td><td>Sigma</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Fisher</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Fisher</td><td>M33</td><td></td></tr><tr><td>100 nm Goldpartikel</td><td>BBI Solutions</td><td>EM. GC100</td><td></td></tr><tr><td>Wasser in molekularer Qualität</td><td>Life Technologies</td><td>10977</td><td></td></tr><tr><td>Dpn1</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Aufreinigungskit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Miniprep-Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Midiprep-Kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740410</td><td></td></tr><tr><td>0,6 ml Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Fisher</td><td>05-408-120</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Fisher</td><td>05-408-137</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Röhrchen</td><td>Fisher</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Polypropylen-Rundbodenröhrchen</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>14 ml Polypropylen-Rundbodenröhrchen</td><td>BD Biosciences</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Röhrchen</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Röhrchen</td><td>GeneMate</td><td>C-3328-1</td><td></td></tr><tr><td>SOC Medium</td><td>Life Technologies</td><td>15544</td><td></td></tr><tr><td>LB Bouillon</td><td>BD Biosciences</td><td>244610</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycinsulfat</td><td>Fisher</td><td>BP906</td><td></td></tr><tr><td>Kompetente Zellen</td><td>Life Technologies</td><td>C4040</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

photoaktivierte lokalisationsmikroskopie mit bimolekulare fluoreszenzkomplementation (bifc-palm)

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

Protein-Wechselwirkungen (PPIs) sind wichtige molekulare Ereignisse in der Biologie. Es bleibt jedoch eine Herausforderung, PPIs mit ausreichender Auflösung und Empfindlichkeit in Zellen sichtbar zu machen, da die Auflösung der konventionellen Lichtmikroskopie auf ~250 nm beugungsbegrenzt ist. Durch die Kombination der bimolekularen Fluoreszenzkomplementation (BiFC) mit der photoaktivierten Lokalisationsmikroskopie (PALM) können PPIs in Zellen mit Einzelmolekülempfindlichkeit und räumlicher Auflösung im Nanometerbereich sichtbar gemacht werden. BiFC ist eine häufig verwendete Technik zur Visualisierung von PPIs mit Fluoreszenzkontrast, bei der ein fluoreszierendes Protein in zwei nicht fluoreszierende Fragmente aufgespalten wird. PALM ist eine neue hochauflösende Mikroskopietechnik zur Abbildung biologischer Proben im Nanometer- und Einzelmolekülbereich, bei der phototransformierbare Fluoreszenzsonden wie photoaktivierbare fluoreszierende Proteine (PA-FPs) verwendet werden. BiFC-PALM wurde durch die Spaltung von PAmCherry1, einem PA-FP, das mit PALM kompatibel ist, aufgrund seiner monomeren Natur, seiner guten Einzelmolekülhelligkeit, seines hohen Kontrastverhältnisses und seiner Nützlichkeit für Stöchiometrie-Messungen demonstriert. Wenn PAmCherry1 zwischen den Aminosäuren 159 und 160 aufgeteilt wird, kann es zu einer BiFC-Sonde verarbeitet werden, die bei 37 °C effizient rekonstituiert wird, eine hohe Spezifität für PPIs und eine geringe unspezifische Rekonstitution aufweist. Die Ras-Raf-Wechselwirkung wird als Beispiel verwendet, um zu zeigen, wie BiFC-PALM hilft, Wechselwirkungen auf der Nanometerskala und mit Einzelmolekülauflösung zu untersuchen. Ihre Diffusion kann auch in lebenden Zellen mit Hilfe von Single Molecule Tracking (smt-) PALM verfolgt werden. In diesem Protokoll werden Faktoren diskutiert, die bei der Entwicklung der Fusionsproteine für BiFC-PALM zu berücksichtigen sind, die Probenvorbereitung, die Bildaufnahme und die Datenanalyseschritte erläutert und einige beispielhafte Ergebnisse vorgestellt. BiFC-PALM bietet eine hohe räumliche Auflösung, Spezifität und Sensitivität und ist ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung von PPIs in intakten biologischen Proben.

Das gezeigte BIFC-PALM Beispiel ist KRAS-mutierten G12D Interaktion mit den Ras-Bindungsdomäne (RBD) von Craf (Abbildung 1A). Wie diskutiert, wurden die RN oder RC-Fragmente nicht an den C-Terminus von Ras markiert, weil es die Membranlokalisierung und daher die biologische Aktivität von Ras unterbrechen. Dies reduziert die möglichen Kombinationen von acht auf vier (1B). Jede dieser vier Kombinationen wurde in U2OS-Zellen unter Verwendung von lentiviralen Infektion eingeführt. Die Zelle...

Protein-Wechselwirkungen werden in Zellen mit räumlicher Auflösung im Nanometerbereich visualisiert, indem die bimolekulare Fluoreszenzkomplemmentierung (BiFC) mit der photoaktivierten Lokalisationsmikroskopie (PALM) kombiniert wird. Beschrieben wird hier die Verwendung von BiFC-PALM zur Abbildung von Ras-Raf-Wechselwirkungen in U2OS-Zellen zur Visualisierung des nanoskaligen Clusterings und der Diffusion einzelner Ras-Raf-Komplexe.

Photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie mit Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (BIFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and ...

Das übergeordnete Ziel dieser Mikroskopietechnik besteht darin, Proteine und Proteinwechselwirkungen auf Ebene einzelner Moleküle und im Nanometerbereich sichtbar zu machen. Diese Methode kann uns daher dabei helfen, zentrale Fragen im Bereich der Biologie zu beantworten, beispielsweise bezüglich molekularer Wechselwirkungen in onkogenen Signalprozessen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie empfindlich und spezifisch ist und Auflösungen auf Ebene einzelner Moleküle sowie im Nanometerbereich bietet.Dr. Tahan, ein leitender wissenschaftlicher Mitarbeiter in meinem Labor, wird das Verfahren demonstrieren, nachdem RAs und RAF R-B-D-P-A-M Cherry-eins-Fragmente gemäß dem schriftlichen Protokoll in virale Partikel verpackt und U2-OS-Zellen infiziert wurden. Um eine Probe für die Bildgebung vorzubereiten, geben Sie etwa 5,5 × 10⁴ stabil exprimierende Zellen pro Vertiefung auf eine acht-Vertiefungen-Glasbodenkammer, in 350 µL phenolrotfreiem DMEM. Fixieren Sie die Zellen mit frischem Paraldehyd in Kombination mit Glutaraldehyd und ersetzen Sie danach das Fixativ durch PBS oder Imaging-Puffer. Vortexen Sie 100 Nanometer große Goldpartikel und geben Sie 35 µL pro Vertiefung zur Verfolgung von Objektträgerverschiebungen während der Bildaufnahme hinzu.Nähern Sie sich dem Mikroskop und schalten Sie die Laser mit 405 und 561 Nanometer ein, wobei die Verschlüsse an dieser Stelle geschlossen bleiben. Stellen Sie sicher, dass der dichroische Spiegel und der Notch-Filter für 561 Nanometer korrekt positioniert sind. Öffnen Sie die Software zur Bildaufnahme. Schalten Sie die E-M-C-C-D-Kamera ein, lassen Sie sie abkühlen, stellen Sie die Belichtungszeit auf 100 Millisekunden ein und wählen Sie einen geeigneten Wert für die E-M-C-C-D-Verstärkung.Geben Sie Immersionsöl auf das Objektiv und befestigen Sie die Probe auf dem Mikroskopständer. Bringen Sie die Probe anschließend entweder mit Hellfeld oder dem 561 Nanometer Laser in Fokus, um RAs und andere Membranproteine abzubilden. Verwenden Sie ein 60x APO Chromat Turf Objektiv mit einer numerischen Apertur von 1,49 und stellen Sie das Mikroskop auf Turf-Konfiguration ein.Stellen Sie den Anregungslaser so ein, dass er beim Auftreffen auf die hintere Apertur des Turf-Objektivs exzentrisch liegt, wodurch der Laser beim Erreichen der Puffer-Deckscheibe in die Ebene abgelenkt wird. Passen Sie die Eintrittsposition des Lasers so lange an, bis der kritische Winkel erreicht ist und der Laser zurückreflektiert wird. Suchen Sie eine Zelle zum Abbilden, die mehrere Goldpartikel im Sichtfeld aufweist.Legen Sie dann einen interessierenden Bereich fest, der die Zelle oder einen Teil davon sowie die Goldpartikel umschließt, falls bereits aufgrund hoher Expressionsniveaus eine ausreichende Aktivierung erfolgt. Beginnen Sie die Aufnahme mit dem 405-Nanometer-Laser ausgeschaltet und dem 561-Nanometer-Laser eingeschaltet. Andernfalls schalten Sie den 405-Nanometer-Laser auf der niedrigsten werkseitigen Leistungsstufe ein und erhöhen diese schrittweise, bis sich pro Bild zehn Moleküle oder so viele befinden, dass einzelne Moleküle gut getrennt sind.Während die Datenaufnahme fortgesetzt wird, erhöhen Sie allmählich die Leistung des 405-Nanometer-Lasers, um die Spotdichte annähernd konstant zu halten. Setzen Sie die Bildaufnahme fort, bis eine hohe 4 0 5. Leistung keine weiteren Initiationen mehr auslöst.Aktivierungsereignisse enden, um Bilder zu verarbeiten. Laden Sie die Bildverarbeitungssoftware herunter. Öffnen Sie MATLAB und laden Sie die WFI-Lese-Software.Zeigen Sie die Rohbildsequenz an und bestimmen Sie den interessierenden Bereich (ROI), indem Sie durch Linksklick und Ziehen eines Rechtecks den Bereich im Stapel auswählen, der verarbeitet werden soll. Falls der interessierende Bereich während der Aufnahme nicht verkleinert wurde, wählen Sie einen kleineren Bereich, um die Rechenzeit zu verkürzen. Um einen Bereich abzuwählen und den gesamten Bildausschnitt zu verarbeiten, klicken Sie mit der rechten Maustaste an beliebiger Stelle im Bild, um eine Reihe fiduziärer Marker festzulegen, wie beispielsweise Gold-Nanopartikel, die auf dem Deckglas adsorbiert sind, gut isoliert, gleichförmig in Form und während des gesamten Bildstapels im Sichtfeld vorhanden sind. Beginnen Sie damit, ein geeignetes Goldpartikel auszuwählen, indem Sie auf dessen Abbildung klicken und ein kleines Rechteck darum ziehen.Klicken Sie unter Partikelverfolgung auf die Schaltfläche „Track“. Es erscheint ein Diagramm, das die Position des ausgewählten Goldpartikels über den gesamten Bildstapel hinweg anzeigt und so das Ausmaß der Drift veranschaulicht. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um möglichst viele Goldpartikel zu verfolgen, und ermitteln Sie die Partikel, die zusammen verfolgt werden können. Idealweise.Die Gesamtverschiebung beträgt maximal 0,1 Pixel, jeweils einzeln. Wählen Sie die Goldpartikel aus, die gemeinsam verfolgt wurden, und unter Partikelverfolgung. Klicken Sie auf die Schaltfläche Marker hinzufügen.Ein grünes Kreuz erscheint, das anzeigt, dass das Teilchen als Markierung hinzugefügt wurde und zur Korrektur von Drift verwendet wird. Passen Sie den Glättungsbereich der Sigma-Range und die Schwelle nach Bedarf an, indem Sie den Wert leicht verändern. Klicken Sie auf die Schaltfläche „Teilchen finden“, um die Einstellungen zu testen, und überprüfen Sie visuell die verarbeiteten Teilchen; runde und helle Strukturen wie einzelne PAM-Cherry-Moleküle werden umrahmt, während andere ausgeschlossen werden.Um mit der Verarbeitung der Bilder zu beginnen, klicken Sie auf die Schaltfläche „Kord-Datei erstellen“ und speichern Sie die Datei unter einem gewünschten Namen, um die Bilder nachzubearbeiten und das Palmabild darzustellen. Starten Sie das Palm-Paket in MATLAB, und laden Sie die soeben erstellte Dot-Core-Datei. Ein grob gerendertes Bild erscheint in der Bildbox neben den Steuertasten.Sortieren Sie die einzelnen Koordinaten mithilfe der folgenden typischen Werte. Für PAM Cherry eins beträgt der kombinierte Frame acht. Die kombinierte Distanz in Nanometern beträgt 100, der minimale RMS beträgt vier.Die minimale Anpassungsgüte beträgt 0,25 und die maximale Exzentrizität beträgt 1,4. Klicken Sie auf die Schaltfläche „Sortieren“, um einen neuen Satz kuratierter Koordinaten zu generieren, die für die Erstellung von hochauflösenden Bildern bereitstehen. Geben Sie Werte für die korrekte Darstellung des endgültigen Bildes ein, wie beispielsweise die Rohpixelgröße, wie zuvor bestimmt, sowie die gewünschte Merkmalsgröße im gerenderten Bild, die normalerweise auf einen Wert festgelegt wird, der geringfügig über der durchschnittlichen Lokalisierung und der Pixelgröße liegt, beispielsweise 10 Nanometer.Klicken Sie für das gerenderte Bild auf die Schaltfläche „Render“, um das Palm-Bild zu generieren. Verwenden Sie anschließend die Plus- und Minus-Lupe-Symbole in der Symbolleiste des Abbildungsfensters, um hinein- und hinauszuzoomen und einzelne Moleküle in lebenden Zellen zu verfolgen. Behandeln und säen Sie die Zellkulturfläche und die Zellen wie zuvor in diesem Video beschrieben aus.Stellen Sie sicher, dass die Deckglasdicke für den Mikroskopieaufbau geeignet ist, nachdem Sie die Zellen durchtrennt und alle für das Experiment erforderlichen Behandlungen und Inkubationen durchgeführt haben. Stellen Sie die Kulturschale auf einen Inkubator auf dem Mikroskoptisch. Lassen Sie die Schale einige Minuten auf dem Objekttisch ruhen, bis sich Temperatur und CO2-Konzentration stabilisiert haben. Blockieren Sie die Laserstrahlen.Wenn keine CO2-Steuerung verfügbar ist, wechseln Sie unmittelbar vor der Bildaufnahme auf ein CO2-unabhängiges Medium wie Leibovitzs L 15, um die Hintergrundfluoreszenz zu reduzieren. Erwerben Sie schließlich die Bilder wie zuvor gezeigt, wobei eine geeignete Belichtungszeit eingestellt wird, um ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis sicherzustellen, ohne die zeitliche Auflösung zu beeinträchtigen. Der BFC-Palm in dieser Abbildung ist der KRAS G 12 D-Mutant, der mit der RAS-Bindedomäne oder RBD von CRAF interagiert. Jede der hier gezeigten vier Kombinationen wurde mittels lentiviraler Infektion in U2 OS-Zellen eingeführt. Zellen mit zwei der Konfigurationen zeigten starke positive BFC-Signale, erkennbar an dem plötzlichen Anstieg der Fluoreszenz, wenn der 405-Nanometer-Laser eingeschaltet wurde, bedingt durch die Photoaktivierung des rekonstituierten PAM Cherry one, wie hier mit denselben experimentellen Einstellungen wie beim ursprünglichen PAM Cherry one demonstriert.Ein starkes BFC-Signal wurde nach Infektion mit RN R und RAF RBD RC erzeugt. Hier bezeichnen RN und RC die N- und C-terminale Fragment von PAM Cherry One jeweils, wenn einzelne Moleküle vergrößert werden, und ihre nanoskalige räumliche Verteilung ist in diesem Experiment deutlich sichtbar, in dem Einzelmolekül-Tracking-PALM durchgeführt wurde, um Diffusionsbahnen einzelner RAs aufzuzeichnen. RAF RBD-Komplexe unter kontinuierlicher Beleuchtung mit 561 Nanometer und 405 Nanometer Laser. Einzelne PA m cherry one Moleküle st.Schalten Sie ein und bleiben Sie einige Bilder lang aktiv, bevor sie in dunkle Zustände übergehen, in denen sie entweder unbeweglich oder beweglich waren. Diese Aufzeichnung mehrerer Moleküle veranschaulicht deutlich beide Arten von Trajektorien. Dieselbe heterogene Verteilung von Diffusionszuständen lässt sich aus dem Histogramm der Molekülverschiebungen zwischen aufeinanderfolgenden Bildern ableiten. Massen beherrscht.Diese Technik kann je nachdem, ob die Konstrukte transient übertragen, transfiziert oder stabil unterdrückt werden, innerhalb von einer bis drei Wochen durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, Kontrollen vorzubereiten, beispielsweise mutierte Putins, die nach diesem Verfahren keine Interaktion mehr aufweisen. Weitere Methoden, wie beispielsweise eine Clusteranalyse, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, etwa wie die räumliche Organisation der Proteininteraktionen in der Zelle aussieht.Für die Zellverfolgung im Labor und als evaluative Grundlage kann die Einzelpartikel-Verfolgung durchgeführt werden, um Diffusionszustände und Übergangswahrscheinlichkeiten nach ihrer Entwicklung zu bestimmen. Diese Technik wird in unserem Labor im Bereich der Krebsbiologie eingesetzt, um RA-vermittelte Wechselwirkungen sowie die Homo- und Heterodimerisierung von HER-Familienrezeptoren in menschlichen Tumorzellen zu untersuchen. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Biopsie-PALM-Analyse entwirft und durchführt, um eine Protein-Protein-Wechselwirkung von Interesse zu untersuchen.Es sollte nicht vergessen werden, dass die Arbeit mit Antivirenstoffen und Tumorzellen äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie die standardmäßigen Biosicherheitsprotokolle sollten stets beachtet werden, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Die subzelluläre Lokalisierung von Proteinen ist bei der Bestimmung der räumlich-zeitliche Regulation der zellulären Signalübertragung wichtig. Hier beschreiben wir bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BIFC) als eine einfache Methode zur Überwachung der räumlichen Wechselwirkungen von Proteinen in der Zelle.

Bimolekularen Fluoreszenz Komplementation

Dieses Video beschreibt BiFC-PALM ― eine Kombination aus photoaktivierter Lokalisationsmikroskopie und bimolekularer Fluoreszenzkomplementierung ― zur Beurteilung von Protein-Protein-Wechselwirkungen. BiFC beinhaltet die Fusion von zwei fluoreszierenden Proteinfragmenten mit zwei interagierenden Proteinen von Interesse. Wenn die beiden Proteine interagieren, werden die Fragmente in die Nähe gebracht, wodurch die beiden Teile zusammenkommen und ein funktionsfähiges fluoreszierendes Protein...

Bimolekulare Fluoreszenz-Komplementierungs-gekoppelte photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie

Wir beschreiben eine super-resolution imaging Methode, um die strukturelle Organisation des bakteriellen FtsZ-Ring, ein wesentlicher Vorrichtung zur Zellteilung zu untersuchen. Diese Methode basiert auf quantitativen Analysen von photoaktivierten Lokalisierungs-Mikroskopie (PALM) Bilder und kann auf andere bakterielle Proteine ​​des Zytoskeletts angewendet werden.

Super-Resolution Imaging der Bakterien Abteilung Machinery

Wir demonstrieren die Verwendung von Fluoreszenz-Photoaktivierungs-Lokalisierungsmikroskopie (FPALM), um gleichzeitig mehrere Arten von fluoreszenzmarkierten Molekülen in Zellen abzubilden. Die beschriebenen Techniken ermöglichen die Lokalisierung von Tausenden bis Hunderttausenden einzelner fluoreszierend markierter Proteine mit einer Genauigkeit von Dutzenden von Nanometern innerhalb einzelner Zellen.

Simultane Multicolor-Imaging biologischer Strukturen mit Fluoreszenzphotoaktivierung Lokalisationsmikroskopie

Photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM), kombiniert mit Einzelmolekül-Tracking ermöglicht die direkte Beobachtung und Quantifizierung von DNA-Protein-Interaktionen in lebenden Escherichia coli-Zellen.

Visualisierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen in der lebenden Bakterienzellen Verwendung Photoactivated Einzelmolekül-Tracking

Bildung von Protein-Komplexen in vivo kann durch bimolekulare Fluoreszenzkomplementation visualisiert werden. Interaktionspartnern sind, um komplementäre Teile Fluoreszenz-Markierungen geschmolzen und transient in Tabakblättern exprimiert, was zu einem wiederFluoreszenzSignal auf enger Nähe der beiden Proteine.

Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Bimolekulare Fluoreszenz-Komplementation in Tabak-Protoplasten-und Blätter-Visualisierte

PI (4,5) P 2 regelt verschiedene Zellfunktionen, aber die nanoskaligen Organisation in der Zellplasmamembran ist wenig bekannt. Durch Markierung PI (4,5) P 2 mit einer zweifarbige Fluoreszenzsonde zur Domäne Pleckstrin Homology fusioniert beschreiben wir einen neuen Ansatz der PI (4,5) P 2 in der räumlichen Verteilung der Plasmamembran im Nanometerbereich zu studieren .

Einzelmolekül-Super-Resolution Imaging von Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat in der Plasmamembran mit neuartigen Fluoreszenzsonden

Wir präsentieren ein Protokoll für die Anwendung von interferometrischen photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (iPalm), einer 3-dimensionalen Einzelmoleküllokalisierung Super Resolution Mikroskopie-Methode, um die Abbildung des Aktin-Zytoskelett in adhärenten Säugerzellen. Dieser Ansatz ermöglicht es Licht-basierte Visualisierung von Nanostrukturmerkmale, die sonst mit herkömmlichen beugungsbegrenzten optischen Mikroskopie ungelöst bleiben würde.

Dreidimensionale Super Resolution Mikroskopie von F-Aktin durch interferometrische fotoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (iPalm)

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die multi-Color Lokalisierung der einzelnen Membranproteine in Organellen der lebenden Zellen. Um Fluorophore zu befestigen, sind selbst Kennzeichnung Proteine verwendet. Proteine, befindet sich in verschiedenen Membranen Kompartimenten des die gleichen Organellen lokalisiert werden können, mit einer Genauigkeit von ~ 18 nm.

Multi-Color-Lokalisierung Mikroskopie des einzigen Membranproteine in Organellen der lebenden Säugetier-Zellen

Herkömmliche BODIPY-Konjugate können für die livezellige Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie (SMLM) durch Ausnutzung ihrer vorübergehend bildenden, rot verschiebeten Bodenzustandsdimer eingesetzt werden. Wir präsentieren ein optimiertes SMLM-Protokoll zur Verfolgung und Auflösung subzellulärer neutraler Lipide und Fettsäuren in lebenden Säugetier- und Hefezellen auf der nanoskopischen Längenskala.

Konventionelle BODIPY-Konjugate für Live-Cell Super-Resolution-Mikroskopie und Single-Molecule Tracking

Die Bildung eines richtigen Sarcomere-Netzwerks ist wichtig für die Reifung von iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten. Wir präsentieren einen super Auflösungs-basierten Ansatz, der die quantitative Bewertung der strukturellen Reifung von Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten ermöglicht, um die Kulturbedingungen zu verbessern, die die Herzentwicklung fördern.

Analyse des α-Actinin-Netzwerks in humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten mittels Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie

Erfahren Sie, wie BiFC-PALM Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Zellen auf Einzelmolekül- und Nanometerskala visualisiert. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Ras-Raf-Komplexen in U2OS-Zellen.

Photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie mit Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (BIFC-PALM)

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