In-vitro-Erzeugung von Murine Plasmazytoide dendritischen Zellen aus Lymphoid Gemeinsame Vorläufern mit der AC-6-Feeder-System

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine effiziente Methode zur Erzeugung plasmazytoider dendritischer Zellen oder PDCs zur Untersuchung ihrer Entwicklung bereitzustellen. Diese Methode kann bei der Beantwortung zentraler Fragen im Immunologiebereich helfen, beispielsweise: Wie wird die Entwicklung der PDCs reguliert? Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die Verwendung einer geringen Anzahl von Vorläuferzellen ermöglicht, um effizient große Mengen an PDCs zu erzeugen.

Die Implikationen dieser Technik betreffen die Therapie von mit PDC assoziierten Autoimmunerkrankungen wie systemischem Lupus, Athetose und Psoriasis. Die Durchführung des Verfahrens demonstriert heute Xang, ein hervorragender Student aus dem Labor. Am Tag vor der Knochenmarkzellgewinnung säen Sie 5,9 × 10⁴ Zellen der stromalen Zelllinie AC6 pro Vertiefung in einzelne Vertiefungen von 12-Loch-Platten aus und inkubieren die Platten über Nacht bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid. Am nächsten Morgen bestrahlen Sie die AC6-Zellen mit 3000 rad Gammastrahlung und ersetzen das Kulturmedium durch ein Milliliter vollständiges Medium.

Stellen Sie als Nächstes die entsprechende Anzahl erwachsener Wildtyp C57BL/6-Mäuse in eine Präparierschale und desinfizieren Sie die Tiere mit 70 % Ethanol. Bringen Sie die Schale dann in eine halb sterile Haube und führen Sie Schnitte in den mittleren Bauchbereichen jedes Tieres durch, entfernen Sie die Haut von den distalen Abschnitten einschließlich der unteren Extremitäten, um Femur und Tibia freizulegen, schneiden Sie das Femur oberhalb und die Tibia unterhalb der Kniegelenke ab und lösen Sie mit einer Schere die Muskulatur von den Knochen, während diese gesammelt werden. Legen Sie die Knochen in eine 6 cm große Petrischale, die 5 mL vollständiges RPMI enthält, und überführen Sie die Petrischale in eine sterile Zellkulturhaube.

Füllen Sie nun eine Drei-Milliliter-Spritze, die mit einer 27-Gauge-Nadel ausgestattet ist, mit komplettem RPMI und schneiden Sie mit einer Schere beide Enden jedes Knochens ab. Führen Sie die Nadel in jeden Knochen ein und spülen Sie das Mark durch eine vorsichtige Injektion von komplettem RPMI einmal von jedem Ende aus. Danach aspirieren und dispensieren Sie die Zellen ohne Nadel vorsichtig drei bis fünf Mal in der Kulturschale, um eine Einzelzell-Suspension herzustellen.

Nachdem die Zellen abzentrifugiert wurden, lyse die roten Blutkörperchen mit einem Milliliter CK-Puffer und stoppe die Reaktion durch Zugabe von 10 Volumina vollständigem RPMI. Lasse nach einer Minute die abgestorbenen Zellaggregate und Trümmer fünf Minuten lang sedimentieren und dekantiere vorsichtig den Überstand in ein neues Gefäß. Danach werden die Zellen erneut abzentrifugiert und die gesamten Knochenmarkzellen in 100 Mikroliter Fax-Puffer resuspendiert, um die gemeinsamen lymphoiden Vorläuferzellen (CLPs) mittels Durchflusszytometrie zu analysieren.

Als nächstes blockieren Sie die Zellen mit Anti-CD-16 bis 32 für ein bis zwei Minuten, gefolgt von der simultanen Färbung der Zellen mit dem geeigneten Antikörpercocktail. Nach 15 Minuten auf Eis waschen Sie die Zellen in drei Milliliter Fax-Puffer und resuspendieren das Pellet in 300 Mikroliter frischem Fax-Puffer. Anschließend filtrieren Sie die Zellsuspension durch einen 40-Mikrometer-Filter und sortieren die Zellen unverzüglich mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung der geeigneten Filter und Spannungen.

Die Zellen des Interesses in einem 15-Milliliter-Röhrchen sammeln, das acht Milliliter komplettes RPMI enthält. Um eine stark angereicherte PDCM-Population zu erzeugen, ist es entscheidend, die richtige Population an CLPs aus dem gewonnenen Knochenmarkzellgemisch mittels Zellsortierung zu isolieren, um sie anschließend in vitro mit einem Z-sechs-Feeder-System zu kultivieren. Am Ende der Sortierung die Zellen abzentrifugieren und das CLP-Zellpellet in ausreichend komplettem RPMI erneut suspendieren, um eine Zelldichte von etwa fünf mal 10 hoch vier Zellen pro Milliliter zu erhalten.

Ansäen Sie anschließend 500 Zellen pro Vertiefung in die 12-Loch-Platte, die die AC6-Fütterungszellen enthält, und ergänzen Sie die Koinkubationen mit 100 Nanogramm pro Milliliter FL3-Ligand. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid, wobei die Entwicklung der dendritischen Zellen oder DC periodisch visuell mittels Mikroskop überwacht wird. Am Tag 12 sammeln Sie die Zellen aus dem Koinkubationsüberstand und waschen jede Vertiefung einmalig mit einem halben Milliliter vollständigem RPMI-Medium, wobei Sie das resultierende Überstandvolumen und die Waschungen sammeln. Geben Sie dann je eine halbe Milliliter frisches Medium in jede Vertiefung und lösen Sie die anhaftenden Zellen mittels eines Zellkratzers ab.

Kombinieren Sie die abgelösten Zellen mit den schwebenden Zellen und zentrifugieren Sie die resultierende Zellsuspension. Resuspendieren Sie das Pellet in 50 µL Fax-Puffer. Anschließend zählen Sie die Zellen und färben sie nach FC-Blocking für die Expression von CD 11 C, CD 11 b und B zwei 20.

Wie soeben gezeigt, können die Kulturzellen anschließend auf das Vorhandensein konventioneller CD11c-positiver, CD11b-positiver, B220-negativer und plasmazytoider CD11c-positiver, CD11b-negativer, B220-positiver DC-Populationen analysiert werden, insgesamt vier bis sechs Mal 10 hoch 7. Knochenmarkszellen werden typischerweise aus den Femora und Tibiae einer sechs bis acht Wochen alten wildtypischen C57BL/6-Maus isoliert, wobei üblicherweise fünf Mal 10 hoch 4 CLPs aus einer C57BL/6-Maus gewonnen werden. Nach der Sortierung mittels Durchflusszytometrie, wie gerade beschrieben, erscheinen ab Tag drei bis vier der Kultur mit AC6-Stromazellen die cobblestone area bildenden Zellen, auf deren Oberfläche runde, suspendierte plasmazytoide DCs sichtbar werden.

Am achten Tag erreicht die Zahl der plasmazytoiden DCs um den 12. bis 14. Tag herum einen Höhepunkt, woraufhin die Zellen nach ihrer vollständigen Entwicklung mit der Apoptose beginnen und ihre Anzahl allmählich abnimmt. Konventionelle DC-Kolonien erscheinen später, am sechsten bis achten Tag, und sind adhärent mit einer größeren, spindelartigen Morphologie. Die Durchflusszytometrie zeigt, dass die Koinkulturen zu 91 % CD11c-positiv, CD11b-negativ, B220-positiv (plasmazytoide DCs) und zu 6 % CD11c-positiv, CD11b-positiv, B220-negativ (konventionelle DCs) sind, was eine 100-fache Vermehrung der plasmazytoiden DCs gegenüber der ursprünglichen CLP-Population mittels dieser Methode belegt.

Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig sicherzustellen, dass sich die a c six-Zelle in gutem Zustand befindet und die C-Dichte korrekt ist, bevor nach einer Differenzierung das clp hinzugefügt wird. Diese Technik ebnete den Forschern in der DC-Biologie den Weg, um die Einschränkung der Verwendung einer geringen Anzahl von Vorläufern zur Untersuchung der DC-Entwicklung aus verschiedenen Vorläufern zu überwinden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man PCs in vitro aus CLP unter Verwendung eines C six BEAT-Systems erzeugt.