Hochdurchsatz-Screening von Widerspenstigkeit Variationen in Lignocellulose-reicher Biomasse: Gesamt Lignin, Lignin-Monomeren und enzymatische Zuckerfreisetzung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die thermochhemischen Vorbehandlungs- und Enzymhydrolyse-Resistenzen zwischen verwandten Biomassevarianten zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Biomasseproben durch Zerkleinerung sowie Extraktion von Stärke und löslichen Zuckern für die Analyse vorbereitet werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Biomasse mit hoher Präzision in thermisch chemisch beständige Hochdurchsatz-Reaktorplatten abzugeben.

Die Proben werden in einem Dampfreaktor vorbehandelt. Anschließend werden die Proben drei Tage lang mit einer handelsüblichen Standard-Cellulase digeriert, um die Cellulose und Hemicellulose zu hydrolysieren. Der letzte Schritt ist die Bestimmung der während der enzymatischen Hydrolyse freigesetzten Glucose und Xylose mittels GO-pod- und XDH-Assays.

Schließlich erfolgt die Hochdurchsatz-Quantifizierung von Glukose und Xylose, um die relative Freisetzung von Zuckern zwischen den Proben auf der Basis von Gramm Zucker pro Gramm Ausgangsbiomasse zu bestimmen. Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber anderen Laborverfahren, wie beispielsweise Labor-maßstabs-gerechten Vorbehandlungen und enzymatischen Hydrolysen, liegt darin, dass diese Technik an Hunderten oder sogar Tausenden von Proben gleichzeitig durchgeführt werden kann. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Biomasseumwandlung zu beantworten, etwa welche Kultivare oder Varianten besser für die Umwandlung in Zucker und anschließende Produkte geeignet sind.

Die Implikationen dieser Technik können daher auf das Verständnis von Struktur und Funktion der Zellwand ausgeweitet werden, da die Mutationen, die wir in der Biosynthese-Route der Zellwand erzeugen, auf chemische Strukturveränderungen untersucht werden können. Diese Methode kann Einblicke in die Resistenz von Pflanzenzellwänden liefern. Außerdem kann sie auf andere Bestandteile der Biomasseumwandlung angewendet werden, beispielsweise auf Studien zur Enzymaktivität und Synergie.

Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da sie große Probensätze von Biomassevarianten umfasst, die identisch und gleichzeitig im Milligramm-Bereich bearbeitet werden müssen. Daher sind spezialisierte Robotik und Ausrüstung erforderlich. Um das Verfahren zu beginnen, geben Sie etwa 250 Milligramm zuvor gemahlene Biomasse aus einer barcodierten antistatischen Tüte in einen nummerierten Teebeutel und rollen diesen sorgfältig auf, wobei Sie die Enden über die Biomasse falten, um Verluste während der Stärkeentfernung und Extraktion zu vermeiden. Wickeln Sie anschließend jeden Teebeutel mit zinnbeschichtetem Kupferdraht fest verschlossen und notieren Sie die Nummer des Teebeutels für jede barcodierte Probe.

Geben Sie 500 Milliliter einer zuvor hergestellten destrukturierenden Enzymlösung in einen Kunststoffbehälter. Fügen Sie anschließend 120 Teebeutel zur Puffer-Enzym-Lösung für ein Batch-Protokoll hinzu. Nach der Inkubation in einem Schüttler spülen und tauchen Sie die Biomasse in mehreren Litern entionisiertem Wasser für 30 Minuten ein, nachdem die destrukturierte Biomasse gründlich gespült wurde.

Um Puffer-Salze zu entfernen, geben Sie die Teebeutel in eine Socke-Lit-Säule zur Extraktion. Richten Sie die Socke-Lit-Rückflussanlage mit 95 %igem Ethanol ein und extrahieren Sie die Proben 24 Stunden lang. Sobald die Extraktion abgeschlossen ist, rollen Sie die Teebeutel auf und geben die getrocknete Biomasse in das ursprüngliche, mit Barcode versehene Gefäß zurück.

Antistatische Beutel: Überführen Sie mindestens 50 Milligramm der getrockneten Biomasse in einen barcodierten Trichter. Scannen Sie die Barcodes der antistatischen Beutel und des Aufnahmetrichters, um eine genaue Probennachverfolgung sicherzustellen. Nach dem Einsetzen der Trichter in eine feste Wägevorrichtung, wiegen Sie robotisch fünf Milligramm der getrockneten Proben in säurebeständigen Edelstahl ab.

96-Loch-Platten wiegen drei Wiederholungen jeder Probe aus, die um die Platte verteilt sind, um lokale Variationen zu minimieren. Fügen Sie anschließend 250 Mikroliter deionisiertes Wasser in jedes Loch hinzu und verschließen Sie die Platten mit silikonbeschichteter POLYTETRAFLUOROETHYLEN- oder PTFE-Folie. Durchstechen Sie mit einer 3,2 mm (1/8 Zoll) Lötspitze die PTFE-Folie an jedem Dampfauslass.

Für jede Platte die Platten mit 0,79 mm dicken, glasverstärkten PTFE-Dichtungen zwischen den Platten sowie leeren Platten an Ober- und Unterseite des Stapels festklemmen. Die Proben in einem Dampfreaktor bei 180 Grad Celsius für 17,5 Minuten vorbehandeln. Nach Beendigung den Reaktor durch Überfluten mit entionisiertem Wasser auf 50 Grad Celsius abkühlen.

Wenn die Platten abgekühlt sind, zentrifugieren Sie sie in einem Schwenkkorbrotor bei 1700 ×g für 20 Minuten. Anschließend entfernen Sie den Deckelfilm.

Gebe 40 µL der zuvor hergestellten 8 %-Enzym-Stammlösung in jede Vertiefung, nachdem die Platte mit neuem PTFE-Band versiegelt wurde. Stelle die versiegelte Platte in eine magnetische Plattenhalterung. Mische die Proben vorsichtig durch mindestens 15maliges Invertieren und inkubiere sie 70 Stunden bei 50 °C. Nach der Inkubation werden die Reaktorplatten gemischt und zentrifugiert.

Anschließend wird der Flüssigkeits-Handling-Roboter verwendet, um die Quantifizierung von Glukose und Xylose mittels enzymgekoppelter farbmetrischer Assays durchzuführen: Xylose-Dehydrogenase (XDH) für Xylose sowie Glukose-Oxidase, Peroxidase oder GO-POD für Glukose. Die Arbeitsfläche wird mit Reservoiren der GO-POD- und XDH-Reagenzien sowie Wasser zur Verdünnung und 96-Kanal-200-Mikroliter-Spitzenracks für jedes Reagenz ausgestattet. Diese Spitzen werden für mehrere Reaktorplatten wiederverwendet.

Die Arbeitsfläche enthält außerdem Einweg-Spitzen mit 200 Mikrolitern für die Wasserentfernung und die Zugabe der Zuckerstandards sowie vorgefertigte Zuckerstandards. Aus HPLC-Gefäßen aus dem Speicherkarussell bringt der Roboter drei klare Mikrotiterplatten ein, eine zur Verdünnung des Hydrolysatgemischs sowie je eine für die XDH- und GoPod-Assays. Der Greifer bewegt alle vier Platten an Positionen auf der Arbeitsfläche.

Einfach verwendbare 96-Kanal-100-Mikroliter-Spitzen werden von der Drehscheibe auf das Deck gebracht, um die Proben vom Reaktorplättchen auf das Verdünnungsplättchen und anschließend vom Verdünnungsplättchen auf die XDH- und Go-Pod-Plättchen zu übertragen. Mithilfe des variablen Spannungs-8-Kanal-Pipettiergeräts wird das Wasser, das vor der Vorbehandlung hinzugefügt wurde, aus den drei Vertiefungen in jeder Ecke des Reaktorplättchens entfernt, um eine Mitführung in das Verdünnungsplättchen zu verhindern. Diese 12 Vertiefungen werden für Zuckernormale verwendet, wobei der 96-Kanal-Pipettierkopf eingesetzt wird.

Nachdem die drei Tips in jeder Ecke entfernt wurden, werden 180 µL Wasser in die Vertiefungen der Verdünnungsplatte gegeben. Nach dem Wechseln der Tips werden die XD-, H- und Go-Pod-Reagenzien mit dem 96-Kanal-Pipettierkopf aus ihren jeweiligen Reservoirs in ihre jeweiligen Testplatten übertragen.

Währenddessen werden die Zuckerkalibratoren in die drei Vertiefungen jeder Ecke der Verdünnungsplatte gegeben. Nachdem die kleineren Pipettenspitzen aufgesetzt wurden, wird der 96-Kanal-Pipettierkopf verwendet, um 20 Mikroliter des Hydrolyseüberstandes auf die Verdünnungsplatte zu übertragen, und die Platte wird durch dreimaliges Pipettieren gemischt. Die Probe sollte nahe der Flüssigkeitsoberfläche angesaugt werden, um eine Verunreinigung der Spitzen durch Biomassepartikel zu minimieren.

Nach dem Mischen werden 20 Mikroliter nacheinander übertragen. Unter Verwendung des 96-Kanal-Pipettierkopfs auf die XDH- und Go-Pod-Platten. Nachdem jede Probe durch den Mischer durchlaufen ist, werden die Reaktions- und Verdünnungsplatten mit den Probenspitzen in ein Abfallgestell im Karussell zurückgestellt; die XDH- und Go-Pod-Platten werden in ein separates Karussellgestell entnommen und vor dem Auslesen im Spektrophotometer mit einem ultraviolett-sichtbaren 96-Well-Plattenreader eine Stunde lang ruhen gelassen.

Stellen Sie die Messwellenlänge auf 510 Nanometer ein und notieren Sie die Extinktion gegenüber einem Reagenzienblanks. Danach stellen Sie die Messwellenlänge des Plattenlesegeräts auf 340 Nanometer ein und nehmen Sie die Extinktion mit einem kleinen Spatel auf. Geben Sie etwa vier Milligramm der hergestellten Biomasse in eine 80-Mikroliter-Edelstahlschale, die für den Autosampler des Massenspektrometers vorgesehen ist.

Unter Verwendung eines Standard-Lochstanzers manuell Glasscheibenfilter aus Glasfasermatten vom Typ AD ohne Bindemittel herstellen, Proben mit einer Pinzette in die Probengeber des Autosamplers geben und die Proben zufällig in die Tassen laden, um Verzerrungen aufgrund von Spektrometerdrift über die Zeit zu vermeiden. Nach Durchführung der Kalibrierung und Eingabe der entsprechenden Parameter im Massenspektrometer die Datenaufnahme starten und mindestens 60 Sekunden warten, um ausreichende Daten für die Hintergrundspektrum-Erfassung zu erhalten. Schließlich die automatisierte Autosampler-Methode mit einer Helium-Trägervolumenstromrate von 0,9 Litern pro Minute starten.

Ein Beispiel für Trends ist eine Untersuchung von Resistenzmerkmalen bei 755 natürlichen Varianten der Pappel, die im pazifischen Nordwesten gesammelt wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Resistenz abnimmt, während das Verhältnis von Spritze zu Guil steigt, bis ein Verhältnis von etwa zwei erreicht ist, ab dem sich die Verbesserung der Resistenz stabilisiert. Ausreißer sind hier sichtbar, wo das Gen PT vier CL eins herunterreguliert wurde.

Bei Pappeln sind bei mehreren der hundert untersuchten Kultivare deutliche Zunahmen an Rekalcitranten festzustellen, was sich an der verminderten Zuckerausbeute zeigt. Verschiedene Weizenstroksorten, die an mehreren Standorten angebaut und nach unterschiedlichen Wachstumsbedingungen geerntet wurden, ergaben 20 unterschiedliche Populationen basierend auf Kombinationen der oben genannten Variablen. Diese Probensätze lassen sich leicht unterscheiden und weisen auf positive und negative Einflussfaktoren hin.

Bei der Pyrolyse widerstandsfähiger Materialien kann die Massenspektrometrie mit Molekularstrahl verwendet werden, um Veränderungen in der Zellwandzusammensetzung zu bewerten. Massenspektrometrische Fragmente werden verschiedenen Lignin-Monomeren zugeordnet. Beim Vergleich einer Probe mit hohem Ligninanteil gegenüber einer Probe mit hohem Gehalt an Kohlenhydraten sind die Unterschiede in den Spektraldaten deutlich erkennbar.

Die Verwendung von Massenspektrometriedaten in Kombination mit einer Hauptkomponentenanalyse wird hier erläutert. Das Lasten-Diagramm der Hauptkomponenten kann dabei helfen, die chemischen Merkmale zu identifizieren, die in der Klassifizierungsgrafik der Scores erfasst werden, sowie aufzuzeigen, welche Merkmale sich zwischen den Beispielclustern ändern. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie bei korrekter Anwendung zur Untersuchung von mehreren tausend Proben pro Woche eingesetzt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, so konsistent wie möglich vorzugehen und nur Proben innerhalb zusammengehöriger Gruppen zu vergleichen.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik anderen Forschern den Weg für Arbeiten an Hochdurchsatz-Screening-Methoden und anderen Bereichen der pflanzlichen Zellwand-Recalcitrance unter Verwendung von Dingen wie ionischen Flüssigkeiten und alkalischer Vorbehandlung. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man große Probensätze von Biomasse im Mikromaßstab korrekt vorbereitet, handhabt und hinsichtlich Unterschieden in der Recalcitrance analysiert, unter Einsatz von Partikelverkleinerung und Extraktion, thermochemischer Vorbehandlung sowie enzymatischer Hydrolyse. Bitte bedenken Sie, dass das Arbeiten mit Hochdruck, Dampf und automatisierten Geräten äußerst gefährlich ist und alle Sicherheitsvorkehrungen getroffen werden müssen, beispielsweise das Tragen persönlicher Schutzausrüstung sowie das Vorhandensein von Sicherheitsverriegelungen an allen Geräten während der Durchführung dieser Verfahren.