Identifizierung von Rare bakteriellen Erregern von 16S rRNA-Gen-Sequenzierung und MALDI-TOF-MS

Das übergeordnete Ziel dieses MALDI-TOF-Massenspektrometrie-Protokolls ist es, die Typisierung seltener Krankheitserreger durch ein schnelles und kostengünstiges Verfahren zu verbessern. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der diagnostischen Mikrobiologie zu beantworten, sie ermöglicht die schnelle Errichtung seltener bakterieller Krankheitserreger. Heute wollen wir über Odoratimimus und Bakterien der Gattung Myroides sprechen.

Die Methode zu demonstrieren und über die Interpretation der Ergebnisse zu sprechen. Im Allgemeinen kann es für Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, schwierig sein, da die Übertragung von Bakterien, die Überlagerung mit Metriken und die Interpretation der Ergebnisse technische Fähigkeiten und mikrobiologisches Fachwissen erfordern. Wir hatten die Idee, MALD-TOF MS zum Screening auf seltene Bakterien einzusetzen, als wir in unserem Krankenhaus einen Patienten hatten, der an einer diabetischen Lebensmittelinfektion litt, die durch Myroides odoratimus verursacht wurde.

Beginnen Sie dieses Protokoll mit der Extraktion von bakterieller DNA, der ribosomalen 16S-DNA-PCR und der Sanger-Sequenzierung, wie im Textprotokoll beschrieben. Verwenden Sie einen hölzernen Zahnstocher, um eine einzelne Bakterienkolonie in eine Vertiefung eines 96-Well-Stahltargets zu übertragen. Einen Mikroliter 70%ige Ameisensäure auf den luftgetrockneten Organismus auf das Stahltarget auftragen und etwa zwei bis drei Minuten trocknen lassen.

Überlagern Sie den Fleck mit einem Mikroliter Matrixlösung, die 50 mg/ml CHCA in einem organischen Lösungsmittel enthält, das aus 50 % Acetonitril, 2,5 Trifluoressigsäure und 47,5 % Wasser besteht. Lassen Sie den Abstrich und die überlagerte Matrix etwa fünf Minuten lang in einer Haube an der Luft trocknen. Um die Proben einzuführen, belüften Sie die Probenladeöffnung des Massenspektrometers, indem Sie die Ein-/Aus-Taste des Geräts drücken.

Öffnen Sie die Ladeöffnung und setzen Sie die MALDI-TOF MS Zielplatte mit dem getrockneten Bakterienabstrich plus Matrize ein. Schließen Sie den Anschluss und evakuieren Sie erneut. Beobachten Sie das Vakuum und wenn es 4,5 Millionen Millibar erreicht, starten Sie die Messung.

Öffnen Sie die MMIS-Analysesoftware und klicken Sie auf das Dateimenü. Wählen Sie "Neue Klassifizierung" und ein neues Fenster mit dem Namen "MALDI Biotyper Real Time Classification Wizard" sollte sich öffnen. Geben Sie den Projektnamen in das Feld "Projektname" ein und klicken Sie auf "Neu", überprüfen Sie unter dem neuen Dialogfeld "Neues Projekt" den Projektnamen und klicken Sie auf die Schaltfläche "Okay".

Beobachten Sie im MALDI Biotyper Real Time Classification Wizard das Fenster Analytplatzierung. Wählen Sie Zielpositionen aus, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf eine ausgewählte Position und wählen Sie Proben hinzufügen. Geben Sie in der automatisch geöffneten Tabellenansicht den Namen des Beispiels, die Beispiel-ID und optional einen Kommentar ein.

Klicken Sie auf die Schaltfläche "Weiter", um fortzufahren. Beobachten Sie als Nächstes das Fenster Auswahl der MALDI-Biotyper-Methoden. Wählen Sie Bruker Taxonomie aus den MSPs aus den Taxonomiebäumen aus und klicken Sie auf Weiter, um fortzufahren.

Beobachten Sie dann das Fenster mit der Projektzusammenfassung. Prüfen Sie die oben eingefügten Einträge für das eigentliche Klassifizierungsprojekt. Starten Sie den Klassifizierungslauf, indem Sie auf die Schaltfläche "Fertig" klicken.

Die Messungen starten automatisch, wenn das entsprechende Vakuum erreicht ist. Befolgen Sie den Klassifizierungslauf, bis die Messung erfolgreich abgeschlossen ist. Sobald die Messung abgeschlossen ist, öffnen Sie das Menü "Ansicht" und klicken Sie auf "Ergebnisse", um die Ergebnistabelle in der MALDI Biotyper Real Time Classification Project One anzuzeigen.

Zeigen Sie die Ergebnisse der Bruker-Daltonik MALDI Biotyper-Klassifizierung als HTML-Datei im Standard-Webbrowser an. Drucken Sie die Ergebnisse aus und speichern Sie sie. Hier sind Spektren zu sehen, die von MALDI-TOF MS erhalten und in Echtzeit gemessen und klassifiziert werden.

Den Spektren wird ein Artname und ein Score-Wert zugewiesen, der die Qualität der Messung widerspiegelt. Werte über 2.300 stellen eine sehr wahrscheinliche Artidentifikation dar. Ein Score zwischen 2.000 und 2.300 deutet auf eine sichere Artbestimmung hin.

Ein Wert unter 1.700 und 2.000 deutet auf eine wahrscheinliche Artbestimmung hin. Und eine Punktzahl unter 1.700 ist nicht zuverlässig. Die Identifizierung von bakteriellen Krankheitserregern, die in einer Reinkultur auf einem festen Medium gezüchtet werden, dauert zwei bis drei Minuten.

Es ist wichtig zu bedenken, dass seltene bakterielle Krankheitserreger mit MALDI-TOF MS nur dann gefunden werden können, wenn das Gerät zuverlässig die entsprechenden Spektren enthält. Andernfalls muss sie durch Integration von MaSDA-Spektren aus typisierten Stämmen ihrer charakterisierten Isolate gelöscht werden. Für den Fall, dass die Score-Ergebnisse nicht zu einer eindeutigen Stammidentifizierung führen, können weitere Methoden, wie z.B. biochemisches Profiling oder 16S rDNA-Sequenzierung, angewendet werden.

Obwohl diese Methode Einblicke in den bakteriellen Nachweis geben kann, kann sie auch auf andere Mikroorganismen wie Pilze oder Anaerobier angewendet werden. Darüber hinaus kann die Resistenz von Bakterien gemessen werden. Vergessen Sie nicht, mit einer Matrix zu arbeiten, die ein gefährlicher Stoff ist, Handschuhe und eine Schutzbrille zu tragen und unter einer Haube zu arbeiten.

Des Weiteren ist es unbedingt erforderlich, die Matrize und den Abstrich gründlich zu trocknen, um ein Überspritzen in der Analysekammer zu vermeiden.