Studieren der Stöchiometrie der Epidermal Growth Factor Receptor in intakten Zellen mit korrelative Mikroskopie

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Verteilung und Stöchiometrie von epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptoren oder EGFRs in der Plasmamembran intakter und hydratisierter Zellen mittels Fluoreszenz- und Elektronenmikroskopie sichtbar zu machen. Dazu werden zunächst EGFR-exprimierende Zellen wie COS-7 auf Mikrochips kultiviert, die über eine 50 Nanometer dünne Siliziumnitridmembran verfügen, die einen zentral gelegenen Fensterbereich überspannt. Anschließend werden die Zellen mit einer biotinylierten Version des epidermalen Wachstumsfaktors inkubiert, der an den Rezeptor bindet und die Konformation von EGFR verändert, was zur Dimerisierung und Aktivierung führt.

Anschließend werden die Zellen fixiert, um die Rezeptoren zu immobilisieren, und mit abgestrippten, an Hagen konjugierten Quantenpunkten inkubiert, die an die durch EGF aktivierten Rezeptoren binden, woraufhin die Zellen abgebildet werden. Abschließend stabilisiert eine zweite Fixierung mit Glutaraldehyd die vernetzten abgestrippten Hagen in den konjugierten Quantenpunkten mit dem EGFR und macht die Probe für die Elektronenmikroskopie bereit. Die Ergebnisse zeigen eine Aussage über die räumliche Verteilung roter Fluoreszenz mittels Fluoreszenz-Aufnahme der Quantenpunkte sowie über die Verteilung, den stöchiometrischen Zustand beziehungsweise die Clusterbildung des EGFR mittels Rastertransmissionselektronenmikroskopie.

Diese Methode liefert einzigartige Informationen über die räumliche Anordnung und Verteilung von Membranrezeptoren in intakten Zellen und kann genutzt werden, um Einblicke in die Aktivierung des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors in normalen sowie in Krebszellen zu gewinnen. Sie kann außerdem zur Untersuchung anderer Membranrezeptoren wie Ionenkanäle angewendet werden. Beginnen Sie, während Sie unter einem Abzug arbeiten. Für die ersten Vorbereitungsschritte der Siliziumnitrid-Membran-Mikrochips und nach dem Eintauchen in Aceton gemäß dem schriftlichen Protokoll, überführen Sie die Mikrochips direkt in ein Becherglas mit Ethanol und warten Sie zwei Minuten. Entfernen Sie die Chips aus dem Ethanol und legen Sie sie auf ein Reinraum-Tuch.

Nachdem die Chips getrocknet sind, überführen Sie sie auf einen Glasobjektträger, der zuvor in eine Petrischale gelegt wurde. Danach setzen Sie den Deckel auf die Schale. Anschließend geben Sie den Glasobjektträger mit den Mikrochips in einen Plasma-Reiniger.

Führen Sie ein fünfminütiges Standardreinigungsprogramm durch, um die Oberfläche der Siliziumnitrid-Membran hydrophil zu machen. Übertragen Sie anschließend unter dem laminaren Flusswerk die Mikrochips von dem Glas. Legen Sie sie auf ein sauberes Reinraum-Tuch, bevor Sie sie in eine Vertiefung einer 24-Loch-Platte geben, die mit Poly-L-Lysin-Lösung (PLL) gefüllt ist, und inkubieren Sie fünf Minuten lang.

Anschließend überführen Sie die Mikrochips einzeln in eine zweite Vertiefung, die HPLC-Reinstwasser enthält, und spülen Sie sie in einer weiteren Wasser-Vertiefung. Schließlich geben Sie die Mikrochips einzeln in mit DM gefüllte Vertiefungen einer 96er-Platte und stellen die Platte in einen Kohlendioxid-Inkubator unter Verwendung einer COS-7-Zellsubkultur. Bereiten Sie eine mono-disperse Zellsuspension mit einer Konzentration von etwa 5 × 10¹⁰ vor.

Fünf Millionen Zellen pro Milliliter. Geben Sie einen Tropfen der Zellsuspension auf jeden Mikrochip in der 96-Loch-Platte und inkubieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur mit einem invertierten Mikroskop. Untersuchen Sie die Bereiche der Mikrochips, um eine ungefähre Dichte von 20 bis 30 Cos-7-Zellen pro 150 mal 400 Mikrometer Fenster zu erreichen.

Wenn die Zellen ausreichend angeheftet haben, die Mikrochips vorsichtig mit der Zellseite nach oben in neue Brunnen mit dm überführen. Wenn ausreichend Zellen angeheftet geblieben sind, die Mikrochips mit der Zellseite nach oben in neue Brunnen mit serumfreiem dmm transferieren. Anschließend die Mikrochips für mehrere Stunden bis über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem Kohlendioxid-Inkubator für die folgenden Schritte inkubieren.

Verwenden Sie eine 96er-Platte, füllen Sie die Vertiefungen mit den erforderlichen Lösungen auf und nutzen Sie eine Spalte pro Mikrochip. Spülen Sie die Mikrochips, indem Sie sie in eine Vertiefung mit frischem B-S-A-G-E-L-P-B-S geben und bei 37 Grad Celsius fünf Minuten lang inkubieren. Überführen Sie die Mikrochips in eine 300 Nanomolare EGF-Biotin-Lösung und stellen Sie sie für drei Minuten zurück in den Inkubator, da die Zellen damit beginnen, das mit EGF markierte EGFR zu internalisieren.

Spülen Sie die Mikrochips dreimal schnell mit PBS. Anschließend spülen Sie die Proben mit 0,1 molarer Cate-Pufferlösung oder CB. Danach überführen Sie die Mikrochips in 3 % PFA und inkubieren sie 10 Minuten lang.

Nachdem die Chips einmal mit CB und dreimal mit PBS gespült wurden, überführen Sie die Chips in G-L-Y-P-B-S und inkubieren sie zwei Minuten lang. Anschließend spülen Sie zweimal mit PBS. Danach legen Sie die Mikrochips in 10 NANOMOLAR S-T-R-Q-D für 10 Minuten, bevor Sie viermal mit B-S-A-P-B-S spülen.

Tauchen Sie dann einen Mikrochip in eine Glasboden-Kulturschale mit 35 Millimeter Durchmesser, die vorab mit BSA-PBS bei Raumtemperatur gefüllt wurde, um die Zellen mittels DIC und Fluoreszenzmikroskopie abzubilden. Verwenden Sie ein 40×-Luftobjektiv für Übersichtsaufnahmen von Zellen, die mit QD 655 markiert sind. Nutzen Sie einen Filterkubus, der die Quantenpunkte zwischen 340 und 380 Nanometern anregt und eine Emission oberhalb von 420 Nanometern ermöglicht.

Reduzieren Sie die Lichtintensität, um zwei intensive Lichtquellen zu vermeiden, die die Probe beschädigen könnten. Stellen Sie die Belichtungszeit auf mindestens 300 Millisekunden ein, damit die Signale aller QDs erfasst werden, da die QD-Fluoreszenz blinkt; passen Sie die Lichtintensität und die Verstärkung so an, dass helle Bilder ohne sichtbares Bildrauschen entstehen, wobei die Lichtintensität minimiert wird. Nach der Aufnahme stellen Sie den Mikrochip zurück in eine 96-Loch-Platte mit B-S-A-P-B-S.

Einmal in CB spülen, dann eine 2%ige Glutaraldehydlösung hinzufügen und weitere 10 Minuten inkubieren. Waschen und CB verwenden, um den Mikrochip mit BSA-PBS dreimal zu waschen; anschließend in mit BSA-PBS vorgefüllten Vertiefungen einer neuen 96-Loch-Platte je Mikrochip lagern. Eine Reihe mit vier Vertiefungen mit HPLC-reinem Wasser füllen.

Nachdem das ESEM gemäß dem Textprotokoll eingerichtet wurde, laden Sie eine Probe in die Vor-COOL-ESEM-STEM-Stufe, indem Sie die 96-WAT-Platte aus dem Kühlbehälter nehmen und in die Nähe der geöffneten ESEM-Stufe stellen. Legen Sie ein Reinraumtuch daneben. Spülen Sie einen Mikrochip schnell ab, indem Sie ihn viermal für jeweils eine Sekunde in eine mit HPLC-Reinstwasser gefüllte Vertiefung eintauchen.

Blotter Sie die Rückseite des Mikrochips kurz auf das Papier und legen Sie ihn in die vorgekühlte Halterung mit drei Mikrolitern gekühltem HPLC-Reinstwasser. Benetzen Sie die Oberfläche der Probe und befestigen Sie die Probe in der Halterung. Geben Sie anschließend drei weitere Wassertropfen zu je drei Mikrolitern in die Nähe der Probe auf die Halterung und schließen Sie die Probenkammer.

Nachdem eine Zelle von Interesse identifiziert wurde, gemäß dem schriftlichen Protokoll ein STEM-Übersichtsbild der Zelle aufnehmen, in einen peripheren Bereich der Zelle wechseln, wo die Zellgrenze sichtbar ist, und auf eine 50.000-fache Vergrößerung heranzoomen. Bilder aufnehmen, die einzelne QDs zeigen, und dabei Pixel-Verweilzeiten von 20 bis 30 Mikrosekunden verwenden. Dargestellt sind hier QD 655-markierte, membranständige EGFR in intakten, vollständig hydratisierten COS-7-Zellen. Das DIC-Bild veranschaulicht die Membrantopographie der Zellen, und das entsprechende Fluoreszenzbild zeigt die Verteilung von EGFR über die gesamte Zelloberfläche nach dreiminütiger Inkubation mit EGF-Biotin.

Diese ESEM-STEM-Bilder mit niedriger Vergrößerung zeigen feine Strukturen wie von der Zelle zu benachbarten Zellen reichende Filopodien sowie einige Strukturen in den dünneren Zellbereichen. Starke zentrale Zellbereiche, einschließlich des Zellkerns, erscheinen weiß, da eine Durchstrahlung der Probe für Elektronen der verwendeten Energie nicht möglich ist. Hohe Auflösung.

ESEM-STEM-Aufnahmen der dünneren peripheren Bereiche zeigen QD-Markierungen an einer Membranfalte, die diagonal durch das Bild verläuft. Diese Membranstruktur weist an mehreren Stellen eine höhere EGFR-Dichte auf als die umgebenden Membranbereiche, wobei sich zwei Markierungen in unmittelbarer Nähe zueinander befanden. Zwei Beispiele mit Abständen von 20 und 24 Nanometern sind mit Pfeilspitzen gekennzeichnet.

Diese Paare von Markierungen werden als zu EGFR-Fers gehörend interpretiert. Diese Aufnahme wurde von einer Region mit geringerer EGFR-Dichte und schwächerem Fluoreszenzsignal angefertigt. Dennoch wurde EGFR auch hier in Dimere sowie in zwei Clustern mit jeweils 10 oder 11 EEG gefunden.

Wenn die Probenpräparation einmal beherrscht ist, kann sie innerhalb von zwei Stunden durchgeführt werden, was deutlich schneller ist als die üblicherweise verwendeten Techniken für die Elektronenmikroskopie. Die anschließende STEM-Aufnahme kann innerhalb eines halben Tages bis zu 100 hochauflösende Bilder liefern.