Name: Hochdurchsatz-Screening von Widerspenstigkeit Variationen in Lignocellulose-reicher Biomasse: Gesamt Lignin, Lignin-Monomeren und enzymatische Zuckerfreisetzung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Erfahren Sie Hochdurchsatz-Screening von Biomasse-Varianten zur Messung von Widerspenstigkeit mittels thermochemischer Vorbehandlung und enzymatischer Hydrolyse. Diese Methode identifiziert optimale Rohstoffe für Biokraftstoffe.

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Die Autoren danken der Praktikantin Evelyn Von Neida, die herausragende Einblicke in die Vorbereitung von Biomasseproben für die beiden in diesem Manuskript besprochenen Hochdurchsatz-Pipelines gegeben hat. Die Entwicklung dieser Arbeit und des Manuskripts wurde vom BioEnergy Science Center unterstützt. Das BioEnergy Science Center ist ein Bioenergie-Forschungszentrum des US-Energieministeriums, das vom Office of Biological and Environmental Research im DOE Office of Science unterstützt wird. Das National Renewable Energy Laboratory (NREL) ist ein nationales Labor des US DOE Office of Energy Efficiency and Renewable Energy, das von der Alliance for Sustainable Energy, LLC für das DOE betrieben wird. Diese Arbeiten wurden vom U.S. Department of Energy im Rahmen des Vertrags Nr. DE-AC36-08-GO28308 mit dem National Renewable Energy Laboratory.

1. Hochdurchsatz-Bestimmung von Glucose und Xylose Renditen nach enzymatischer Verzuckerung 9,29 <ol><li> Probenvorbereitung (Schleifen, De-starching, Gewinnung, Vorbehandlung) <ol><li> Schleifen mindestens 300 mg jeder Biomasse Probe unter Verwendung einer Wiley-Mühle, so daß die Teilchen durch ein 20 mesh passieren (850 um) Bildschirm. Transfer zum antistatischen zip-Top-Taschen (typischerweise Strichcode) und Plattenprobeninformationen zum Barcode-Datenbank. </li><li> In etwa 250 mg oder mehr des Grund Biomasse aus antistatischen Beutel mit einem nummerierten (mit Bleistift, verwenden Sie keine Tinte oder Marker) Teebeutel vorsichtig rollen die Teebeutel, dass auf jeden Fall die Enden über die Biomasse zu falten, um zu verhindern, Verlust während de-starching und Extraktion. </li><li> Wickeln Sie den Teebeutel geschlossen mit verzinnten Kupferdraht. Nehmen Sie den Teebeutel Nummer für jede Probe mit Strichcode. </li><li> Vorbereitung de-Stärkeenzymlösung aus kommerziellen Enzyme (typischerweise 0,25% (v / v) Glucoamylase (~ 1.600 AGU / l) und1,5% (v / v) alpha-Amylase (~ 2.900 KNU-S / L) in 0,1 M Natriumacetat (pH 5,0)). Bereiten Sie 16 ml pro g des Groß Biomasse oder 500 ml pro 120 Teebeutel-Proben. Anmerkung: Die Beladungen entfernen kann Stärke aus irdische Biomasse sollte empirisch durch Testen der Stärke nach der Verdauung mit einer Reihe von Enzymbeladungen und Verhältnisse bestimmt werden. </li><li> In einem Kunststoffbehälter, fügen Sie 16 ml de-Stärkeenzymlösung pro 1 g des Großirdischen Biomasse. Für eine Charge de-Appretur Protokoll hinzufügen 120 Teebeutel auf 500 ml der Puffer-Enzymlösung. </li><li> Inkubieren in einem Schüttler bei 55 ° C für 24 (± 4) Stunden, bei 120 UpM auf mögliche Stärke zu entfernen. </li><li> Nach der de-Stärke Inkubation spülen Sie und genießen die Biomasse in mehreren Litern entionisiertem Wasser für 30 Minuten. Wiederholen Sie diesen Vorgang zwei weitere Male, um Puffersalze, die Stöße (Bildung von Gasblasen in der Lösung, die in einer plötzlichen und heftigen Anstieg des Niveaus der Lösung führen kann, was zu heißen flüssigen Ethanol, um Kaskaden verursachen können, zu entfernenaus dem Reaktionsgefäß) während der Extraktion. </li><li> Nach der Vollständigkeit Spülen der de-gestärkten Biomasse, legen Sie die Teebeutel in die Soxhlet-Säule für die Extraktion. Kein Kausche ist für diesen Schritt erforderlich. </li><li> Einrichten der Soxhlet Reflux, mit 95% Ethanol und extrahieren Sie die Proben für 24 Stunden. </li><li> Entfernen Sie die Teebeutel aus der Soxhlet-Reaktor und verteilt in einer einzigen Schicht auf einem flachen Fach. </li><li> Man lässt die Proben über Nacht bei Raumtemperatur in einem Abzug trocknen. </li><li> Rollen Sie die Teebeutel und gibt die getrocknete Biomasse zur Original barcodierte antistatischen Beuteln. Hinweis: Die Anti-Statik-Taschen sind effizienter bei der Reduzierung statischer Elektrizität in der Biomasse, die Verbesserung der Fahreigenschaften. Wenn andere Speicheroptionen verwendet werden, können zusätzliche Biomasse aufgrund der Biomassefesthalten an der Seite des Vorratsbehälters erforderlich sein. </li><li> Übertragen mindestens 50 mg der getrockneten Biomasse mit einem Barcode versehene Trichter (unter Verwendung von mehr Material ist besser für eine genaue Abgabe). Skann Barcodes von den antistatischen Beuteln und dem Aufnahmetrichter, um genaue Probenverfolgung zu gewährleisten. </li><li> Last Trichtern auf Feststoffe mit einem Gewicht von Roboter, aufmerksam auf die Reihenfolge der Proben in den Racks. Laden Sie genug Reaktorplatten, alle Proben enthalten und wählen Sie das Ausgabeprotokoll auf der Basis der Anzahl der Platten verwendet. </li><li> Roboter wiegen 5 mg der getrockneten Proben (± 0,3 mg) in säurebeständigen Edelstahl-Platten mit 96 Vertiefungen. Abwiegen 3 Wiederholungen jeder Probe auf der Platte verteilt auf jede lokalisierte Variationen zu minimieren. </li><li> Fügen 8 Steuer Biomasse Proben eines gut charakterisierten Biomasse Standard-Material, um die Assayleistung zu verfolgen. Für mehrere Platten, wird die Verwendung von mehreren Standard Biomasse Trichtern Teilchengröße Drift durch Sieben in den Trichtern über wiederholte Abgabezyklen zu minimieren. Anmerkung: In jeder Platte, sollte 24 Proben mit 3 Wiederholungen, 4 Rohlinge bestehend aus deionisiertem Wasser und Enzym und 8 contro seinls, mit der zuvor gekennzeichnet Standard Biomasse. Die 3 Ecke Vertiefungen von jeder der 4 Ecken der Platte sind für die Zuckerstandards vorbehalten. </li><li> Überprüfen blank und Zucker Standard Brunnen für fehlerhafte Biomassepartikel und falls vorhanden entfernen. </li><li> Fügen Sie 250 ul entionisiertem Wasser in jedes Loch, und verschließen Sie die Platten mit Silikon-selbstklebenden Polytetrafluorethylen (PTFE) Band. </li><li> Unter Verwendung eines 1/8 &quot;Lötkolbenspitze, durchbohren die PTFE-Band an jedem Dampfanschluss (117 gesamt) für jede Platte. Verwenden Sie eine leere Platte auf versiegelten Reaktorplatte als Führung gestapelt und zu beschränken, PTFE-Filmbewegung. </li><li> Klemmen Sie die Platten fest mit 0,031 &quot;dicken glasfaserverstärktem PTFE-Dichtungen (mit Löchern für Dampföffnungen vorgestanzt) zwischen den Platten und leere Teller auf Ober- und Unterseite des Stapels. Vorbehandlung der Proben mit einem Dampfreaktor auf 180 ° C für 17,5 min, oder eine andere Temperatur / Zeit-Kombinationen, basierend auf gewünschten Härte eingestellt. </li><li> Kühlen Reaktorplatten bis 50 °; C durch Hochwasser mit VE-Wasser. </li></ol></li><li> Enzymatischen Verzuckerung <ol><li> Vorbereitung einer enzymatischen Verzuckerung Lösung, bestehend aus 8% (v / v) Enzym-Lösung in 1,0 M Natriumcitrat, pH 5.0. Bereiten Sie 5 ml pro Reaktorplatte. Hinweis: Die Verdünnung erforderlich sollte basierend auf Aktivität und Proteingehalt der spezifischen Aktienenzymlösung bestimmt werden. </li><li> Wenn die Platten sind cool, zentrifugieren sie in einem Schwingbecher-Rotor bei 1.500 × g für 20 min. Entfernen Siegelfolie. Hinweis: Diese Platten sind schwer und die Zentrifuge Spezifikationen sollten auf Verträglichkeit überprüft werden. </li><li> In 40 ul der 8% Enzymstammlösung in jede Vertiefung (70 mg Enzym pro g Biomasse). </li><li> Verschließen Sie mit neuen PTFE-Band. Zeigen versiegelt Platte in Magnetplattenklemme. </li><li> Vorsichtig mischen die Proben durch Inversion (mindestens 15-fach), und Inkubieren bei 50 ° C für 70 Std. </li><li> Wenn die Verzuckerung zu dem Schluss gekommen, mischen durch Umdrehen und zentrifugieren Sie die Platten bei 1.500 xg für 20 min. </li></ol></li><li> Zucker Assay <ol><li> Einen Satz von 6 Glucose und Xylose kombinierten Kalibrierungsstandards in 0,014 M Citrat-Puffer (pH 5,0) von 0 bis 0,750 mg / ml (0, 0,2, 0,3, 0,45, 0,65 und 0,75 mg / ml empfohlen) und 0 bis 0,600 mg / ml (0, 0,1, 0,2, 0,35, 0,45 und 0,6 mg / ml empfohlen) für Glucose und Xylose sind. </li><li> Bereiten Sie die Glucose-Oxidase / Peroxidase (GOPOD) und Xylose-Dehydrogenase (XDH) Reagenzien gemäß den Anweisungen im Kit. </li><li> Mit einer Pipette zu entfernen 200 ul Flüssigkeit aus den 4 Ecken Brunnen und Rand Brunnen neben der Ecke Kavitäten (12 insgesamt Wells) der Reaktorplatte. </li><li> Mit einer Pipette verzichtet werden 180 ul entionisiertem Wasser in jede Vertiefung einer 96-Well Polystyrol Flachboden-Verdünnungsplatte. Kein Wasser auf die 12 Zucker Standard und Ecke Brunnen nicht hinzufügen (entfernen Sie diese Tipps, wenn unter Verwendung eines 96-Kanal-Kopf). </li><li> Verwendung eines Pipette jeweils 180 ul GOPOD in jede Vertiefung der Glucose-Assay plaß. </li><li> Mit einer Pipette verzichtet werden 180 ul XDH Reagenz in jede Vertiefung der Xylose Assayplatte. </li><li> Mit Hilfe einer Pipette 20 ul Aliquots Hydrolysat aus dem 96-Loch-Reaktorplatte auf der Verdünnungsplatte. Pipette aus dem oberen Teil der Vertiefungen zur Biomasse-Feststoffe und Restflüssigkeit in der Ecke Vertiefungen zu vermeiden. Mischen durch Verreiben für mindestens 10 Zyklen. </li><li> Mit Hilfe einer Pipette 110 ul von Zucker-Standards, in zweifacher Ausfertigung an die Ecke Vertiefungen der Verdünnungsplatte. </li><li> Mit Hilfe einer Pipette 20 ul Aliquots von der Verdünnungsplatte auf die Glucose und Xylose Assayplatten. Mischen Sie durch Verreiben. </li><li> Inkubieren Glucose und Xylose Assay-Platten bei Raumtemperatur für 30 min. Keine Oberflächenblasen vorsichtig brechen vor dem Lesen. Ein kurz über die Oberfläche der Platte vergangen Heißluftpistole funktioniert gut. </li><li> Verwendung eines UV / VIS-96-Well-Platten-Lesegerät, setzen Sie den gemessenen Wellenlänge um 510 nm und zeichnen Sie die Absorption gegen einen Reagenzienleer.Diese Messung überwacht die Bildung von Chinonimin, die proportional zur Glucosekonzentration ist. Die Glucosekonzentration wird aus der Eichkurve basierend auf den Kalibrierungsstandards in 1.3.1 hergestellten berechnet. </li><li> Verwendung eines UV / VIS-96-Well-Platten-Lesegerät, setzen Sie den gemessenen Wellenlänge um 340 nm und zeichnen Sie die Absorption. Diese Messung überwacht die Reduktion von NAD + zu NADH, die proportional zur Xylose-Konzentration. Die Xylose-Konzentration von der Kalibrierungskurve auf Grundlage der Kalibrierungsstandards in 1.3.1 hergestellten berechnet. </li></ol></li></ol> 2. Hochdurchsatz-Bestimmung von Gesamt Lignin und Lignin Monomere Inhalt Mit pyMBMS 28 <ol><li> Probenvorbereitung <ol><li> Schleifen und extrahieren Sie die Biomasse unter Verwendung der in den Schritten 1.1.1 und 1.1.6-1.1.8 beschriebenen Methoden. Dazu gehören Mahlen und Extrahieren eines Satzes von Standards als experimentelle Kontrollen zu verwenden. Hinweis: Die pyMBMS measurements nicht Teilchengröße abhängig, so dass, wenn nur mit dem pyMBMS Protokoll sollte Biomasse Herstellung durchgeführt, um damit die Probe in den Probenhalter 4 mm passen, &lt;werden. </li><li> Mit einem kleinen Spatel Abgabe etwa 4 mg (3 bis 5 mg bevorzugt) der aufbereiteten Biomasse in eine 80 &amp; mgr; Edelstahl-Tasse für den Autosampler entwickelt. </li><li> Stellen Sie sicher, dass mindestens 10% der Proben, die analysiert werden Kontrollstandards, wie sie aus dem Nationalen Institut für Standards und Technologie zur Verfügung (Bagasse-8491; Pappel-8492; Pinien 8493 oder Weizenstroh-8494). Der Standard kann auch jede Spezies analog zu den zu analysierenden Proben, die bereits mit Standardmethoden charakterisiert haben. </li><li> Die Proben in den Autosampler Becher mit einer Pinzette, um Verzerrungen zu vermeiden zufällig laden wegen möglicher Spektrometer Drift über die Zeit. Hinweis: Ein typisches Randomisierung der Proben würde die Messung aller Proben ein, gefolgt von einer Re-Randomisierung umfassender Reihenfolge der Proben, eine Zweitmessung. Randomisierung Programme sind online verfügbar. </li><li> Mit einem Standard-Loch manuell Glasfilterscheiben zu produzieren von A / D-Glasfaser-Platten, ohne Bindemittel. Halten Sie die runde Glasfaserfilter mit einer Pinzette, zentrieren sie über den Probenbecher, und drücken Sie in die Probe mit einem 3,5 mm Innensechskantschlüssel, um das Material in jeder Tasse während des Experiments zu beschränken. </li></ol></li><li> Instrumental-Protokoll <ol><li> Kalibrieren des Massenspektrometers mit einem bekannten Standard, der Peakintensitäten über den gesamten Bereich von Verbindungen, die für die experimentellen Proben bestehen kann, hat. Für typische Biomasseproben verwenden Perfluortributylamin (PFTBA). </li><li> Gesetzt den Heliumträgergasflussrate von 0,9 L / min mit einem Gasdurchflussmesser. </li><li> Die Auto- sampler Ofen auf eine Pyrolysetemperatur von 500 ° C und die Grenzflächentemperatur auf 350 ° C unter Verwendung der Autosampler Software. Hinweis: Ein 1/8 &quot;aus Edelstahl erwärmtÜbertragungsleitung in Wärmeband, das die Auto-Sampler zum Massenspektrometer verbindet wickelt wird unter Verwendung einer Wärmeregler bei 250 ° C geregelt. </li><li> Beginnen Sie die Datenerfassung auf dem Massenspektrometer und warten Sie mindestens 60 Sekunden, um ausreichend Daten für die Hintergrundspektren Sammlung zu erhalten. </li><li> Starten Sie den automatischen Autosampler-Methode mit den Spezifikationen von 2.2.2. Hinweis: Der Autosampler fällt jede Probe einzeln in den Autosampler Ofen. Die gesamte Datenerfassungszeit beträgt etwa 1,5 min; jedoch Pyrolyse eines typischen 4-mg-Probe nach 30 Sekunden abgeschlossen. </li><li> Nehmen Gesamtionengehalt (TIC) von jeder Probe mit Massenspektrometer-Software mit 0,5 sec Abtastrate. Nehmen Intensitäten zwischen m / z 30 bis 450. Hinweis: Typische Biomasse Verbindungen verwenden weiche Ionisierung bei 17 eV. Das Instrument kann größeren Abständen von m / z 1 bis 1000 aufzunehmen; jedoch wird Abtastrate von Computerrechenleistung begrenzt werden. </li><li> Entfernen Hintergrund aus den Spektren mit der maFeature Jahres zu verbessern in der Software. Anmerkung: Eine 60 abzutastenden Teil der Grundlinie zu Beginn der Datenerfassung verwendet, um eine durchschnittliche Hintergrundwert zu berechnen. Diese durchschnittliche Hintergrundspektren aus dem experimentellen Probenspektren automatisch im Massenspektrometer-Software entfernt. </li><li> Importieren Sie die einzelnen Spalte Textdatei, die durch den Massenspektrometer-Software, die die spektralen Daten für jede Probe in ein Datenbankprogramm und vereinen alle Proben in einer Datenbank. In geltendem Metadaten in die Tabellenkalkulation. Importieren Sie die formatierte Daten (Tabellenkalkulationsdatei / CSV) in eine Statistik-Software-Paket und bedeuten Normalisierung der Spektren für die Variation in den pyrolysierten Probe Massen zu berücksichtigen. </li><li> Verwenden Sie eine Statistik-Software-Paket, um eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) mit Hilfe der spektralen Daten zur Gruppierung der replizierten Standardproben in den Messungen verwendet analysieren zuführen sowie zu beurteilen, welche Spitzen integral für die Einstufung chemischer sindVerbindungen in den Ladungsplot 28. Anmerkung: PCA-Gruppen der Proben auf der Basis der Ähnlichkeit ihrer Spektren, und ermöglicht eine Überprüfung der Normen auf experimentelle Fehler aufgrund von Instrumentendrift während des Laufs zu messen. </li><li> Um das Lignin Syringyl (S) / Guaiacyl (G-Verhältnis) zu berechnen, summieren die Bereiche der S Peaks (m / z = 154, 167, 168, 182, 194, 208 und 210) und dividiert durch die Summe von g Peaks bei 124, 137, 138, 150, 164 und 178. </li><li> Um die Gesamt Ligningehalt zu berechnen, summiere die Lignin Peaks mit m / z = 120, 124, 137, 138, 150, 152, 154, 164, 167, 178, 180, 182, 194 und 210. </li><li> Berechnen eines Korrekturfaktors für die Skalierung des pyMBMS Messung einer Standardmethode zur Schätzung der Gesamt Lignin, wie Klason Lignin. Teilen Sie die Klason Lignin Wert der einzelnen Standard durch die Gesamt Ligningehalt für die Standardprobe mit pyMBMS gemessen. </li><li> Wenden Sie diesen Korrekturfaktor für alle Gleich Arten im Datensatz. Wiederholen für jede Art von Biomasse analysiert. NAnmerkung: Der Korrekturfaktor kann wesentlich von der S / G der Biomasse analysiert variieren. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die wichtigsten Schritte der Probenvorbereitung für den Erhalt von genauen und reproduzierbaren Daten bei der Durchführung von Hochdurchsatz-Screening-Versuche sind wie folgt: Zucker Release Assay: Im Allgemeinen werden die Proben in Lose von wenigen Dutzend bis zu mehreren Tausend zu einem Zeitpunkt hergestellt. Jedem Hauptschritt wird typischerweise für alle Proben vor, um Schwankungen in der Zubereitung zwischen Proben zu minimieren Vorwärtsbewegung durchgefüh...

Da die weltweite Versorgung mit nicht-erneuerbaren Energieträger und die dazugehörigen Produkte sinkt, haben Wissenschaftler herausgefordert, ähnlichen Kraftstoffen und Chemikalien aus pflanzlichen Quellen 1 zu erstellen. Ein wichtiger Aspekt dieser Arbeit ist zu bestimmen, welche Arten von Pflanzen können für die Produktion von Biokraftstoffen und Biomaterialien 2,3 sein. Üblicherweise werden diese Einsatzstoffe für Lignin, Cellulose und Hemicellulose bewertet; sowie ihre Anfälligkeit für deconstruction (recalcitrance), durch thermische, mechanische und / oder chemische Vorbehandlung mit oder ohne anschließender Enzym Verzuckerung. Detailliertere Analysen werden verwendet, um die spezifische Zusammensetzung der Lignin und Hemicellulose-Fraktionen sowie eine optimale Enzymaktivitäten benötigt bestimmen. Transgene Modifikationen von Pflanzen, die nicht eigen Sie besitzen ideale Merkmale für biochemische oder thermochemische Umwandlung, um die gewünschten Rohstoffe haben die Forscher mit einer stark erweiterten Quelle Topf bereitgestelltzielle Ausgangsmaterialien 4. Die Standard-Analyseverfahren zum Quantifizieren der chemischen Eigenschaften einer Pflanze, während sehr nützlich für kleine Probenmengen, nicht geeignet sind für das schnelle Screening von Hunderten oder Tausenden von Proben 5-7. Die hierin beschriebenen HTP Methoden wurden entwickelt, um schnell und effizient auszuwerten zahlreiche Biomasse Varianten für Veränderungen in der Zellwand recalcitrance thermochemische und / oder enzymatischen Abbau. Es ist wichtig zu verstehen, dass die hier beschriebenen HTP-Screening-Assays wurden nicht entwickelt, um Wandlungs- oder Ertrag zu maximieren. Das Ziel ist der relative Unterschied in der intrinsischen recalcitrance verwandter Biomasseproben zu bestimmen. Als Folge sind viele der Analyseschritte von den &quot;typischen&quot; Umwandlung von Biomasse-Assays, wo das Ziel ist es, maximale Conversion-Rate oder das Ausmaß zu erhalten, abweichen. Beispielsweise werden geringer Vorbehandlung severities und kürzere Enzymhydrolyse verwendet zu maximieren abweichenschiede zwischen den Proben. In den meisten Fällen relativ hohe Enzymbeladungen verwendet werden, um Unterschiede, die durch experimentelle Variation der Enzymaktivität, die die Ergebnisse erheblich verfälschen könnte reduzieren. Schnelle Techniken zur Bestimmung der Zusammensetzung von Pflanzenzellwänden und den monomeren Zuckern freigesetzte folgenden enzymatischen Verzuckerung gehören Robotik, besonders angefertigt, thermochemisch kompatible 96-Well-Platten, und Modifikationen der Standard-Labormethoden 8-11 und Instrumental-Protokolle, wie Schwingungsspektroskopie (IR- (IR), im nahen Infrarotbereich (NIR) oder Raman) und magnetische Kernresonanz (NMR) 12-17. Diese Methoden sind der Schlüssel zur Isolierung von Ausgangsmaterialien mit hoher Cellulose oder niedrigen Ligningehalt, oder diejenigen erwartet, die höchsten Glucose, Xylose, Ethanol Ausbeute usw. Diese Methoden wurden heruntergerechnet Analysen, die kleinere Mengen an Biomasse und Verbrauchsmaterialien verwenden aktiviert, was zu einer Senkung der Versuchs Kosten 18 </sup&gt;. Ein weiteres Merkmal dieser methodische Ansatz ist, dass verschiedene Versuchsbedingungen schnell zu sein, und in einigen Fällen gleichzeitig ausgewertet. Beispielsweise kann eine Vielzahl von unterschiedlichen Vorbehandlungsstrategien oder Enzymcocktails getestet werden, so dass die optimalen experimentellen Parameter schnell identifiziert und verwendet werden. Beliebte Einsatzmaterialien, wie beispielsweise Maisstroh 9, Pappel 8,10, Bagasse 8 und Switch 8 wurden erfolgreich unter Verwendung dieser HTP Verfahren bewertet. Gesamt Lignin und Lignin Monomerzusammensetzung werden auch üblicherweise quantifiziert Biomasse Züge. Verringerungen der Ligningehalt haben gezeigt, dass die enzymatische Verdaubarkeit von Polysacchariden 19,20 erhöhen. Die Rolle, die das Lignin monomeren Verhältnis (oft als Syringyl / Guaiacyl (S / G) gemeldet) spielt in der Dekonstruktion der Pflanzenzellwand wird noch untersucht. Einige Berichte haben gezeigt, dass eine Verringerung des S / GQuote führte zu einer erhöhten Glucoseausbeuten nach der Hydrolyse 21, während andere Studien enthüllen den gegenläufigen Trend 19,22. Hochdurchsatz-Methoden zur Bewertung Lignin und seine Monomere sind Schwingungsspektroskopie (IR, NIR und Raman-23-26), die mit der multivariaten Analyse und Pyrolyse Molekularstrahl-Massenspektrometrie (pyMBMS) 27,28. Bei der Entwicklung von HTP Verfahren zum Screenen von Biomasse müssen mehrere integrale Überlegungen im Auge gehalten werden. Ein wichtiger Aspekt ist die Komplexität des Verfahrens. Was ist die erforderliche Qualifikationsniveau für die Technik? Chemometrische Analysen zum Beispiel erfordern bestimmte Fähigkeiten für den Aufbau, Bewertung und Aufrechterhaltung der Vorhersagemodelle. Die Standardmethoden weisen unerwünschte Vor- oder Datenanalyseschritte oder beschäftigen toxischen Reagenzien. Entwicklung der Modelle ist ein laufender Prozess, wo neue Daten über die Zeit, um die Robustheit des Modells zu erhöhen in das Modell ein. Ein weiterer ConsIDmenarbeit ist die Kosteneinsparungen und verringerte experimentellen Analysezeiten der vorgeschlagenen Hochdurchsatzverfahren. Wenn die Methode ist sehr schnell, aber sehr teuer ist, kann es keine praktikable Methode für viele Labors, um anzunehmen. Die in dieser Handschrift dargestellten Verfahren sind Varianten von standardisierten Techniken modifiziert, um die Durchsatzfähigkeiten zu verstärken. Diese Protokolle quantitativ die Biomasse Merkmale von Interesse zu messen, ohne die Notwendigkeit der Entwicklung von Vorhersagemodellen. Dies ist ein Schlüsselattribut dieser Techniken, da Vorhersagemethoden, während sie eine starke Korrelationen mit den Standardanalysen verwendet, um die Modelle zu entwickeln, sind nicht so genau wie eigentlich Messung der Menge von Interesse für die Proben. Während die Verwendung von im wesentlichen nach unten Versionen von Standard-Labormaßstab Analysemethoden skaliert Verfahren werden Genauigkeit und Präzision für die Geschwindigkeit und Durchsatz gehandelt. Meist ist dieses Ergebnis aufgrund höherer Fehlern in kleinen Volumen Pipettieren und Wiegen; sowie erhöhte sreichliche Heterogenität als Stichprobengröße wird verringert. Während große Sample-Sets können gesiebt und verglichen werden, müssen große Sorgfalt, wenn Vergleiche zwischen den einzelnen Kampagnen und den Labormaßstab Ergebnisse ausgeübt werden. Die zeitaufwendigsten Schritte erfordern die physikalische Manipulation der Biomasse. Schleifen Proben kann mehrere Minuten pro Probe, einschließlich Reinigung der Mühle zwischen den Proben zu nehmen. Manuelles Laden, Entladen und Reinigungstrichter und Befüllen und Entleeren Teebeutel und Probenbeutel ist auch sehr arbeitsintensiv. Während jeder Schritt kann eine Minute oder länger dauern kann dabei Tausende von Proben viele Stunden oder sogar Tage dauern. Die Roboter können eine typische Reaktorplatte mit Biomasse in etwa 3 bis 4 Stunden oder 6 bis 8 Platten Tag -1 Roboter laden -1. Diese Situation hängt von der Genauigkeit Parameter sowie der Art und der Menge an Biomasse zu prüfenden verwendet. Füllen Reaktorplatten mit Wasser, verdünnter Säure oder Enzym wird schnell mit einem Liquid-Handling-Roboters durchgeführt. PNachbehandlung von einem Plattenstapel (1 bis 20 Reaktorplatten) dauert zwischen 1 und 3 Stunden, wenn Montage, abkühlen und Demontage enthalten. Enzymhydrolyse dauert 3 Tage und die Zuckeranalyse benötigt etwa 1 Stunde Vorbereitungszeit plus 10 min pro Reaktorplatte, um den Test abzuschließen und lesen Sie die Ergebnisse. Ein Wochenplan gesetzt Vorbehandlung und Analyse Tage nimmt eine vernünftige Arbeitszeiten, ungerade Stunden und am Wochenende Anstrengungen für die menschliche Komponente des Assays zu minimieren und ermöglicht die Verarbeitung ~ 800 bis 1000 Proben pro Woche auf kontinuierlicher Basis. Der maximale Durchsatz von mehreren Faktoren abhängig, vor allem, wie viel Hardware (Roboter, Reaktoren Platten, etc.) und wie viel &quot;Software&quot; (dh Personal) stehen zur Verfügung, um die manuelle Arbeit zu tun. Die praktische obere Grenze ist 2500 bis 3000 Proben / Woche; erfordert jedoch, dass Ausgangs 7 Tage in der Woche Betrieb und mehrere Praktikanten und Techniker. Im Vergleich dazu würden 3.000 Proben mittels HPLC etwa 125 Tagen sam erforderlichB. Analyse plus die zusätzliche Arbeit der Hand mit einem Gewicht von Proben in Reaktoren und Filterproben vor der Analyse.

<table><tbody><tr><td>Biomek FX Automated Workstation</td><td>Beckman Coulter</td><td>Biomek FX</td><td>Automated Liquid Handler</td></tr><tr><td>Wiley</td> Mill <td>Thomas Scientific</td><td>3375E15 (Model 4) oder 3383L20 (Mini-Mill)</td><td></td></tr><tr><td>antistatische Beutel</td><td>Minigrip*</td><td>MGST4P02503</td><td>2,5x3", mehrere Lieferanten verfügbar</td></tr><tr><td>verzinnter Kupferdraht</td><td>McMaster-Carr</td><td>8871K84</td><td>0,016" Durchmesser, Teebeutel mit gebogenem Draht</td></tr><tr><td></td><td>Herbco</td><td>Press n' Brew Teebeutel</td><td>3,5x5 Zoll</td></tr><tr><td>Gluco-Amylase</td><td>Novozyme</td><td>Spirizyme Fuel&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Alpha-Amylase</td><td>Novozyme</td><td>Liquozyme SC DS</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetat-Trihydrat</td><td>jeder chemische Lieferant</td><td></td><td>Reagenzqualität</td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>jeder chemische Lieferant</td><td></td><td>Reagenz Qualität</td></tr><tr><td>190 (95%) Ethanol</td><td>jeder chemische Lieferant</td><td></td><td>Reagenzienqualität</td></tr><tr><td>Trichter</td><td>Freeslate</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96- gut C-276 Hastelloy Platten</td><td>Aspen Machining (Lafayette, Colorado)</td><td>N/A (Sonderanfertigung)</td><td></td></tr><tr><td>1/8" Lötkolbenspitze</td><td>Sears</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silikonkleber mit Teflonband 3M</td><td></td><td>5180</td><td>3" breit (36-Yard-Rollen)</td></tr><tr><td>Enzymlösung</td><td>Novozyme</td><td></td><td>Cellic CTec2</td></tr><tr><td>Zitronensäuremonohydrat</td><td>jeder Chemikalienlieferant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trinatriumcitrat-Dihydrat</td><td>jeder Chemikalienlieferant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Einweg-, Polystyrol-96-Well-Platten</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655101</td><td>oder gleichwertig; mehrere Lieferanten verfügbar</td></tr><tr><td>Glukoseoxidase/Peroxidase&nbsp;</td><td>Megazyme</td><td>K-Gluc</td><td>Megazyme D-Glucose Assay Kit</td></tr><tr><td>Xylose Dehydrogenase</td><td>Megazyme</td><td>K-Xylose</td><td>Megazyme D-Xylose Assay Kit</td></tr><tr><td>Glukose Standardlösung</td><td>Megazyme</td><td>K-Gluc</td><td>Megazyme D-Glucose Assay Kit</td></tr><tr><td>Xylose Standardlösung</td><td>Megazyme</td><td>K-Xylose</td><td>Megazyme D-Xylose Assay Kit</td></tr><tr><td>Probenbecher aus Edelstahl</td><td>Frontier Laboratories</td><td>PY1-EC80F</td><td></td></tr><tr><td>Glasfaserplatten</td><td>Pall</td><td>66227</td><td>8x10" Platten; Kreise gestanzt mit Standardlocher</td></tr><tr><td>Zuckerrohr Bagasse Ganze Biomasse</td><td>Rohstoff NIST</td><td>8491</td><td></td></tr><tr><td>Eastern Cottonwood (Pappel) Ganze Biomasse</td><td>Rohstoff NIST</td><td>8492</td><td></td></tr><tr><td>Monterey Pine Ganze Biomasse Rohstoff</td><td>NIST</td><td>8493</td><td></td></tr><tr><td>Weizen Stroh Ganze Biomasse Rohstoff</td><td>NIST</td><td>8494</td><td></td></tr></tbody></table>

hochdurchsatz-screening von widerspenstigkeit variationen in lignocellulose-reicher biomasse: gesamt lignin, lignin-monomeren und enzymatische zuckerfreisetzung

High-throughput Screening of Recalcitrance Variations in Lignocellulosic Biomass: Total Lignin, Lignin Monomers, and Enzymatic Sugar Release

Die Umwandlung von lignozellulosehaltiger Biomasse in Kraftstoffe, Chemikalien und andere Rohstoffe wurde als ein möglicher Weg zur Reduzierung der Nutzung nicht-erneuerbarer Energiequellen untersucht. Um zu identifizieren, welche Pflanzen aus einem vielfältigen Pool die gewünschten chemischen Eigenschaften für nachgelagerte Anwendungen aufweisen, müssen Attribute wie der Cellulose- und Ligningehalt oder die Freisetzung von monomerem Zucker nach einer enzymatischen Verzuckerung verglichen werden. Die experimentellen und Datenanalyseprotokolle der Standardanalysemethoden können zeitaufwändig sein, wodurch die Anzahl der Proben, die gemessen werden können, begrenzt wird. Hochdurchsatzmethoden (HTP) beheben die Mängel der Standardmethoden und ermöglichen ein schnelles Screening verfügbarer Proben, um diejenigen mit den gewünschten Merkmalen zu isolieren. Diese Studie veranschaulicht die HTP-Zuckerfreisetzungs- und Pyrolyse-Molekularstrahl-Massenspektrometrie-Pipelines, die am National Renewable Energy Lab eingesetzt werden. Diese Pipelines haben die effiziente Bewertung von Tausenden von Anlagen ermöglicht und gleichzeitig die Versuchszeit und -kosten durch Einsparungen bei Arbeitsaufwand und Verbrauchsmaterialien reduziert.

Der kombinierte Effekt der thermochemischen Vorbehandlung und anschließende Enzym Verzuckerung wird als Funktion der Masse der Glucose und Xylose am Ende des Tests gemessen und errechnet. Die Ergebnisse sind in der Einheit Milligramm von Glucose und Xylose pro Gramm Biomasse frei gemeldet. Dies steht in krassem Gegensatz zu den Daten aus Labormaßstab Assays, die üblicherweise als prozentuale theoretische Ausbeute, bezogen auf die Zusammensetzungs-Analyse des Ausgangsmaterials gemeldet wird, gemeldet. Da es noch nicht pr...

Die Zellwandstruktur und die chemischen Eigenschaften von Pflanzen werden bewertet, um ideale Rohstoffe für Biokraftstoffe und Biomaterialien zu identifizieren. Standardmethoden haben Einschränkungen, wenn sie auf große Datensätze angewendet werden. Diese Methoden der Hochdurchsatz-Vorbehandlung, der Enzymverzuckerung und der Pyrolyse-Molekularstrahl-Massenspektrometrie vergleichen eine große Anzahl von Biomasseproben mit geringerem Zeit- und Kostenaufwand.

Hochdurchsatz-Screening von Widerspenstigkeit Variationen in Lignocellulose-reicher Biomasse: Gesamt Lignin, Lignin-Monomeren und enzymatische Zuckerfreisetzung

The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die thermochhemischen Vorbehandlungs- und Enzymhydrolyse-Resistenzen zwischen verwandten Biomassevarianten zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Biomasseproben durch Zerkleinerung sowie Extraktion von Stärke und löslichen Zuckern für die Analyse vorbereitet werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Biomasse mit hoher Präzision in thermisch chemisch beständige Hochdurchsatz-Reaktorplatten abzugeben.Die Proben werden in einem Dampfreaktor vorbehandelt. Anschließend werden die Proben drei Tage lang mit einer handelsüblichen Standard-Cellulase digeriert, um die Cellulose und Hemicellulose zu hydrolysieren. Der letzte Schritt ist die Bestimmung der während der enzymatischen Hydrolyse freigesetzten Glucose und Xylose mittels GO-pod- und XDH-Assays.Schließlich erfolgt die Hochdurchsatz-Quantifizierung von Glukose und Xylose, um die relative Freisetzung von Zuckern zwischen den Proben auf der Basis von Gramm Zucker pro Gramm Ausgangsbiomasse zu bestimmen. Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber anderen Laborverfahren, wie beispielsweise Labor-maßstabs-gerechten Vorbehandlungen und enzymatischen Hydrolysen, liegt darin, dass diese Technik an Hunderten oder sogar Tausenden von Proben gleichzeitig durchgeführt werden kann. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Biomasseumwandlung zu beantworten, etwa welche Kultivare oder Varianten besser für die Umwandlung in Zucker und anschließende Produkte geeignet sind.Die Implikationen dieser Technik können daher auf das Verständnis von Struktur und Funktion der Zellwand ausgeweitet werden, da die Mutationen, die wir in der Biosynthese-Route der Zellwand erzeugen, auf chemische Strukturveränderungen untersucht werden können. Diese Methode kann Einblicke in die Resistenz von Pflanzenzellwänden liefern. Außerdem kann sie auf andere Bestandteile der Biomasseumwandlung angewendet werden, beispielsweise auf Studien zur Enzymaktivität und Synergie.Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da sie große Probensätze von Biomassevarianten umfasst, die identisch und gleichzeitig im Milligramm-Bereich bearbeitet werden müssen. Daher sind spezialisierte Robotik und Ausrüstung erforderlich. Um das Verfahren zu beginnen, geben Sie etwa 250 Milligramm zuvor gemahlene Biomasse aus einer barcodierten antistatischen Tüte in einen nummerierten Teebeutel und rollen diesen sorgfältig auf, wobei Sie die Enden über die Biomasse falten, um Verluste während der Stärkeentfernung und Extraktion zu vermeiden. Wickeln Sie anschließend jeden Teebeutel mit zinnbeschichtetem Kupferdraht fest verschlossen und notieren Sie die Nummer des Teebeutels für jede barcodierte Probe.Geben Sie 500 Milliliter einer zuvor hergestellten destrukturierenden Enzymlösung in einen Kunststoffbehälter. Fügen Sie anschließend 120 Teebeutel zur Puffer-Enzym-Lösung für ein Batch-Protokoll hinzu. Nach der Inkubation in einem Schüttler spülen und tauchen Sie die Biomasse in mehreren Litern entionisiertem Wasser für 30 Minuten ein, nachdem die destrukturierte Biomasse gründlich gespült wurde.Um Puffer-Salze zu entfernen, geben Sie die Teebeutel in eine Socke-Lit-Säule zur Extraktion. Richten Sie die Socke-Lit-Rückflussanlage mit 95 %igem Ethanol ein und extrahieren Sie die Proben 24 Stunden lang. Sobald die Extraktion abgeschlossen ist, rollen Sie die Teebeutel auf und geben die getrocknete Biomasse in das ursprüngliche, mit Barcode versehene Gefäß zurück.Antistatische Beutel: Überführen Sie mindestens 50 Milligramm der getrockneten Biomasse in einen barcodierten Trichter. Scannen Sie die Barcodes der antistatischen Beutel und des Aufnahmetrichters, um eine genaue Probennachverfolgung sicherzustellen. Nach dem Einsetzen der Trichter in eine feste Wägevorrichtung, wiegen Sie robotisch fünf Milligramm der getrockneten Proben in säurebeständigen Edelstahl ab.96-Loch-Platten wiegen drei Wiederholungen jeder Probe aus, die um die Platte verteilt sind, um lokale Variationen zu minimieren. Fügen Sie anschließend 250 Mikroliter deionisiertes Wasser in jedes Loch hinzu und verschließen Sie die Platten mit silikonbeschichteter POLYTETRAFLUOROETHYLEN- oder PTFE-Folie. Durchstechen Sie mit einer 3,2 mm (1/8 Zoll) Lötspitze die PTFE-Folie an jedem Dampfauslass.Für jede Platte die Platten mit 0,79 mm dicken, glasverstärkten PTFE-Dichtungen zwischen den Platten sowie leeren Platten an Ober- und Unterseite des Stapels festklemmen. Die Proben in einem Dampfreaktor bei 180 Grad Celsius für 17,5 Minuten vorbehandeln. Nach Beendigung den Reaktor durch Überfluten mit entionisiertem Wasser auf 50 Grad Celsius abkühlen.Wenn die Platten abgekühlt sind, zentrifugieren Sie sie in einem Schwenkkorbrotor bei 1700 ×g für 20 Minuten. Anschließend entfernen Sie den Deckelfilm.Gebe 40 µL der zuvor hergestellten 8 %-Enzym-Stammlösung in jede Vertiefung, nachdem die Platte mit neuem PTFE-Band versiegelt wurde. Stelle die versiegelte Platte in eine magnetische Plattenhalterung. Mische die Proben vorsichtig durch mindestens 15maliges Invertieren und inkubiere sie 70 Stunden bei 50 °C. Nach der Inkubation werden die Reaktorplatten gemischt und zentrifugiert.Anschließend wird der Flüssigkeits-Handling-Roboter verwendet, um die Quantifizierung von Glukose und Xylose mittels enzymgekoppelter farbmetrischer Assays durchzuführen: Xylose-Dehydrogenase (XDH) für Xylose sowie Glukose-Oxidase, Peroxidase oder GO-POD für Glukose. Die Arbeitsfläche wird mit Reservoiren der GO-POD- und XDH-Reagenzien sowie Wasser zur Verdünnung und 96-Kanal-200-Mikroliter-Spitzenracks für jedes Reagenz ausgestattet. Diese Spitzen werden für mehrere Reaktorplatten wiederverwendet.Die Arbeitsfläche enthält außerdem Einweg-Spitzen mit 200 Mikrolitern für die Wasserentfernung und die Zugabe der Zuckerstandards sowie vorgefertigte Zuckerstandards. Aus HPLC-Gefäßen aus dem Speicherkarussell bringt der Roboter drei klare Mikrotiterplatten ein, eine zur Verdünnung des Hydrolysatgemischs sowie je eine für die XDH- und GoPod-Assays. Der Greifer bewegt alle vier Platten an Positionen auf der Arbeitsfläche.Einfach verwendbare 96-Kanal-100-Mikroliter-Spitzen werden von der Drehscheibe auf das Deck gebracht, um die Proben vom Reaktorplättchen auf das Verdünnungsplättchen und anschließend vom Verdünnungsplättchen auf die XDH- und Go-Pod-Plättchen zu übertragen. Mithilfe des variablen Spannungs-8-Kanal-Pipettiergeräts wird das Wasser, das vor der Vorbehandlung hinzugefügt wurde, aus den drei Vertiefungen in jeder Ecke des Reaktorplättchens entfernt, um eine Mitführung in das Verdünnungsplättchen zu verhindern. Diese 12 Vertiefungen werden für Zuckernormale verwendet, wobei der 96-Kanal-Pipettierkopf eingesetzt wird.Nachdem die drei Tips in jeder Ecke entfernt wurden, werden 180 µL Wasser in die Vertiefungen der Verdünnungsplatte gegeben. Nach dem Wechseln der Tips werden die XD-, H- und Go-Pod-Reagenzien mit dem 96-Kanal-Pipettierkopf aus ihren jeweiligen Reservoirs in ihre jeweiligen Testplatten übertragen.Währenddessen werden die Zuckerkalibratoren in die drei Vertiefungen jeder Ecke der Verdünnungsplatte gegeben. Nachdem die kleineren Pipettenspitzen aufgesetzt wurden, wird der 96-Kanal-Pipettierkopf verwendet, um 20 Mikroliter des Hydrolyseüberstandes auf die Verdünnungsplatte zu übertragen, und die Platte wird durch dreimaliges Pipettieren gemischt. Die Probe sollte nahe der Flüssigkeitsoberfläche angesaugt werden, um eine Verunreinigung der Spitzen durch Biomassepartikel zu minimieren.Nach dem Mischen werden 20 Mikroliter nacheinander übertragen. Unter Verwendung des 96-Kanal-Pipettierkopfs auf die XDH- und Go-Pod-Platten. Nachdem jede Probe durch den Mischer durchlaufen ist, werden die Reaktions- und Verdünnungsplatten mit den Probenspitzen in ein Abfallgestell im Karussell zurückgestellt; die XDH- und Go-Pod-Platten werden in ein separates Karussellgestell entnommen und vor dem Auslesen im Spektrophotometer mit einem ultraviolett-sichtbaren 96-Well-Plattenreader eine Stunde lang ruhen gelassen.Stellen Sie die Messwellenlänge auf 510 Nanometer ein und notieren Sie die Extinktion gegenüber einem Reagenzienblanks. Danach stellen Sie die Messwellenlänge des Plattenlesegeräts auf 340 Nanometer ein und nehmen Sie die Extinktion mit einem kleinen Spatel auf. Geben Sie etwa vier Milligramm der hergestellten Biomasse in eine 80-Mikroliter-Edelstahlschale, die für den Autosampler des Massenspektrometers vorgesehen ist.Unter Verwendung eines Standard-Lochstanzers manuell Glasscheibenfilter aus Glasfasermatten vom Typ AD ohne Bindemittel herstellen, Proben mit einer Pinzette in die Probengeber des Autosamplers geben und die Proben zufällig in die Tassen laden, um Verzerrungen aufgrund von Spektrometerdrift über die Zeit zu vermeiden. Nach Durchführung der Kalibrierung und Eingabe der entsprechenden Parameter im Massenspektrometer die Datenaufnahme starten und mindestens 60 Sekunden warten, um ausreichende Daten für die Hintergrundspektrum-Erfassung zu erhalten. Schließlich die automatisierte Autosampler-Methode mit einer Helium-Trägervolumenstromrate von 0,9 Litern pro Minute starten.Ein Beispiel für Trends ist eine Untersuchung von Resistenzmerkmalen bei 755 natürlichen Varianten der Pappel, die im pazifischen Nordwesten gesammelt wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Resistenz abnimmt, während das Verhältnis von Spritze zu Guil steigt, bis ein Verhältnis von etwa zwei erreicht ist, ab dem sich die Verbesserung der Resistenz stabilisiert. Ausreißer sind hier sichtbar, wo das Gen PT vier CL eins herunterreguliert wurde.Bei Pappeln sind bei mehreren der hundert untersuchten Kultivare deutliche Zunahmen an Rekalcitranten festzustellen, was sich an der verminderten Zuckerausbeute zeigt. Verschiedene Weizenstroksorten, die an mehreren Standorten angebaut und nach unterschiedlichen Wachstumsbedingungen geerntet wurden, ergaben 20 unterschiedliche Populationen basierend auf Kombinationen der oben genannten Variablen. Diese Probensätze lassen sich leicht unterscheiden und weisen auf positive und negative Einflussfaktoren hin.Bei der Pyrolyse widerstandsfähiger Materialien kann die Massenspektrometrie mit Molekularstrahl verwendet werden, um Veränderungen in der Zellwandzusammensetzung zu bewerten. Massenspektrometrische Fragmente werden verschiedenen Lignin-Monomeren zugeordnet. Beim Vergleich einer Probe mit hohem Ligninanteil gegenüber einer Probe mit hohem Gehalt an Kohlenhydraten sind die Unterschiede in den Spektraldaten deutlich erkennbar.Die Verwendung von Massenspektrometriedaten in Kombination mit einer Hauptkomponentenanalyse wird hier erläutert. Das Lasten-Diagramm der Hauptkomponenten kann dabei helfen, die chemischen Merkmale zu identifizieren, die in der Klassifizierungsgrafik der Scores erfasst werden, sowie aufzuzeigen, welche Merkmale sich zwischen den Beispielclustern ändern. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie bei korrekter Anwendung zur Untersuchung von mehreren tausend Proben pro Woche eingesetzt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, so konsistent wie möglich vorzugehen und nur Proben innerhalb zusammengehöriger Gruppen zu vergleichen.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik anderen Forschern den Weg für Arbeiten an Hochdurchsatz-Screening-Methoden und anderen Bereichen der pflanzlichen Zellwand-Recalcitrance unter Verwendung von Dingen wie ionischen Flüssigkeiten und alkalischer Vorbehandlung. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man große Probensätze von Biomasse im Mikromaßstab korrekt vorbereitet, handhabt und hinsichtlich Unterschieden in der Recalcitrance analysiert, unter Einsatz von Partikelverkleinerung und Extraktion, thermochemischer Vorbehandlung sowie enzymatischer Hydrolyse. Bitte bedenken Sie, dass das Arbeiten mit Hochdruck, Dampf und automatisierten Geräten äußerst gefährlich ist und alle Sicherheitsvorkehrungen getroffen werden müssen, beispielsweise das Tragen persönlicher Schutzausrüstung sowie das Vorhandensein von Sicherheitsverriegelungen an allen Geräten während der Durchführung dieser Verfahren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Environment

Umwelt

Pflanzlicher Biomasse ist ein wichtiger klimaneutrale erneuerbare Ressource, die für die Herstellung von Biokraftstoffen verwendet werden könnten. Pflanzliche Biomasse besteht im Wesentlichen aus Zellwände, eine strukturell komplexen Verbundwerkstoff bezeichnet Lignocellulose. Hier beschreiben wir ein Protokoll für eine umfassende Analyse des Inhalts und der Zusammensetzung der Polyphenol-Lignin.

Umfassende Analyse der Zusammensetzung von pflanzlichen Zellwänden (Lignozellulose) Teil I: Lignin

Eine Methode der konfokalen Raman Mikroskopie basiert vorgestellt, bietet label-free-Visualisierung von Lignin in pflanzlichen Zellwänden und den Vergleich der Verholzung in verschiedenen Geweben, Mustern oder Arten.

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Dieses Protokoll beschreibt einen hohen Durchsatz Bildschirm für cellulolytische Aktivität von einem metagenomische Bibliothek in Escherichia coli exprimiert. Der Bildschirm ist Lösung und hoch automatisiert und nutzt Ein-Topf-Chemie in 384-Well-Mikroplatten mit dem letzten Auslesen als Extinktionsmessung.

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Wir beschreiben eine niedrige Kosten, hohe Durchsatz-Verfahren zum Screening von Pilzen Endoglucanaseaktivität...

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Eine einfache, schnelle Methode zur Bestimmung der Verzuckerung Potenzial einer großen Zahl von pflanzlicher Biomasse Proben beschrieben. Die automatisierte Plattform für diese Analyse umfasst die Vorbereitung der pflanzlichen Biomasse für die Analyse in 96-Well-Platten und die anschließende Performance der Vorbehandlung, Hydrolyse und Quantifizierung der Zucker freigesetzt.

High-Throughput-Assay Verzuckerung für Lignocellulose-Materialien

Ein Doppelstrang-RNA-Interferenz (dsRNAi)-Technik wird eingesetzt, um nach unten zu regulieren den Mais Cinnamoyl Coenzym A-Reduktase (ZmCCR1)-Gen zu niedrigeren Pflanzen Ligningehalt. Lignin Down-Regulation aus der Zellwand wird durch mikroskopische Analysen visualisiert und durch die Klason Verfahren quantifiziert. Änderungen der Zusammensetzung in kristalliner Cellulose und Hemicellulose werden analysiert.

Lignin Herunterregulierung<em&gt; Zea mays</em&gt; Über dsRNAi und Klason Lignin Analyse

Adaptive Evolution und Isolationstechniken sind beschrieben und gezeigt , Derivate von Scheffersomyces stipitis - Stamm NRRL Y-7124 zu erhalten , die der Lage sind, schnell Hexose und Pentose - Zuckern in gemischten Enzym verbrauchen verzuckert undetoxified Hydrolysate und über 40 g / l Ethanol zu akkumulieren.

Techniken für die Entwicklung von robusten Pentose-gärenden Hefe für Biokonversion von Lignocellulose zu Ethanol

Ein Hochdurchsatz-Assay für das Enzym-Screening wird beschrieben. Dieses gebrauchsfertige Multiplex-Assay-Kit besteht aus vorausgewählten C-hromogenen P-Olymer-H-Ydrogel-Substraten (CPH) und komplexenI-nlöslichen C-hromogenen B-iomasse(ICB)-Substraten. Zielenzyme sind Polysaccharid-abbauende Endoenzyme und Proteasen.

Hochdurchsatz-Screening von Kohlenhydrat-abbauenden Enzymen Neuartige Unlöslich chromogenen Assays Kits

OrganoCat ist ein Verfahren zur Vorbehandlung und Fraktionierung von Lignocellulose unter milden Bedingungen zu Lignin, fermentierbaren Zuckern und Cellulosezellstoff. In einem biogenen, biphasischen Lösungsmittelsystem aus Wasser und 2-Methyltetrahydrofuran mit 2,5-Furancarbonsäure als Katalysator werden die OrganoCat-Produkte zur einfachen Produktrückgewinnung in situ getrennt.

Fraktionierung von Lignozellulose-Biomasse mit dem OrganoCat-Verfahren

Die tiefen eutektische lösungsmittelbasierte, mikrowellengestützte Vorbehandlung ist ein grünes, schnelles und effizientes Verfahren für die lignozellulosehaltige Fraktionierung und hochreine Ligninrückgewinnung.

Ultraschnelle Ligninextraktion aus ungewöhnlichen mediterranen Lignocellulose-Rückständen

Dieses Protokoll bietet einen standardisierten Hochdurchsatz-Screening-Workflow für industrielle Mikroorganismen. Dabei wird eine mutierte Bibliothek mittels ARTP-Mutagenese erstellt, ein positives Tröpfchenscreening mit automatisierter Mikrofluidik durchgeführt und anschließend die Ergebnisse überprüft. Die Zuverlässigkeit des Workflows wurde durch das Screening von Hochleistungs-B . coagulans-Stämmen bestätigt.

Hochdurchsatz-Screening von L-Milchsäure-hyperproduzierenden Bacillus-Coagulans-Mutanten mittels einer automatisierten tropfen-mikrofluidischen Plattform

Erfahren Sie Hochdurchsatz-Screening von Biomasse-Varianten zur Messung von Widerspenstigkeit mittels thermochemischer Vorbehandlung und enzymatischer Hydrolyse. Diese Methode identifiziert optimale Rohstoffe für Biokraftstoffe.

Hochdurchsatz-Screening von Widerspenstigkeit Variationen in Lignocellulose-reicher Biomasse: Gesamt Lignin, Lignin-Monomeren und enzymatische Zuckerfreisetzung (Video) | JoVE Journal

Hochdurchsatz-Screening von Widerspenstigkeit Variationen in Lignocellulose-reicher Biomasse: Gesamt Lignin, Lignin-Monomeren und enzymatische Zuckerfreisetzung

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