Name: Lieferung von Proteinen, Peptiden oder Handy-undurchlässige kleine Moleküle in lebenden Zellen durch Inkubation mit dem endosomolytische Reagenz dfTAT (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Erfahren Sie eine effiziente Methode zur Zufuhr von Makromolekülen in lebende Säugetierzellen mittels dfTAT-Inkubation. Dieses endosomolytische Reagenz ermöglicht schonende Zellpenetration und zytosolische Freisetzung für zellbiologische Forschung.

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Dieser Artikel wurde unterstützt durch die Auszeichnung Nummer R01GM087227 vom National Institute of General Medical Sciences, dem Norman Ackerman Advanced Research Program und der Robert A. Welch Foundation (Grant A-1769).

1. SPPS: CK (TMR) TATG (fTAT) Synthese Anmerkung: dfTAT wird in zwei Schritten hergestellt: Synthese des Monomers fTAT durch Festphasenpeptidsynthese, gefolgt von einer Disulfidbindung Dimerisierung dfTAT bilden. <ol><li> Quellen 500 mg Rink-Amid-MBHA-Harz in Dimethylformamid (DMF) in einem Standard-50 ml-SPPS-Gefß 1 Stunde. </li><li> Zuführen Fmoc-Abspaltung durch Inkubieren der Fmoc geschützten Harzes in einer 20% igen Piperidin-Lösung (20% Piperidin in DMF, 10 ml (0,30 mmol). Führen Entschützungsschritte zweimal (1 x 5 min und 1 x 15 min) mit einem Waschschritt mit DMF (der Waschschritt ein Spülen des Harzes mehrere Male mit einem Gesamtvolumen von etwa 150 ml DMF gelöst und das Lösungsmittel durch Vakuumfiltration) dazwischen Reaktionen. </li><li> Synthetisieren CK (TMR) RKKRRQRRRG (fTAT) auf der Rink-Amid-MBHA-Harz. Verwenden der folgenden Fmoc-geschützten Aminosäuren Fmoc-Lys (Mtt) -OH (nur am N-Terminus), Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc- Gln (Trt) -OH und Fmoc-Cys (Trt) -OH. Die Reaktion mit N 2 (20 psi), um die Reaktion zu rühren. Führen Sie alle Reaktionen bei RT. <ol><li> Führen Sie jede Aminosäure Kupplungsreaktion 4 Stunden. Für jede Kupplung Verwenden der Fmoc geschützten Aminosäure (1,2 mmol), N, N, N &#39;, N&#39; -Tetramethyl- O- (1-benzotriazol-1-yl) uroniumhexafluorphosphat (HBTU) (0,44 g, 1,1 mmol ) und Diisopropylethylamin (DIEA) (0,51 ml, 3,0 mmol) in DMF gelöst. Nach 4 Stunden Kopplung, Waschen des Harzes mit DMF und führen Sie die Fmoc Entschützungsschritt, wie in Schritt 1.2 beschrieben. </li><li> Wiederholen, bis die lineare Peptidkette fTAT (Linear Peptidkette: CKRKKRRQRRRG kein TMR) synthetisiert. </li><li> Dann waschen Harz gründlich mit ersten DMF und nach, dass mit Dichlormethan (DCM). Mit einem Gesamtvolumen von etwa 150 ml DMF oder DCM Spülen Sie den Harz mehrere Male und das Lösemittel durch Vakuumfiltration. </li><li> Use MALDI-TOF, um zu bestätigen, dass das erhaltene Peptid hat das korrekte Molekulargewicht. <ol><li> Einen Matrixmischung durch Zugabe von 1 mg Matrix zu einer Lösung von 50 ul 0,01% TFA in Wasser-Lösung und 50 ul Acetonitril besteht. </li><li> Um linearen Peptidkette Masse zu bestätigen, verwenden α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure. Führen Sie eine analytische HPLC des rohen Peptids und sammeln Sie 50 ul von der Oberseite des reinen Peak. </li><li> Um die Probe vorzubereiten, um auf der MALDI Teller Teller: In 8 ul der Peptid bis 2 &amp; mgr; l der Matrix-Lösung und auf den MALDI-Platte trocken oder auf einer 37 ° C Wärmeplatte in die Luft. Anmerkung: Arginin ist bekannt, dass eine Aminosäure schwierig Paar in SPPS sein. Erfolgreiche Kopplung durch Ausführen einer Kaiser-Test 14 (zB Ninhydrintest) etabliert. Dieser Test ermöglicht den Nachweis von freien Aminen, die auf dem Harz abgekoppelt bleiben könnten. Im Falle einer blauen Farbe festgestellt wird (Anzeichen für die Anwesenheit freier Amine), Kupplungs sTEPs werden wiederholt. </li></ol></li></ol></li><li> CK (-NH-TMR) TATG (fTAT), spalten die Mtt-Schutzgruppe an der &amp; egr; -Aminogruppe von Lys an CK (-NH-Mtt) TATG mit einer Lösung aus 1% Trifluoressigsäure (TFA) und 2% Triisopropylsilan zusammen (TIS) in DCM. <ol><li> Die Entfernung von MTT Schutzgruppe würde das Auftreten einer gelben Farbe führen, Inkubation des Harzes mit 20 ml der obigen Lösung für 5 min, wiederholen, bis keine gelbe Farbe beobachtet wird. Dazwischen das Harz mit DCM und DMF. Zusätzlich seit TIS ist ein Aasfresser, die die MTT abfangen würde, sobald keine gelbe Farbe erscheint in der Lösung in Gegenwart von MTT. </li><li> Hinzufügen eines zusätzlichen Lösung mit 1% TFA in DCM (kein TIS) zu dem Harz keine MTT mehr versichern wird entfernt und die Lösung bleibt klar. </li></ol></li><li> Lösen die drei Komponenten: Carboxytetramethylrhodamin (TMR), HBTU und DIEA (4, 3,9 und 10 Äquivalenz in Bezug auf die Menge des Harzes (in mg)) in DMF und diese Mischungzu dem Harz und die Reaktion O / N mit trockenem N 2, um Unruhe zu schaffen. </li><li> Nach der Fmoc-Entschützung und Aminosäure-Konjugation, das Harz mit DCM und trocknen lassen. Für eine vollständige Spaltung des Peptids von dem Harz, wird eine Lösung aus 92,5% TFA, 2,5% H 2 O, 2,5% TIS, 2,5% Ethandithiol (EDT) (Gesamtvolumen = 4 ml), um die Peptidyl-Harz für 3 h bei RT zur Entfernung der Schutzgruppen und Abspaltung vom Harz zu erzielen. <ol><li> Ausfällung der rohen Peptidprodukte mit kaltem wasserfreiem Ethylether (Et 2 O) durch Ablassen der Lösung aus Stufe 1.6 werden in 40 ml Et 2 O, drehen diese hinunter auf 4 ° C und 4.000 × g für 20 - 25 min. Wiederholen Sie diesen Schritt, um Waschen des Niederschlags mit kaltem wasserfreiem Et 2 O ermöglichen </li><li> Resuspendieren des Präzipitats in Wasser (5 ml, oder bis Niederschlag vollständig gelöst ist), und lyophilisiere. Dann resuspendieren in 0,1% wässriger TFA / Acetonitril erhaltenen Produkte. </li></ol></li> &lt;li&gt; Eine HPLC-Analyse mit einer analytischen C18-Säule (5 &amp; mgr; m, 4 x 150 mm), um jedes Peptid zu analysieren. Verwenden einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml / min und Detektion bei 214 nm und 550 nm. </li><li> Zuführen semipräparative HPLC auf einer C18 10 x 250 mm-Säule zur Peptidreinigung. Verwenden einer Fließgeschwindigkeit von 4 ml / min und Detektion bei 214 nm und 550 nm. Für alle Durchläufe verwenden linearen Gradienten von 0,1% wässriger TFA (Lösungsmittel A) und 90% Acetonitril, 9,9% Wasser und 0,1% TFA (Lösungsmittel B). </li><li> Bestätigen Sie die korrekte Identität der Peptide durch MALDI-TOF nach Herstellerprotokoll: fTAT, erwartete Masse: 2,041.17, beobachtete Masse: 2.040,66. DEAC-K9, erwartete Masse: 1,412.97, beobachtete Masse: 1,415.59. Verwenden ein α- Cyano-4-hydroxyzimtsäure-Matrix für den MALDI-TOF. </li></ol> 2. Oxidation: dfTAT Erstellung <ol><li> Belüften phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), pH 7,4 für 1 Stunde (mindestens 5 ml für die Reaktion weiter unten). </li><li> Löse fTAT (0,3 mg, 1,5 x 10 -4 mmol) in aerATED PBS pH 7,4 (5 ml). Sicherzustellen, dass der pH-Wert zwischen 7,0 bis 7,5 nach der Zugabe des Peptids. Wenn nicht Natriumhydroxid hinzufügen (1 M, in kleinen Schritten 1-5 ul), um den pH-Wert wieder auf 7,4 zu bringen. </li><li> Anmerkung: Sauerstoff, gelöst in PBS wirkt die Thiolgruppen auf fTAT oxidieren und eine Disulfidbindung bilden. </li><li> Nutiert die Reaktion O / N, damit sie bis zum Abschluß (100% Ausbeute, basierend auf HPLC-Analyse) zu reagieren. Man reinigt das Produkt mittels Umkehrphasen-HPLC und Massenspektrometrie (MALDI-TOF) analysiert, wie in Schritt 1.9. Erwartete Masse: 4,080.34, beobachtete Masse: 4,084.21. </li><li> Lyophilisiere reinen dfTAT (0,71 x10 -4 mmol) und resuspendieren in 200 ul Wasser (Konzentration reiner dfTAT = 356,3 &amp; mgr; M). </li></ol> 3. Mess dfTAT Konzentration <ol><li> Resuspendieren eines Aliquots des gereinigten dfTAT (typischerweise 1 &amp; mgr; l in Abhängigkeit von der Menge an Peptid gereinigt) in einem 149 ul 50 mM TCEP Lösung. </li><li> Anmerkung: In diesem Schritt dfTAT in seine mo reduziertennomer Gegen fTAT um die Absorption Abschrecken, der aufgrund der großen Nähe des TMR-Fluorophor in dfTAT (der Extinktionskoeffizient ε der TMR in dfTAT wird im Vergleich zu der ε von TMR in reduzierter fTAT reduziert) zu eliminieren. </li><li> Die Probe wird für etwa 20 min reagieren (analytische HPLC kann verwendet werden, um die Bildung von fTAT bestätigen). </li><li> Hinzufügen all der Lösung auf die Quarzküvette und Messung der Absorption bei 556 nm. </li><li> Unter Verwendung des Beerschen Gesetzes (A = εcl: ε = 91.500 M -1 cm -1), um die Konzentration von fTAT berechnen, bestimmen die Konzentration von dfTAT, und teilen [fTAT] durch zwei. </li></ol> 4. Cellular Lieferung Experimente <ol><li> Pflanzensamen, die Zellen (HeLa, HDF, etc.) In einer Schale auf einer Konfluenz von 80-90% (zB 8-Well-oder 24-Well-Schale). 90% Konfluenz in einer 37 ° C - wachsen Zellen in einem geeigneten Medium, bis 80 (zB DMEM mit 10% FBS und Pen / Strep ergänzt)befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO 2. </li><li> Die Zellen werden dreimal (3x) mit PBS (durch Zugabe von 200 ul PBS und dann Entfernen dreimal). </li><li> Einen 5 uM Arbeitskonzentration von dfTAT durch in NRL-15 Medien Verdünnen einer Stamm der dfTAT (in Wasser) (für ein 8 gut austeilen das Gesamtvolumen sollte 200 ul sein). Eine Konzentration von 5 uM dfTAT führt zu effizienten Lieferung (hohe cytosolische Lieferung in über 90% der in einer Schale vorhanden Zellen) in den meisten auf dem neuesten Stand (Abbildung 3) getesteten Zelltypen. Jedoch können niedrigere oder höhere Konzentrationen für Zelltypen mit einem hohen oder niedrigen Neigung zum Eindringen mehr ausreichend sein. HINWEIS ÜBER DIE MEDIEN: NRL-15 ist für die Lieferung von dfTAT verwendet, da es nicht Cystein, das die Disulfidbindung in dfTAT reduzieren könnten. Jedoch zeigen unsere Daten, dass sowohl reguläre L-15 (mit Cystein) und DMEM kann als Abgabemedien verwendet werden. L-15 das Reduktions Aminosäure Cystein, aber Cystein presumab enthältly oxidiert in den Medien, um Cystin bilden (DMEM mit Cystin formuliert). dfTAT bleibt daher intakt in diesen Medien und Lieferwerk in der gleichen Effizienz wie die mit nrL15 erhalten. </li><li> Inkubieren Zellen mit dfTAT (5 &amp; mgr; M) mit oder ohne Ladung (z. B. EGFP (10 &amp; mgr; M)) und halten bei 37 ° C für 1 Stunde (Inkubationszeit reduziert, sondern dfTAT erfordert typischerweise etwa 30 bis 45 min, um die endosomale Leck induzieren ). </li><li> In L-15-Zellen zu waschen mit Heparin (1 mg / ml) (3 Waschungen werden empfohlen) zu dfTAT entfernen, um die Plasmamembran der Zellen gebunden wird. </li><li> Zellen mit Zell-undurchlässige Kernfärbung, Inkubation z. B. Sytox Blau, Sytox Green (2 uM in NRL-15), um zu bestimmen, ob die Plasmamembran der Zellen beeinträchtigt wird gemäß (toten Zellen, die während lebende Zellen werden nicht gefärbt werden) Protokoll des Herstellers. </li><li> Bildzellen mit einem Fluoreszenzmikroskop (100x Ölimmersion oder 20x-Objektiv). Bild dfTAT mit einem RFP-Filter (Ex =560 ± 20 nm / Em = 630 ± 35 nm). Anmerkung: Die erfolgreiche Bereitstellung führt zu einer diffuse Fluoreszenz dfTAT gesamten Zelle (Beurteilung der Abgabe von Protein oder Peptid von Interesse wird auf Anwendung abhängt). Färbung von Nukleoli von fTAT (das reduzierte Produkt der dfTAT auf cytosolischen Eingabe) kann als Indiz dafür, dass die nachgewiesene Fluoreszenz intrazellulär verwendet werden. fTAT wird innerhalb weniger Stunden abgebaut. Zu diesem Zeitpunkt wird die Fluoreszenz der Abbaufragmente als punktförmige angezeigt. Dies ist nicht zu verwechseln für die punktförmige Verteilung, die auch zu sehen ist, wenn dfTAT bleibt erfolglos Inneren Endosomen gefangen (dies kann passieren, wenn dfTAT bei zu niedrigen Konzentration vorhanden ist) sein. </li></ol> 5. Controling Konzentration der MOI Lieferung <ol><li> Identifizieren Sie die erforderlich ist, um eine effiziente Freisetzung von zytosolischen dfTAT in der verwendeten Zelltyp zu erreichen &quot;optimale Lieferung&quot; Konzentration. Führen Fluoreszenzmikroskopie auf Zellen mit increasin inkubiertg Konzentrationen dfTAT. Die optimale dfTAT Konzentration wird als die minimale Konzentration, die zum Löschen cytosolischen führt definierten &quot;Diffus&quot; TMR Fluoreszenz in etwa 100% der Zellen in einer Kultur. </li><li> Variiert die Konzentration des MOI in Coinkubation Protokoll verwendet, während die Konzentration von dfTAT Konstante (zB unter Verwendung von optimalen Lieferkonzentration dfTAT&#39;S). Änderung der Inkubationszeit auf weniger als 1 Stunde könnte auch eine Option, um die Menge zu variieren MOI geliefert werden. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die zur dfTAT Lieferung verwendet wird, sollte nicht übermäßig sein konfluenten Zellen (&gt; 90% Konfluenz), da dies die Abgabeeffizienz beeinflussen könnten. Die Zellen sollten auch gesund sein: toten Zellen in der Kultur kann apoptotischen Fragmente mit dem dfTAT können (zB DNA aus degradierten Kerne) interagieren, zu lösen. Dies wiederum kann mit der Lieferung Effizienz und die Qualität der Bildgebung stören. Zellen sollten gründlich gewaschen werden, um FBS zu entfernen, bevor dfTAT. BSA vorhanden in FBS ka...

Die Verabreichung von Proteinen, Peptiden oder zell undurchlässigen kleinen Molekülen in lebende Zellen ist häufig bei vielen biologischen oder biotechnologischen Anwendungen (zelluläre Bildgebung, funktionelle Assays Reprogrammierung, etc.) 1-4 wünschenswert. Vielen Lieferansätze bereits berichtet wurden, einschließlich Mikroinjektion, Elektroporation oder Verwendung von Trägermitteln (z. B. zellpenetrierenden Peptide wie TAT, Lipide) 5-7. Jede Technik hat in der Regel spezifische Vor- und Nachteile, die diese Ansätze angemessen für bestimmte Anwendungen, aber nicht für andere machen könnten. Häufige Probleme beinhalten schlechte Lieferung Effizienzen und / oder Mangel an Kontrolle, wie viel Material 8,9 geliefert, Toxizität oder nachteilige physiologische Auswirkungen 10,11, mangelnde zeitliche Kontrolle, Lieferung in wenigen Zellen, nicht aber in einer Gesamtbevölkerung (z. B. Mikroinjektion) 12, und komplexe chemische Konjugation oder Formulierungssysteme 11. s = &quot;jove_content&quot;&gt; Kürzlich haben wir einen neuen Liefer Strategie, die diese Einschränkungen umgeht entwickelt. Diese Strategie stützt sich auf ein Peptid mit dem Namen dfTAT (Dimer Fluoreszenz TAT) 13. dfTAT wird aus der gut bekannten zellpenetrierenden Peptid (CPP) TAT abgeleitet. dfTAT enthält zwei disulfidgebundenen Kopien TAT mit dem Fluorophor Tetramethylrhodamin markiert. Trotz ihrer Ähnlichkeiten, TAT und dfTAT unterscheiden sich erheblich in der Aktivität. TAT wird typischerweise durch Endozytose in die Zellen internalisiert. Das CPP bleibt jedoch meist innerhalb Endosomen gefangen (dies in der Regel auf eine punktförmige Verteilung des Peptids in Zellen führen, wenn durch Fluoreszenzmikroskopie untersucht). Wie TAT wird dfTAT effizient von Zellen Endozytose. Allerdings bedeutet dfTAT nicht in Endosomen gefangen zu bleiben. Stattdessen vermittelt es endosomalen Leckage in einer Weise, die sehr effizient ist. Die endosomolytische Aktivität dfTAT können dann genutzt werden, um Makromoleküle durch eine einfache Inkubation Assay zu liefern. ntent &quot;&gt; Das aktuelle Verständnis der Lieferprozess ist wie folgt. dfTAT induziert Makropinozytose. Dadurch Zellen mit dfTAT inkubiert nehmen lösliche Proteine, Peptide oder kleine Moleküle (Moleküle von Interesse, MOI) in Medien präsent durch Flüssigkeitsphasen- Endozytose (siehe Abbildung 1). Die Wechselwirkungen zwischen dfTAT und MOI sind nicht erforderlich, solange beide Entitäten Verkehr zusammen im endocytischen. Wie dfTAT erreicht eine bestimmte Schwelle im Lumen endozytischen Organellen, ihre endosomalen Leckageaktivität (die molekularen Details ausdrückt bleiben werden vollständig charakterisiert). Der Inhalt des Lumens leaky Organellen und damit die MOI, wird dann in den Zellen freigesetzt wird. Dieser Ansatz ist daher sehr praktisch, da keine Konjugation oder Zubereitung Schemata mit MOI erforderlich. Da außerdem dfTAT ist nicht direkt Modifizieren einer MOI, sollte es auch nicht mit MOIs Funktion stören, wenn intrazelluläre Abgabe erreicht wird. Darüber hinaus ist die Konzentration vondfTAT verwendet Lieferung ist unabhängig von jenem des Innenministeriums in Medien. Zum Beispiel kann dfTAT Konzentration zwischen verschiedenen Versuchen konstant gehalten wird, um reproduzierbare Effizienzen in endosomalen Leckage zu gewährleisten. Im Gegensatz dazu kann die Konzentration des MOI in Medien allmählich geändert werden, um gewünschte Niveaus erreichen MOI in Cytosol abgegeben. Die hohe Effizienz bei der endosomalen Leck dfTAT erreicht ist bemerkens unschädlich, viele der Zellen, die bisher getestet. Das ist eine Überraschung, weil endozytischen Organellen sind wichtiger Bestandteil der Zellen und würde man erwarten, dass die dramatische Leckage durch dfTAT vermittelt würden von schädlichen Zellreaktionen begleitet werden. Doch behandelten Zellen vermehren sich mit der gleichen Geschwindigkeit wie unbehandelte Zellen und keine wesentlichen Veränderungen in ihrem Transkriptom anzuzeigen. Darüber hinaus können innerhalb von Minuten mit reproduzierbaren Abgabeeffizienzen wiederholt werden, was darauf hinweist, dass die Zellen entweder toleriert oder erholen sich von den Lieferprozess ohne Verlustihre Fähigkeit zur Endozytose oder endosomalen Leckage. Subtile zellulären Reaktionen während dfTAT Lieferung und die molekularen Details, was diese Reaktionen könnte bleiben, erkundet zu werden werden stattfinden könnte. Doch durch das hohe Wirtschaftlichkeit, Bequemlichkeit der Protokolle, und das Fehlen von Toxizität, diese Lieferansatz sofort in vielen zellbasierten Anwendungen als nützlich erweisen. Die hier angegebenen Protokollen arbeiten daran, dass diese Technologie zugänglich zu der Forschungsgemeinschaft ausgerichtet.

<table><tbody><tr><td>Heparin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>CAS 9041-08-1</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Blue</td><td>Invitrogen</td><td>S11348</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Green</td><td>Invitrogen</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>nrL15 L-15 (&ndash;) cystein</td><td>Hyclone</td><td></td><td>Sonderbestellung</td></tr><tr><td>Fmoc-geschützte Aminosäuren</td><td>Novabiochem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dfTAT</td><td></td><td></td><td>Proben werden auf Anfrage zur Verfügung gestellt (Kontakt: pellois@tamu.edu)</td></tr><tr><td>Biosicherheitswerkbank</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverses Epifluoreszenzmikroskop</td><td>Olympus</td><td>Modell IXB1</td><td>mit einem Heiztisch, der bei 37 &° gehalten wird; C und mit einer rückwärtig belichteten EMCCD-Kamera (Electron-Multiplying Charge-Coupled Device) (Qimaging) von Rolera-MGI Plus ausgestattet.</td></tr><tr><td>37°; C befeuchteter Inkubator mit 5 % CO2</td> Peptidsynthesizer oder Gefäß zur Vorformung der manuellen Peptidsynthese <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

lieferung von proteinen, peptiden oder handy-undurchlässige kleine moleküle in lebenden zellen durch inkubation mit dem endosomolytische reagenz dftat

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Makromolekulare Lieferstrategien verwenden typischerweise die endozytischen Weg als Weg der zellulären Eintrag. Jedoch schränkt endosomalen Einschluß der Effizienz bei der Makromoleküle eine cytosolische Raum der Zellen einzudringen. Vor kurzem haben wir dieses Problem durch die Identifizierung der Reagenzien dfTAT, eine Disulfidbindung Dimer des Peptids TAT ​​mit dem Fluorophor Tetramethylrhodamin markiert umgangen. Wir haben eine fluoreszenzmarkierte Dimer des prototypischen zellpenetrierende Peptid (CPP) TAT dfTAT, die lebende Zellen eindringt und erreicht den cytosolischen Raum von Zellen mit einem besonders hohen Wirkungsgrad erzeugt wird. Cytosolische Lieferung dfTAT in mehreren Zelllinien, einschließlich Primärzellen erreicht. Außerdem dauert die Lieferung nicht merklich beeinträchtigen die Lebensfähigkeit der Zellen, Proliferation oder Genexpression. dfTAT können kleine Moleküle, Peptide, Antikörper, biologisch aktive Enzyme und einen Transkriptionsfaktor zu liefern. In diesem Bericht beschreiben wir die Protokolle DfTa beteiligtT-Synthese und Zell Lieferung. Die Handschrift beschreibt, wie die Menge des Proteins an das cytosolische Raum der Zellen zugeführt, indem die Menge an Protein extrazellulär verabreicht steuern. Schließlich werden die jeweiligen Einschränkungen dieser neuen Technologie und Schritte bei der Validierung Lieferung beteiligt diskutiert. Die beschriebenen Protokolle sollten für zellbasierte Assays als auch für die ex vivo-Manipulation und Reprogrammierung von Zellen extrem nützlich sein.

Um die Differenz zwischen fTAT und dfTAT beurteilen, werden HeLa-Zellen für 1 Stunde mit jedem Peptid inkubiert, um den Unterschied in ihrer zellulären Lokalisation zu bestimmen. Die Internalisierung der beiden CPP wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht. 2 zeigt, dass fTAT (20 uM) lokalisiert in einem punktförmige Verteilung. Diese Verteilung steht im Einklang mit dem Peptid noch im Gerät befindliche Endosomen eingeschlossen. Im Gegensatz dazu das Fluoreszenzsignal dfTAT (5 uM) zeigt eine homog...

Wir beschreiben, wie Proteine und zellundurchlässige kleine Moleküle in kultivierte Säugetierzellen durch ein einfaches Co-Inkubationsprotokoll mit einem Reagenz eingebracht werden können, das endozytäre Organellen undicht werden lässt.

Lieferung von Proteinen, Peptiden oder Handy-undurchlässige kleine Moleküle in lebenden Zellen durch Inkubation mit dem endosomolytische Reagenz dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Makromoleküle mithilfe von Dimer-Fluoreszenz-Tat oder df-Tat, einem Reagenz, das Zellen sehr effizient durchdringen kann, ohne sie zu schädigen, in lebende Zellen einzubringen. Dies wird erreicht, indem zunächst der Delivering-Agent erzeugt und gereinigt wird. Dfta als zweiter Schritt.Dfta wird eine Stunde bei 37 Grad Celsius in Gegenwart des gewünschten makromolekularen Cargos mit Zellen inkubiert, wodurch df tat die Aufnahme des Cargos in endozytotische Vesikel induziert. Die Vesikel reifen zu frühen Endosomen aus und erreichen schließlich das Stadium des späten Endosoms, in dem DF tat in der Lage ist, das Cargo in den zytosolischen Raum der Zellen freizusetzen. Anschließend werden die Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie abgebildet, um die Effizienz der Abgabe von detta sowie des gewünschten Cargos zu bewerten.Die Ergebnisse zeigen, dass DF TT mit hoher Effizienz in Zellen eindringen kann und keine beobachtbare Zytotoxizität aufweist. DF tat kann Makromoleküle unterschiedlicher Größe in den zytosolischen Raum von Zellen befördern, wie mittels Fluoreszenzmikroskopie beobachtet werden kann. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden der festen Abgabesysteme liegt darin, dass unser Abgabemittel eine hohe Abgabeeffizienz besitzt und keine beobachtbaren negativen Auswirkungen auf die zelluläre Physiologie hat. Zusätzlich ist es einfach in der Anwendung, da lediglich ein einfacher Kokubationsschritt erforderlich ist.Um zu beginnen, quellen Sie 500 Milligramm R-Amid-MBHA-Harz in Dimethylformamid oder DMF in einem standardmäßigen 50-Milliliter-SPPS-Gefäß eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf, wobei gerade genug Stickstoffgas zugeführt wird, um die Reaktion perlen zu lassen. Synthetisieren Sie FTA auf dem Rink-Amid-MBHA-Harz unter Verwendung von 1,2 Millimol jedes im Textprotokoll aufgeführten FM-geschützten Aminosäurederivats pro Aminosäurekupplungsreaktion. Geben Sie außerdem 0,44 Gramm HBTU und 0,51 Milliliter DIEA, in DMF gelöst, hinzu und führen Sie jede Aminosäurekupplungsreaktion vier Stunden lang durch. Schließen Sie nach der vierstündigen Kupplung die Reaktion ab.Waschen Sie das Harz mit DMF und führen Sie den FD-Schutzschritt wie im Textprotokoll beschrieben durch. Wiederholen Sie dies, bis die lineare Peptidkette von FTA synthetisiert ist. Entfernen Sie anschließend die MTT-Schutzgruppe, indem Sie das Harz mit 20 Milliliter einer Lösung, bestehend aus 1 % Trifluoressigsäure oder TFA und 2 % Triisopropylsilan oder TIS in DCM, fünf Minuten lang inkubieren.Da die Entfernung der MTT-Schutzgruppe zur Bildung einer gelben Farbe führen würde. Wiederholen Sie dies, bis keine gelbe Färbung mehr beobachtet wird, wobei das Harz zwischenzeitlich mit DCM und DMF gewaschen wird. Geben Sie eine zusätzliche Lösung mit 1 % TFA in DCM zum Harz, um sicherzustellen, dass kein MTT entfernt wird und die Lösung klar bleibt.Anschließend lösen Sie T-M-R-H-B-T-U und DIEA in DMF und geben diese Mischung zum Harz. Führen Sie die Reaktion über Nacht unter Rühren mit trockenem Stickstoff durch, nachdem die fmoc-Schutzgruppe entfernt und die Aminosäure konjugiert wurde. Waschen Sie das Harz mit DCM und lassen Sie es trocknen, um die vollständige Spaltung des Peptids vom Harz zu ermöglichen.Geben Sie eine Lösung mit 92,5 % TFA, 2,5 % Wasser, 2,5 % TIS und 2,5 % Ethanedithiol zur Peptidharz-Lösung hinzu und lassen Sie sie drei Stunden bei Raumtemperatur stehen, um eine vollständige Entschützung und Abspaltung vom Harz zu erreichen. Fällen Sie die rohen Peptidprodukte mit kaltem wasserfreiem Diethylether, indem Sie die vorbereitete Lösung in 40 Milliliter Diethylether abtrennen. Zentrifugieren Sie 20 bis 25 Minuten bei vier Grad Celsius und 4.000 × g.Wiederholen Sie diesen Schritt, um die Waschung des Niederschlags mit kaltem wasserfreiem Diethylether reus. zu ermöglichen. Suspendieren Sie die Niederschläge in Wasser und lyophilisieren Sie sie, anschließend resuspendieren Sie die erhaltenen Produkte in 0,1%iger wässriger TFA ACEDONITE-Lösung. Führen Sie eine Hochleistungsflüssigkeitschromatographie oder HPLC-Analyse mit einer analytischen C 18-Säule durch.Verwenden Sie zur Analyse jedes Peptids eine Flussrate von einem Milliliter pro Minute und die Detektion bei 214 Nanometern und 550 Nanometern. Führen Sie anschließend die halbpräparative HPLC an einer C 18-Säule zur Peptidreinigung durch. Verwenden Sie für alle Durchläufe eine Flussrate von vier Milliliter pro Minute und die Detektion bei 214 Nanometern und 550 Nanometern.Verwenden Sie lineare Gradienten, bevor Sie die Oxidationsreaktion durchführen. Bestätigen Sie die korrekte Identität der Peptide mittels MALDI gemäß der Herstelleranleitung. Lösen Sie FTA in belüftetem phosphatgepuffertem Salzlösungsmittel.Stellen Sie sicher, dass der pH-Wert zwischen 7,0 und 7,5 liegt. Nach der Zugabe des Peptids inkubieren Sie die Reaktion über Nacht, um eine vollständige Umsetzung zu ermöglichen. Reinigen Sie das Produkt mittels umgekehrter HPLC und analysieren Sie es durch Massenspektrometrie. Lyophilisieren Sie anschließend das reine DF-tat und resuspendieren Sie es in 200 Mikrolitern Wasser, um die Konzentration zu bestimmen.Zunächst suspendieren Sie ein Aliquot des gereinigten DF tat in 149 µL einer 50 mmolaren TCEP-Lösung und lassen die Probe etwa 20 Minuten reagieren. In diesem Schritt wird DF tat zu seinem monomeren Gegenstück F tat reduziert, um die Absorptionsunterdrückung zu beseitigen, die aufgrund der engen räumlichen Nähe zwischen dem TMR-Fluorophor und DF tat auftritt. Geben Sie alle Lösungen in eine Quarz-CVE und messen Sie die Absorption bei 556 Nanometern.Mithilfe des Lambert-Beerschen Gesetzes. Bestimmen Sie die Konzentration der Lösung. Dies entspricht der Konzentration von FTA.Teilen Sie die Konzentration von FTA durch zwei, um die Konzentration von dfta zu erhalten. Kultivieren Sie die Zellen in einem geeigneten Medium, bis eine Konfluenz von 80 bis 90 % erreicht ist, bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2, waschen Sie die Zellen dreimal mit jeweils 200 Mikroliter PBS und einmal mit NRL 15. Inkubieren Sie die Zellen mit fünf Mikromolar df tat mit oder ohne Fracht, wie zum Beispiel enhanced green fluorescent protein, und lassen Sie sie eine Stunde bei 37 Grad Celsius stehen, um nach der Inkubation einen endosomalen Leckageeffekt auszulösen.Waschen Sie die Zellen dreimal mit Heparin in L-15-Medium, um DF tat zu entfernen, das an die Plasmamembran der Zellen gebunden ist. Als letzten Schritt bilden Sie die Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie ab, wobei Sie DF tat mit einem Filter für rotes fluoreszierendes Protein (RFP) detektieren, um den Unterschied zwischen F TAT und D ftt zu beurteilen. HeLa-Zellen werden mit jedem Peptid inkubiert, um die Unterschiede in ihrer zellulären Lokalisation zu bestimmen.Wie hier gezeigt, lokalisiert FTA in einer punktf&ouml;rmigen Verteilung. Diese Verteilung ist damit vereinbar, dass das Peptid in den Endosomen eingeschlossen bleibt. Im Gegensatz dazu zeigt das fluoreszierende Signal von dfta eine homogene Verteilung im gesamten Zytoplasma und Kern.Die zytosolische Verteilung von DF tat wird in einer Reihe unterschiedlicher Zelllinien beobachtet. Die 20×-Bilder zeigen, dass ein sehr hoher Anteil der Zellen in einer Petrischale eine zytosolische Verteilung von DF tat aufweist, ohne zelluläre Toxizität, wie durch die fehlende Cyt-blue-Kernfärbung ersichtlich ist, um zu bestimmen, ob dfta-vermittelte Endosomenleckage große Proteine in das Zytosol der Zellen befördert. EGFP wurde verwendet, um die Zufuhr korrekt gefalteter Proteine nachzuweisen.EGFP zeigte eine zytosolische und nukleäre grün fluoreszierende Verteilung, ähnlich wie sie für DF tat in mehr als 90 % der Zellen beobachtet wird, ohne nachweisbare Toxizität. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass die Zellen nicht übermäßig konfluent sein sollten. Außerdem sollten die Zellen gründlich gewaschen werden, um FPS zu entfernen, bevor df tap hinzugefügt wird.

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Forschung

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Engineering zellpermeablen Protein

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Lieferung von Proteinen, Peptiden oder Handy-undurchlässige kleine Moleküle in lebenden Zellen durch Inkubation mit dem endosomolytische Reagenz dfTAT (Video) | JoVE Journal

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