Photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie mit Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (BIFC-PALM)

Das übergeordnete Ziel dieser Mikroskopietechnik ist es, Protein-Protein-Wechselwirkungen auf der Einzelmolekül- und Nanometerskala sichtbar zu machen. Diese Methode kann uns also helfen, einige Schlüsselfragen im Bereich der Biologie zu beantworten, wie z.B. molekulare Wechselwirkungen in onkogenen Signalprozessen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie empfindlich und spezifisch ist und eine Auflösung von Einzelmolekülen und Nanometern bietet.

Nach dem Klonieren von RAs und RAF R-B-D-P-A-M Cherry One wird das Verfahren von Dr. Tahan demonstriert, einem leitenden Forscher, der in meinem Labor tätig ist. Nach dem Klonen von RAs und RAF R-B-D-P-A-M fragmentiert man die Verpackung in virale Partikel und infiziert U2-OS-Zellen gemäß dem Textprotokoll. Zur Vorbereitung einer Probe für die Speicherfolie werden etwa 5,5 mal 10 bis zur vierten stabilen Expressionszelle pro Vertiefung einer Glasbodenkammer mit acht Vertiefungen in 350 Mikroliter phenolrotfreies DMEM eingeschoben. Verwenden Sie frisches Paraldehyd mit Glutaraldehyd, um die Zellen zu fixieren, und nach dem Ersetzen des Fixiermittels durch PBS oder Bildgebungspuffer 100 Nanometer Goldpartikel vortexen und 35 Mikroliter pro Vertiefung hinzufügen, um die Drift des Tisches während der Bildgebung zu verfolgen.

Nähern Sie sich dem Mikroskop und schalten Sie die 405- und 561-Nanometer-Laser ein, halten Sie die Verschlüsse an dieser Stelle geschlossen und stellen Sie sicher, dass der dichroitische 561-Nanometer-Spiegel und der Kerbfilter an Ort und Stelle sind. Öffnen Sie die Bildaufnahmesoftware. Schalten Sie die E-M-C-C-D-Kamera ein und lassen Sie sie abkühlen und stellen Sie die Belichtungszeit auf 100 Millisekunden und die E-M-C-C-D-Verstärkung auf einen entsprechenden Wert ein.

Geben Sie Immersionsöl in das Objektiv und fixieren Sie die Probe auf dem Mikroskoptischalter. Bringen Sie anschließend die Probe entweder mit dem Hellfeld oder dem 561-Nanometer-Laser in den Fokus, um RAs und andere Membranproteine abzubilden. Verwenden Sie ein 60-faches APO-Chromat-Rasenobjektiv mit einer numerischen Apertur von 1,49 und bringen Sie das Mikroskop in eine Rasenkonfiguration.

Stellen Sie den Anregungslaser so ein, dass er beim Auftreffen auf die hintere Öffnung des Rasenobjektivs dezentriert ist, was dazu führt, dass der Laser beim Erreichen des Deckglaspuffers in die Fläche abgelenkt wird. Passen Sie die Einfallsposition des Lasers so lange an, bis der kritische Winkel erreicht ist und der Laser zurückreflektiert wird. Suchen Sie nach einer Zelle, die abgebildet werden soll und in der mehrere Goldpartikel angezeigt werden.

Legen Sie dann eine Region of Interest fest, die die Zelle oder einen Bereich davon und die Goldpartikel umschließt, falls aufgrund der hohen Expressionsniveaus bereits eine ausreichende Aktivierung erfolgt. Beginnen Sie die Erfassung, wenn der 405-Nanometer-Laser ausgeschaltet und der 561-Laser-Laser eingeschaltet ist. Andernfalls schalten Sie den 405-Nanometer-Laser auf die niedrigste Werkseinstellung ein und erhöhen Sie sie allmählich, bis Dutzende von Molekülen pro Bild vorhanden sind oder so dass einzelne Moleküle gut getrennt sind.

Erhöhen Sie im Laufe der Datenerfassung schrittweise die Laserleistung von 405 Nanometern, um die Punktdichte in etwa konstant zu halten. Setzen Sie die Bildaufnahme fort, bis sie hoch ist 4 0 5. Die Macht tritt nicht mehr in Gang.

Aktivierungsereignisse werden beendet, um Bilder zu verarbeiten. Laden Sie die Bildbearbeitungssoftware herunter. Öffnen Sie MATLAB und laden Sie die WFI-Lesesoftware.

Zeigen Sie die Rohbildsequenz an und bestimmen Sie den Interessenbereich oder ROI. Wählen Sie den Bereich des Stapels aus, der verarbeitet werden soll, indem Sie mit der linken Maustaste klicken und einen Rahmen um den gewünschten Bereich ziehen. Wenn der interessierende Bereich während der Aufnahme nicht verkleinert wurde, wählen Sie einen kleineren Bereich aus, um die Rechenzeit zu verkürzen und die Auswahl eines Bereichs aufzuheben und den gesamten Frame zu verarbeiten. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf eine beliebige Stelle im Bild daneben, um einen Satz treuhänderischer Marker zu definieren, z. B. Goldnanopartikel, die auf dem Deckglas absorbiert werden, die gut isoliert, gleichmäßig und geformt sind und im gesamten Bildstapel im Sichtfeld vorhanden sind. Beginnen Sie damit, ein mögliches Goldpartikel auszuwählen, indem Sie mit der linken Maustaste auf sein Bild klicken und ein kleines Kästchen darum ziehen.

Klicken Sie unter "Partikelverfolgung" auf die Schaltfläche "Spur". Es wird ein Diagramm angezeigt, das die Position des ausgewählten Goldpartikels auf dem Bildstapel anzeigt, der das Ausmaß der Drift darstellt. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um so viele Goldpartikel wie möglich zu verfolgen und die Partikel zu bestimmen, die zusammen verfolgt werden. Idealerweise.

Die Gesamtabweichung liegt in der Größenordnung von maximal 0,1 Pixeln, jeweils einzeln. Wählen Sie die Goldpartikel aus, die zusammen und unter Partikelverfolgung verfolgt wurden. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Markierung hinzufügen".

Ein grünes Kreuz zeigt an, dass das Partikel als Markierung hinzugefügt wurde und zur Korrektur der Drift verwendet wird. Passen Sie den Glättungsbereich und den Schwellenwert des Sigma-Bereichs nach Bedarf an, indem Sie den Wert leicht ändern. Klicken Sie auf die Schaltfläche Partikel suchen, um die Einstellungen zu testen und Prozesspartikel wie die PAM-Kirsch-Eins-Moleküle, die relativ rund und hell sind, visuell zu untersuchen.

Um mit der Verarbeitung der Bilder zu beginnen, klicken Sie auf die Schaltfläche "Kabeldatei erstellen" und speichern Sie die Datei unter einem gewünschten Namen, um die Bilder nachzubearbeiten und das Handflächenbild zu rendern. Starten Sie das Palm-Paket in MATLAB und laden Sie die soeben erstellte Dot-Core-Datei. Ein natürlich gerendertes Bild wird in der Bildbox neben den Steuerschaltflächen angezeigt.

Sortieren Sie die einzelnen Koordinaten anhand der folgenden typischen Werte. Bei PAM Cherry one ergibt der kombinierte Rahmen acht. Die Kombination aus Abstand in Nanometern entspricht 100 minimalem RMS gleich vier.

minimale Anpassungsgüte beträgt 0,25 und die maximale Exzentrizität 1,4. Klicken Sie auf die Schaltfläche Sortieren, um einen neuen Satz kuratierter Koordinaten zu generieren, die zum Rendern von hochauflösenden Bildern bereit sind. Geben Sie Werte für das korrekte Rendern des endgültigen Bildes ein, z. B. die Rohpixelgröße, wie sie zuvor bestimmt wurde, die gewünschte Merkmalsgröße im gerenderten Bild, die normalerweise auf einen Wert festgelegt wird, der etwas höher ist als die durchschnittliche Lokalisierung und die Pixelgröße, z. B. 10 Nanometer.

Klicken Sie für das gerenderte Bild auf die Schaltfläche Rendern, um das Handflächenbild zu generieren. Verwenden Sie dann die Plus- und Minus-Vergrößerungssymbole in der Symbolleiste des Abbildungsfensters, um zu vergrößern und zu verkleinern, um einzelne Moleküle in lebenden Zellen zu verfolgen. Behandeln Sie die Oberfläche der Gewebekultur und plattieren Sie die Zellen, wie weiter oben in diesem Video beschrieben.

Stellen Sie sicher, dass das Deckglas die richtige Dicke für die Mikroskopie hat, die nach dem Durchtrennen der Zellen und der Durchführung aller für das Experiment erforderlichen Behandlungen und Inkubationen eingerichtet wurde, und stellen Sie die Kulturschale auf einen Inkubator auf der Bühne. Lassen Sie das Gericht einige Minuten auf der Bühne ruhen, bis sich die Temperatur und die CO2-Konzentration bei diesem Schritt stabilisiert haben. Blockieren Sie die Laser.

Wenn keine CO2-Kontrolle verfügbar ist, wechseln Sie direkt vor der Bildgebung zu einem CO2-unabhängigen Medium, wie z. B. dem L 15 von leibovitz, um die Hintergrundfluoreszenz zu unterdrücken, und nehmen Sie schließlich Bilder auf, wie zuvor gezeigt, und stellen Sie eine geeignete Belichtungszeit ein, um ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis zu gewährleisten, ohne die Zeitauflösung zu verlieren. Die BFC-Handfläche in dieser Abbildung ist die KRAS G 12 D-Mutante, die mit der RAs-Bindungsdomäne (RBD) von CRAF interagiert. Jede der vier hier gezeigten Kombinationen wurde unter Verwendung lentiviraler Infektionszellen in U2-OS-Zellen eingeführt, wobei zwei der Konfigurationen starke positive BFC-Signale aufwiesen, wie durch den abrupten Anstieg der Fluoreszenz beim Einschalten des 405-Nanometer-Lasers aufgrund der Photoaktivierung von BFC-rekonstituiertem PAM Cherry eingeschaltet wurde, wie hier unter Verwendung der gleichen experimentellen Einstellungen wie mit dem übergeordneten PAM Cherry gezeigt.

Nach einer Infektion mit RN R und RAF RBD RC wurde ein starkes BFC-Signal erzeugt. Hier bezeichnen RN und RC das n- und C-terminale Fragment von PAM Cherry jeweils eins, wenn sie in einzelne Moleküle hineingezoomt werden, und ihre räumliche Verteilung auf der Nanoskala ist in diesem Experiment deutlich zu sehen, in dem die Verfolgung einzelner Moleküle durchgeführt wurde, um Diffusionsbahnen einzelner RAs zu erfassen. RAF RBD-Komplexe unter kontinuierlicher Beleuchtung mit 561 Nanometer und 405 Nanometer Lasern. Individuum PA m Kirsche ein Molekül st.

Schalten Sie das Frame ein und halten Sie einige Frames ab, bevor Sie in dunkle Zustände wechseln, in denen sie entweder unbeweglich oder mobil sind. Dieses Diagramm der Aufzeichnungen für mehrere Moleküle veranschaulicht deutlich beide Arten von Trajektorien. Die gleiche heterogene Verteilung der Diffusionszustände kann aus dem Histogramm der Molekülverschiebung zwischen aufeinanderfolgenden Frames abgeleitet werden.

Diese Technik kann in ein bis drei Wochen durchgeführt werden, je nachdem, ob die Konstrukte transzendent, transfiziert oder stabil unterdrückt sind, wenn sie richtig ausgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, Kontrollen wie mutierte Putins vorzubereiten, denen die Interaktion nach diesem Verfahren fehlt. Andere Methoden, wie z.B. eine Clusteranalyse, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. wie die Proteininteraktionen in der Zelle räumlich organisiert sind.

Für die Verfolgung von Laborzellen kann eine Auswertungsbasis und ein Einzelpartikel-Tracking durchgeführt werden, um die Diffusionszustände und die Übergangswahrscheinlichkeiten nach ihrer Entwicklung zu bestimmen. Diese Technik wird in unserem Labor auf dem Gebiet der Krebsbiologie eingesetzt, um die Wechselwirkungen zwischen RA und der Homosexualität und der Aktivierung ihrer Familienrezeptoren in menschlichen Tumorzellen zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine Biopsiehandfläche entwerfen und implementieren, um eine Proteininteraktion von Interesse zu untersuchen.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Antivirenprogrammen und Tumorzellen äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie die Standard-Biosicherheitsprotokolle getroffen werden sollten.