Name: Identifizierung von Rare bakteriellen Erregern von 16S rRNA-Gen-Sequenzierung und MALDI-TOF-MS (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 34 s
Description: Erfahren Sie die Identifizierung seltener bakterieller Erreger mit MALDI-TOF-MS und 16S rRNA-Gen-Sequenzierung. Diese Methode ermöglicht schnelle, kostengünstige Diagnostik in der Mikrobiologie.

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Die Autoren danken Prof. Enno Jacobs für seine anhaltende Unterstützung.

1. Extraktion von Bakterien-DNA <ol><li> Herstellung der PBS-Lösung <ol><li> Wiegen 1,65 g Na 2 HPO 4 x 2H 2 O, 0,22 g NaH 2 PO 4 x 2H 2 O und 8,80 g NaCl in einem Kolben und füllt mit destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 1000 ml. Den pH-Wert auf 7,4. Für die endgültige Verwendung filtern Sie die Lösung durch eine bakteriendichte (0,22 &amp; mgr; m-Filter). </li></ol></li><li> DNA Extraction of Gram-negative Bacteria <ol><li> Streak das Patientenmaterial auf geeigneten Kulturmedien (zB Columbia - Blut - Agar), zu identifizieren und potenzielle Krankheitserreger zu isolieren. </li><li> Bereiten Reinkultur und führen Gram-Färbung , um Morphotyp zu bestimmen und Reinheit zu bestätigen und der Kultur 49. </li><li> Wählen Sie eine einzelne Bakterienkolonie und übertragen es mit einem 1 ul einmaligen Gebrauch Impföse in eine sterile 2,0 ml Reaktionsröhrchen, die 1 ml PBS-Lösung enthält. </li><li> Inkubieren diese Suspension in einem thermomixer bei 95 ° C für 10 min. Nach der Inkubation ließ den Bakterienextrakt auf Raumtemperatur abkühlen (die gelöste DNA enthält) und entweder zur Verstärkung oder bei -20 ° C zur weiteren Verwendung (Abbildung 1a) direkt verwenden. </li></ol></li><li> DNA Extraction of Gram-positive Bakterien <ol><li> Streak das Patientenmaterial auf geeigneten Kulturmedien (zB Columbia - Blut - Agar), zu identifizieren und potenzielle Krankheitserreger zu isolieren. Führen Gram-Färbung, um Morphotyp der Kultur zu bestätigen. </li><li> Bereiten Reinkultur und führen Gram-Färbung, um Morphotyp zu bestimmen und die Reinheit der Kultur zu bestätigen. </li><li> Wählen Sie eine einzelne Bakterienkolonie mit einer sterilen 1 &amp; mgr; l-Impföse und suspendieren es in 500 ul PBS-Lösung in einem 2,0 ml Reaktionsgefäß. </li><li> Hinzufügen, 500 &amp; mgr; l Glaskügelchen und übertragen die Röhre zu einer oszillierenden Homogenisators bei maximaler Frequenz betrieben und Amplitude (50 Hz) für 5 min. Verwenden Sie Glasperlen von 1,0 mm Durchmesserdie Bakterienzellwände zu zerstören. </li><li> Inkubieren dieses Röhrchen 10 min bei 95 ° C und auf Raumtemperatur abkühlen. Verwenden Sie den Extrakt entweder direkt für die PCR-Reaktion oder bei -20 ° C zur weiteren Verwendung. </li></ol></li></ol> 2. 16S rDNA-PCR <ol><li> Herstellung von Amplifikationsprimern <ol><li> Verwenden Sie den Primer TPU1 (5&#39;-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3 &#39;[M = A / C]) als Vorwärtsprimer und RTU4 (5&#39;-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3&#39;) als Reverse-Primer 25. Bereiten Sie eine Grundierung Stammlösung mit DNAse und RNAse freies Wasser, um eine Konzentration von 100 pmol / ul (100 &amp; mgr; M) und verdünnen Sie es weiter zu einer Arbeitslösung bei 10 pmol / ul. Bewahren Sie die Grundierung Lager und Arbeitslösung bei -20 ° C oder direkt verwendet werden. </li></ol></li><li> Herstellung der PCR-Reaktionsmischung <ol><li> Pipette 1 &amp; mgr; l jedes Primers, 1 &amp; mgr; l dNTP-Mix (100 mM), 2,5 ul der DNA-Extrakt, 5 &amp; mgr; l 10x PCR-Puffer (enthaltend 25 mM MgCl 2), 0,25 ul Taq-Polymerase (5 Einheiten / ul) und 39,25 ul DNase- und RNase - frei PCR Wasser in einen sterilen 200 ul Reaktionsröhrchen. </li></ol></li><li> PCR-Protokoll <ol><li> Starten Sie die PCR-Programm wie folgt aufgebaut: Zunächst wird ein anfängliches Inkubationsschritt bei 95 ° C für 5 min, die notwendig ist, die Taq-Polymerase zu aktivieren. Zweitens 35 Amplifikationszyklen, enthaltend eine 1 min. Denaturierungsschritt bei 95 ° C, einer 1 min. Primer Temperschritt bei 50 ° C und einem 1,5 min Primerverlängerungsschritt bei 72 ° C. Drittens wird eine abschließende Extension für 10 min bei 72 ° C. Schließlich wird die PCR-Reaktion auf 4 ° C abgekühlt. HINWEIS: Staphylococcus aureus und H 2 O dienen als positive und negative Kontrolle (Abbildung 1b). </li><li> Das Röhrchen wird die PCR-Reaktionsmischung in den Thermocycler enthält, und das Programm starten. </li></ol></li><li> Reinigung des PCR-Produkts HINWEIS: Um das PCR-Produkt, mehrere Protokolle zu reinigen, entwederEnzymbasis oder mit einem Siliciumdioxid Adsorptionsmatrix verwendet werden. Der einstufige verwendet PCR-Reinigung hier verwendet zwei hydrolytische enzymatische Reaktionen. Während Exonuclease I (Exo I) einzelsträngige DNA entfernt, Garnelen alkalische Phosphatase (SAP) hydrolisiert unincorporated dNTPs. Das zweite Verfahren basiert auf einer Silica-Membran-Adsorptionstechnik mit einem hohen Salz schnelle Bindung - waschen - niedrige Elution Zyklus Salz. <ol><li> In 1,5 ul einer Enzymmischung, die sowohl Exo I und SAP bis 25 &amp; mgr; l PCR-Produkt, gut mischen und in ein Thermocycler ein einfaches Protokoll der ersten 15 min bei 37 ° C, gefolgt von 15 min bei 80 ° C anwenden. Lagern Sie das gereinigte PCR-Produkt entweder bei -20 ° C oder verwenden Sie es direkt als Ziel für die PCR-Markierung. </li></ol></li></ol> 3. DNA Agarose-Gelelektrophorese <ol><li> Herstellung des Elektrophorese-Puffer (TBE-Puffer) <ol><li> Titrieren 54,0 g (445 mM), Tris-Base, 27,5 g (445 mM) Borsäure und 20 ml einer 0,5 M EDTA (10mM) Lösung bei pH 8,0 mit NaOH in einem Kolben und füllt mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 1000 ml. Dann verdünnen diese 5x Puffer 1:10 mit destilliertem Wasser (0,5x TBE) für die Elektrophorese. </li></ol></li><li> Herstellung des Loading Buffer <ol><li> Mischen Sie 250 mg Bromphenolblau, 250 mg Xylolcyanol FF und 15 g Polysucrose (Werkstoff - Tabelle) in einen Kolben. Dann füllen Sie es mit 0,5x TBE-Puffer auf ein Gesamtvolumen von 100 ml. Aliquot der Lade Farbstoff zu 1 ml-Portionen und bei -20 ° C für die weitere Verwendung. </li></ol></li><li> Gießen des Agarosegels <ol><li> Wiegen 6 g Standard Elektrophorese Agarose zu 300 ml 0,5x TBE-Puffer (siehe Abschnitt 3.1.1) in einen Kolben, eine 2% (w / v) Agarose-Gel herzustellen. Dann legen Sie die Agarose-Gemisch in einem Mikrowellenofen, erhitzen Sie es in der Nähe von Siedepunkt, bis die Agarose vollständig gelöst ist und die Lösung klar erscheint. </li><li> Lassen Sie die geschmolzene Agarose abkühlen ausreichend und fügen Sie 10 ul einer 1% (w / v) Ethidiumbromid Lager solution. Füllen Sie die Lösung in eine gegossene und legen Sie eine Gelkamm (unter Berücksichtigung von 30 Brunnen) in der Besetzung. Nehmen Sie den Kamm, wenn das Gel vollständig erstarrt ist und setzen Sie das Gel in die Elektrophoresekammer 0,5x TBE-Puffer enthält. HINWEIS: Ethidiumbromid ist toxisch und mutagen. Daher sollten Sie sie mit Vorsicht behandelt werden. Es ist ratsam, Nitril-Handschuhe zu benutzen. Es gibt alternative interkalierende Nukleinsäure Flecken, die als nicht-toxische Alternative verwendet werden kann. </li></ol></li><li> Agarose-Gelelektrophorese der PCR-Produkte ANMERKUNG: Um die richtige Größe der PCR-Amplikons zu überprüfen und die DNA-Konzentration das gereinigte PCR-Produkt in einem Agarosegel aufgetrennt wird zu schätzen. <ol><li> Pipette 2 ul des Beladungspuffers in ein Reaktionsrohr PCR und aus 8 &amp; mgr; l des PCR-Produktes. Pipettieren diese Mischung in die Vertiefungen des Gels. In 8 ul einer molekularen Größe Marker (DNA-Leiter) in einem separaten gut die Größe des PCR-Produkts zu schätzen. </li><li> anwendeneine konstante Spannung bei 10 V / cm und sobald der Bromphenolblau-Marker über die Elektrophorese stoppen ¾ der Gesamtlänge des Gels erreicht hat. Visualisieren Sie die getrennten PCR-Fragmente unter Verwendung eines UV-Transilluminator (Wellenlänge 302 nm) und dokumentieren sie ein Gel-Dokumentationssystem verwendet wird. Schätzen Sie die DNA-Menge durch einen visuellen Vergleich mit der DNA-Leiter. Verwenden Sie ca. 10 ng als Ziel für die Kennzeichnung PCR. </li></ol></li></ol> 4. Sanger-Sequenzierung <ol><li> Cycle Sequencing PCR HINWEIS: Führen Sie die PCR - Markierung in einer 10 ul Reaktion eines kommerziellen Kits (Werkstoff - Tabelle) verwendet wird . <ol><li> In 2 ul 5x Reaktion Mastermix, 2 ul der DNA-Präparation wurden 1,5 ul TPU1 oder RTU4 Arbeitslösung (10 pmol / ul) und 4,5 ul DNAse und RNAse freies Wasser. </li><li> Setzen Sie diese Sequenzierungsreaktionsmischung in einem Thermocycler und führen Sie eine weitere PCR. Insgesamt bestehend Prozess 25 Zyklen eines Denaturierungsschritt (96 ° C,10 sec), einem Glühschritt (45-60 ° C, 5 sek) und einen Verlängerungsschritt (60 ° C, 2 min). Schließlich Abkühlen der Reaktion auf 4 ° C. </li></ol></li><li> Reinigung der Sequenzierungsreaktion <ol><li> Reinige die Markierungsreaktion Mix mit kommerziellen Spin - Säulen für die PCR - Reinigung (Werkstoff - Tabelle). </li><li> Last 10 ul der Sequenzierungsreaktion auf die vorge hydratisierte Gel-Filtrationsmatrix und führen einen Zentrifugationsschritt bei 750 × g für 3 min. Hinweis: Durch die Verwendung dieses Verfahrens nicht eingetragene Farbstoffterminatoren in der Gelmatrix zurückgehalten werden. </li><li> Dann trocknen die wässrige Eluat in einem Vakuum-Konzentrator. Zentrifuge bei 2.500 xg für 20 bis 30 min bei 40 ° C zur Vervollständigung Trockenheit. </li><li> Zugabe von 10 &amp; mgr; l stark entionisierte Formamid dann 2 min bei 90 ° C denaturieren und die Mischung auf Eis kühlen. Je 10 ul der denaturierten Proben auf einer 96-Well-Platte ul. Das getrocknete und gereinigte PCR-Produkt bei -20 ° C, wenn die Analysewerden zu einem späteren Zeitpunkt durchgeführt. </li></ol></li><li> 16S-rRNA-Gen-Sequenzierung und Analyse der DNA-Sequenz ANMERKUNG: Führen Sie Analysesequenz auf einem automatischen Sequenzer (Werkstoff - Tabelle). Der Sequenzer hier ist ein automatisiertes Fluoreszenz-basierten Kapillar - Elektrophorese - System , das gleichzeitig vier Proben analysiert (50 cm 4-Kapillar - Array) mit einem flüssigen Polymer 67 (Abbildung 1c). <ol><li> Legen Sie die Mikrotiterplatte im Sequenzer. Schreibe eine Probenblatt (Plattensatz) wie in 2 gelegt, speichern und starten Sie die Sequenzierung run / Analyse im Anschluss an die angegebenen Schritte in 1. HINWEIS: Die Dauer einer Sequenz Lauf ist 2 Stunden und liefert Daten von 800 bis 1.000 bp. </li><li> Öffnen Sie die Sequenzanalyse - Software (Werkstoff - Tabelle). Die Sequenzdaten werden als Textdatei (.seq) und eine Datei mit dem Elektropherogramm einschließlich Qualitätswerte (QV) (.ab1) gegeben. HINWEIS: Basistelefonie ist automatisch perdurch die Sequenzanalyse - Software gebildet und die darunter liegende Elektropherogramm wird visuell überprüft (beispielsweise die Peakhöhe, Peaktrennung) vor der Sequenz wird für weitere Anwendungen eingesetzt. </li><li> Vergleichen Sie die gespeicherten DNA-Sequenz-Datei in der NCBI-nr Datenbank mit BLAST-Algorithmus (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide). </li></ol></li></ol> 5. MALDI-TOF MS HINWEIS: Das Massenspektrometer verwendet eine 337 nm N &amp; sub2 ; -Laser und wird durch eine spezifische Steuerungssoftware (Materials Table) betrieben. Spektren werden im linearen Modus und einen Massenbereich zwischen 2.000 bis 20.000 aufgezeichnet Da bedeckt ist. Dateninterpretation und Zuteilung von Noten zu den Proben wird in Echtzeit durch eine Analyse - Software (Materials Table) (1d) durchgeführt. <ol><li> Herstellung von Bakterien für MALDI-TOF-MS-Analyse <ol><li> Wachsen die Bakterien von Interesse (zB Myroides odoratimimus) auf dem Columbia Blutagar mit 5% Pferdeblut bei 37 ° C für 18 bis 24 h, je nach Bakterienstamm (Abbildung 2a). Führen Gram-Färbung der Morphotyp des Organismus unter Untersuchung sowie Reinheit der Kultur zu überprüfen. </li><li> Verwenden Sie einen Zahnstocher für eine einzelne Bakterienkolonie zu einer Vertiefung einer 96-Well - Stahl Ziel übertragen (Abbildung 2b und 2c). Spot 1 ul 70% iger Ameisensäure auf der Oberseite der Luft getrocknet Organismus auf dem Stahl Ziel und nach etwa 2-3 min trocknen. </li><li> Dann überlagert die Stelle mit 1 &amp; mgr; l Matrix - Lösung, enthaltend 50 mg / ml CHCA (α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure) in einem organischen Lösungsmittel (50% Acetonitril, 2,5% Trifluoressigsäure, 47,5% H 2 O). HINWEIS: Die Säure-Overlay-Verfahren (auf Plattenherstellungsverfahren) kann die Qualität der Massenspektren zu verbessern verwendet werden. Es hat sich für Gram-positive Bakterien, wie eine &quot;Säureangriff&quot; erhöht sich die Punktzahl va gezeigtLues der gemessenen Spektren 45. HINWEIS: Alternativ kann ein automatisiertes Probenvorbereitungssystem (Materials Table) kann in dem kontaktlos spots von 1 &amp; mgr; l 70% -iger Ameisensäure - Lösung und nach einem ersten Trocknungszyklus, 1 ul Matrixlösung auf dem Bakterien smear angewendet werden. Die Proben werden dann unter standardisierten Bedingungen bei 60% relativer Luftfeuchtigkeit getrocknet und sind bereit für die Analyse zu verwenden. </li><li> Lassen Sie den Abstrich mit Matrix der Luft trocknen wieder für ca. 5 min in einer Haube überlagert. Diese bakterielle Abstrich mit der Matrix aufgebracht ist jetzt stabil für viele Stunden. HINWEIS: Bakterielle schmiert ohne Matrix nicht stabil sein kann aufgrund von Proteinabbau. </li></ol></li><li> Die Durchführung der MALDI-TOF-MS-Analyse <ol><li> Einführung von Proben <ol><li> Öffnen Sie die Steuerungssoftware unserer MMIS (Werkstoff - Tabelle). </li><li> Belüften der Probenladeöffnung des Massenspektrometers durch Drücken der IN / OUT-Taste des Gerätes. </li><li> Öffnen Sie die Ladeöffnung nach einem Klick und legen Sie die MALDI-TOF-MS-Zielplatte mit dem getrockneten bakteriellen Abstrich und Matrix. </li><li> Schließen Sie den Hafen und evakuieren wieder. Beachten Sie Vakuum und bei Erreichen des 4,5 x 10 -6 mbar Messung starten. </li></ol></li><li> Probenanalyse <ol><li> Öffnen Sie die Analysesoftware unserer MMIS (Werkstoff - Tabelle) und klicken Sie auf das Menü &quot;Datei&quot;. Wählen Sie &quot;Neu-Klassifizierung&quot; und ein neues Fenster &quot;MALDI Biotyper Klassifikation Assistent Echtzeit&quot; wird geöffnet. Geben Sie den Namen des Projekts, zum Beispiel &quot;Myroides Messung project_1, im Bereich&quot; Projektname &quot;und drücken Sie die Schaltfläche&quot; Neu &quot;. Unter dem neuen Dialogfeld mit dem Namen&quot; Neues Projekt &quot;Check Projektnamen und gehen Sie durch Drücken der Taste&quot; OK &quot;. </li><li> In der &quot;MALDI Biotyper-Klassifikation Assistent Echtzeit&quot; beachten Sie die &quot;Analyte Platzierung&quot; Fenster geöffnet. Wählen Sie Zielpositionen (zB A1, A2, A3 ...) mit der rechten click jede gewählte Position (mit einem blauen Quadrat gekennzeichnet) und wählen Sie &quot;Proben&quot;. In der automatisch geöffnet Tabellenansicht Art der Probenname, Proben-ID und optional einen Kommentar. Klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Weiter&quot;, um fortzufahren. </li><li> In der &quot;MALDI Biotyper-Klassifikation Assistent Echtzeit&quot; beachten Sie die &quot;Auswahl der MALDI Biotyper-Methoden&quot; Fenster zu öffnen. Wählen Sie &quot;Bruker Taxonomy&quot; von &quot;MSPs von Taxonomie Bäume&quot; und klicken Sie auf &quot;Weiter&quot;, um fortzufahren. </li><li> In der &quot;MALDI Biotyper-Klassifikation Assistent Echtzeit&quot; beachten Sie die &quot;Projektübersicht&quot; Fenster zu öffnen. Überprüfen Sie die Einträge eingefügt oben für die eigentliche Klassifizierung Projekt. Starten Sie die Klassifizierung laufen durch Drücken der Taste &quot;Finish&quot; (2d - f). Die Messung wird automatisch gestartet, wenn das entsprechende Vakuum erreicht ist. </li><li> Folgen Sie der Klassifizierung laufen, bis die Messung erfolgreich abgeschlossen. Sehen Sie sich die Ergebnistabelle in ter &quot;MALDI Biotyper Realtime Klassifizierung Projekt Myroides Messung project_1&quot; öffnen Sie das Menü &quot;Ansicht&quot; und klicken Sie auf &quot;Ergebnisse&quot;. </li><li> Sehen Sie sich die &quot;Bruker Daltonics MALDI Biotyper Klassifikation Ergebnisse&quot; als HTML-Datei im Standard-Web-Browser. Drucken und die Ergebnisse speichern. </li></ol></li><li> Messen Sie einen Teststandard täglich vor Analyse zu probieren das Gerät zu kalibrieren und Gerätevalidierung wöchentlich durchführen (Geräteselbsttest). HINWEIS: Bei der Messung MALDI-TOF - Spektren werden in Echtzeit durch die Analysesoftware (Materials Table) analysiert. Eine Liste von zehn Arten mit ihren jeweiligen Noten gegeben und wird in das Laborinformationssystem (LIS) für die Berichterstattung eingespeist. </li><li> Kritisch zu bewerten die MALDI-TOF MS-Ergebnisse (siehe repräsentative Ergebnisse) und gegebenenfalls auch andere Tests, wie biochemical- und Antibiotikaempfindlichkeitsprofile oder 16S-rRNA-Gen-Sequenzierung und, falls erforderlich, Gram-Färbung füreiner Bakterienart auf die mikrobiologische Bericht zuordnen. </li></ol></li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Sowohl MALDI-TOF MS und 16S-rRNA-Gen-Sequenzierung bieten die Möglichkeit, eine große Anzahl von verschiedenen Bakterien zu identifizieren. MALDI-TOF-MS ist eine schnelle und kostengünstige Methode, die leicht zu handhaben und große Datenbanken von bakteriellen Massenspektren zur Verfügung. Aus diesem Grund ist MALDI-TOF MS eine schnelle, kostengünstige und zuverlässige Methode zum Screening Studien konzentrierten sich auf seltene bakterielle Pathogene 17,20,39,51 zuführen. In einer prospektiven Studie MALDI-...

Sichere Identifizierung von seltenen Krankheitserregern in der Routinediagnostik wird durch die Tatsache erschwert, dass die klassische kulturelle und biochemische Methoden sind umständlich und manchmal fragwürdig. Darüber hinaus hat ein diagnostisches mikrobiologischen Labor eine große Anzahl von Krankheitserregern zu verarbeiten, von ein paar hundert bis zu mehreren tausend hin, täglich, die die Verwendung von automatisierten Systemen erfordert. Zusätzlich zu der Verwaltung eines hohen Tagesdurchsatz, die genaue Identifizierung von Bakterienspezies erforderlich. Dies ist gerechtfertigt , da sie in ihrer antimikrobiellen Empfindlichkeitsmuster unterscheiden und damit die korrekte Identifizierung liefert dem Arzt wichtige Informationen geeigneten Antibiotika zu wählen (zB Enterococcus spp., Acinetobacter spp.) 12,43. Automatisierte mikrobiellen Identifizierungssysteme (AMIS) gelten standardisierte Sätze von enzymatischen Reaktionen, die metabolischen Eigenschaften von bakteriellen Isolate zu charakterisieren <sup&gt; 13,15,16,26,27. Obwohl die in diesen Systemen verwendeten Patronen verwenden , um eine große Anzahl von verschiedenen biochemischen Reaktionen, zum Beispiel 47 in der GN - Karte der AMIS in dieser Studie verwendeten 52, diese Strategie erlaubt eine sichere Identifikation nur für eine begrenzte Anzahl von Bakterien. Weiterhin wird die Datenbank, ein fortschrittliches Expertensystem fokussiert klar auf der Erfassung der relevanten und hoch relevanten Bakterien von medizinischer Bedeutung 13,15,16,36. Zwei weitere Systeme, die weithin in Laboratorien verwendet werden, gelten auch für diese biochemische Ansatz zur Identifizierung von Bakterien. Jüngste Studien zeigen eine vergleichbare Identifikationsgenauigkeit zwischen den Amis in dieser Studie und einer der Wettbewerber verwendet (93,7% bzw. 93,0%), während die 3. AMIS eine Identifikationsgenauigkeit von nur 82,4% hat auf Art 35 nivellieren. Solche Abweichungen können von der Qualität der zugrunde liegenden Identifikationsdatenreferenzen, die Versionen von Kits und Software, Unterschiede in metabo erklärt werdenlism und Kenntnisse des technischen Personals 35,36. Zwei automatisierte MALDI-TOF-MS-Systeme (MALDI-TOF mikrobiellen Identifizierungssystem, MMIS) werden hauptsächlich verwendet. Diese Systeme ermöglichen die Erfassung einer großen Anzahl von Bakterienspezies auf der Grundlage ihrer Protein Fingerabdruck-Massenspektren. Zum Beispiel verwendet die Datenbank des MMIs enthält 6,000 Referenzspektren. Identifikationssysteme basierend auf Massenspektrometrie bieten schnelle und zuverlässige Detektion einer Vielzahl von Mikroorganismen , einschließlich seltene Erreger 11,48,51. Bis heute sind nur wenige direkte Vergleiche zwischen den verfügbaren MMIS in dieser Studie und der Wettbewerber verwendet 19,33. Gemäß Daek et al. Beide Systeme bieten eine ähnlich hohe Rate der Identifikationsgenauigkeit, aber die in dieser Studie verwendet MMIs scheint in Speziesidentifizierung 19 zuverlässiger zu sein. In ähnlicher Weise Adressieren molekulare Techniken gut konserviert, sondern auch verschiedene Gene ( <em&gt; zB 16S rDNA oder rpoB) ermöglichen eine eindeutige Identifizierung von Arten 3,22,61. Unter diesen ist die 16S - rDNA der am häufigsten verwendete Housekeeping - Gen wegen seiner Präsenz in allen 34 Bakterien. Seine Funktion unverändert bleibt und schließlich mit etwa 1500 bp, das lang genug ist , für Bio-Informatik 14,34 eignen. Viele Forscher betrachten 16S rRNA - Gen - Analyse als &quot;Gold-Standard&quot; für die Identifizierung von Bakterien 21. Dies ist aufgrund der Tatsache , dass nur wenige Laboratorien DNA-DNA - Hybridisierungstechniken bisher zur Identifizierung von seltenen oder neue Bakterien 14,34 verwenden. Darüber hinaus werden immer mehr Datenbanken verfügbar , die für die 16S - rRNA - Gen - Analyse 50 verwendet werden kann. Sie hat jedoch berücksichtigt werden, dass 16S rDNA basierten Detektionssystemen haben eine begrenzte Empfindlichkeit gegenüber Standard-PCR-Protokolle. Darüber hinaus ist die molekulare Ansatz anspruchsvoll, zeitaufwendig und erfordert gut ausgebildetes Personal sowiegewidmet Laboreinrichtungen und ist daher nicht so leicht in die Routinediagnostik implementiert 55. Darüber hinaus hat es sich gezeigt, dass die Kombination von mindestens zwei verschiedenen Methoden der Bakterienidentifikation zur hochgenauen Dehnungs Identifizierung führt. Die Kombination von MALDI-TOF MS und 16S-rDNA-Sequenzierung erlaubt die Identifizierung einer großen Anzahl von verschiedenen Bakterienspezies mit hoher Genauigkeit. Vor kurzem hat die Kombination von MALDI-TOF - MS und 16S rRNA - Gen - Analyse wurde 56 zur Identifizierung von Bakterien studieren epidemiologische Fragestellungen und seltene Krankheitserreger vorgestellt.

<table><tbody><tr><td>CHROMASOLV, Wasser in HPLC-Qualität, 1 L</td><td>Sigma-Aldrich Chemie, M&uuml; nchen, Deutschland</td><td>270733</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Lyser LT</td><td>Qiagen, Hilden, Deutschland</td><td>85600</td><td>Oszillierender Homogenisator</td></tr><tr><td>Glasperlen 1,0 mm</td><td>VWR International, Darmstadt, Deutschland</td><td>412-2917</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer 5436</td><td>Eppendorf, Hamburg, Deutschland</td><td>2050-100-05</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit (250)</td><td>Qiagen, Hilden, Deutschland</td><td>51306</td><td></td></tr><tr><td>Taq PCR Core Kit (1.000 U)</td><td>Qiagen, Hilden, Deutschland</td><td>201225</td><td></td></tr><tr><td>Forward Primer TPU1 (5&-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')</td><td>biomers.net, Ulm, Deutschland&nbsp;</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Reverse Primer RTU4 (5&akut;-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3&akut;)</td><td>biomers.net, Ulm, Deutschland&nbsp;</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler&nbsp;</td><td>Eppendorf, Hamburg, Deutschland</td><td>-&nbsp;</td><td>Thermocylcer</td></tr><tr><td>Reaktionsgefäß 1,5 ml</td><td>SARSTEDT, N&uuml; mbrecht, Deutschland</td><td>72.692</td><td></td></tr><tr><td>Reaktionsgefäß 2 ml</td><td>SARSTEDT, N&uuml; mbrecht, Deutschland</td><td>72.693.005</td><td></td></tr><tr><td>PCR 8er-CapStrips</td><td>Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Deutschland</td><td>711040X</td><td></td></tr><tr><td>PCR 8er-SoftStrips</td><td>Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Deutschland</td><td>711030X</td><td></td></tr><tr><td>Sharp R-ZV11&nbsp;</td><td>Sharp Electronics, Hamburg, Deutschland</td> <td>-</td> <td>Mikrowellen-Titriplex</td></tr><tr><td>III (EDTA Na2-Salz-Dehydrat; 1 kg)</td><td>Merck, Darmstadt, Deutschland</td><td>1084211000</td><td></td></tr><tr><td>SeaKem LE Agarose</td><td>Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Deutschland</td><td>849006</td><td></td></tr><tr><td>SmartLadder SF - 100 bis 1.000 bp</td><td>Eurogentec, L&uuml; ttich, Belgien</td><td>MW-1800-04</td><td></td></tr><tr><td>Bromphenolblau (25 g)</td><td>Sigma-Aldrich Chemie, M&uuml; nchen, Deutschland</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>Xylolcyanol FF (10 g)</td><td>Sigma-Aldrich Chemie, M&uuml; nchen, Deutschland</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>ComPhor L Maxi&nbsp;</td><td>Biozym, Hessisch Oldendorf,</td> <td>Deutschland-Ethidiumbromid-Lösung</td><td></td></tr> <tr><td>1% (10 ml)</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland</td><td>2218.1</td><td></td></tr><tr><td>Gel Doc 2000</td><td>Bio-Rad Laboratories, M&uuml; nchen,</td><td></td> <td>Deutschland-Gel-Dokumentationssystem&nbsp;</td></tr><tr><td>ExoSAP-IT (500 Reaktionen)</td><td>Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, Vereinigtes Königreich</td><td>78201</td><td></td></tr><tr><td>Puffer (10x) mit EDTA&nbsp;</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Deutschland</td><td>402824</td><td></td></tr><tr><td>BigDye Terminator Kit v1.1</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Deutschland</td><td>4337450</td><td></td></tr><tr><td>Hi-Di Formamid (25 ml)</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Deutschland</td><td>4311320</td><td></td></tr><tr><td>DyeEx 2.0 Spin Kit (250)</td><td>Qiagen, Hilden, Deutschland</td><td>63206</td><td></td></tr><tr><td>3130 Genetic Analyzer</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Deutschland</td><td>-</td><td>Sequenzer</td></tr><tr><td>MicroAmp optische 96-Well-Reaktionsplatte mit Barcode</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Deutschland</td><td>4306737</td><td></td></tr><tr><td>3130 Genetic Analyzer, Plattenbasis 96-Well</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Deutschland</td><td>4317237</td><td></td></tr><tr><td>3130 Genetic Analyzer, Plattenhalter 96-Well</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Deutschland</td><td>4317241</td><td></td></tr><tr><td>3130 Genetic Analyzer, well Plattensepten</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Deutschland</td><td>4315933</td><td></td></tr><tr><td>3130 Genetic Analyzer, POP-7 Polymer, 7 ml</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Deutschland</td><td>4352759</td><td></td></tr><tr><td>3130 Genetic Analyzer, 4-Capillary Array, 50</td><td>cm Life Technologies, Darmstadt, Deutschland</td><td>4333466</td><td></td></tr><tr><td>Sequencing Analysis Software 5.4</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Deutschland</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>microflex</td><td>Bruker Daltonik, Bremen,</td> <td>Deutschland-Unser</td> <td>mMIS</td></tr><tr><td>VITEK MS</td><td>bioM&eacute; rieux, N&uuml; rtingen, Deutschland&nbsp;</td><td></td><td>2nd mMIS</td></tr><tr><td>flexControl 3.4</td><td>Bruker Daltonik, Bremen,</td> <td>Deutschland-Software</td> <td>zur Gerätesteuerung</td></tr><tr><td>Biotyper Realtime Classification 3.1 (RTC)</td><td>Bruker Daltonik, Bremen,</td> <td>Deutschland-Analysesoftware</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Cyano-4-hydroxyzimtsäure, HCCA, 1&nbsp; g</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, Deutschland</td><td>201344</td><td></td></tr><tr><td>Peptid-Kalibrierstandard II</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, Deutschland</td><td>222570</td><td></td></tr><tr><td>MSP 96 Target polierter Stahl</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, Deutschland</td><td>8224989</td><td></td></tr><tr><td>peqGREEN</td><td>peqlab&nbsp;</td><td>37-5010</td><td></td></tr><tr><td>MALDI Biotyper Galaxie&nbsp;</td><td>Bruker Daltonik, Bremen, Deutschland</td><td>Art.-Nr. 1836007&nbsp;</td><td>Automatisiertes Probenvorbereitungssystem</td></tr><tr><td>Vitek 2&nbsp;</td><td>bioM&eacute; rieux, N&uuml; rtingen, Deutschland&nbsp;</td><td></td><td>Unser aMIS</td></tr><tr><td>MicroScan&nbsp;</td><td>Beckman Coulter, Krefeld, Deutschland</td><td></td><td>2nd aMIS</td></tr><tr><td>BD Phoenix&trade; Automatisiertes Mikrobiologie-System</td><td>BD, Heidelberg, Deutschland</td><td></td><td>3rd aMIS</td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus&nbsp;subsp.&nbsp; aureus&nbsp; Rosenbach (ATCC&reg; &nbsp; 25923&Handel;)</td><td>American Type Culture Collection (ATCC), LGC Standards, Molsheim, Frankreich</td><td></td><td>Positive Kontrolle für PCR&nbsp;</td></tr></tbody></table>

identifizierung von rare bakteriellen erregern von 16s rrna-gen-sequenzierung und maldi-tof-ms

Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS

Es gibt eine Reihe von seltenen und daher unzureichend bakterielle Pathogene beschrieben, die schwere Infektionen berichtet werden insbesondere bei immunsupprimierten Patienten zu verursachen. In den meisten Fällen nur wenige Daten, meist als Fallberichte veröffentlicht, zur Verfügung, die die Rolle solcher Krankheitserreger wie ein infektiöses Agens untersuchen. Daher wird, um die pathogene Charakter solcher Mikroorganismen zu klären, ist es notwendig, epidemiologische Studien durchzuführen, die eine große Anzahl dieser Bakterien umfassen. Die verwendeten Methoden in einer solchen Überwachung Studie haben die folgenden Kriterien erfüllen: die Identifizierung der Stämme hat genau zu sein nach der gültigen Nomenklatur, sollten sie leicht sein (Robustheit), sparsam in der Routinediagnostik zu handhaben, und sie haben zu erzeugen, vergleichbar Ergebnisse unter verschiedenen Labors. Im Allgemeinen gibt es drei Strategien für die Bakterienstämme in einer Routineeinstellung identifiziert: 1) phänotypische Identifizierung der BioChemica charakterisierendenl und metabolischen Eigenschaften der Bakterien, 2) Molekulartechniken wie 16S rRNA-Gen-Sequenzierung und 3) Massenspektrometrie als neuartige Proteom basierten Ansatz. Da Massenspektrometrie und molekularen Ansätzen die vielversprechendsten Mittel zur Identifizierung einer Vielzahl von Bakterienarten sind, sind diese beiden Methoden beschrieben. Die Fortschritte, Grenzen und mögliche Probleme bei der Anwendung dieser Techniken werden diskutiert.

MALDI-TOF-MS ist eine neue, schnelle und kostengünstige Methode für die mikrobiologische Routinediagnostik. Bakterielle Artbestimmung durch MALDI-TOF - MS - Spektren produziert hauptsächlich aus ribosomalen Proteinen zusammengesetzt , sondern auch andere &quot;sehr konservierten Proteinen mit Housekeeping Funktionen beeinträchtigt in geringem Umfang durch die Umgebungsbedingungen&quot; 17 .Die Datenbank dieser MMIS enthält eine große Menge von Referenzspektren und sogar Bakter...

Matrixgestützte Laserdesorption/Ionisationszeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS) und molekulare Techniken (16S rRNA-Gensequenzierung) ermöglichen die Identifizierung seltener bakterieller Krankheitserreger in der Routinediagnostik. Das Ziel dieses Protokolls liegt in der Kombination beider Techniken, die zu genaueren und zuverlässigeren Daten führt.

Identifizierung von Rare bakteriellen Erregern von 16S rRNA-Gen-Sequenzierung und MALDI-TOF-MS

There are a number of rare and, therefore, insufficiently described bacterial pathogens which are reported to cause severe infections especially in ...

Das übergeordnete Ziel dieses MALDI-TOF-Massenspektrometrie-Protokolls besteht darin, die Typisierung seltener Krankheitserreger durch ein schnelles und kostengünstiges Verfahren zu verbessern. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der diagnostischen Mikrobiologie zu beantworten, da sie eine schnelle Identifizierung seltener bakterieller Pathogene ermöglicht. Heute möchten wir über Odoratimimus und Bakterien der Gattung Myroides sprechen.Um die Methode zu demonstrieren und über die Interpretation der Ergebnisse zu sprechen. Im Allgemeinen könnten Personen, die neu in dieser Methode sind, dies als schwierig empfinden, da die Übertragung von Bakterien, die Überlagerung mit Metriken und die Interpretation der Ergebnisse technische Fähigkeiten und mikrobiologisches Fachwissen erfordern. Wir hatten erstmals die Idee, MALDI-TOF MS zur Untersuchung seltener Bakterien einzusetzen, als wir einen Patienten in unserem Krankenhaus hatten, der an einer diabetischen Fußinfektion litt, verursacht durch Myroides odoratimus.Beginnen Sie dieses Protokoll mit der Extraktion bakterieller DNA, der 16S-ribosomalen DNA-PCR und der Sanger-Sequenzierung, wie im Textprotokoll beschrieben. Ve

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Die Anwendung der Matrix-unterstützten Laserdesorption / Ionisation Flugzeit (MALDI-TOF)-Massenspektrometrie (MS) direkt an Blutkulturbrühe beschleunigt die Identifizierung von Bakterien. Das vorgestellte Verfahren ist ein schnelles und zuverlässiges Verfahren zur Identifizierung von Gram-negativen Bakterien direkt aus Blutkulturbrühe.

Schnelle Identifizierung von Gram-negativen Bakterien aus Blutkulturbrühe unter Verwendung von MALDI-TOF-Massenspektrometrie

Diese Arbeit beschreibt Verfahren zur schnellen Identifizierung von Bakterien mittels MALDI-TOF MS. Zu den Identifizierungsverfahren gehören die Erfassung des Spektrums, der Aufbau einer Datenbank und Folgeanalysen. Es werden zwei Identifizierungsmethoden vorgestellt, die auf dem Ähnlichkeitskoeffizienten und die auf Biomarkern basierende Methode.

Die Verwendung von MALDI-TOF-Massenspektrometrie und einer Kundendatenbank zu den Bakterien Indigene auf eine einzigartige Höhle Umwelt (Kartchner Caverns, AZ, USA) Charakterisieren

Die Massenspektrometrie-basierte phyloproteomics (MSPP) wurde verwendet , um eine Sammlung von Campylobacter jejuni ssp geben. Doylei isoliert auf Stammebene im Vergleich zu multilocus Sequenz Typisierung (MLST).

Subtyping von<em&gt; Campylobacter jejuni</em&gt; Ssp.<em&gt; doylei</em&gt; Massen Isolaten Spectrometry-basierte PhyloProteomics (MSPP)

Dieses Manuskript beschreibt ein detaillierte standardisierte Protokoll von Hochdurchsatz-16 s rRNA-Amplifikate Sequenzierung. Das Protokoll stellt eine integrierte, uniformierte Machbare und preiswerte Protokoll Kotprobe Sammlung durch Datenanalysen ab. Dieses Protokoll ermöglicht die Analyse einer großen Anzahl von Proben mit strengen Standards und mehrere Steuerelemente.

Geführte Protokoll für fäkale mikrobielle Charakterisierung von 16 s rRNA-Amplifikate Sequenzierung

IDBac ist eine Open-Source-Pipeline für Massenspektrometrie, die Daten sowohl aus intakten Proteinen als auch aus spezialisierten Metabolitenspektren integriert, die auf Zellmaterial gesammelt werden, das aus Bakterienkolonien abgekratzt wurde. Die Pipeline ermöglicht es Forschern, schnell Hunderte bis Tausende von Bakterienkolonien in vermeintliche taxonomische Gruppen zu organisieren und sie auf der Grundlage der spezialisierten Metabolitenproduktion weiter zu differenzieren.

Verwendung der Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline zur Analyse von mikrobiellen Protein- und Spezialisierten Metabolitendaten

Hier wird ein vereinfachtes Standard-Betriebsverfahren für die Mikrobiom-Profilierung mit 16S rRNA metagenomischer Sequenzierung und Analyse mit frei verfügbaren Werkzeugen beschrieben. Dieses Protokoll wird Forschern helfen, die neu im Mikrobiom-Bereich sind, sowie solchen, die Aktualisierungen von Methoden benötigen, um bakterielleS Profiling mit einer höheren Auflösung zu erreichen.

Mikrobiota-Analyse mit zweistufiger PCR- und 16S-rRNA-Gensequenzierung der nächsten Generation

Hier stellen wir ein Protokoll zur schnellen Identifizierung von Proteinen vor, die von genomisch sequenzierten pathogenen Bakterien mittels MALDI-TOF-TOF-Tandem-Massenspektrometrie und Top-Down-Proteomanalyse mit eigens entwickelter Software produziert werden. Metastabile Proteinionen fragmentieren aufgrund der Asparaginsäurewirkung und diese Spezifität wird für die Proteinidentifizierung ausgenutzt.

Identifizierung antibakterieller Immunitätsproteine in Escherichia coli mittels MALDI-TOF-TOF-MS/MS und Top-Down-Proteomanalyse

Dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle und kostengünstige Bewertung der mikrobiellen Zusammensetzung in Milchprodukten durch die Kombination von Kulturwissenschaften mit MALDI-TOF MS. Es liefert Taxonomieergebnisse, die mit der 16S-rRNA-Sequenzierung vergleichbar sind, mit einer kürzeren Durchlaufzeit als herkömmliche Kulturmethoden.

Bewertung der mikrobiellen Sicherheit von Molkereien mittels Bacterial Proteomic Profiling mittels MALDI-Ansatz

Eine einfache Methode zur Identifizierung der prioritären bakteriellen Erregern ist gentechnisch Reporter Phagen verwenden. Diese Reporter-Phagen, die spezifisch für ihre besonderen Wirtsarten sind, sind in der Lage schnell Transduktion eines Biolumineszenz-Signal Antwort auf Wirtszellen. Hier beschreiben wir die Verwendung von Reporter Phagen für den Nachweis...

&quot;Bioluminescent &#39;Reporter Phage für den Nachweis von Kategorie A bakteriellen Erregern

Transparente Zebrafischembryonen haben nützliches Modell Gastgeber zu visualisieren und funktionell Studie Wechselwirkungen zwischen Zellen des angeborenen Immunsystems und intrazelluläre bakterielle Erreger wie...

Die Infektion von Zebrafisch-Embryos mit Intrazelluläre bakterielle Krankheitserreger

Erfahren Sie die Identifizierung seltener bakterieller Erreger mit MALDI-TOF-MS und 16S rRNA-Gen-Sequenzierung. Diese Methode ermöglicht schnelle, kostengünstige Diagnostik in der Mikrobiologie.

Identifizierung von Rare bakteriellen Erregern von 16S rRNA-Gen-Sequenzierung und MALDI-TOF-MS

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