Name: In-vitro-Modell von physiologischen und pathologischen Blutfluss mit Anwendung auf Untersuchungen der Gefäßzell Remodeling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Lernen Sie ein In-vitro-Modell physiologischen und pathologischen Blutflusses zur Untersuchung endothelialer Zellantworten. Diese Methode ermöglicht präzise Analysen von Morphologie und Proteinexpression.

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Die Autoren möchten Finanzierungsquellen, einschließlich der AHA (13GRNT16990019 zu WT) und NHLBI (HL097246 und HL119371 zu WT) zu quittieren.

1. Silanisierung und Biomolekül Funktionalisierung von Slide oder Polycarbonatmembran Hinweis: Viele der Chemikalien und Lösungen innerhalb dieses Protokolls haben hohe Verdunstungsraten (Ethanol (EtOH), Aceton, etc.). Weitere Schritte zur Folge haben lange Inkubationszeiten für niedrige Verdampfungsraten. Paraffinfilm wird empfohlen, um Behälter zu versiegeln. Achtung: Viele der Chemikalien (einschließlich: Schwefelsäure, Aceton, (3-Aminopropyl) triethoxysilan, Glutaraldehyd, EtOH) als gefährlich oder flüchtig. Wenden Sicherheitsdatenblatt (MSDS) der einzelnen Materialien für die ordnungsgemäße Lagerung, Handhabung und Entsorgung vor dem Gebrauch. <ol><li> Legen Sie neue Objektträger Abmessungen 75 mm x 50 mm von 1 mm, in sauberen, Glasobjektträger Färbeschale ohne Rücksicht auf Orientierung, die Gewährleistung der vollen Immersion. Verwenden Sie Container für Schritte 1,1-1,12. Hinweis: Für die Co-Kultur, sind Polycarbonat (PC) Membran mit 0,4 um Porengröße, der Größe von 75 mm × 50 mm geschnitten, für alle nachfolgenden steps für PC Funktionalisierung und EC Aussaat. </li><li> Tauchen Folie in Schwefelsäure (20%), O / N. Achtung: Konsultieren MSDS für Schwefelsäure vor dem Gebrauch. </li><li> Indem in entionisiertem Wasser (DI) für 5 min, dreimal eingetaucht, Ändern DI jedes Mal waschen Folie. </li><li> Einzutauchen Folie in Aceton für 30 min. Achtung: Konsultieren MSDS für Aceton vor der Verwendung. </li><li> Einzutauchen Schieber in 6% (3-Aminopropyl) triethoxysilan / Aceton-Lösung, O / N. Achtung: Konsultieren MSDS für (3-Aminopropyl) triethoxysilan und Aceton vor der Verwendung. </li><li> Einzutauchen Folie in Aceton 5 min, dreimal Wechsel Aceton jedesmal. Achtung: Konsultieren MSDS für Aceton vor der Verwendung. </li><li> Durch in DI für 5 min dreimal Eintauchen, Ändern DI jedes Mal waschen Folie. </li><li> Tauchen Folie in 1,5% Glutaraldehyd / DI-Lösung für 60 min. Achtung: Konsultieren MSDS für Glutaraldehyd vor der Verwendung. </li><li> Durch in DI für 5 Minuten, zweimal eingetaucht, Ändern DI jedes Mal waschen Folie. </li><li> Den Objektträgers in 70% Ethanol (EtOH) für 30 Minuten in sterilen Laminarströmungshaube. </li><li> Entfernen EtOH und lassen verbleibende Rückstand verdampft. Tauchen Sie Folien in sterilem DI und Drain, um die Folien rehydrieren. Hinweis: Die Objektträger oder PC-Membran kann in Glasobjekthalter bis zu einer Woche versiegelt und bei 4 ° C gelagert. Bei der Verwendung für die Zellkultur, wiederholen Sie die Schritte 1.10 und 1.11. </li><li> Entfernen Sie die Folie von der Objektträgerhalter und legen Sie sie in einen 100 mm mal 100 mm quadratischen Petrischale in der Sterilbank. Anmerkung: Dieser Behälter wird für alle verbleibenden Schritte verwendet werden. <ol><li> Bereiten Schlitten oder PC für die endotheliale Zellaussaat zur Monokultur-Experiment. <ol><li> Beschichten das funktionalisierte Folie oder PC (Schritt 1.11) mit 1 ml Fibronektin-Lösung (25 ug / ml), auf der einen Seite für den ungefähren Bereich an Zellkulturkammer ausgesetzt. </li><li> Dias oder PC Inkubieren in sterilen Brutschrank bei 37 ° C für 1-2 h eingestellt. </li><li> Nach der Inkubation, saugen Sie den verbleibenden Lösung unter Verwendung eines glass Aspirator Pipette mit einem Vakuum verbunden. Hinweis: Die Objektträger können nun zur weiteren Verwendung gelagert O / N werden bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Folgen 1.12.2 Schritte nur zur Herstellung von EG / SMC Co-Kultur. Bereiten Sie und Samen glatten Muskelzellen (SMC) Kultur für Co-Kultur-Experiment. <ol><li> Ort Silikondichtung auf der Oberseite des Schiebers (Schritt 1.11), mit den Abmessungen von 75 mm × 50 mm Außendurchmesser, Innendurchmesser von 50 mm bis 30 mm, einer Dicke von 0,5 mm und Perforationen, die mit Durchflusskammer-Vakuum auszurichten. </li><li> Bereiten Sie 1 ml SMC in 10% FBS / DMEM Suspension. Neutralisieren 1 ml Lösung von 2 mg / ml Kollagen Typ-I mit 7% NaHCO 3 und 0,1 M NaOH-Lösung auf pH-Wert von 7,4 und mit SMC-Suspension mit der endgültigen Zelldichte von 2 x 10 6 Zellen / ml zu mischen. </li><li> Verteilt SMC Lösung innerhalb Dichtung und inkubieren Objektträger bei 37 ° C und 5% CO 2 für 30 min. </li><li> Nach der Inkubation, bedecken die Objektträger mit 25 ml 0,1% fötalem Rinderserum (FBS) in Dulbeccos Modified vermischtEagle-Medium (DMEM) 72 h. </li></ol></li></ol></li><li> Kultur Endothelzellen (ECs) auf Glasobjektträger / Polycarbonat-Membran. <ol><li> Samen 1 ml ECs in 10% FBS / DMEM mit Anfangskonzentration von 6,0 x 10 5 Zellen / ml, auf Fibronectin Oberflächen der Glasträger oder Polycarbonatmembran. </li><li> Inkubieren Zellen im Brutschrank bei 37 ° C, 5% CO 2 und 10% FBS für 120 min. </li><li> Deckgläser enthaltenden Zellen mit zusätzlichen 10% FBS / DMEM, und in Inkubator 37 ° C, 5% CO &amp; sub2; O / N bis 70% -80% konfluent. </li></ol></li></ol> 2. Bestimmung der Fluidviskosität und Volumendurchfluss Hinweis: Rotierende Viskosimeter sind empfindliche Geräte, und das Viskosimeter Bedienungsanleitung sollte vor der Kalibrierung, Nullstellen, oder die Durchführung von Messungen herangezogen werden. <ol><li> Bestimmen Sie gewünschte Fluidscher (τ) aus der Literatur des Experiments die gezielte Gefäßsystem. </li><li> Measure 1% FBS / DMEM-Viskosität (μ) mit einem Rotationsviskosimeter. </li><li> Bestimmen Sie benötigten Volumenstrom (Q) von Poiseuille-Gleichung: <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/53224/53224eq1.jpg" /> . wobei τ = Fluidscherungs, μ = Viskosität, Q = vol. Durchfluss, w = Kammerbreite und h = Kammerhöhe). </li><li> Pumpenaggregat zur Durchflussmenge in Schritt 2.3 abgeleitet, und verwenden Sie für alle folgenden Schritte. </li></ol> 3. Bestimmung der Pulsatilitätsindex Hinweis: Alle Verbindungsanschlüsse innerhalb des Systems sollte mit geeigneter Größe Lock-Ring-zu-Widerhaken oder weiblichen Luer-to-Widerhaken-Verbindungen angeschlossen werden. Verbindungs ​​PVC-Schlauch kann dann auf Schlauchtüllen verbunden werden, und die Schaltung vervollständigt. <ol><li> Schließen Strömungskreislauf, wie in Abbildung 2, mit Dämpfungskammer (Abbildung 3) und Ultraschall-Durchflussmesser in der richtigen Flussrichtung. Hinweis: Ultraschall-Durchflussmesser ist ein empfindliches Gerät, undDie Bedienungsanleitung sollte vor der Verwendung konsultiert werden. </li><li> Füllen Strömungskreislauf und das Reservoir mit DI-Wasser, indem sichergestellt wird, Reservoirauslass Rohr (zur Pumpe) in Speichervolumen eingetaucht. Visualisieren Flusswellenform mit einem Durchflussmesser. </li><li> Öffnen Sie das Entlüftungsventil an der Dämpfungskammer Fluid / Luft-Volumenverhältnis zu ändern. Schließen Entlüftungsventil an verschiedenen Flüssigkeitsstand Abständen und berechnen Pulsatilitätsindex (PI = (V max - V Min) / V Mittelwert) unter Verwendung von Flusswellenformspitze (V max), Mulde (V min) und bedeutet (V Mittelwert). PI-Werten in Notebook. </li><li> Mark resultierenden Flüssigkeitsstand und PI auf dem Dämpfungsraum mit einem Filz gekippt, permanent Tintenfeder für die zukünftige Verwendung. Bestimmen Sie die gewünschte PI Ebenen aus der Pathologie Literatur 11. </li><li> Silikon-Schlauch Formation- Optionale, erweiterte Verfahren zur Steuerung Pulsatilität <ol><li> Mischen Sie das Silikon-Elastomer Basis und Härter in verschiedenen Verhältnissen (zB ein base-to-Vernetzer-Verhältnis von 10: 1 bis 36: 1.) für unterschiedliche Ziel Elastizitätsmoduli, wie zuvor dargestellt 2 </li><li> Herzustellen Silikonschläuche durch wiederholte Tauch Härtungsprozess, kurzes Eintauchen Stahlkanüle (14 g) in Silikon Prepolymermischung mit einem vorbestimmten Basis-Vernetzer-Verhältnis. </li><li> Platzieren des Präpolymeren beschichteten Kanüle in einem Ofen bei 60 ° C für 4 Stunden eingestellt, um die Polymerbeschichtung auf der Kanüle zu heilen, Umschalten der Richtung in der Mitte des Aushärtungsprozesses. </li><li> Wiederholen Sie den Tauchverfahren mit der gleichen Siliconelastomermischung und legen Sie wieder in den Ofen für weitere 4 Stunden, die in ~ 0,3 mm dicken Rohren führt. </li><li> Entfernen Sie die ultradünnen Silikonschlauch von der Edelstahlkanüle. </li><li> Schließen Rohre zu fließen Kreis statt Dämpfungskammer und Test PI für jeden, wie in 3.3. </li></ol></li></ol> 4. Pumpe Sterilisation <ol><li> Eintauchen der Strömungskammer (2), PVC-Schläuche und Dichtungen in 10% Wasserstoffperoxid (H 2 O 2). Waschen mit sterilem DI vor Schritt 4. </li><li> Legen Sie die Blutpumpe auf einem Ersatz Inkubator Regal. Anmerkung: Incubator Regalen sollten aus rostfreiem Stahl bestehen, und in der Lage, das Gewicht des gesamten Strömungskreislauf zu unterstützen. </li><li> Füllen des Strömungskreislaufs und der Behälter mit 10% H 2 O 2 durch Sicherstellung Reservoir Auslaßrohr (Pumpe) ist in Speichervolumen eingetaucht. Zirkulieren H 2 O 2 durch Pumpen durch Kreis für 20 Minuten in der Sterilbank mit UV-Licht auf. </li><li> Aspirieren Sie die gesamte H 2 O 2 aus Schlauch und mit sterilem PBS durch Pumpen durch Strömungskreislauf. </li></ol> 5. Durchflusskammeranordnung Hinweis: Die Durchflusskammer besteht aus einem Acryl, maßgeschneiderte Platte mit Vakuumöffnungen und Eintritts- und Austrittsströmungsöffnungen (siehe Abbildung 2). Kammeranordnung besteht aus der Platzierung der Flusskammer und Dichtungen auf der Oberseite des Kultur Dias, properly ausgerichtet ist, und wird nachfolgend beschrieben. <ol><li> Warm up 1% FBS / DMEM in einem 37 ° C Wasserbad und bereiten Flusskammer. <ol><li> Nehmen EG Rutsche von Medien (aus Schritt 1.13) und Ort Dichtung oben mit Zellseite nach oben. </li><li> (Optional) Nehmen Sie PC-Membran von Medien (aus Schritt 1.13) und Ort Dichtung oben mit Zellseite nach oben. Zeigen Co-Kultur-Objektträger mit gesäten SMC (Schritt 1.12.2) unter PC-Membran. </li></ol></li><li> Ausrichten Vakuumkanal der Strömungskammer mit den Löchern in der Dichtung (Figur 2). </li><li> Bringen Vakuumröhre, um Vakuumanschlüsse (Abbildung 2) zu gewährleisten, keine Medien Lecks Vakuum. </li><li> Platz Polycarbonatfolie unterhalb Glasobjektträger und Klemmströmungskammeranordnung mit Federklemmen, eine auf jeder Seite der Flusskammer (2 und 5). </li><li> Platz Strömungssystem im Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2, und füllen Kreis mit Medien durch Pumpen aus gefüllten Vorratsbehälter bei niedrigen Pulsatilität.Halten Sie diese Fluss für 4 Stunden zur Vorkonditionierung Zellen. </li><li> Passen Flüssigkeitsvolumen im Dämpfungsraum um deutliche PI-Ebene, und Kultur für die gewünschte Zeit ein. </li></ol>

<ol><li>Scott-Drechsel, D., Su, Z., Hunter, K., Li, M., Shandas, R., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+flow+co-culture+system+for+studying+mechanobiology+effects+of+pulse+flow+waves%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">A new flow co-culture system for studying mechanobiology effects of pulse flow waves.</a> Cytotechnology. 64 (6), 649-666 (2012).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Wiedergabe pulsatile Strömung in vitro und können instrument erste Schritt bei der Bestimmung Beitrag der Strömungsverhältnisse um Krankheiten Pathologien. Frühere Studien unter Verwendung dieses Protokolls haben festgestellt, Strömungsverhältnisse tragen zu Gefäßentzündungsreaktion. 1, 10 Darüber hinaus dieses Protokoll ist für erfahrene Labors vorgesehen. Als solche weder eingehend Fluidmechanik und auch biochemischen Analyse wird hier beschrie...

Morbiditätsraten für Herzkreislauferkrankungen sind die größten in Amerika, mit von ungesunden Gefäß viele resultieren. Gesunde Arterien bestehen aus elastischem Gewebe, mit weichen Lumenoberfläche mit einem Endothelzellen (EG) Monoschicht beschichtet. Arteriellen Blutfluss kann als eine oszillierende Wellenfunktion mit positiven mittleren Strömungsgeschwindigkeit modelliert werden. Die Pulsatilitätsindex (PI) ist der Quotient aus Schwingungs Betrag und mittlere Fließ (PI = (Max. - Min.) / Mittelwert), 1 und wurde in vitro mit variabler Gefäßelastizität modelliert 2 Arterielle Elastizität ist bei der Lagerung der Strömung wichtig. Energie von Herzkontraktionen, Dilatation unter den systolischen Druck, und spielt eine bedeutende Rolle bei der Modulation des Blutflusses PI. Weil das Herz für ein konsistentes, pulsatile, Volumenstrom erhöht arterielle Expansionsquerschnittsfläche, die Verbesserung Strömungsstabilität durch die Verringerung der Strömungsgeschwindigkeit, Schubspannung und PI. Häufig ungesunde Arterien geht auf Elastizitätoder die Einhaltung und zeigt Versteifungs von vaskulären Umbau, Narbengewebe oder Verkalkung 3, 4. Zusätzlich können andere vaskuläre Erkrankungen, wie neointimale Hyperplasie (NIH), 5 Aneurysma und Hypertonie 6 und vaskuläre Fibrose 4, Gefäßdurchmesser zu verengen. Allerdings sind die bisherigen medikamentösen Behandlung und Geräte Behandlung von Gefäßerkrankungen vernachlässigen oft die Bedeutung der Gefßwand Compliance oder Blutströmungsdynamik in vaskulären Erkrankung, die häufig durch Veränderungen der Gefäß Morphologie und Eigenschaften kompliziert. Weder Ballon-Angioplastie oder Stenting beantworten Sie die Komplikation der Wandelastizität 7. Daher fließt in vitro Modellierung von Blut von arteriellen Erkrankungen und Behandlungen resultiert, ist bei der Untersuchung von Krankheitspathologien und künftige Wirksamkeit der Behandlung wichtig. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Replikation von physiologischen und pathologischen Blutfluss zur Zellantwort in Gefäßerkrankungen pathol bestimmengien. Fluidstrom bewirkt Scherspannung an der Gefßwand, die ein wichtiges mechanisches Signal in Gefäß Gesundheit ist, die alle Zellen innerhalb des Gefäßsystems. Mehrere mechanische Sensoren an das vaskuläre Endothel zur Fluidscher identifiziert wurden, einschließlich der letzten Untersuchungen für endotheliale mechanosensing 8 gezeigten primären Zilien. Endotheliale Zell-Aktivität und Morphologie von Strömungsgeschwindigkeit, Richtung und Pulsatilität betroffen. Zusätzlich kann der glatten Muskelzellen (SMC) Migration durch mechano-Signale mit niedriger Strömungsgeschwindigkeit durch Interstitialflüssigkeit 9 beeinflusst werden, und kann auch durch die parakrine Signalisierung von Endothelzellen durch ihre Reaktion zu fließen und mechano-Transduktion von Flusssignalen via Zytokin freizugeben 10. Die &quot;Dosis&quot; Abhängigkeit der mittleren Scher, PI, und parakrine Signalisierung kann auch voneinander abhängig zu sein. Zu diesem Zweck wird die Bestimmung des Gefäßzellantwort auf Fluidscherungskupplung mit unterschiedlichen &quot;Dosieren&quot; in Monolayer-Kulturoder Co-Kultur in vitro konnten mechanistische Einblicke in die vaskuläre Remodeling und zur Verbesserung der Erkrankung und Behandlung Vorhersage. Das Flusssystem in diesem Experiment verwendet besteht aus einer Blutpumpe, einem vorgeschalteten Strömungsdämpfungsluftbehälter, einem nachgeschalteten Durchflussmesser nur während der Versuchsaufbau, einem nachgeschalteten Zellkultur, Parallelplatten-Durchflusskammer und Medienspeicher verwendet. Kontrolle der Gefäßdurchflussgrößen wie meine Durchfluss, Schläge pro Minute und PI kann durch Steuerung der Strömungsrate, Impulsfrequenz, und die Einführung der Druckdämpfung erreicht werden. Pulsierenden Blutpumpen sind mit variablen Hub Hubraum, bei kontrollierter Hubfrequenz, die sich direkt auf Volumenstrom und Impulsfrequenz bedeutet. Einführung einer Luftbehälter innerhalb des Strömungskreislaufs ermöglicht Druck Dämpfung reduziert Strömungsoszillation Größenordnung. Medium ist ein inkompressibles Fluid, während Luft in der Dämpfungskammer komprimierbar ist, so dass Überdruck von der Strömungswellen seindurch Luftkompression absorbiert. Die Luft um Medien-Verhältnis ermöglicht eine Kontrolle darüber, wie viel Dämpfung auftritt. Ein kundenspezifisches Zellkultur Durchflußkammer 75 mm Länge und 50 mm Breite wurde aus Acryl hergestellt. Strom tritt durch die Einlassöffnung und expandiert durch den Ansaugkrümmer, eine konsistente Strömung über die Gesamtheit der Strömungskammer. Ähnliche Fluss und Strukturen sind in Kammerausgang vorhanden. Zellen werden auf funktionalisierten Objektträger ausgesät und anschließend in die Strömungskammer angebracht ist. Dies ermöglicht eine große Populationen, einfach nach dem Studium abgerufen. Co-Kultur-Experimente kann eine poröse Polycarbonatmembran zu verwenden, um Zell-zu-Zell-Kontakt zwischen den Kulturen zu beseitigen und ermöglicht Zytokin / Flussverkehr. Dieses System wurde zuvor verwendet, um hohe Strömungs PI und seine Wirkung auf die endotheliale Monolayer-Kultur und EC / SMC Kokultur 1, 10 zu modellieren, um die Zellreaktion zu pathologisch hohen PI Krankheit zu untersuchen. Durch die verwendet werden, um diese Strömungs con Musterprotokoll beschreibtBedingungen, hoffen wir, andere bei der Bestimmung Flusssignal Beitrag zur Antwortzelle zu unterstützen.

<table><tbody><tr><td>Aceton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34850</td><td></td></tr><tr><td>Schwefelsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320501</td><td></td></tr><tr><td>(3-Aminopropyl)triethoxysilan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440140</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehydlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>Glasobjektträger (70&#160; mm x 50&#160; mm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS294775X50</td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonat-Membran</td><td>Millipore Corp.</td><td></td><td></td>HTTP09030</tr><tr><td>Silikondichtung</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>RD 475464</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin (25 &mu; g/ml)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen Typ-I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3867</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fluka</td><td>36486</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Dämpfungskammer</td><td></td><td></td><td>Diese Kammer ist eine Sonderanfertigung und kann unter Verwendung der technischen Zeichnung von Abbildung 3 angefordert werden.</td></tr><tr><td>Blutpumpe</td><td>Harvard Apparat</td><td>529552</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylcarbonat-Schlauch</td><td>US Kunststoff</td><td>65066, 65063, 65062</td><td>Möglicherweise sind verschiedene Größen erforderlich</td></tr><tr><td>Luer-Anschlüsse</td><td>Nordson Medical</td><td>Verschiedene</td><td>Größen sind erforderlich, und eine Reihe von Teilen sollte als Ersatz gekauft werden.</td></tr><tr><td>Kulturkammer</td><td>Im eigenen Haus bearbeitetes kundenspezifisches</td><td></td><td>Acryl kann in Platten erworben und für den beabsichtigten Gebrauch bearbeitet werden. Die in Abbildung 2 gezeigte technische Zeichnung kann verwendet werden, um diese Kammer nachzubauen.</td></tr><tr><td>Quadratische Petrischale</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-14007-10</td><td></td></tr><tr><td>Objektträgerhalter aus Glas</td><td>Capitol Scientific</td><td>WHE-900303</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's modifizierter Eagle Medium</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Durchflussmesser</td><td>Sonotec, GmbH</td><td>Sonoflow co.55/060</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard Elastomer Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>761036-5EA</td><td></td></tr><tr><td>14 G Stahlkanüle</td><td>Allgemeines Laborbedarf</td><td>S8365-1</td><td></td></tr></tbody></table>

in-vitro-modell von physiologischen und pathologischen blutfluss mit anwendung auf untersuchungen der gefäßzell remodeling

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

Kreislauf-Erkrankungen ist eine häufige Todesursache in den Vereinigten Staaten. Hier präsentieren wir eine Methode, um den Beitrag der Strömungsdynamik in Richtung Kreislauf-Erkrankungen Erkrankungen zu untersuchen. Ungesunde Arterien oft mit Wandversteifung, Narbenbildung oder partielle Stenose, die alle betreffen können Fluiddurchflußraten, und die Größe der pulsierenden Fluss oder Pulsatilitätsindex vorhanden. Replikation von verschiedenen Strömungsbedingungen ist das Ergebnis der Abstimmung eines Strömungsdruckdämpfungskammer stromab einer Blutpumpe. Einführen von Luft in einem geschlossenen Strömungssystem ermöglicht ein kompressibles Medium auf pulsatile Druck von der Pumpe zu absorbieren und daher variieren die Pulsatilitätsindex. Das hier beschriebene Verfahren ist einfach wiedergegeben werden, mit hoch steuerbaren Eingabe und leicht messbare Ergebnisse. Einige Einschränkungen sind Erholung der komplexen physiologischen Pulswellenform, die nur durch das System angenähert wird. Endothelzellen, glatte Muskelzellen und Fibroblasten werden durch den Blutfluss thr betroffenOugh die Arterie. Die dynamische Komponente des Blutflusses durch das Herzminutenvolumen und Arterienwand Übereinstimmung bestimmt. Gefäßzelle mechanisch-Transduktion der Strömungsdynamik kann Zytokinfreisetzung und Übersprechen zwischen Zelltypen innerhalb der Arterie auslösen. Co-Kultur von Gefäßzellen ist ein genaueres Bild reflektierenden Zell-Zell-Wechselwirkung an die Blutgefäßwand und Gefäßreaktion zur mechanischen Anzeige. Beitrag der Strömungsdynamik, einschließlich der Zelle als Antwort auf die dynamischen und mittlere (oder stationären) Strömungskomponenten, ist daher eine wichtige Metrik zu bestimmen Krankheitspathologie und die Wirksamkeit der Behandlung. Durch die Einführung eines in vitro Cokulturmodell und Druckdämpfung stromabwärts von Blutpumpe, die simulierte Herzleistung erzeugt, können verschiedene arterielle Erkrankung Pathologien untersucht werden.

Wartung der Strömungsverhältnisse ist angewiesen auf korrekte Montage des Strömungskreislauf (Abbildung 1). Schlauchdurchmesser ist ein wichtiges Auswahl in Montage, mit größeren Durchmessern Reduktionsströmungswiderstand und anschließende Druckabfall vor und nach der Kulturkammer. Um vorgesehenen Druck und Strömungsgeschwindigkeit zu gewährleisten, montieren Sie das System mit Durchflussmesser vor dem Experiment mit bestimmt Schläuche. Ausrichtung der Kulturkammer Vakuumkanal (Abbildung</strong...

Dieses Protokoll repliziert physiologische oder pathologische Blutfluss in vitro zur Bestimmung Zellantwort bei Krankheitspathologien unterstützen. Durch Einführung einer Druckdämpfungskammer stromabwärts von einer Blutpumpe, kann die Blutströmung durch die Vaskulatur rekapituliert und auf einer Monoschicht von Gefäßendothel oder eines Mimetikums Kokultur auferlegt.

In-vitro-Modell von physiologischen und pathologischen Blutfluss mit Anwendung auf Untersuchungen der Gefäßzell Remodeling

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Auswirkungen unterschiedlicher pulsatile Strömungspathologien auf endotheliale Zellen in vitro zu beobachten. Dies wird erreicht, indem Glasobjektträger zunächst chemisch behandelt und mit Protein beschichtet werden, um die Zelladhäsion während der Strömungsbelastung sicherzustellen.Im zweiten Schritt wird der Pulsatilitätsindex des Flusses bestimmt, der einen Vergleich des in-vitro-Flusses mit in der Literatur beschriebenen Werten ermöglicht. Anschließend werden Zellkammern mit angehefteten Zellen an das Flusssystem angeschlossen, um die Zellreaktion auf Strömungspathologien zu messen. Die Ergebnisse zeigen Veränderungen in Morphologie und Proteinausprägung in Abhängigkeit von den Strömungsprofilen, die mittels optischer Mikroskopie und immunfluoreszenzbasierter Färbung ermittelt wurden.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber der peristaltischen oder pulsierenden Pumpe liegt in der Möglichkeit, die Pulsationsstärke des Flusses anzupassen, um kranke oder gesunde Reaktionen nachzuahmen. Dies kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der arteriellen Erkrankungen zu beantworten. Beginnen Sie damit, neue Objektträger mit den Maßen 75 Millimeter × 50 Millimeter × 1 Millimeter in eine saubere Objektträger-Färbeschale zu legen.Gegeben Sie anschließend so viel 20%ige Schwefelsäurelösung hinzu, dass die Objektträger vollständig eingetaucht sind, und inkubieren Sie sie am folgenden Tag über Nacht in der Säurelösung. Waschen Sie die Träger dreimal, indem Sie sie jeweils fünf Minuten lang in frisches deionisiertes Wasser tauchen. Nach dem Spülen tauchen Sie die Träger 30 Minuten in Aceton ein und anschließend über Nacht in eine Lösung von 6% 3-Aminopropyl-triethoxysilan in Aceton.Als Nächstes spülen Sie die Objektträger dreimal mit reinem Aceton für jeweils fünf Minuten, wobei das Aceton nach jeder Wäsche ausgetauscht wird. Danach waschen Sie die Objektträger dreimal mit entionisiertem Wasser für jeweils fünf Minuten und erneuern das entionisierte Wasser nach jeder Wäsche. Tauchen Sie die Objektträger anschließend in 1,5 % Glutaraldehyd ein und lassen Sie sie 60 Minuten lang darin eingetaucht.Nach der Vernetzung die Objektträger zweimal in entionisiertem Wasser waschen, wobei nach jedem Waschgang frisches entionisiertes Wasser verwendet wird. Anschließend die Objektträger zur Sterilisation 30 Minuten in 70 % Ethanol geben. Das Ethanol entfernen und sicherstellen, dass der restliche Rückstand vollständig von den Objektträgern verdunstet. Nach dem Trocknen die Objektträger durch vorübergehendes Eintauchen in steriles entionisiertes Wasser wieder befeuchten.Als Nächstes entfernen Sie den Objekttr&auml;gerhalter und legen Sie ihn in eine quadratische Petrischale mit 100 Millimeter Durchmesser. Beschichten Sie im laminaren Flusswerk den funktionalisierten Objekttr&auml;ger mit einem Milliliter einer Fibronectin-L&ouml;sung mit 25&nbsp;Mikrogramm pro Milliliter, wobei der ungef&auml;hre Bereich bedeckt werden sollte, der der Zellkulturkammer ausgesetzt sein wird. Danach decken Sie die Schale ab und inkubieren die Objekttr&auml;ger eine bis zwei Stunden bei 37&nbsp;Grad Celsius. Nach der Inkubation saugen Sie die restliche L&ouml;sung ab und geben 600.000 Endothelzellen in einem Milliliter DMEM mit 10&nbsp;% FBS auf die beschichtete Seite des Objekttr&auml;gers.Decken Sie die Kammer ab und inkubieren Sie die Zellen anschließend 120 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Danach bedecken Sie die Zellen mit zusätzlichem Medium und setzen die Inkubation fort, bis sie 70 bis 80 % konfluent sind. Schließen Sie den Flusskreislauf wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben und hier gezeigt an und stellen Sie sicher, dass die Dämpfungskammer und das Ultraschall-Durchflussmessgerät in der korrekten Strömungsrichtung angeordnet sind.Füllen Sie als Nächstes den Durchfluss, die Zirkulation und das Reservoir mit entionisiertem Wasser. Stellen Sie sicher, dass sich das Auslassrohr des Reservoirs innerhalb des Reservoirvolumens unter Wasser befindet. Anschließend visualisieren Sie die Durchflussform mithilfe eines Durchflussmessgeräts.Öffnen Sie das Entlüftungsventil an der Dämpfungskammer, um das Verhältnis von Flüssigkeit zu Luftvolumen zu ändern. Schließen Sie das Entlüftungsventil in verschiedenen Intervallen des Flüssigkeitsstands und berechnen Sie den Pulsatilitätsindex. Zur Berechnung des Index bewerten Sie die Flusswellenform, wobei das Maximum dem VM max entspricht.Das Minimum repräsentiert das v_min, und der V_mittelwert ist der Mittelwert der Signalaufzeichnung. Notieren Sie die resultierenden Werte für Flüssigkeitsstand und Pulsatilitätsindex in einem Protokollheft. Kennzeichnen Sie den resultierenden Flüssigkeitsstand und den Pulsatilitätsindex am Dämpfungsgefäß mit einem wasserfesten Filzstift für zukünftige Verwendung.Bestimmen Sie die gewünschten Pulsatilitätsindex-Werte anhand der im begleitenden Textprotokoll zitierten pathologischen Literatur, während Sie die Durchflusskammer für die Aufwärmphase vorbereiten. DMEM ergänzt mit 1 % FBS in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Entnehmen Sie eine der mit Zellen beschichteten Objektträger aus dem Medium, sobald sie 70 bis 80 % konfluent sind, und legen Sie eine Dichtung auf die Seite mit den angesiedelten Zellen. Als Nächstes richten Sie den Vakuumkanal der Durchflusskammer mit den Löchern in der Dichtung aus. Anschließend befestigen Sie Vakuumschläuche an den Vakuumanschlüssen, wobei darauf zu achten ist, dass kein Medium in das Vakuum austritt. Legen Sie eine Polycarbonatplatte unter den Objektträger und befestigen Sie die Montage der Durchflusskammer mit je einer Federklemme an den kurzen Seiten und zwei Federklemmen entlang der langen Seiten der Durchflusskammer. Als Nächstes verbinden Sie die Durchflusskammer sowie den Einlass und Auslass mit dem Durchflusskreislauf. Stellen Sie das Durchflusssystem in einen Inkubator, der auf 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid eingestellt ist, und füllen Sie den Kreislauf mit dem vorgewärmten Medium, indem Sie das Reservoir mit dem Medium befüllen und es mit geringer Pulsation hineinpumpen. Halten Sie diesen Durchfluss vier Stunden lang aufrecht, um die Zellen vorzuconditionieren.Danach das Flüssigkeitsvolumen in der Dämpfungskammer auf das vormarkierte Niveau des Pulsatilitätsindex einstellen und die Zellen für die gewünschte Dauer kultivieren. Die hier gezeigten Endothelzellen wurden ohne Fluss, mit konstantem Fluss und mit pulsatilem Fluss kultiviert.Veränderungen in der Morphologie können beobachtet werden, wenn die typische Endothelzellen-Morphologie nach 24-stündiger Exposition gegenüber hohem pulsatilem Fluss in eine spindelförmigere Morphologie übergeht. Sowohl statische als auch gleichmäßige Strömungsbedingungen zeigen hingegen kaum oder keine Unterschiede in der Morphologie. Auch glatte Muskelzellen werden durch die Kokultur mit Endothelzellen, die hohem pulsatilem Fluss ausgesetzt waren, beeinflusst, wie hier durch unterschiedliche Expression von alpha glatter Muskel-Aktin und Myosin-Schwerketten gezeigt wird.Unter den unterschiedlichen Strömungsbedingungen wiesen Zellen, die pulsatilem Fluss ausgesetzt waren, die höchsten Mengen beider Proteine auf, was auf Hypertrophie und Kontraktilität hinweist. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, alle Dichtungen beizubehalten und sicherzustellen, dass die Flüssigkeitsstände nach dem Verfahren konstant bleiben. Andere Methoden wie die Ko-Kultur von endothelialen Zellen und vaskulären Zellen können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Wechselwirkungen zwischen Zellen zu beantworten.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man den Flusskreislauf zusammenbaut, den Index steuert und endotheliale Zellen pulsierendem Fluss aussetzt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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