Name: Studieren der Stöchiometrie der Epidermal Growth Factor Receptor in intakten Zellen mit korrelative Mikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Lernen Sie die Visualisierung der EGFR-Stöchiometrie in intakten COS7-Zellen mittels korrelativer Fluoreszenz- und Elektronenmikroskopie. Diese Methode ermöglicht Einblicke in die Rezeptoraktivierung auf Einzelmolekülebene.

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Wir danken E. Arzt für seine Unterstützung durch INM, M. Koch für die Hilfe beim ESEM und DENS Solutions für die Bereitstellung der Mikrochips. Die Forschung wird teilweise durch den Leibniz-Wettbewerb 2013 gefördert.

1. Vorbereitung der Kennzeichnung und Fixierungsreagenzien <ol><li> Vorbereitung Markierungspuffer (BSA-GEL-PBS) unter Verwendung autoklaviert phosphatgepufferter Salzlösung, pH 7,4 (PBS). Supplement mit 1% BSA (Rinderalbuminfraktion V, Biotin-frei) und 0,2% Gelatine (GEL, aus Kaltwasserfischen Haut) und Wirbel / gut schütteln. Hinweis: Kann für ~ 5 Tage bei 4 ° C gelagert werden. </li><li> Vorbereitung Waschpuffer (BSA-PBS) von autoklaviertem phosphatgepufferter Salzlösung, pH 7,4. Supplement mit 1% BSA und Vortex / gut schütteln. Hinweis: Kann für ~ 5 Tage bei 4 ° C gelagert werden. </li><li> Bereiten Sie 50 mM Boratpuffer (BB) von 200 mM Borsäure Stammlösung, pH-Wert auf 8,3 mit 200 mM Natriumtetra eingestellt. Hinweis: Kann für ~ 12 Monate bei 4 ° C gelagert werden. </li><li> Bereiten 0,1 M Cacodylatpuffer (CB) von 0,2 M Natriumcacodylat Stammlösung, pH-Wert auf 7,4 eingestellt, mit 0,1 M Saccharose ergänzt. Hinweis: Geöffnete Stammlösung kann für ~ 5 Tage bei 4 ° C gelagert werden. </li><li> Vorbereitung 0,1 M Glycin in PBS (GLY-PBS). Hinweis: Kann für ~ 2 Monate bei 4 ° C gelagert werden. </li><li> Bereiten Sie 3% Paraformaldehyd in CB (3% PFA) aus frisch zubereiteten oder geöffneten Fläschchen von 16% PFA, Stammlösung, EM Klasse. Hinweis: Geöffnete Stammlösung kann für ~ 5 Tage bei 4 ° C gelagert werden. </li><li> Bereiten Sie 2% Glutaraldehyd in CB (2% GA) aus frisch zubereiteten (oder geöffneten Fläschchen) 25% GA-Stammlösung, EM Klasse. Hinweis: Geöffnete Stammlösung kann für ~ 5 Tage bei 4 ° C gelagert werden. </li><li> Bereiten 300 nM EGF-Biotin-Markierungslösung <ol><li> Verdünnen Sie 6 um EGF-Biotin-Stammlösung in BSA-GEL-PBS, mit einem Volumen von 100 bis 200 &amp; mgr; l pro Mikrochip. Verwenden Sie innerhalb von ein paar Stunden. </li></ol></li><li> Bereiten Sie 10 nM STR-QD Markierungslösung <ol><li> Zentrifugieren Sie die Streptavidin-QD-Stammlösung für 4 min bei 8000 · g, nehmen Stand und verdünnt 1:10 in BB. Verschiedene Arten von Quantenpunkten verwendet werden kann, beispielsweise QD655 oder QD800. Zu verdünnen, um Endkonzentration in BSA-GEL-PBS, verwenden 75-100 ul pro Mikrochip. Verwenden Sie innerhalb vonein paar Stunden. </li></ol></li></ol> 2. Herstellung der Siliziumnitridmembran Mikrochips <ol><li> Reinigen eines Mikroskopobjektträger aus Glas, wie für die Lichtmikroskopie verwendet wird, mit einem Reinraum Gewebe und Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) Äthanol. </li><li> In einer laminaren Luftstroms Werkbank mit einem niedrigen Staubgehalt, öffnen Sie einen Durchmesser von 100 mm Petrischale, und legen Sie die gereinigten Objektglas in die Schüssel; lassen Sie das Gericht offen. </li><li> Mit sauberen Pinzette, bevorzugt mit Kohlefaser oder anderen Beschichtung beschichtet ist, nehmen Sie 4-10 Mikrochips mit dünnen (50 nm) Siliziumnitrid-Membranen, eine nach der anderen, aus ihrer Aufbewahrungsbox und auf den Objektträger. Besorgen Sie sich die Mikrochips sanft an ihren Seiten und berühren Sie die fragile Oberseite, die aus dem dünnen Siliziumnitrid-Membran. Achten Sie unbedingt auf immer die Membranseite und berühren Sie sie nicht. Hinweis: Die Mikrochips sollten rechteckig sein und flachen Kanten senkrecht zu ihrer Siliziumnitrid abgedecktstellen, so dass sie leicht gegriffen werden kann. </li><li> Schließen Sie den Deckel der Petrischale und bringen sie zu einem Abzug. Holen Sie sich einen neuen Reinraumgewebe und legen sie neben der Petrischale. Bereiten Sie zwei saubere 200 ml Glasbecher, indem man mit 50-70 ml Aceton, und die andere mit einem ähnlichen Volumen Ethanol, beide HPLC-Qualität. Übertragen Sie die Mikrochips von der Glasobjektträger zunächst auf die Reinraumgewebe. </li><li> Aus dem Gewebe übertragen Mikrochips eines nach dem anderen in das erste Becherglas mit Aceton zur Entfernung der Schutzlackschicht. Warten Sie 2 Minuten, während sanft bewegten das Becherglas ein paar Mal, um sicherzustellen, dass die Mikrochips sind gut gespült. </li><li> Übertragen Sie die Mikrochips direkt in das Becherglas mit Ethanol, ohne sie auszutrocknen. Warten Sie 2 Minuten. Dann übertragen Sie den Becher auf die laminare Luftströmung Werkbank. Holen Sie sich einen neuen Reinraumgewebe. </li><li> Übertragen Sie die Chips auf das Gewebe und lassen Sie sie für ein paar Minuten trocknen. Übertragen Sie die Mikrochips auf den Objektträger in der Petrischale, schließen Sie das Gericht,und bringen sie in die Plasmareiniger. </li><li> Hinterlegung der Glasobjektträger mit den Mikrochips in das Plasma Reiniger. Ausführen eines 5 min Reinigungsprogramm, um die Oberfläche des Siliziumnitrid-Membran hydrophil zu machen. Hinweis: für unsere Plasmareiniger angewendet Geeignete Einstellungen sind: 70 mTorr Gasstrom von 11,5 sccm für O 2 und 35,0 sccm für Ar, 50 W vorne Radiofrequenz (RF) Ziel, 5 W HF-Bereich und max. reflektierte RF. </li><li> Setzen Sie den Glasobjektträger mit dem Mikrochip in die Petrischale, und schließen Sie den Deckel. Achten Sie darauf, um die Mikrochips sterilen von nun an zu halten. </li><li> Untersuchen Sie die Fensterflächen der Mikrochips unter einem Lichtmikroskop nach möglichen Membranbruch und Restschmutzpartikel. </li><li> Bringen Sie die Petrischale auf die laminare Luftströmung Werkbank. </li><li> Legen Sie die folgenden Elemente in der laminare Luftströmung Workbench: Rohre / Flaschen mit sterilisiert 0,01% Poly-L-Lysin-Lösung (. PLL, Molekulargewicht 150.000-300.000, steril filtriert und Zellkultur getestet), HPLCreines Wasser, Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum, DMEM ohne Serum, einem Reinraum Gewebe einer sterilen 24-Well-Platte (eine Platte mit 12 Vertiefungen können ebenfalls verwendet werden), einen sterilen 96- ergänzt Well-Platte, sterile Pipettenspitzen, eine Pipette, und flache, abgerundete Spitze, Pinzette. </li><li> Nehmen Sie die 24-Well-Platte, und füllen Sie einen gut mit PLL und zwei Brunnen mit HPLC-Wasser, verwenden Sie eine ca. Volumen von 1 ml pro Vertiefung. Nehmen Sie die 96-Lochplatte und füllen Sie für jeden Mikrochip zwei Brunnen mit Serum DMEM und ein gut mit serumfreiem DMEM, verwenden Sie eine ca. Volumen von 200 ul pro Vertiefung. </li><li> Von nun an mit Hilfe einer Pinzette mit sterilem Tipps, um die Mikrochips zu handhaben. Dies erreichen, zum Beispiel, indem Sie kurz flammenden und anschließend Abkühlung die Spitzen der Pinzette. </li><li> Zuerst übertragen Sie die Mikrochips von der Glasobjektträger auf die Reinraumgewebe. Aus dem Gewebe, Transfer bis zu sechs Mikrochips in die PLL-gefüllte gut, bebrüten die Mikrochips für 5 min. Nichte: Bei einem Experiment mit mehr Mikrochips, füllen weitere Bohrungen im 24-Well-Platte. </li><li> Die Mikrochips Anschließend spülen, indem man sie, einer nach dem anderen, in die erste wassergefüllten gut, und von dort in die zweite Wanne mit Wasser gefüllt. Die Mikrochips in das Wasser länger als etwa eine Minute zu lassen Sie nicht auf die Entfernung von PLL zu vermeiden. </li><li> Schließlich legen Sie sie einzeln in die DMEM gefüllten Wells der 96-Well-Platte. Speichern die 96-Well-Platte im CO 2 kultiviert, bis die Zellsuspension wird hergestellt. </li></ol> 3. Herstellung von Zellen, die auf Mikrochips <ol><li> Führen eine Subkultur von COS7-Zellen, um eine Zellsuspension mit einer Konzentration von ca. vorzubereiten. 5 × 10 5 Zellen / ml. Achten Sie darauf, die Zellen monodisperse. </li><li> Nehmen Sie die 96-Loch-Platte mit den Mikrochips, und fügen Sie einen Tropfen der Zellsuspension in jedes Mikrochip. Warten Sie 5 min. </li><li> Start in den Fensterbereichen der Mikrochips mit einem inversen Mikroskop untersuchen, um choose rechten Augenblick zur Übertragung in ein neues und mit serumfreiem DMEM. Anmerkung: Eine gute Dichte der Zellen mit etwa einer Zelle pro 2500 &amp; mgr; m 2 Fläche erreicht, entsprechend 24 COS7 Zellen auf einer Fenstergröße von 150 x 400 um. Höhere Zelldichten, besteht das Risiko, um eine maximale Abflachung der Zellen zu verhindern. Beachten Sie, dass, nachdem eine Zelle nach unten auf die SIN-Membran angesiedelt, braucht es 3-5 min, um genügend Haftung auf widerschwimm off während der Übertragung in das neue gut entwickelt. </li><li> Übertragen Sie Mikrochip zum nächsten gut, wenn ausreichend Zellen auf das Fenster geklebt. Halten Sie die Mikrochips immer mit den Zellen nach oben und vermeiden Sie jegliche Berührung dieser Seite. </li><li> Nach der Übertragung prüfen jeden Mikrochip-Fenster wieder. Wenn zu viele Zellen wurden gewaschen und die Anzahl der verbleibenden Zellen nicht ausreichend ist, erneut verreiben die Zellsuspension (aufzubrechen neu gebildeten Zellklumpen) und wiederholen Sie die Schritte 3,1-3,5. </li><li> Wenn alle übertragenen Mikrochips genuganhaftenden Zellen auf ihre Fensterflächen, übertragen Sie die Chips in den letzten gut mit serumfreiem DMEM. Legen Sie die Platte mit 96 Vertiefungen in die CO 2-Inkubator und lassen Sie die Zellen zu gewinnen und flach aus für mehrere Stunden, am besten O / N. </li></ol> 4. EGFR Labeling, Fixierung und Fluoreszenzmikroskopie <ol><li> Für die folgenden Schritte, verwenden Sie ein 96-Loch und einer 24-Well-Platte. Pre-fill Wells mit den jeweiligen Lösungen, und verwenden Sie eine Zeile oder Spalte per Mikrochip. Die 24-Well-Platte ist unter dem Abzug für die Fixierung Schritte mit CB, PFA und GA verwendet. Immer übertragen Mikrochips mit den Zellen nach oben und vermeiden Sie jegliche Berührung dieser Seite. </li><li> Mikrochips spülen, indem man die Mikrochips in einem gut mit frischen BSA-GEL-PBS, dann legen Sie Platte mit 96 Vertiefungen in Brutschrank bei 37 ° C für 5 min. </li><li> Inkubieren mit 300 nM EGF-Biotin-Lösung für 3 min bei 37 ° C. Da die Zellen wird die Endozytose von EGF-markierten EGFRs starten, gehen Sie so schnell wie möglich nach Step 4,4. </li><li> Spülen 3 mal mit PBS und 1-mal mit CB (jetzt der 96-Well-Platte wird wieder bei RT). </li><li> Inkubieren in 3% PFA für 10 min. </li><li> Spülen Chips 1 Zeit mit CB, und 3-mal mit PBS. </li><li> Inkubieren in Gly-PBS für 2 Minuten, spülen Sie 2 mal mit 1 Zeit PBS. </li><li> Inkubieren in 10 nM STR-QD 10 min. </li><li> Mit BSA-PBS spülen 4 mal. </li><li> Tauchen Sie einen Mikrochip in einem Glasboden-35-mm-Schale mit BSA-PBS-Fertig bei RT. </li><li> Erwerben Differentialinterferenzkontrast (DIC) Bildern und Fluoreszenzbilder von QD-markierte Zellen. <ol><li> Verwenden Sie ein 40-facher Luft Ziel für Übersichtsbilder der Zellen mit QD655 beschriftet. Verwenden Sie ein Ölimmersionsobjektiv (beispielsweise 63X), um die effizienteste Sammlung des emittierten Fluoreszenzlicht zu ermöglichen; Dies ist insbesondere dann erforderlich, wenn Abbilden Zellen mit QD800 markiert. </li><li> Verwenden Sie einen Filterwürfel, die die QDs zur Fluoreszenzanregung Licht zwischen 340 und 380 nm über 420 nm sui aussetzt und ermöglicht die Erfassung des emittierten LichtsTabelle für die meisten QD (Filter Cube A in diesem Fall). </li><li> Minimieren Sie die Lichtintensität, zu intensives Licht, das die Probe beschädigen könnten. Stellen Sie die Belichtungszeit auf mindestens 300 ms, so dass die Signale aller QDs erfasst, stellt fest, dass die Fluoreszenz der QDs hat eine Blinkverhalten. </li><li> Passen Sie die Lichtintensität und die Verstärkung zu helle Bilder ohne sichtbare Bildrauschen zu schaffen, bei gleichzeitiger Minimierung der Lichtintensität. Hinweis: Alternativ können kürzere Belichtungszeit verwendet, wenn Bildserie werden von der gleichen Region übernommen werden. Diese Serie kann verarbeitet werden, um eine maximale Bildprojektion ergeben, was zu einer Mittelwertbildung und damit Geräuschreduzierung des resultierenden Bildes. </li></ol></li><li> Legen Sie die abgebildeten Mikrochip zurück (Zellen nach oben) in eine Vertiefung einer 96-Well-Platte mit BSA-PBS gefüllt. </li><li> Spülen Mikrochips 1 mal in CB. </li><li> Inkubieren in 2% GA für 10 min. </li><li> Spülen Sie 1 Mal in CB und 3-mal mit BSA-PBS. </li><li> Shop Mikrochips bis ESEM imaging, in BSA-PBS vorgefüllten Vertiefungen einer neuen Platte mit 96 Vertiefungen. Für jeden Mikrochip füllen eine Reihe von vier Vertiefungen mit HPLC-Wasser. Anmerkung: Die Proben können bei 4 ° C mehrere Wochen haltbar, aber die besten Ergebnisse werden erzielt, wenn der vollständige Abbildungsreihe innerhalb von zwei Tagen durchgeführt. QDs wird langsam beginnen, um aus der Probe zu trennen, es wird daher nicht empfohlen, mehr als 10 Tage warten, bevor der ESEM-Bildgebung durchgeführt wird. Anmerkung: Die Fluoreszenzbilder werden für die zukünftige Analyse gelagert. Die Positionen der Zellen in den Bildern kann leicht mit Elektronenmikroskopie Bildern über die Lokalisierung der Ecken des SiN-Fenster und Messen der Positionen relativ zu den Ecken in Beziehung gesetzt werden. Hinweis: Es ist ratsam, Qualitätsfluoreszenzbilder zu drucken und nutzen sie zur Orientierung bei der Aufnahme die ESEM Bilder. </li></ol> 5. Wet ESEM-STEM ganzer Zellen <ol><li> Bereiten Sie die ESEM für nasse STEM <ol><li> Montieren Sie den gasförmigen Sekundärelektronen-detector (GSED) und die Peltier-Stufe, die das STEM-Detektor (unter der Probe entfernt). </li><li> Starten Sie den Kühlwasserstrom durch die Bühne, und die Temperatur um 3 ° C. </li><li> Die Bühne xy-Koordinaten auf Null, und stellen Sie den Arbeitsabstand auf ca. 6 mm. </li></ol></li><li> Während der ESEM-Bildgebung, halten Sie die 96-Loch-Platte mit den Mikrochips zu kühlen, beispielsweise auf gefrorenen Kühlelemente, in einem Styropor-Box. </li><li> Zum Laden einer Probe in die vorgekühlten ESEM-STEM Bühne, nehmen Sie die Platte mit 96 Vertiefungen aus dem Kühlbehälter und legen Sie sie in der Nähe der geöffneten ESEM Bühne. Setzen Sie einen neuen Reinraumgewebe daneben. </li><li> Schnell spülen einen Mikrochip (mit den Zellen nach oben) durch Eintauchen vier Mal, jedes Mal für etwa eine Sekunde, in eine gut mit HPLC-Wasser gefüllt. </li><li> Tupfen Sie die Rückseite des Mikrochips kurz auf die Reinraumgewebe und legen Sie den Mikrochip in den vorgekühlten Bühne. Stellen Sie sicher, dass die Zellen nass bleiben, kann das seindurch eine reflektierende Oberfläche erkannt (Trocknen ergibt eine matte Oberfläche). </li><li> Befeuchten Sie die Probenoberfläche mit 3 ul abgekühlt HPLC-Wasser (stellen Sie sicher, dass Sie die Oberfläche mit der Pipettenspitze berühren), und befestigen Sie die Probe in der Bühne. </li><li> Stellen drei zusätzliche 3 &amp; mgr; l Wassertröpfchen auf der Stufe nahe der Probe. </li><li> Schließen Sie die Probenkammer </li><li> Spülen Sie die Probenkammer durch Aus- und Einschalten der Druck fünf Mal zwischen 800 und 1500 Pa. Beenden Sie das Radfahren mit 800 Pa. </li><li> Schalten Sie den Elektronenstrahl (30 kV) an und untersuchen Sie die Probe unter der niedrigsten Vergrößerung mit beiden Detektoren, dh der GSED und der STEM-Detektor, um für den Standort des Mikrochips Fenster zu suchen. Hinweis: Wenn die Wasserschicht zu dick ist, kann das Fenster nicht sichtbar sein. In diesem Fall starten Absenken des Drucks auf 760 Pa und warten Sie einige Minuten. Das Fenster wird erst mit der GSED sichtbar. </li><li> Positionieren Sie den SiN-Membran-Fenster in der Mitte des Bildes, indem Sie den Specimen Bühne und den Druck auf 750 bis 720 Pa zu reduzieren. Hinweis: Wenn der Wasserschicht dünn genug ist, wird das Fenster auch mit der STEM-Detektor sichtbar. </li><li> Von nun an verwenden die Dunkelfeld-Segment des STEM-Detektor, um Bilder aufzunehmen. Zunächst erwerben ein oder zwei Bilder, die alle Zellen auf der gesamten Fensterfläche. </li><li> Vergleichen Sie diese ESEM Bilder mit der Lichtmikroskopie Bilder, suchen Sie die Ecken des SiN-Fenster. </li><li> Korrelieren die Koordinatensysteme beider Mikroskopie Modalitäten durch den Vergleich der Vergrößerung, Rotation und möglicher Spiegelung. Suchen Sie die gleichen Zellen in beiden Bildern. </li><li> Wählen sehr kleine Schmutzpartikel oder ein Zellenbereich mit kleinen Merkmalen zu Abbildungseinstellungen, wie dem euzentrischen Höhe der Feinorientierung und die Korrektur der Linsen stigmatism einzustellen. Arbeiten bei einer Vergrößerung von mindestens 50.000X verwenden eine Elektronensondenstrom etwa 0,6 nA, einen Pixel-Verweilzeit von 30 us und eine Bildgröße von 1024 x 884 Pixel. Hinweis: Weitere Einstellungen können auch be verwendet wird, solange eine Erhöhung der Elektronendosis vermieden. Hinweis: Auch bei der Arbeit sehr sauber, werden die Chipoberflächen in der Praxis immer enthalten einige Schmutzpartikel, da das Protokoll nicht in einer Reinraumumgebung ausgeführt. </li><li> Um STEM Bilder aus den QD-markierte Zellen aufzeichnen, beziehen sich auf die Fluoreszenzbilder und wählen Sie eine Zelle von Interesse. Hinweis: Es ist am besten, mit einer Zelle, die starke QD Signale starten. </li><li> Nehmen Sie einen Überblick über STEM Bild dieser Zelle. </li><li> Gehen Sie zu einem Randbereich, wo die Zelle Rand ist sichtbar und vergrößern, um 50.000X Vergrößerung erreichen. </li><li> Nehmen Sie die Bilder, welche einzelnen QDs, verwenden Pixelverweilzeiten von 20-30 &amp; mgr; s. Um Strahlenschäden, Bild jede Region nur einmal mit hoher Vergrößerung zu vermeiden. Hinweis: In der Regel, in dieser Phase sowohl, den Fokus und die Korrektur des Astigmatismus, müssen einige Feineinstellung. </li><li> Nach der Aufnahme von einer ausreichenden Anzahl von hoher Vergrößerung Bilder, Zoom-out und Wechselerfordern eine weitere STEM Übersichtsbild, Darstellung der Regionen nur mit hoher Vergrößerung als dunkle Rechtecke aufgezeichnet. Hinweis: Diese Übersichtsbilder werden später dazu dienen, ESEM und Fluoreszenzbilder zu korrelieren und die genaue Lage der hohen Vergrößerung Bilder innerhalb der zellulären Kontext zu bestimmen. </li><li> Weiter zur nächsten Zelle von Interesse, beginnen Sie mit einem Übersichtsbild, nehmen Sie eine Reihe von Bildern mit hoher Vergrößerung, und am Ende mit einem Übersichtsbild. </li><li> Am Ende eines ESEM Bildgebungssitzung, erhöhen den Druck auf 850 bis 900 Pa vor dem Start, um die Kammer zu entlüften. Anmerkung: Diese Druckerhöhung verbessert die Möglichkeit der Wiedergewinnung des Mikrochip mit einer noch benetzten Fläche; Dies kann jedoch nicht immer erreicht werden. Eine Probe, die nie getrocknet worden ist, kann in BSA-PBS wieder hergestellt werden und, falls gewünscht, in der ESEM erneut untersucht zu einem späteren Zeitpunkt. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

, Die räumliche Verteilung und die Stöchiometrie der Membranproteine, wie beispielsweise die EGFR, in ganzen Zellen wichtige Kontextinformation über seine Funktion und deren eventuellen Änderungen 11-14. Es wird schwierig, die Verteilung der Monomere, Dimere und Cluster direkt auf einem subzellulärer Ebene mit gängigen biochemischen Verfahren, für die Informationen über die Lokalisierung des Proteins in der Zelle oder Unterschiede zwischen den Zellen 15 verloren studieren. Die hier beschriebenen Etikettierung und Mikroskopieverfahren erlauben die Sichtbarmachung von Proteinkomplexen auf einer Längenskala von wenigen Nanometern, so daß seine Stöchiometrie kann im Rahmen der einzelnen, intakten Zellen 4-7 untersucht werden. Dies ist nicht mit der (Super Resolution) Lichtmikroskopie 23, weil seine Entschließung nicht ausreichend, um Moleküle in einem Proteinkomplex beschäftigt zu unterscheiden ist möglich. Förster Resonance Energy Transfer (FRET) ist ein Ensemble Mittelungstechnik &lt;sup&gt; 24, und nicht unbedingt die Dimere und höhere Ordnung Clustern zu erkennen als Folge der kurzen Reichweite der Energieübertragung 25. Ligationsassays 26 nicht tatsächlich Abstände zu messen und daher nicht in der Lage ist, zwischen einem zellularen Bereich mit einem hohen Proteindichte unvermeidlich, was zu einer Anzahl von detektierten Annäherungen durch Zufall aus einer zelluläre Region mit einer ähnlichen Proteindichte aber Protein enthält Komplexe unterschiedliche Abstände zwischen den Etiketten aufweisen. Die geforderte hohe Auflösung, die Bestandteile von Proteinkomplexen Visualisierung wird durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) erreicht. Jedoch wird die herkömmliche TEM von ganzen Zellen durch die Anforderung von dünnen Proben / Abschnitte schneiden durch die Plasmamembran 27 oder Plasmamembran Rippen oder Abbruch 28,29 was zufällig gebildeten kleinen Membranstücke beschränkt. Die Plasmamembran wird somit nicht als Ganzes abgebildet wird, was zu einem Mangelder möglicherweise entscheidenden zellulären Kontext-Informationen. Andere experimentelle Herausforderungen für die Untersuchung von Protein-Stöchiometrie in Zellen entstehen aus der aufgetragenen Proteinmarkierung. Üblicherweise verwendeten Immunmarkierung trägt die Schwierigkeit, die eins-zu-eins-Stöchiometrie zwischen Rezeptor und Marker kann nur mit einem einwertigen Sonde erreicht werden kann; ist dies nicht der Fall, wenn primäre und sekundäre Antikörper erforderlich sind. Um Informationen über die Protein Stöchiometrie zu erhalten, ist es erforderlich, dass eine Sonde bindet eindeutig einem Epitop auf dem Rezeptor und weist eine Bindungsstelle für eine Fluoreszenzsonde oder einer hohen Ordnungszahl Nanopartikel auf der anderen Seite. Zweitens ist die Präzision erreichbar mit Antikörper-Markierung aufgrund ihrer Größe von 30 bis 30 nm beschränkt, so dass eine Unterscheidung zwischen Nachbar einzelne Proteine, Homodimere oder größere Cluster nicht möglich ist, zumindest nicht für Rezeptoren der EGFR-Familie. Viel kleineren spezifischen Etiketten werden in der Literatur und ca bekanntn auch für die intrazelluläre Markierung 31 aufgebracht werden, aber diese sind nicht häufig verwendet. Die Länge des gesamten Etiketts (EGF-Biotin-Streptavidin-QD) von ähnlicher Abmessung wie die EGFR und ausreichend klein, um das Dimer zu detektieren. Außerdem vermeidet die beschriebene zweistufige Etikettiervorgang Kennzeichnung induzierten Rezeptoraggregation. Unsere Methode ist nicht sehr schwierig, nicht viel mehr als Fluoreszenzmikroskopie von markierten Proteinen. Jedoch benötigt ein Experiment mit großer Sorgfalt durchgeführt werden, da die Anzahl der Stufen summiert und ein Fehler in einem der Schritte können zu einem kompletten Ausfall des Experiments führt. Der Umgang mit den Mikrochips ist langweiliger als die Handhabung von TEM Grids, aber einige Trainings leere Chips wird empfohlen. ESEM-STEM ganzer hydratisierten Zellen ist wahrscheinlich der schwierigste Aspekt und erfordert mindestens eine qualifizierte Betreiber und mehrere Tage von der Praxis, um eine Auflösung von etwa 3 nm zu erreichen, wie erforderlich, um die QDs zu visualisieren. Strahlung damAlter der Probe unter Untersuchung eine Gefahr. Der Druck und die Temperatur sollte sorgfältig beobachtet, um eine Wasserschicht aufrecht zu erhalten. Darüber hinaus kann die Dicke der Wasserschicht zwischen den Zellen variieren. Es ist ratsam, die Anwesenheit der Wasserschicht unter Verwendung des gasförmigen Elektronendetektor über die Probe zu überwachen, wie auch anderswo. 6 beschrieben Zelluläre Regionen sollten nur einmal oder zweimal abgebildet werden, um Schäden zu vermeiden. Eine Haupteinschränkung des Verfahrens besteht darin, dass hochauflösende Information über die Ultrastruktur fehlt. Andere Techniken, zum Beispiel Cryo TEM, werden benötigt, um die Proteinstruktur und der zellulären Ultrastruktur 15 zu studieren. Zweitens die Untersuchung der dynamischen Zusammenspiel von einem Vielfachen von Proteinen in lebenden Zellen in Zeitraffer-Mikroskop nicht möglich ist aufgrund von Strahlenschäden und erfordert state-of-the-Art-Lichtmikroskopie 23. Derzeit ist unser Verfahren nicht in der Lage, die Bestimmung der absoluten Höhe der Dimere seit dem lAbeling Effizienz ist unbekannt, aber wir erwarten, dass diese Daten in Zukunft hinzuzufügen. Dennoch ist es möglich, zu sagen, ob Dimere vorhanden sind oder nicht. Aus der Literatur ist bekannt, dass sogar ein Markierungseffizienz etwa 15% reicht aus, um Dimere mit ausreichender statistischer Signifikanz 32 zu erkennen. Es ist ohne weiteres möglich, andere membrangebundene Rezeptoren über ihre Liganden zu untersuchen, über biotinylierten Fab-Fragmenten von Antikörpern oder über andere kleine Linker 7 unter Verwendung des beschriebenen zweistufigen Markierungsprotokoll. Da wir bereits gezeigt, dass zwei verschiedene Farben (Größen) der QDs verwendet werden kann, und Gold-Nanopartikel-Markierung wurde in früheren Arbeiten 6 verwendet, so scheint es möglich, mehrere Proteinspezies im gleichen Experiment zu beschriften. Die größte Herausforderung für die Untersuchung der Stöchiometrie von mehreren Proteinspezies ist die Gewährleistung einer ähnlichen Markierungseffizienz für beide Spezies oder zumindest eine Normalisierung der erhaltenen relativen Stöchiometrie auf der Achtungive Kennzeichnung Wirkungsgrade. Dennoch unterscheiden sich die beiden unterschiedlichen QD in dieser Studie verwendet scheinen nicht sehr verschieden in Markierungseffizienz (siehe 2 und 4). Das beschriebene Verfahren, das Zwei-Schritt-Markierung mit QDs und korrelative Fluoreszenzmikroskopie und ESEM-STEM stellt eine praktikable Methode, um das komplexe Zusammenspiel von Membranproteinen in den intakten Plasmamembranen von ganzen Zellen zu studieren.

Ein neuer Ansatz wurde vor kurzem mit markierten Proteinen in flüssigem Zustand unter Verwendung von STEM 1-3 oder korrelative Fluoreszenzmikroskopie und STEM 4-7 eingeführt, die dem Bild mit ganzen Zellen. Diese Methode ist in der Lage, die räumliche Verteilung der Membranproteine ​​und Proteinkomplexen einschließlich ihrer Stöchiometrie auf der Einzelmolekülebene in den intakten Plasmamembranen von ganzen Zellen. Hier beschreiben wir ein Protokoll mit einen zweistufigen spezifische Markierung von Rezeptorproteinen mit Fluoreszenzquantenpunkten (QDs) 8 und korrelativen Lichtmikroskopie und ESEM-STEM. Als Beispiel untersuchten wir die EGFR, ein Membranprotein, das an die Proteinkinase-Superfamilie gehört. Nach Ligandenbindung aktiviert und dann der Rezeptor bildet ein Dimer mit einem anderen aktivierten EGFR; die nachfolgende Signalkaskade treibt Zellproliferation 9. Mutationen, die zu abnormalen EGFR-Expression oder -Aktivität spielen eine zentrale Rolle in vielen Arten von Krebs 10. Studying die räumliche Anordnung dieser Membranrezeptor in ganzen Zellen wichtige Kontextinformation über seine Funktion und deren eventuellen Änderungen 11-14. Aber es bleibt schwierig, die Verteilung der EGFR Monomere, Dimere und Cluster direkt auf einem (Teil-) zellulärer Ebene mit biochemical- oder konventionellen Mikroskopieverfahren 15 zu sondieren. Unsere Methode ist in der Lage, zu visualisieren EGFRs mit einer räumlichen Auflösung von wenigen Nanometern, so dass die Positionen von Proteinen, in einem Komplex bestimmt werden kann. Am wichtigsten ist, bezieht sich die erhaltenen Informationen zu dem stöchiometrischen Verteilung zum nativen Zustand des Proteins in der intakten Zelle. Um eine kurze Strecke zwischen dem Etikett und dem Rezeptor zu erreichen, wurde EGFR direkt über seinem Liganden EGF bezeichnet, mit einer Biotin-Streptavidin-Bindung zu einem QD. Dieses Label kann sowohl mit Fluoreszenz- und Elektronenmikroskopie nachgewiesen werden. Wir haben dieses Label für korrelative Bildgebung von COS7-Zellen in verwendetFlüssigkeit in einem mikrofluidischen Kammer zuvor 1,16,17 umschlossen. Jedoch aufgrund eines Vielfachen von Streptavidin-Molekülen pro QD, kann das Etikett im Rezeptoraggregation induzieren, was zu einer geringen Markierungsausbeute oder eher teuer Experimenten und es ist nicht möglich, auf die Stöchiometrie der untersuchten Proteins schließen. Etikett induzierten Rezeptorclusterbildung ganz durch den Einsatz der hier dargestellten zweistufigen Markierungsverfahren, was zu einer Sonde, umfassend biotinylierten EGF, denen nur ein Streptavidin-Quantenpunkt (STR-QD) angekoppelt ist vermieden. Die Zellen werden zuerst mit biotinyliertem EGF inkubiert und dann fixiert. Der Fixierungsschritt bestimmt den Zeitpunkt, zu dem Protein Prozesse werden gestoppt (in Abhängigkeit von der Geschwindigkeit der Fixierung). STR-QD wird anschließend als zweiten Schritt der Markierungsprotokoll angewendet. Clustering nicht stattfindet, da dynamischen Membranbewegung der Proteine ​​behindert wird, wenn die Proteine ​​befestigt sind. Darüber hinaus ist die STR-QD-Lösung, die dieteuerste Komponente des Experiments sich in optimierter geringer Konzentration angewendet werden, und dieser zweite Schritt der Etikettierung ist es zeitlich nicht entscheidend, dh die QD in einigen Minuten angekoppelt werden. Die Stöchiometrie von EGFR zu untersuchen, wie in ganzen Zellen verteilt waren zelluläre Proben auf Silicium-Mikrochips 18 vorbereitet. Nach dem Aufbringen des zweistufigen QD Kennzeichnung sowie die Aufzeichnung der Fluoreszenzmikroskopiebilder wurden die Zellen mit reinem Wasser gespült und in hydratisiertem Zustand unter Verwendung von ESEM-STEM 19 abgebildet. Die resultierenden Korrelations Bilder geben Auskunft über die zellulären EGFR Verteilung und der Stöchiometrie in ihrem natürlichen Kontext der hydratisierten Zellen. Ein ähnliches Verfahren wurde verwendet, um Proteine ​​HER2 in Brustkrebszellen in einer aktuellen Studie 7 studieren.

<table><tbody><tr><td>Inverses Fluoreszenzmikroskop</td><td>Leica</td><td>AF6000 + DMI6000B</td><td></td></tr><tr><td>ESEM</td><td>FEI Company</td><td>Quanta 400 FEG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMax + Glukose + Pyruvat</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (1x) - Calciumchlorid - Magnesiumchlorid</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum, Performance Plus (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000-036</td><td></td></tr><tr><td>Cellstripper</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>25-056 Cl</td><td></td></tr><tr><td>Wasser, chromasolv Plus für HPLC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34877-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>PBS Roti-Stock 10x PBS</td><td>Carl Roth</td><td>1058.1</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, Rotisolv HPLC type</td><td>Carl Roth</td><td>P076.2</td><td></td></tr><tr><td>Albumin Fraktion V, biotinfrei (BSA)</td><td>Carl Roth</td><td>O163.2</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine, aus Kaltwasserfischhaut</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7041-500G</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Carl Roth</td><td>T873.1</td><td></td></tr><tr><td>Epidermale</td><td>Wachstumsfaktor-Molekularsonden</td><td>E3477</td><td>Biotin-XX-Konjugat (Biotin EGF)</td></tr><tr><td>Natriumteraborat-Decahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9640-500G</td><td></td></tr><tr><td>Borsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768-500G</td><td></td></tr><tr><td>Qdot 655 Streptavidin-Konjugat</td><td>Molekulare Sonden</td><td></td><td></td>Q10121MP</tr><tr><td>Qdot 800 Streptavidin Konjugat</td><td>Molekulare Sonden</td><td>Q10173MP</td><td></td></tr><tr><td>Silizium-Mikrochips mit Siliziumnitrid-Membranen von 50 nm Dicke und Abmessungen von 50 &; Mikro; m x 0,40 mm</td><td>DENS Lösungen</td><td>nach</td><td></td> Maß</tr></tbody></table>

studieren der stöchiometrie der epidermal growth factor receptor in intakten zellen mit korrelative mikroskopie

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

Dieses Protokoll beschreibt die Markierung des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) auf COS7-Fibroblastenzellen und anschließende korrelativen Fluoreszenzmikroskopie und Environmental Scanning-Elektronenmikroskopie (ESEM) von ganzen Zellen in hydratisiertem Zustand. Fluoreszenzquantenpunkten (QD) wurden über eine zweistufige Markierungsprotokoll an EGFR gekoppelt und stellt eine effiziente und spezifische Markierung von Proteinen, unter Vermeidung Etikett induzierten Clustering des Rezeptors. Fluoreszenzmikroskopie zur Verfügung gestellt Übersichtsbilder der zellulären Stellen des EGFR. Die Rastertransmissionselektronenmikroskop (STEM) Detektor wurde verwendet, um die QD-Etiketten mit nanoskaliger Auflösung zu erfassen. Die erhaltenen korrelativen Bilder liefern Daten des zellulären EGFR Verteilung und der Stöchiometrie auf der Einzelmolekülebene in der natürlichen Umgebung des hydratisierten intakte Zelle. ESEM-STEM-Bilder zeigten der Rezeptor als Monomer vorliegen, wie Homodimer und in kleinen Clustern. Markierung mit zwei verschiedenen QDs,dh eine Emission bei 655 nm und bei 800 offenbart ähnliche Charakteristik Ergebnisse.

Figur 1 und 2 zeigen repräsentative Bilder von QD655 markierten membrangebundener EGFR in intakten, vollständig hydratisiert COS-7-Zellen sichtbar gemacht. Das DIC-Bild in Abbildung 1 a gibt einen Eindruck von der Membran Topographie der Zellen und die entsprechenden Fluoreszenzbild in Figur 1b veranschaulicht die Verteilung der EGFR nach 3 min der EGF-Biotin inkubiert. 1A und B sind jeweils zusammen aus zwei genähte Bilder mit einer 40X Luftziel aufgezeichnet. Der EGF EGFR aktiviert wird über die gesamte Zelloberfläche verteilt. In den meisten Zellen eine leichte Verstärkung der Fluoreszenz (1B) können an den Zellenrändern zu sehen ist, die einen lokal erhöhten Auftreten von EGFR 20. Kontrollversuche durchgeführt, unter Verwendung eines ähnlichen Protokolls verifiziert bestimmte EGFR Kennzeichnung (Daten nicht gezeigt). Diese Steuerungen enthalten: 1) ein Steuer Kennzeichnung ohne vorherige Inkubation der cells mit EGF-Biotin, dh nur Inkubation mit STR-QD, und 2) einer Inkubation mit nicht-biotinyliertem EGF und STR-QD. Die drei Zellen mit Rechtecken markiert wurden weiter mit ESEM-STEM sucht. Die ESEM-STEM Bilder in 1C dargestellt - E zeigen geringer Vergrößerung Übersichten dieser Zellen. Diese Transmissionsbilder reflektieren ganzen Zellen in hydratisiertem Zustand mit einer dünnen Wasserschicht über der Zelle aufhalten auf einem Silizium-Mikrochip mit Siliziumnitrid (SiN) Sichtfenster angeordnet. Die Vakuumkammer im Mikroskop enthaltene Wasserdampf, und das Gleichgewicht zwischen der Probentemperatur und der Druck wurde so eingestellt, um eine dünne Schicht der Flüssigkeit auf den Zellen zu halten. Die einzelnen Zellen können leicht auf Grund ihrer Form und Lage auf die Membran SiN Fenster erkannt werden kann. Die Low-Vergrößerung ESEM-STEM Bilder offenbaren feine Strukturen, wie Filopodien, die sich von der Zellkante zur benachbarten Zellen und einige Struktureninnerhalb der dünneren Zellregionen. Dicken zentralen zellulären Regionen einschließlich den Kern weiß erscheinen, weil die Übertragung durch die Probe ist nicht möglich, für Elektronen der eingesetzten Energie (30 keV). Hochauflösende ESEM-STEM-Bilder wurden in den Verdünner, Randregionen erfasst. Die räumliche Auflösung für die ESEM-STEM von Nanopartikeln in den dünnen Regionen von Zellen in einer dünnen Flüssigkeitsschicht wurde in einer früheren Studie 6 bestimmt, bis zu 3 nm betragen. Vier Bilder mit hoher Auflösung in 2A gezeigt - D wurden an den Stellen der kleinen Rechtecke in 1C aufgezeichnet - E. Die verwendete Vergrßerung war ausreichend, um einzelne QD erscheinen als helle, geschoßförmigen Stangen zu erkennen, die jeweils einer einzelnen gebundenen EGFR. Die QD655 hat typischen Abmessungen von 6 x 14 nm 2. 2A (entspricht der rechteckige Bereich in der Zelle in Figu deutetWieder 1C) zeigt QD Etiketten auf einer Membran diagonal falten Querung des Bildes. Diese Membranstruktur weist eine höhere Dichte als die EGFR umgebenden Membranbereichen. An mehreren Standorten, waren zwei Etiketten in unmittelbarer Nähe. Zwei Beispiele mit Abständen von 20 und 24 nm sind mit Pfeilspitzen markiert. Diese Paare von Etiketten, um EGFR Dimere gehör interpretiert. 2B zeigt ein Beispiel von dem Rand einer Zelle (1D linken Rechteck) kann EGFR Monomere und Dimere sowie gesehen werden. 2C (1C rechten Rechteck) wurde in einer Region mit einer geringeren Fluoreszenzsignal, dh niedrigere EGFR Dichte aufgezeichnet. Dennoch EGFR wurde auch hier in Dimere als auch gefunden. Außerdem ließen sich zwei Gruppen von 10 oder 11 EGFRs (siehe Ellipsen). 2D zeigt ein weiteres Beispiel eines Membranfalte (1E) mit kleineren Cluster einschließlich 5-6 EGFRs, zusätzlich zu mehreren Monomerenund Dimere. Als ein Beispiel für die Art von Informationen, die aus diesen Daten wird die Paarkorrelationsfunktion 21 g (x) erhalten wird, kann für alle Etikettenpositionen in Figur 2 bestimmt werden kann. Man beachte, daß diese Analyse ist nicht Teil des Protokolls und das Verfahren wurde beschrieben an anderer Stelle 6,7. g (x) ist ein Maß für die Wahrscheinlichkeit eines Teilchens in einem bestimmten radialen Abstand x von einem Referenzpartikel gefunden werden. g (x) = 1 für eine Zufallsverteilung, und ein größerer Wert ist ein Beweis für das Clustering. Die Positionen insgesamt 210 Etiketten wurden automatisch in den vier Bildern von 2A-D detektiert wird, und g (x) wurde berechnet unter Verwendung einer Abschnittsgröße von 5 nm und einem Glättungsfilter mit einer Bandbreite von 10 nm. Die g (x) die Kurve (3) zeigt eine bevorzugte Mitte-zu-Mitte-Abstand von QD 25 nm. EGFRs somit nicht zufällig ausgerichtet, aber ein signifikanter Anteil von ihnen liegt bei dieser bevorzugten Abstand. Von einer approximate molekulares Modell 6 (3 Kasten) Wir schätzen, dass der Abstand zwischen dem QD und der EGF-Bindungstasche von Mitte zu Mitte beträgt ~ 14 nm, und in der Mitte-zu-Mitte-Abstand zwischen den beiden QDs auf eine EGFR-Dimer, die an sein ~ 27 nm (dieser Wert wird wahrscheinlich von einigen Nanometern variieren aufgrund der Flexibilität des Linkers). Die bevorzugte Etikettenabstand ist somit im Einklang mit der erwarteten Etikettenabstand für den EGFR-Dimer innerhalb der Genauigkeit des Verfahrens. Die g (x) -Kurve größer als Eins für die Entfernung von bis zu 300 nm, was das Vorhandensein von Clustern in Übereinstimmung mit den Daten. Diese Analyse zeigt, daß die Stöchiometrie der EGFR kann mit unserer Methode untersucht werden. Figur 4 zeigt ein ähnliches Ergebnis wie Figur 2, mit der Ausnahme, dass die Kennzeichnung mit EGF-QD800 geführt und ein 63X Ölimmersionsobjektiv wurde für die Fluoreszenzbildes verwendet. Diese Daten bestätigen, daß diese typischen Ergebnisse sind ebenfalls gefunden, wenndie EGFR-Kennzeichnung ist mit QDs, die in der Nähe von roten Spektrums emittieren getan. 4A ist das Fluoreszenzbild einer repräsentativen Zelle zeigt 4B die gleiche Zelle im ESEM-STEM Übersichtsmodus und 4C ist eine 150.000-facher Vergrößerung Bild, aufgezeichnet am oberen Rand der Membranzelle (siehe Rechteck in Figur 4B). Ähnlich wie bei 2A und D Abbildung, die Bilder erfassen QD-markierte EGFR auf einer Membran Falte und zeigt monomeren, dimeren und Clustered-Rezeptoren. Beachten Sie, dass das Elektron dichten QD Kern scheint etwas kleiner und runder als die Kerne der QDs Emission bei 655 nm, im Einklang mit ihren kleineren Kerngröße 22 ~ 5 nm. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53186/53186fig1.jpg" /> Abbildung 1. Korrelative DIC, Fluoreszenz und ESEM-STEM von EGF-QD655 markierten EGFR auf vollständig hydratisiert COS-7-Zellen </stRong&gt;. (A) DIC Bild der Zellen auf dem SiN-Membran Fensterbereich gewachsen, wodurch ein topographisches Bild von der Plasmamembran. (B) Fluoreszenzbild zeigt Zellen auf der zentral gelegenen SiN-Membran-Fenster (durch die gestrichelte Rechteck markiert). (C - E) Drei ESEM-STEM geringer Vergrößerung Bilder von der mit Rechtecken in A und B markierten Zellen. Diese Zellübersichtsbilder dienen dazu, die genaue Lage der nachfolgend aufgenommenen Bilder mit hoher Auflösung zu bestimmen. Die Lage von vier hochauflösenden Bildern (in 2A-D dargestellt) sind mit weißen Rechtecke gekennzeichnet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53186/53186fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53186/53186fig2.jpg" /> <strong&gt; Abbildung 2. Hochauflösende ESEM-STEM Bilder zeigen Membran gebunden EGFRs. (A) Schliffbild bei 75,000X Vergrößerung des in Figur 1B markierten Bereich. Viele Monomere sind sichtbar. Mehrere Dimere mit den Pfeilspitzen markiert. (B) und (C) bei 50.000-Bilder Vergrößerung des linken erworben, in 1C markiert jeweils rechts Membranbereichen. Cluster von EGFRs skizziert. (D) mit 50.000-Vergrößerung am Standort in 1D markiert aufgenommene Bild. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53186/53186fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53186/53186fig3.jpg" /> Abbildung 3. Paarkorrelationsfunktion g (x) als Funktion der radialen Distanz X für den inter-parti bestimmt<html> CLE Abstände aller 210 Etiketten in 2A &amp; ndash; D erfasst. Der Peak bei 25 nm zeigt an, dass eine Mitte-zu-Mitte QD Abstand hat eine viel höhere Wahrscheinlichkeit des Auftretens als zufällige, wobei ag (x) = 1 anzeigt, eine zufällige Chance. Die gestrichelte Linie ist ein Leitfaden für das Auge darstellt, g (x) einer Zufallsverteilung. Der Einschub zeigt ein ungefähres Molekularmodell des EGFR-Dimer mit gebundenen EGF und Streptavidin beschichteten QDs über Biotin gebunden. Die Modelle von Streptavidin wurden EGF und EGFR von CPK-Modelle der 1stp (Streptavidin), 1EGF (EGF) erhalten, 1NQL, 2JWA, 1M17, 1IVO und 2GS6 (EGFR) Strukturen im RCSB Protein Protein Databank, erstellt von Jmol Version 12.2.15. Das Biotin-Modell ist wie in RCSB Ligand Explorer Version 1.0 erstellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53186/53186fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> /53186/53186fig4.jpg &quot;/&gt; Abbildung 4. Beispielhafte COS-7-Zellen mit EGF-QD800 markiert und mit korrelativen Fluoreszenz und ESEM-STEM abgebildet. (A) Fluoreszenzbild, (B) geringer Vergrößerung Übersicht ESEM-STEM Bild. (C) Hochauflösendes Bild am Ort des Rechtecks ​​in b aufgenommen am 150,000X Vergrößerung. Monomeren, dimeren und gruppierten EGFRs ähnlich Markierung mit EGF-QD655 werden erkannt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53186/53186fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Dieses Protokoll beschreibt die Markierung des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors (EGFR) auf COS7-Fibroblastenzellen und die anschließende korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie ganzer Zellen im hydratisierten Zustand. Die Markierung enthielt fluoreszierende Quantenpunkte. Das Protokoll kann verwendet werden, um die Stöchiometrie von EGFR auf Einzelmolekülebene zu untersuchen.

Studieren der Stöchiometrie der Epidermal Growth Factor Receptor in intakten Zellen mit korrelative Mikroskopie

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Verteilung und Stöchiometrie von epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptoren oder EGFRs in der Plasmamembran intakter und hydratisierter Zellen mittels Fluoreszenz- und Elektronenmikroskopie sichtbar zu machen. Dazu werden zunächst EGFR-exprimierende Zellen wie COS-7 auf Mikrochips kultiviert, die über eine 50 Nanometer dünne Siliziumnitridmembran verfügen, die einen zentral gelegenen Fensterbereich überspannt. Anschließend werden die Zellen mit einer biotinylierten Version des epidermalen Wachstumsfaktors inkubiert, der an den Rezeptor bindet und die Konformation von EGFR verändert, was zur Dimerisierung und Aktivierung führt.Anschließend werden die Zellen fixiert, um die Rezeptoren zu immobilisieren, und mit abgestrippten, an Hagen konjugierten Quantenpunkten inkubiert, die an die durch EGF aktivierten Rezeptoren binden, woraufhin die Zellen abgebildet werden. Abschließend stabilisiert eine zweite Fixierung mit Glutaraldehyd die vernetzten abgestrippten Hagen in den konjugierten Quantenpunkten mit dem EGFR und macht die Probe für die Elektronenmikroskopie bereit. Die Ergebnisse zeigen eine Aussage über die räumliche Verteilung roter Fluoreszenz mittels Fluoreszenz-Aufnahme der Quantenpunkte sowie über die Verteilung, den stöchiometrischen Zustand beziehungsweise die Clusterbildung des EGFR mittels Rastertransmissionselektronenmikroskopie.Diese Methode liefert einzigartige Informationen über die räumliche Anordnung und Verteilung von Membranrezeptoren in intakten Zellen und kann genutzt werden, um Einblicke in die Aktivierung des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors in normalen sowie in Krebszellen zu gewinnen. Sie kann außerdem zur Untersuchung anderer Membranrezeptoren wie Ionenkanäle angewendet werden. Beginnen Sie, während Sie unter einem Abzug arbeiten. Für die ersten Vorbereitungsschritte der Siliziumnitrid-Membran-Mikrochips und nach dem Eintauchen in Aceton gemäß dem schriftlichen Protokoll, überführen Sie die Mikrochips direkt in ein Becherglas mit Ethanol und warten Sie zwei Minuten. Entfernen Sie die Chips aus dem Ethanol und legen Sie sie auf ein Reinraum-Tuch.Nachdem die Chips getrocknet sind, überführen Sie sie auf einen Glasobjektträger, der zuvor in eine Petrischale gelegt wurde. Danach setzen Sie den Deckel auf die Schale. Anschließend geben Sie den Glasobjektträger mit den Mikrochips in einen Plasma-Reiniger.Führen Sie ein fünfminütiges Standardreinigungsprogramm durch, um die Oberfläche der Siliziumnitrid-Membran hydrophil zu machen. Übertragen Sie anschließend unter dem laminaren Flusswerk die Mikrochips von dem Glas. Legen Sie sie auf ein sauberes Reinraum-Tuch, bevor Sie sie in eine Vertiefung einer 24-Loch-Platte geben, die mit Poly-L-Lysin-Lösung (PLL) gefüllt ist, und inkubieren Sie fünf Minuten lang.Anschließend überführen Sie die Mikrochips einzeln in eine zweite Vertiefung, die HPLC-Reinstwasser enthält, und spülen Sie sie in einer weiteren Wasser-Vertiefung. Schließlich geben Sie die Mikrochips einzeln in mit DM gefüllte Vertiefungen einer 96er-Platte und stellen die Platte in einen Kohlendioxid-Inkubator unter Verwendung einer COS-7-Zellsubkultur. Bereiten Sie eine mono-disperse Zellsuspension mit einer Konzentration von etwa 5 × 10¹⁰ vor.Fünf Millionen Zellen pro Milliliter. Geben Sie einen Tropfen der Zellsuspension auf jeden Mikrochip in der 96-Loch-Platte und inkubieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur mit einem invertierten Mikroskop. Untersuchen Sie die Bereiche der Mikrochips, um eine ungefähre Dichte von 20 bis 30 Cos-7-Zellen pro 150 mal 400 Mikrometer Fenster zu erreichen.Wenn die Zellen ausreichend angeheftet haben, die Mikrochips vorsichtig mit der Zellseite nach oben in neue Brunnen mit dm überführen. Wenn ausreichend Zellen angeheftet geblieben sind, die Mikrochips mit der Zellseite nach oben in neue Brunnen mit serumfreiem dmm transferieren. Anschließend die Mikrochips für mehrere Stunden bis über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator für die folgenden Schritte inkubieren.Verwenden Sie eine 96er-Platte, füllen Sie die Vertiefungen mit den erforderlichen Lösungen auf und nutzen Sie eine Spalte pro Mikrochip. Spülen Sie die Mikrochips, indem Sie sie in eine Vertiefung mit frischem B-S-A-G-E-L-P-B-S geben und bei 37 Grad Celsius fünf Minuten lang inkubieren. Überführen Sie die Mikrochips in eine 300 Nanomolare EGF-Biotin-Lösung und stellen Sie sie für drei Minuten zurück in den Inkubator, da die Zellen damit beginnen, das mit EGF markierte EGFR zu internalisieren.Spülen Sie die Mikrochips dreimal schnell mit PBS. Anschließend spülen Sie die Proben mit 0,1 molarer Cate-Pufferlösung oder CB. Danach überführen Sie die Mikrochips in 3 % PFA und inkubieren sie 10 Minuten lang.Nachdem die Chips einmal mit CB und dreimal mit PBS gespült wurden, überführen Sie die Chips in G-L-Y-P-B-S und inkubieren sie zwei Minuten lang. Anschließend spülen Sie zweimal mit PBS. Danach legen Sie die Mikrochips in 10 NANOMOLAR S-T-R-Q-D für 10 Minuten, bevor Sie viermal mit B-S-A-P-B-S spülen.Tauchen Sie dann einen Mikrochip in eine Glasboden-Kulturschale mit 35 Millimeter Durchmesser, die vorab mit BSA-PBS bei Raumtemperatur gefüllt wurde, um die Zellen mittels DIC und Fluoreszenzmikroskopie abzubilden. Verwenden Sie ein 40×-Luftobjektiv für Übersichtsaufnahmen von Zellen, die mit QD 655 markiert sind. Nutzen Sie einen Filterkubus, der die Quantenpunkte zwischen 340 und 380 Nanometern anregt und eine Emission oberhalb von 420 Nanometern ermöglicht.Reduzieren Sie die Lichtintensität, um zwei intensive Lichtquellen zu vermeiden, die die Probe beschädigen könnten. Stellen Sie die Belichtungszeit auf mindestens 300 Millisekunden ein, damit die Signale aller QDs erfasst werden, da die QD-Fluoreszenz blinkt; passen Sie die Lichtintensität und die Verstärkung so an, dass helle Bilder ohne sichtbares Bildrauschen entstehen, wobei die Lichtintensität minimiert wird. Nach der Aufnahme stellen Sie den Mikrochip zurück in eine 96-Loch-Platte mit B-S-A-P-B-S.Einmal in CB spülen, dann eine 2%ige Glutaraldehydlösung hinzufügen und weitere 10 Minuten inkubieren. Waschen und CB verwenden, um den Mikrochip mit BSA-PBS dreimal zu waschen; anschließend in mit BSA-PBS vorgefüllten Vertiefungen einer neuen 96-Loch-Platte je Mikrochip lagern. Eine Reihe mit vier Vertiefungen mit HPLC-reinem Wasser füllen.Nachdem das ESEM gemäß dem Textprotokoll eingerichtet wurde, laden Sie eine Probe in die Vor-COOL-ESEM-STEM-Stufe, indem Sie die 96-WAT-Platte aus dem Kühlbehälter nehmen und in die Nähe der geöffneten ESEM-Stufe stellen. Legen Sie ein Reinraumtuch daneben. Spülen Sie einen Mikrochip schnell ab, indem Sie ihn viermal für jeweils eine Sekunde in eine mit HPLC-Reinstwasser gefüllte Vertiefung eintauchen.Blotter Sie die Rückseite des Mikrochips kurz auf das Papier und legen Sie ihn in die vorgekühlte Halterung mit drei Mikrolitern gekühltem HPLC-Reinstwasser. Benetzen Sie die Oberfläche der Probe und befestigen Sie die Probe in der Halterung. Geben Sie anschließend drei weitere Wassertropfen zu je drei Mikrolitern in die Nähe der Probe auf die Halterung und schließen Sie die Probenkammer.Nachdem eine Zelle von Interesse identifiziert wurde, gemäß dem schriftlichen Protokoll ein STEM-Übersichtsbild der Zelle aufnehmen, in einen peripheren Bereich der Zelle wechseln, wo die Zellgrenze sichtbar ist, und auf eine 50.000-fache Vergrößerung heranzoomen. Bilder aufnehmen, die einzelne QDs zeigen, und dabei Pixel-Verweilzeiten von 20 bis 30 Mikrosekunden verwenden. Dargestellt sind hier QD 655-markierte, membranständige EGFR in intakten, vollständig hydratisierten COS-7-Zellen. Das DIC-Bild veranschaulicht die Membrantopographie der Zellen, und das entsprechende Fluoreszenzbild zeigt die Verteilung von EGFR über die gesamte Zelloberfläche nach dreiminütiger Inkubation mit EGF-Biotin.Diese ESEM-STEM-Bilder mit niedriger Vergrößerung zeigen feine Strukturen wie von der Zelle zu benachbarten Zellen reichende Filopodien sowie einige Strukturen in den dünneren Zellbereichen. Starke zentrale Zellbereiche, einschließlich des Zellkerns, erscheinen weiß, da eine Durchstrahlung der Probe für Elektronen der verwendeten Energie nicht möglich ist. Hohe Auflösung.ESEM-STEM-Aufnahmen der dünneren peripheren Bereiche zeigen QD-Markierungen an einer Membranfalte, die diagonal durch das Bild verläuft. Diese Membranstruktur weist an mehreren Stellen eine höhere EGFR-Dichte auf als die umgebenden Membranbereiche, wobei sich zwei Markierungen in unmittelbarer Nähe zueinander befanden. Zwei Beispiele mit Abständen von 20 und 24 Nanometern sind mit Pfeilspitzen gekennzeichnet.Diese Paare von Markierungen werden als zu EGFR-Fers gehörend interpretiert. Diese Aufnahme wurde von einer Region mit geringerer EGFR-Dichte und schwächerem Fluoreszenzsignal angefertigt. Dennoch wurde EGFR auch hier in Dimere sowie in zwei Clustern mit jeweils 10 oder 11 EEG gefunden.Wenn die Probenpräparation einmal beherrscht ist, kann sie innerhalb von zwei Stunden durchgeführt werden, was deutlich schneller ist als die üblicherweise verwendeten Techniken für die Elektronenmikroskopie. Die anschließende STEM-Aufnahme kann innerhalb eines halben Tages bis zu 100 hochauflösende Bilder liefern.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Wir entwickelten eine Software-Plattform, Imaris Neuroscience, ImarisXT und MATLAB, um die Änderungen in der Morphologie einer undefinierten Form von dreidimensionalen konfokale Fluoreszenz einzelner Zellen aufgenommen zu messen verwendet. Dieser neuartige Ansatz kann verwendet werden, um Veränderungen in der Zellform nach Aktivierung des Rezeptors zu quantifizieren und stellt somit eine mögliche zusätzliches Werkzeug für die Wirkstoffforschung.

Ein analytisches Werkzeug, das zelluläre Morphologie Änderungen von Dreidimensionale Fluorescence Images Quantifiziert

In diesem Video demonstrieren wir den Efferozytose-Assay, um die Clearance apoptotischer Zellen mittels konfokaler Mikroskopie zu untersuchen. Die Efferozytose ist ein mehrstufiger Prozess, bei dem apoptotische Zellen von Fresszellen verschlungen und in Vesikel, den sogenannten Efferosomen, abgebaut werden. Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Visualisierung internalisierter und nicht-internalisierter Teile einzelner apoptotischer Zellen und zur Quantifizierung der Efferozytose.

Fixierter Zell-Efferozytose-Assay: Eine Methode zur Untersuchung der efferozytären Aufnahme apoptotischer Zellen durch Makrophagen mittels Fluoreszenzmikroskopie

Wir beschreiben eine einfache zellbasierten Bioassay zum Nachweis, zur Quantifizierung und Überwachung der Aktivität der Mitglieder der vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor-Familie von Liganden. Der Assay verwendet chimären Rezeptoren in einem Faktor-abhängigen Zelllinie exprimiert eine semi-quantitative oder quantitative Bewertung der Rezeptorbindung bereitzustellen, und die Vernetzung durch den Liganden.

Eine einfache Bioassay für die Beurteilung von Vascular Endothelial Growth Factors

Antikörper, die Ziel-Rezeptoren auf der Zelloberfläche binden können Konformation und clustering Veränderungen verleihen. Diese dynamischen Veränderungen haben Auswirkungen für die Charakterisierung von Arzneimittelentwicklung in Zielzellen. Dieses Protokoll nutzt konfokalen Mikroskopie und Bild Korrelation Spektroskopie durch ImageJ/Fidschi, das Ausmaß des Rezeptors auf der Zelloberfläche clustering zu quantifizieren.

Konfokale Mikroskopie zeigt Zelle Oberfläche Rezeptor Aggregation über Bild Korrelation Spektroskopie

Efferocytosis, die phagocytic Entfernung der Apoptotic Zellen ist erforderlich, um die Homöostase und wird erleichtert durch die Rezeptoren und Signalwege, die für die Anerkennung, Engulfment und Internalisierung der Apoptotic Zellen ermöglichen. Hier präsentieren wir ein Fluoreszenz-Mikroskopie-Protokoll für die Quantifizierung des Efferocytosis und die Aktivität der Efferocytic Signalwege.

Quantifizierung der Efferocytosis durch einzellige Fluoreszenz-Mikroskopie

Wir beschreiben einen bildgebenden Ansatz zur Bestimmung des durchschnittlichen oligomeren Zustands von mEGFP-getaggten Rezeptor-Oligomeren, die durch Ligandenbindung in der Plasmamembran lebender Zellen induziert werden. Das Protokoll basiert auf der Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Mikroskopie in Kombination mit der Number and Brightness (N&amp;B)-Analyse.

Oligomerisierungsdynamik von Zelloberflächenrezeptoren in lebenden Zellen durch totale interne Reflexionsfluoreszenzmikroskopie kombiniert mit Zahlen- und Helligkeitsanalyse

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur systematischen Kultivierung epidermaler Sphäroide in 3D-Suspensionskultur. Dieses Protokoll hat weitreichende Anwendungen für den Einsatz in einer Vielzahl von epithelialen Gewebetypen und für die Modellierung mehrerer menschlicher Krankheiten und Zustände.

Etablierung eines epidermalen Sphäroidkultursystems mit hohem Durchsatz zur Modellierung der Plastizität von Keratinozyten-Stammzellen

TGT surface ist eine innovative Plattform zur Untersuchung von Wachstumsfaktor-Integrin-Crosstalk. Das flexible Sondendesign, die Spezifität des Adhäsionsliganden und die präzise Modulation der Stimulationsbedingungen ermöglichen robuste quantitative Bewertungen des EGFR-Integrin-Zusammenspiels. Die Ergebnisse unterstreichen EGFR als "Mechano-Organizer", der die Integrin-Mechanik abstimmt und die fokale Adhäsionsmontage und Zellausbreitung beeinflusst.

Zugspannungsmessstreifen zur Quantifizierung von Wachstumsfaktor-vermittelter Integrinmechanik und Adhäsion

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Probenvorbereitung und Datenanalyse zur Quantifizierung der Proteinphosphorylierung unter Verwendung eines verbesserten Einzelmolekül-Pulldown-Assays (SiMPull).

Ein optimierter Einzelmolekül-Pulldown-Assay zur Quantifizierung der Proteinphosphorylierung

Wir präsentieren einen validierten Sandwich-ELISA-Assay mit neuartigen monoklonalen Anti-HER2-Antikörpern. Dieser Assay ermöglicht die präzise Quantifizierung von zellgebundenem und freigesetztem HER2-Protein aus in vitro kultivierten Zellen und anderen Proben, einschließlich Blut und Geweben.

Validierter immunchemischer Assay zur umfassenden Bestimmung des humanen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors 2, der aus Zellen freigesetzt und an Zellen gebunden wird

Lernen Sie die Visualisierung der EGFR-Stöchiometrie in intakten COS7-Zellen mittels korrelativer Fluoreszenz- und Elektronenmikroskopie. Diese Methode ermöglicht Einblicke in die Rezeptoraktivierung auf Einzelmolekülebene.

Studieren der Stöchiometrie der Epidermal Growth Factor Receptor in intakten Zellen mit korrelative Mikroskopie

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