Name: In-vitro-Erzeugung von Murine Plasmazytoide dendritischen Zellen aus Lymphoid Gemeinsame Vorläufern mit der AC-6-Feeder-System (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-23T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Erfahren Sie die effiziente In-vitro-Generierung von Plasmazytoide dendritischen Zellen aus lymphoiden Vorläufern mit dem AC-6-Feeder-System. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von pDC-Entwicklung und Autoimmunerkrankungen.

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Wir danken Drs. Markus Manz und Irving Weissman für die Bereitstellung von Reagenzien. Der Service von der Analyse über Durchflusszytometrie und Zellsortierung Core Facility des ersten und zweiten Kern Laboratory an der National Taiwan University College of Medicine und NTU Krankenhaus zur Verfügung gestellt Wir erkennen auch auf. Diese Arbeit wurde durch das Ministerium für Wissenschaft und Technologie, Taiwan unterstützt (MOST 102-2320-B-002-030-MY3) und den Nationalen Gesundheitsforschungsinstitute, Taiwan (NHRI-EX102-10256SI und NHRI-EX103-10256SI).

C57BL / 6-Wildtyp-Mäuse wurden von der National Laboratory Animal Center (NLAC), Taiwan gekauft. Alle Mäuse wurden gezüchtet und unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen gehalten. Protokolle und Tiernutzung Verfahren wurden überprüft und von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss der National Taiwan University College of Medicine (Permit-Nummer: 20120075) zugelassen. Darüber hinaus machte die Forscher alles tun, um das Potenzial für die Schmerzen, Leiden oder Angst bei den Tieren zu reduzieren, während die Durchführung von Experimenten. Alle beschriebenen Verfahren wurden bei RT mit Handschuhen. 1. Herstellung von AC-6 Feeder-Zellen Hinweis: Die AC-6.21 (AC-6 in kurzen) Stromazelllinie 18 (von I. Weissman, der Stanford University zur Verfügung gestellt) sollten in RPMI aufrechterhalten werden, ergänzt mit 15% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS). Als Feeder-Zellen dienen, sind AC-6-Zellen γ-bestrahlt mit 3000 rad (30Gy) einen Tag vor der Co-Kultur, um ihre Verbreitung zu verhindern. Hinweis thbei AC-6 Zellen neigen dazu, ihre Differenzierung unterstützende Fähigkeit zu verlieren, wenn bei der Wartung überfüllten verlassen, oder wenn ihre Durchgang Nummer ist über 20. <ol><li> Wasch AC-6 Zellen einmal mit 1 ml Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS) gewaschen und durch Absaugen zu entfernen DPBS. Behandlung von AC-6-Zellen mit 0,8 ml Trypsinlösung (0,05% Trypsin und 0,5 mM EDTA in DPBS) für 3-5 Minuten bei 37 ° C, 5% CO 2 und stoppt dann die Reaktion durch mit 10 Volumina Kulturmedium zu verdünnen machen Einzelzellsuspension. </li><li> Samen AC-6-Zellen bei 5.9x10 4 Zellen / Well in 12-Well-Platten und Inkubieren bei 37 ° C, 5% CO &amp; sub2; O / N. Anmerkung: Die Dichte des AC-6-Zellen ist sehr wichtig, da eine geringere Dichte wird cDC- Erzeugung begünstigen. Aussaat mit einer Dichte von 5.9x10 4 Zellen / Vertiefung ermöglicht AC-6 bis zur Konfluenz am nächsten Tag, die optimal für die Ableitung pDCs von CLPs ist zu erreichen. </li><li> Bestrahlen AC-6-Zellen mit 3000 rad (30 Gy) unter Verwendung von γ-Bestrahlungsvorrichtung. Notiz: Das zur AC-6 bestrahlen Dosis ist optimiert, um die Zellen aus proliferierenden zu verhindern und dennoch tragfähig zu halten sie lange genug, um die für die Differenzierung der DCs von CLPs erforderlich Zytokine und Zell-Zell-Kontakt. </li><li> Saugen Sie Medium und ersetzen mit 1 ml komplettem RPMI (RPMI mit 10% hitzeinaktiviertem FBS, 50 ug / ml Gentamycin und 50 uM β-Mercaptoethanol). </li></ol> 2. Isolieren BM Zellen von Mäusen <ol><li> Opfern Mäuse durch CO 2 Ersticken und Genickbruch. Platzieren Sie die Maus auf eine Dissektion Tablett und sterilisieren mit 70% Ethanol. Einen Einschnitt in der Mitte der Unterleib und entfernen Sie die Haut von dem distalen Teil der Maus, einschließlich der Haut, die die unteren Extremitäten. </li><li> Sezieren Mäuse in einem semi-sterile Haube. Um den Oberschenkel und Schienbein zu lösen, Clip den Oberschenkelknochen und Schienbeine oben unterhalb des Kniegelenks. Lösen Sie die Muskeln von den Knochen mit einer Schere und legen Sie die Knochen in einer 6 cm Petrischale mit 5 ml RPMI abzuschließen. </li><li> Gehen Sie zu einem sterilen Kultur Kapuze. Füllen Sie ein 3-ml-Spritze mit einer 27G Nadel mit komplettem RPMI verbunden. Schneiden Sie die beiden Enden der Knochen mit einer Schere, und legen Sie die 27G Nadel, um das Mark aus den Knochen durch leichtes Einspritzen von komplettem RPMI einmal von jedem Ende zu spülen. </li><li> Vorbereitung einer Einzelzellsuspension durch vorsichtiges Pipettieren die Zellen auf und ab 3-5 mal in der Kulturschale mit der Spritze ohne Nadel. </li><li> Zentrifugieren die Zellen 5 min bei 500 xg und dekantiert den Überstand. </li><li> Lyse der roten Blutzellen, die mit 1 ml ACK-Puffer (150 mM NH 4 Cl, 10 mM KHCO 3, 0,1 mM EDTA) Inkubation für 1 min und Abstoppen der Reaktion durch Verdünnen mit 10 Volumina komplettem RPMI. Lassen Sie Zellen für 5 Minuten, um durch die Schwerkraft zu pelletieren tot Zellklumpen und Gewebereste stehen. Hinweis: Stellen Sie sich nicht mehr als 5 Minuten, da dies in der Zellverlust durch Absetzen der lebensfähigen Zellen führen. </li><li> Langsam decant zellhaltige Überstand in ein neues Röhrchen verlassen Trümmerhinter der original tube. </li><li> Zentrifugieren Sie für 5 Minuten bei 500 xg, um die Zellen zu pelletieren, dann entfernen und den Überstand verwerfen. </li><li> Resuspendieren Gesamt BM-Zellen in 100 &amp; mgr; l FACS-Puffer (1 × PBS + 2% FBS + 1 mM EDTA) (typischerweise 4-6 × 10 7 Zellen werden aus BM eine Maus erhalten wurde). </li></ol> 3. FACS Analyse und Sortierung der CLP <ol><li> Fügen Sie anti-CD16 / 32 (Hybridom-Überstand Clone 2.4G2, 50 ul / Reaktion oder 1-2 ug / Reaktion) in Zellen in FACS-Puffer (Schritt 2.9) für 1-2 min, um Fc-Rezeptoren zu blockieren. Hinweis: Anti-CD16 / 32 ist auch Fc-Block, der zugegeben wird, um nicht-spezifische Bindung von Antikörpern an Zellen, die Fc-Rezeptoren, einschließlich Granulozyten, Monozyten und B-Lymphozyten zu verhindern bezeichnet. </li><li> Gleichzeitig gefärbt werden Zellen mit den folgenden Fluoreszenzfarbstoff markierten Antikörpern (für 4x10 7 Zellen) für 15 Minuten auf Eis unter Vermeidung Umgebungslicht. Antikörper: PE-konjugierten Lineage Marker (jeweils 0,2 ug), das anti-CD3 (17A2), anti-CD8 (53-6.7), anti-B220 (RA3-6B2), anti-CD19 (eBio1D3), anti-CD11b (M1 / 70), Anti-Gr-1 (RB6-8C5), anti- Thy1.1 (HIS51), anti-NK1.1 (PK136), anti-TER119 (TER-119) und anti-MHC-II (NIMR-4), 0,2 &amp; mgr; g anti-c-Kit-PerCP-Cy5.5 (2B8), 1 &amp; mgr; g anti-Sca-1-FITC (D7), 0,4 &amp; mgr; g anti-M-CSFR-APC (AFS98) und 0,2 &amp; mgr; g anti-IL-7Rα-PE-Cy7 (A7R34). </li><li> Wasche die Zellen mit 3 ml FACS-Puffer und Zentrifuge für 5 Minuten bei 500 x g. </li><li> Die Zellen in 300 ul FACS Puffer und Filterzellen durch ein 40 &amp; mgr; M Zellsieb. </li><li> Waschen Sie die Röhrchen mit einem zusätzlichen 100 ul FACS-Puffer, um alle verbleibenden Zellen zu gewinnen und die Filter in eine sterile FACS-Sortierung Rohr mit der gleichen Zellsieb. </li><li> Führen Durchflusszytometrieanalyse unmittelbar nach der Färbung mit entsprechenden Filtern und Spannungen zur Signalerfassung. Verwenden 488 nm-Laser, um die FITC-PerCP-Cy5.5-markierten Antikörpern, 561 nm-Laser, um die PE- und PE-Cy7-labelded Antikörper und 633 nm erfassen laser, um die APC-markierten Antikörper zu erkennen. </li><li> Sortieren Sie CLP nach folgenden Marker lin - c-kit int Sca-1 int M-CSFR - IL-7Rα + (wie in Schritt 3.2 gefärbt) mit einem Zellsortierer. Sammeln der sortierten Zellen in ein 15 ml Röhrchen, enthaltend 8 ml komplettem RPMI als Polster. </li><li> Erfassen die absolute Anzahl der sortierten Zellen durch den Zellsortierer am Ende des Durchlaufs angezeigt. Typischerweise kann 5x10 4 CLP vom BM einer Maus gewonnen werden. </li></ol> 4. Cokultur CLP und AC-6 <ol><li> Zentrifugieren Sie die sortierten Zellen aus Schritt 3.7 für 10 Minuten bei 500 xg, entfernen Sie den Überstand und Zellpellet mit genügend komplettem RPMI um eine Zelldichte in der Umgebung von 5x10 4 Zellen / ml zu erhalten. Seed 500 Zellen / Well in 12-Well-Platte mit Feeder-Zellen in Schritt 1.4 vorbereitet. </li><li> In 100 ng / ml FL 19 (hu-Flt3L-Ig in-house mit einem Expressionssystem von M. Manz, Universi unsere Anbieterty Spital Zürich, Schweiz) und bei 37 ° C, 5% CO 2 mit periodischen visuelle Überwachung der DC Entwicklung unter dem Mikroskop. Anmerkung: Im Handel erhältliche rekombinante menschliche FL oder Maus FL kann als Ersatz für hu-Flt3L-Ig DC Entwicklung bereitgestellt werden können. </li><li> Sammeln der Zellen im Überstand am Tag 12 und Waschen der Wells einmal mit 0,5 ml RPMI-Medium Kombinieren der resultierenden Überstände zu vervollständigen. 0,5 ml frisches Medium und Schrott, die haftenden Zellen mit einem Zellschaber. </li><li> Verbinden die Zellen enthaltenden Mediums aus beiden Teilen und Zentrifuge für 5 Minuten bei 500 x g. </li><li> Dekantieren und resuspendieren Zellen in 50 ul FACS-Puffer. In 50 ul anti-CD16 / 32 Hybridomüberstand und Inkubation für 1-2 Minuten an Fc-Rezeptoren zu blockieren. </li><li> Aufzuzählen und färben alle Zellen mit den folgenden Antikörpern (jeweils 0,05 ug) Anti-CD11c-APC (N418), Anti-CD11b-FITC und anti-B220-PE. </li><li> Waschen und Zentrifuge die Zellen wie beschriebend in Schritt 3.3. </li><li> Die Zellen in 100 ul FACS-Puffer, Tor auf CD11c + und zu analysieren, für cDCs (CD11c + CD11b + B220 -) und pDCs (CD11c + CD11b - B220 +) 17. </li></ol>

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Autoren haben nichts offenzulegen.

Hier beschreiben wir ein in-vitro-Kultursystem für die robuste Erzeugung von DCs und pDCs insbesondere aus einer kleinen Anzahl von CLPs. Die Einzigartigkeit dieses Kultursystem ist auf die Verwendung von AC-6-Zellen, eine Stromazelllinie, Speiser. Diese Vorgehensweise hat sich gezeigt, dass nicht nur die Cytokine, wie IL-7, SCF, M-CSF und FL 20 vorzusehen, sondern auch die Zell-Zell-Kontakt 21 notwendig DC Entwicklung zu unterstützen. AC-6 Zellen wurden zuvor verwendet, um die Untersuchun...

Dendritische Zellen (DCs) sind professionelle Antigen-präsentierende Zellen, die bei der Kontrolle der Immunantwort 1 eine wichtige Rolle spielen. Während DCs sind heterogen, sie können grob in zwei Populationen klassifiziert werden, herkömmliche DCs (cDCs) und plasmazytoiden DCs (pDCs) 2,3. Zusätzlich zu lymphoiden Organen, sind cDCs und pDCs auch in Geweben, einschließlich Lunge, Darm, Haut und 2 gefunden. Die Morphologie cDCs und pDCs unterscheidet, mit cDCs aufweist Dendriten artigen Vorsprünge und die Form pDCs wobei mehrere Plasmazellenartigen. Darüber hinaus wird der gemeinsame Maus DC Marker, CD11c, stärker auf als auf pDCs cDCs ausgedrückt. CDCs und CD11b - - CD24 + cDCs, die beide exprimieren höhere Niveaus von MHC-Klasse II und kostimulatorische Moleküle als dies pDCs 2 kann darüber hinaus weiter in cDCs CD11b + CD24 teilen. Reife pDCs, andererseits hat sich gezeigt, selektiv auszudrücken Siglec-H und BST2 4. Functionally sind cDCs besser Antigen-präsentierenden Zellen sind als pDCs; jedoch können pDCs eine große Menge an Typ I Interferon bei der Virusinfektion oder entzündlichen Stimulation 5 zu produzieren. Beide cDCs und pDCs sind kurzlebig und müssen deshalb ständig von Vorläufern im Knochenmark (BM) 6,7 nachgefüllt werden. Adoptiven Transfer von gemeinsamen myeloischer Stammzellen (CMPs) und gemeinsame lymphoide Vorläuferzellen (CLP) in letal bestrahlten Mäusen zeigt, dass cDCs und pDCs kann von beiden Abstammungslinien 8-10 erzeugt werden. Jedoch gibt es eine Untergruppe von pDCs die RAG1 / 2 ausdrücken und besitzen umge DJ Abschnitte der IgH-Locus 11,12. Diese Zellen teilen auch molekulare Ähnlichkeit mit B-Lymphozyten, einschließlich Ausdruck der B220 Marker, Nukleinsäure-Sensing-Rezeptoren (TLR7 / TLR9) und Transkriptionsfaktoren (SPIB und BCL11A) 13, verfügt über alle geglaubt, um Unterschriften der lymphoiden Linie zu sein. Daher CLPs kann eine gute Wahl für in-vitro-Erzeugung von pDCs wegen der Abstammung Ähnlichkeit zu sein. Während die Frequenz der beiden cDCs und pDCs bei Mäusen und Menschen ist sehr gering 6 DCs, insbesondere cDCs kann in vitro aus BM oder Vorläuferzellen in der Gegenwart von Cytokinen, wie GM-CSF 11,14 oder Flt3-Liganden erzeugt werden (FL ) unter Verwendung von Feederfreie Systeme 11,15,16. Leider ist es jedoch nicht möglich, eine große Anzahl von pDCs in vitro unter Verwendung von FL 11,15,16 herzustellen. Bisher haben wir gezeigt, dass pDCs effizient in vitro aus CLP mit der AC-6 Speisesystem 17 erzeugt werden. Der Vorteil der Verwendung der AC-6 Stromazelllinie im Kultursystem ist, dass er Zell-Zell-Kontakt und die Sekretion von Cytokinen, die die Erzeugung einer großen Zahl von pDCs von CLPs Unterstützung bietet. Obwohl die Produktion mit diesem System ist sehr robust, ist eine sorgfältige Replikation der Verfahren unten beschrieben erforderlich in, um eine effiziente Erzeugung von pDCs gewährleisten.

<table><tbody><tr><td>Anti-Maus Ly6g/Ly6c (PE), Klon RB6-8C5</td><td>Biolegend</td><td>108408</td><td>Abstammungsmarkierung</td></tr><tr><td>Anti-Maus NK1.1 (PE), Klon PK136</td><td>Biolegend</td><td>108708</td><td>Abstammungsmarkierung</td></tr><tr><td>Anti-Maus&nbsp; CD11b (PE), KlonM1/70</td><td>Biolegend</td><td>101208</td><td>Abstammungsmarkierung</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD19 (PE), Klon eBio1D3</td><td>Biolegend</td><td>115508</td><td>Abstammungsmarkierung</td></tr><tr><td>Anti-Maus B220 (PE), Klon RA3-6B2</td><td>Biolegend</td><td>103208</td><td>Abstammungsmarkierung/FACS</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD3 (PE), Klon 17A2</td><td>Biolegend</td><td>100308</td><td>Abstammungsmarkierung</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD8a (PE), Klon 53-6.7</td><td>Biolegend</td><td>100707</td><td>Abstammungsmarkierung</td></tr><tr><td>Anti-Maus MHC-II (PE), Klon NIMR-4</td><td>Biolegend</td><td>107608</td><td>Abstammungsmarkierung</td></tr><tr><td>Anti-Maus Ter119 (PE), Klon TER-119</td><td>Biolegend 116208</td><td></td><td>Abstammungsmarkierung</td></tr><tr><td>Anti-Maus Thy1.1 (PE), Klon HIS51</td><td>eBioscience</td><td>12-0900-83</td><td>Abstammungsmarkierung</td></tr><tr><td>Anti-Maus M-CSFR (APC), Klon AFS98</td><td>Biolegend</td><td>135510</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Anti-Maus C-Kit (PerCP/Cy5.5), Klon 2B8</td><td>Biolegend</td><td>105824</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Anti-Maus Sca-1 (FITC), Klon D7</td><td>Biolegend</td><td>108106</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Anti-Maus IL-7Ra (PE/Cy7), Klon A7R34</td><td>Biolegend</td><td>135014</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD11c (PerCP/Cy5.5), Klon N418</td><td>Biolegend</td><td>117328</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Anti-Maus CD11b (FITC), Klon M1/70</td><td>Biolegend</td><td>101206</td><td>FACS</td></tr><tr><td>FACSAria III</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Zellsortierer</td></tr><tr><td>FACS-Sortierröhrchen&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo LLC</td><td></td><td>Durchflussanalyse-Software</td></tr></tbody></table>

in-vitro-erzeugung von murine plasmazytoide dendritischen zellen aus lymphoid gemeinsame vorläufern mit der ac-6-feeder-system

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

Plasmazytoiden dendritischen Zellen (pDC) sind starke Typ I Interferon (IFN-I) Herstellung von Zellen, die in Reaktion auf eine Infektion oder bei entzündlichen Reaktionen aktiviert werden. Leider wird Studium der PDC-Funktion durch ihre niedrigen Frequenz in lymphatischen Organen behindert, und die bestehenden Verfahren zur in-vitro-DC Generation überwiegend zugunsten der Produktion von cDCs über pDCs. Hier präsentieren wir einen einzigartigen Ansatz, um effizient zu erzeugen pDCs von gemeinsamen lymphatischen Vorläuferzellen (CLP) in vitro. Speziell beschriebene Protokolldetails, wie CLPs aus dem Knochenmark zu reinigen und zu erzeugen pDCs kokultiviert mit γ-bestrahlten AC-6-Feeder-Zellen in Gegenwart von Flt3-Liganden. Ein einzigartiges Merkmal dieses Kultursystems ist, dass die CLPs wandern unter den AC-6-Zellen und werden gepflasterten Fläche bildenden Zellen, ein kritischer Schritt zur Erweiterung pDCs. Morphologisch DCs, nämlich pDCs und cDCs wurden mit einer Zusammensetzung aus 7 erzeugte nach ca. 2 Wochen0-90% pDCs unter optimalen Bedingungen. Typischerweise ist die Anzahl der pDCs durch dieses Verfahren erzeugte etwa 100-fachen der Anzahl der CLPs ausgesät. Daher ist dies ein neuartiges System, das eine robuste erzeugen die eine große Zahl von pDCs erforderlich, weitere Untersuchungen über die Entwicklung und Funktion der Zellen zu erleichtern.

Insgesamt 4-6x10 7 BM-Zellen werden typischerweise aus Oberschenkelknochen und Schienbein einer 6-8 Wochen alten Wildtyp C57BL / 6-Maus isoliert. Zu sortieren, CLP, sind insgesamt BM-Zellen mit PE-konjugierten Antikörpern gegen Linie Marker (CD3, CD8, B220, CD19, CD11b, Gr-1, Thy1.1, NK1.1, TER119 und MHC-II), anti gebeizt c-kit-PerCP / Cy5.5, anti-Sca-1-FITC, anti-M-CSFR-APC und Anti-IL-7Rα-PE / Cy7, analysiert und sortiert werden mit einem Zellsortierer. Die Sortierstrategie für CLP ist in Abbildung...

In dieser Studie stellen wir ein in vitro Kultursystem vor, das effizient pDCs erzeugen kann, indem gemeinsame lymphoide Vorläuferzellen mit AC-6-Feederzellen in Gegenwart von Flt3-Liganden co-kultiviert werden.

In-vitro-Erzeugung von Murine Plasmazytoide dendritischen Zellen aus Lymphoid Gemeinsame Vorläufern mit der AC-6-Feeder-System

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine effiziente Methode zur Erzeugung plasmazytoider dendritischer Zellen oder PDCs zur Untersuchung ihrer Entwicklung bereitzustellen. Diese Methode kann bei der Beantwortung zentraler Fragen im Immunologiebereich helfen, beispielsweise: Wie wird die Entwicklung der PDCs reguliert? Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die Verwendung einer geringen Anzahl von Vorläuferzellen ermöglicht, um effizient große Mengen an PDCs zu erzeugen.Die Implikationen dieser Technik betreffen die Therapie von mit PDC assoziierten Autoimmunerkrankungen wie systemischem Lupus, Athetose und Psoriasis. Die Durchführung des Verfahrens demonstriert heute Xang, ein hervorragender Student aus dem Labor. Am Tag vor der Knochenmarkzellgewinnung säen Sie 5,9 × 10⁴ Zellen der stromalen Zelllinie AC6 pro Vertiefung in einzelne Vertiefungen von 12-Loch-Platten aus und inkubieren die Platten über Nacht bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid. Am nächsten Morgen bestrahlen Sie die AC6-Zellen mit 3000 rad Gammastrahlung und ersetzen das Kulturmedium durch ein Milliliter vollständiges Medium.Stellen Sie als Nächstes die entsprechende Anzahl erwachsener Wildtyp C57BL/6-Mäuse in eine Präparierschale und desinfizieren Sie die Tiere mit 70 % Ethanol. Bringen Sie die Schale dann in eine halb sterile Haube und führen Sie Schnitte in den mittleren Bauchbereichen jedes Tieres durch, entfernen Sie die Haut von den distalen Abschnitten einschließlich der unteren Extremitäten, um Femur und Tibia freizulegen, schneiden Sie das Femur oberhalb und die Tibia unterhalb der Kniegelenke ab und lösen Sie mit einer Schere die Muskulatur von den Knochen, während diese gesammelt werden. Legen Sie die Knochen in eine 6 cm große Petrischale, die 5 mL vollständiges RPMI enthält, und überführen Sie die Petrischale in eine sterile Zellkulturhaube.Füllen Sie nun eine Drei-Milliliter-Spritze, die mit einer 27-Gauge-Nadel ausgestattet ist, mit komplettem RPMI und schneiden Sie mit einer Schere beide Enden jedes Knochens ab. Führen Sie die Nadel in jeden Knochen ein und spülen Sie das Mark durch eine vorsichtige Injektion von komplettem RPMI einmal von jedem Ende aus. Danach aspirieren und dispensieren Sie die Zellen ohne Nadel vorsichtig drei bis fünf Mal in der Kulturschale, um eine Einzelzell-Suspension herzustellen.Nachdem die Zellen abzentrifugiert wurden, lyse die roten Blutkörperchen mit einem Milliliter CK-Puffer und stoppe die Reaktion durch Zugabe von 10 Volumina vollständigem RPMI. Lasse nach einer Minute die abgestorbenen Zellaggregate und Trümmer fünf Minuten lang sedimentieren und dekantiere vorsichtig den Überstand in ein neues Gefäß. Danach werden die Zellen erneut abzentrifugiert und die gesamten Knochenmarkzellen in 100 Mikroliter Fax-Puffer resuspendiert, um die gemeinsamen lymphoiden Vorläuferzellen (CLPs) mittels Durchflusszytometrie zu analysieren.Als nächstes blockieren Sie die Zellen mit Anti-CD-16 bis 32 für ein bis zwei Minuten, gefolgt von der simultanen Färbung der Zellen mit dem geeigneten Antikörpercocktail. Nach 15 Minuten auf Eis waschen Sie die Zellen in drei Milliliter Fax-Puffer und resuspendieren das Pellet in 300 Mikroliter frischem Fax-Puffer. Anschließend filtrieren Sie die Zellsuspension durch einen 40-Mikrometer-Filter und sortieren die Zellen unverzüglich mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung der geeigneten Filter und Spannungen.Die Zellen des Interesses in einem 15-Milliliter-Röhrchen sammeln, das acht Milliliter komplettes RPMI enthält. Um eine stark angereicherte PDCM-Population zu erzeugen, ist es entscheidend, die richtige Population an CLPs aus dem gewonnenen Knochenmarkzellgemisch mittels Zellsortierung zu isolieren, um sie anschließend in vitro mit einem Z-sechs-Feeder-System zu kultivieren. Am Ende der Sortierung die Zellen abzentrifugieren und das CLP-Zellpellet in ausreichend komplettem RPMI erneut suspendieren, um eine Zelldichte von etwa fünf mal 10 hoch vier Zellen pro Milliliter zu erhalten.Ansäen Sie anschließend 500 Zellen pro Vertiefung in die 12-Loch-Platte, die die AC6-Fütterungszellen enthält, und ergänzen Sie die Koinkubationen mit 100 Nanogramm pro Milliliter FL3-Ligand. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid, wobei die Entwicklung der dendritischen Zellen oder DC periodisch visuell mittels Mikroskop überwacht wird. Am Tag 12 sammeln Sie die Zellen aus dem Koinkubationsüberstand und waschen jede Vertiefung einmalig mit einem halben Milliliter vollständigem RPMI-Medium, wobei Sie das resultierende Überstandvolumen und die Waschungen sammeln. Geben Sie dann je eine halbe Milliliter frisches Medium in jede Vertiefung und lösen Sie die anhaftenden Zellen mittels eines Zellkratzers ab.Kombinieren Sie die abgelösten Zellen mit den schwebenden Zellen und zentrifugieren Sie die resultierende Zellsuspension. Resuspendieren Sie das Pellet in 50 µL Fax-Puffer. Anschließend zählen Sie die Zellen und färben sie nach FC-Blocking für die Expression von CD 11 C, CD 11 b und B zwei 20. Wie soeben gezeigt, können die Kulturzellen anschließend auf das Vorhandensein konventioneller CD11c-positiver, CD11b-positiver, B220-negativer und plasmazytoider CD11c-positiver, CD11b-negativer, B220-positiver DC-Populationen analysiert werden, insgesamt vier bis sechs Mal 10 hoch 7. Knochenmarkszellen werden typischerweise aus den Femora und Tibiae einer sechs bis acht Wochen alten wildtypischen C57BL/6-Maus isoliert, wobei üblicherweise fünf Mal 10 hoch 4 CLPs aus einer C57BL/6-Maus gewonnen werden. Nach der Sortierung mittels Durchflusszytometrie, wie gerade beschrieben, erscheinen ab Tag drei bis vier der Kultur mit AC6-Stromazellen die cobblestone area bildenden Zellen, auf deren Oberfläche runde, suspendierte plasmazytoide DCs sichtbar werden.Am achten Tag erreicht die Zahl der plasmazytoiden DCs um den 12. bis 14. Tag herum einen Höhepunkt, woraufhin die Zellen nach ihrer vollständigen Entwicklung mit der Apoptose beginnen und ihre Anzahl allmählich abnimmt. Konventionelle DC-Kolonien erscheinen später, am sechsten bis achten Tag, und sind adhärent mit einer größeren, spindelartigen Morphologie. Die Durchflusszytometrie zeigt, dass die Koinkulturen zu 91 % CD11c-positiv, CD11b-negativ, B220-positiv (plasmazytoide DCs) und zu 6 % CD11c-positiv, CD11b-positiv, B220-negativ (konventionelle DCs) sind, was eine 100-fache Vermehrung der plasmazytoiden DCs gegenüber der ursprünglichen CLP-Population mittels dieser Methode belegt.Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig sicherzustellen, dass sich die a c six-Zelle in gutem Zustand befindet und die C-Dichte korrekt ist, bevor nach einer Differenzierung das clp hinzugefügt wird. Diese Technik ebnete den Forschern in der DC-Biologie den Weg, um die Einschränkung der Verwendung einer geringen Anzahl von Vorläufern zur Untersuchung der DC-Entwicklung aus verschiedenen Vorläufern zu überwinden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man PCs in vitro aus CLP unter Verwendung eines C six BEAT-Systems erzeugt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Unterscheidung myeloide dendritische Zellen aus dem Knochenmark der Maus. Isolierung von Maus Schienbein und Oberschenkelknochen, und die Verarbeitung von Knochenmark nachgewiesen. Bilder zeigen Zellmorphologie vor und nach der Differenzierung und Figurengruppen Zellphänotyp und IL-12 Produktion nach der Reifung mit CpG gezeigt.

Kultur myeloide dendritische Zellen aus dem Knochenmark Vorstufen

Antigen-Präsentation in sekundären lymphatischen Organen durch dendritische Zellen ist entscheidend für die Einleitung des T-Zell-vermittelten adaptive Immunantwort. Hier zeigen wir die Kultur von Knochenmark abgeleiteten dendritischen Zellen, Aktivierung und Etikettierung für die 2-Photonen-Imaging.

Generierung von Knochenmark murinen dendritischen Zellen für den Einsatz in 2-Photonen-Imaging

Dieses Video beschreibt ein Protokoll zur Erzeugung von dendritischen Zellen - Schlüsselantigen-präsentierende Zellen, die T-Zellen aktivieren - aus dem Knochenmark einer erwachsenen Maus.

Generierung dendritischer Zellen aus Knochenmark: Eine Methode zur Erzeugung dendritischer Zellen aus Knochenmark der Maus

Quelle: Cruz-Adalia, A., et al. T-Zellen fangen Bakterien durch Transinfektion aus dendritischen Zellen ein. J. Vis. Exp. (2016).Dieses Video zeigt bakterielle Transinfektionen durch antigenspezifische T-Zell-dendritische Zell-Interaktionen. Mit Bakterien infizierte dendritische Zellen, die Ovalbumin-Peptid präsentieren, werden mit T-Zellen inkubiert, entweder direkt oder durch eine Membran getrennt. Der direkte Kontakt ermöglicht die Bildung immunologischer Synapsen, die einen...

In vitro bakterielle Transinfektion von T-Zellen durch immunologische Synapsenbildung

Dieses Video zeigt einen In-vitro-Assay zur Erzeugung plasmazytoider dendritischer Zellen (pDCs) aus gängigen lymphoiden Vorläuferzellen (CLPs). Bei der Co-Kultivierung von gereinigten CLPs mit γ-bestrahlten Feeder-Zellen in Gegenwart von Fms-ähnlichen Tyrosinkinase-3-Liganden (FL) differenzieren sich die CLPs in nicht-adhärente pDCs, deren Vorhandensein mittels Durchflusszytometrie bestätigt wird.

In vitro Erzeugung von plasmozytoiden dendritischen Zellen aus gemeinsamen lymphatischen Vorläuferzellen

Dieses Protokoll beschreibt experimentelle Verfahren, die die Differenzierung von dendritischen Zellen in plasmazytoiden Peyer-Plaques aus gemeinsamen dendritischen Vorläuferzellen zu bewerten, mit Hilfe von Techniken mit FACS-vermittelten Zellisolierung, hydrodynamische Gentransfer und Flow-Analyse von Immunteilmengen in Peyer-Plaques.

Die Beurteilung der Entwicklung der Murine Plasmazytoide dendritischen Zellen in Peyer-Patches mit Adoptiv Übertragung von hämatopoetischen Vorläuferzellen

Unterschiedliche dendritische Zelluntergruppen existieren als seltene Populationen in lymphatischen Organen und sind daher für immunologische Experimente schwierig in ausreichender Anzahl und Reinheit zu isolieren. Hier beschreiben wir eine hocheffiziente Methode mit hoher Ausbeute zur Isolierung aller derzeit bekannten Hauptuntergruppen von dendritischen Milzzellen der Maus.

Eine effiziente und High-Yield-Methode zur Isolierung von Maus über dendritische Zellen Subsets

Unreife dendritische Zellen können selektiv in tolerogene oder reife dendritische Zellen differenziert werden, um das Gleichgewicht zwischen Immunität und Toleranz zu regulieren. Diese Arbeit stellt eine Möglichkeit vor, aus unreifen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen (moDCs) in vitro tolerogene und reife moDCs zu generieren, die sich in metabolischen Phänotypen unterscheiden.

Die Erzeugung von Unreife, Ältere und Tolerogene Dendritischen Zellen mit unterschiedlichen Metabolic Phänotypen

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zu entwickeln und tolerogene dendritischen Zellen (TolDCs) zu charakterisieren und deren immuntherapeutischen nutzen zu bewerten.

Entwicklung und Charakterisierung von dendritischen Zellen murinen Tolerogene

Dieser Artikel beschreibt eine neuartige Methode zur Erzeugung von Tumorantigen-spezifischen induzierten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten thymischen Auswanderern (iTE) durch ein dreidimensionales (3D) thymische Kultursystem. iTE sind eine homogene Teilmenge von T-Zellen, die eng mit naiven T-Zellen verwandt sind und die Fähigkeit zur Proliferation, Gedächtnisbildung und Tumorunterdrückung haben.

Ein dreidimensionales thymisches Kultursystem zur Generierung von murine induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Tumor-Antigen-spezifischen thymischen Auswanderern

Hier stellen wir ein Protokoll zur In-vivo-Augmentation der Darmhoming-regulatorischen T-Zell-Induktion vor. In diesem Protokoll werden dendritische Zellen entwickelt, um lokal hohe Konzentrationen des aktiven Vitamin D (1,25-Dihydroxyvitamin D oder 1,25[OH]2D) und des aktiven VitaminS A (Retinoinsäure oder RA) de novo zu produzieren.

In Vivo Augmentation der Gut-Homing Regulatory T Cell Induction

Erfahren Sie die effiziente In-vitro-Generierung von Plasmazytoide dendritischen Zellen aus lymphoiden Vorläufern mit dem AC-6-Feeder-System. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von pDC-Entwicklung und Autoimmunerkrankungen.

In-vitro-Erzeugung von Murine Plasmazytoide dendritischen Zellen aus Lymphoid Gemeinsame Vorläufern mit der AC-6-Feeder-System

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