Lieferung von Proteinen, Peptiden oder Handy-undurchlässige kleine Moleküle in lebenden Zellen durch Inkubation mit dem endosomolytische Reagenz dfTAT

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, Makromoleküle mit Hilfe von Dimer-, Fluoreszenz- oder Df-Tat-Reagenz in lebende Zellen zu bringen, das sehr effizient in Zellen eindringen kann, ohne sie zu beschädigen. Dies wird erreicht, indem zunächst das Trägermedium erzeugt und gereinigt wird. Dfta als zweiten Schritt.

Dfta wird eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius in Gegenwart der interessierenden Makromolekülfracht mit Zellen inkubiert, df tat induziert die Aufnahme der Fracht in endozytären Vesikel. Vesikel reifen zu frühen Endosomen heran und erreichen schließlich das späte Endosomenstadium, in dem DF tat in der Lage ist, die Fracht in den zytosolischen Raum der Zellen freizusetzen. Anschließend werden die Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie abgebildet, um die Liefereffizienz von Detta und der interessierenden Fracht zu beurteilen.

Die Ergebnisse zeigen, dass DF TT mit hoher Effizienz und ohne beobachtbare Zytotoxizität in Zellen eindringen kann: DF tat kann Makromoleküle unterschiedlicher Größe in den zytosolischen Raum von Zellen abgeben, wie durch Fluoreszenzmikroskopie beobachtet werden kann. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden soliden Verabreichungsansätzen besteht darin, dass unser Verabreichungsmittel eine hohe Verabreichungseffizienz ohne beobachtbare negative Auswirkungen auf die Zellphysiologie aufweist. Darüber hinaus ist es einfach zu bedienen, da es nur einen einfachen Co-Inkubationsschritt erfordert.

Zu Beginn der FTA-Synthese 500 Milligramm R-Amid, MBHA-Harz und Dimethylformamid oder DMF in einem Standard-50-Milliliter-SPPS-Gefäß für eine Stunde aufquellen lassen, die Reaktion bei Raumtemperatur mit gerade genug Stickstoffgas durchführen, um die Reaktion zu blasen. Synthetisieren Sie FTA auf der Eisbahn mit 1,2 Millimol jeder FM-geschützten Aminosäure, die im Textprotokoll für jede Aminosäure-Kopplungsreaktion aufgeführt ist. Fügen Sie ferner Punkt 44 Gramm HBTU und Punkt 51 Milliliter DIEA, gelöst in DMF, hinzu und führen Sie jede Aminosäurekupplungsreaktion vier Stunden lang nach der vierstündigen Kopplung durch.

Waschen Sie das Harz mit DMF und führen Sie den FD-Schutzschritt durch, wie im Textprotokoll beschrieben. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die lineare Peptidkette von FTA synthetisiert ist. Als nächstes wird die MTT-Schutzgruppe geklebt, indem das Harz fünf Minuten lang mit 20 Millilitern einer Lösung aus 1 % Trifluoressigsäure oder TFA und 2 % Triisopropyl cy oder TIS in DCM inkubiert wird.

Da das Entfernen der MTT-Schutzgruppe dazu führen würde, dass eine gelbe Farbe angezeigt wird. Wiederholen Sie dies, bis keine gelben Farben mehr zu sehen sind, indem Sie das Harz zwischendurch mit DCM und DMF waschen. Fügen Sie dem Harz eine zusätzliche Lösung mit 1 %TFA in DCM hinzu, um sicherzustellen, dass kein MTT entfernt wird und die Lösung klar bleibt.

Als nächstes lösen Sie T-M-R-H-B-T-u und DIEA in DMF auf und geben diese Mischung zum Harz. Die Reaktion über Nacht mit trockenem Stickstoff durchführen, um nach dem fm d-Schutz und der Aminosäurekonjugation ein Rühren zu gewährleisten. Waschen Sie das Harz mit DCM und lassen Sie es trocknen, um das Peptid vollständig vom Harz zu trennen.

Geben Sie eine Lösung mit 92,5 % TFA, 2,5 % Wasser, 2,5 % TIS und 2,5 % Ethandithiol drei Stunden lang bei Raumtemperatur in das Peptidylharz, um einen globalen Tiefenschutz und eine Spaltung des Harzes zu erreichen. Die rohen Peptidprodukte werden unter Verwendung von kaltem, wasserfreiem Ethylether gefällt, indem die vorbereitete Lösung in 40 Milliliter Eylether abgegossen wird. Schleudern Sie dies bei vier Grad Celsius und 4.000 g für 20 bis 25 Minuten herunter.

Wiederholen Sie diesen Schritt, damit der Niederschlag mit kaltem, wasserfreiem Ethylether reus gewaschen werden kann. Suspendieren Sie die Ausfällungen in Wasser und lyophilisieren Sie sie, dann resuspendieren Sie die Produkte, die in einem 0,1%igen wässrigen TFA-ACEDONIT-Versuch erhalten wurden. Führen Sie Hochleistungsflüssigkeitschromatographie oder HPLC-Analysen mit einer analytischen C 18-Säule durch.

Um jedes Peptid zu analysieren, verwenden Sie eine Flussrate von einem Milliliter pro Minute und eine Detektion bei 214 Nanometern und 550 Nanometern. Als nächstes führen Sie eine semi-präparative HPLC auf einer C 18-Säule zur Peptidaufreinigung durch. Verwenden Sie eine Durchflussrate von vier Millilitern pro Minute und eine Detektion bei 214 Nanometern und 550 Nanometern für alle Durchläufe.

Verwenden Sie lineare Gradienten, bevor Sie die Oxidationsreaktion durchführen. Bestätigen Sie die korrekte Identität der Peptide durch MALDI gemäß dem Protokoll des Herstellers. FTA in belüfteter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung auflösen.

Achten Sie darauf, dass der pH-Wert zwischen 7,0 und 7,5 liegt. Nach der Zugabe des Peptids mutieren Sie die Reaktion über Nacht, damit sie bis zum Abschluss reagieren kann. Reinigen Sie das Produkt mit Umkehrphasen-HPLC und analysieren Sie es wie zuvor durch Massenspektrometrie, lyophilisieren Sie das reine DF-Gerät und suspendieren Sie es in 200 Mikrolitern Wasser, um die Konzentration zu messen.

Zuerst wird ein Aliquot des gereinigten DF-Beutels in 149 Mikrolitern 50 millimolare TCEP-Lösung suspendiert, wodurch die Probe etwa 20 Minuten lang reagieren kann. In diesem Schritt wird DF tat auf sein Monomer-Gegenstück F tat reduziert, um das Absorptionsquenching zu eliminieren, das aufgrund der unmittelbaren Nähe zwischen der TMR-Schicht vier und DF tat auftritt. Geben Sie alle Lösungen zu einem Quarz-CVE und messen Sie die Absorption bei 556 Nanometern.

Mit dem Gesetz des Bieres. Bestimmen Sie die Konzentration der Lösung. Dies entspricht der Konzentration von FTA.

Teilen Sie die Konzentration von FTA durch zwei, um die Konzentration von dfta zu erhalten. Züchten Sie die Zellen in einem geeigneten Medium bis zu 80 bis 90 % Conf in einer 37 Grad Celsius befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2, waschen Sie die Zellen dreimal mit 200 Mikrolitern PBS und einmal mit NRL 15. Inkubieren Sie die Zellen mit fünf mikromolaren df tat mit oder ohne Fracht, wie z. B. verbessertem grün fluoreszierendem Protein, und halten Sie sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius, um nach der Inkubation eine endosomale Leckage zu induzieren.

Waschen Sie die Zellen dreimal mit Heparin in L 15 Medium, um den an die Plasmamembran der Zellen gebundenen DF zu entfernen. Als letztes Bild nehmen die Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop DF tat mit einem rot fluoreszierenden Protein oder RFP-Filter auf, um die Differenz zwischen F TAT und D ftt zu beurteilen. He Heela-Zellen werden mit jedem Peptid inkubiert, um den Unterschied in ihrer zellulären Lokalisation zu bestimmen.

Wie hier gezeigt, lokalisiert FTA in einer punktförmigen Verteilung. Diese Verteilung stimmt mit der Tatsache überein, dass das Peptid in den Endosomen eingeschlossen bleibt. Im Gegensatz dazu zeigt das Fluoreszenzsignal von dfta eine homogene Verteilung im gesamten Zytosol und Zellkern.

Die zytosolische Verteilung von DF tat wird in einer Reihe verschiedener Zelllinien beobachtet. Die 20 x Bilder zeigen, dass ein sehr hoher Prozentsatz in einer Schale eine zytosolische Verteilung von DF tat ohne zelluläre Toxizität zeigt, wie sie bei keiner Cyt-Blue-Kernfärbung zu beobachten ist, um zu bestimmen, ob dfta vermittelte endosomale Leckage große Proteine in das Zytosol der Zellen liefert. EGFP wurde verwendet, um die Verabreichung von korrekt gefaltetem Protein nachzuweisen.

EGFP zeigte eine zytosolische und nukleare grüne Fluoreszenzverteilung, ähnlich der, die bei mehr als 90% der Zellen ohne beobachtbare Toxizität bei DF beobachtet wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass Zellen nicht übermäßig konfluent sein sollten. Darüber hinaus sollten die Zellen gründlich gewaschen werden, um FPS zu entfernen, bevor sie df tap hinzufügen.