In-vitro-Modell von physiologischen und pathologischen Blutfluss mit Anwendung auf Untersuchungen der Gefäßzell Remodeling

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Auswirkungen unterschiedlicher pulsatile Strömungspathologien auf endotheliale Zellen in vitro zu beobachten. Dies wird erreicht, indem Glasobjektträger zunächst chemisch behandelt und mit Protein beschichtet werden, um die Zelladhäsion während der Strömungsbelastung sicherzustellen.

Im zweiten Schritt wird der Pulsatilitätsindex des Flusses bestimmt, der einen Vergleich des in-vitro-Flusses mit in der Literatur beschriebenen Werten ermöglicht. Anschließend werden Zellkammern mit angehefteten Zellen an das Flusssystem angeschlossen, um die Zellreaktion auf Strömungspathologien zu messen. Die Ergebnisse zeigen Veränderungen in Morphologie und Proteinausprägung in Abhängigkeit von den Strömungsprofilen, die mittels optischer Mikroskopie und immunfluoreszenzbasierter Färbung ermittelt wurden.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber der peristaltischen oder pulsierenden Pumpe liegt in der Möglichkeit, die Pulsationsstärke des Flusses anzupassen, um kranke oder gesunde Reaktionen nachzuahmen. Dies kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der arteriellen Erkrankungen zu beantworten. Beginnen Sie damit, neue Objektträger mit den Maßen 75 Millimeter × 50 Millimeter × 1 Millimeter in eine saubere Objektträger-Färbeschale zu legen.

Gegeben Sie anschließend so viel 20%ige Schwefelsäurelösung hinzu, dass die Objektträger vollständig eingetaucht sind, und inkubieren Sie sie am folgenden Tag über Nacht in der Säurelösung. Waschen Sie die Träger dreimal, indem Sie sie jeweils fünf Minuten lang in frisches deionisiertes Wasser tauchen. Nach dem Spülen tauchen Sie die Träger 30 Minuten in Aceton ein und anschließend über Nacht in eine Lösung von 6% 3-Aminopropyl-triethoxysilan in Aceton.

Als Nächstes spülen Sie die Objektträger dreimal mit reinem Aceton für jeweils fünf Minuten, wobei das Aceton nach jeder Wäsche ausgetauscht wird. Danach waschen Sie die Objektträger dreimal mit entionisiertem Wasser für jeweils fünf Minuten und erneuern das entionisierte Wasser nach jeder Wäsche. Tauchen Sie die Objektträger anschließend in 1,5 % Glutaraldehyd ein und lassen Sie sie 60 Minuten lang darin eingetaucht.

Nach der Vernetzung die Objektträger zweimal in entionisiertem Wasser waschen, wobei nach jedem Waschgang frisches entionisiertes Wasser verwendet wird. Anschließend die Objektträger zur Sterilisation 30 Minuten in 70 % Ethanol geben. Das Ethanol entfernen und sicherstellen, dass der restliche Rückstand vollständig von den Objektträgern verdunstet. Nach dem Trocknen die Objektträger durch vorübergehendes Eintauchen in steriles entionisiertes Wasser wieder befeuchten.

Als Nächstes entfernen Sie den Objektträgerhalter und legen Sie ihn in eine quadratische Petrischale mit 100 Millimeter Durchmesser. Beschichten Sie im laminaren Flusswerk den funktionalisierten Objektträger mit einem Milliliter einer Fibronectin-Lösung mit 25 Mikrogramm pro Milliliter, wobei der ungefähre Bereich bedeckt werden sollte, der der Zellkulturkammer ausgesetzt sein wird. Danach decken Sie die Schale ab und inkubieren die Objektträger eine bis zwei Stunden bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation saugen Sie die restliche Lösung ab und geben 600.000 Endothelzellen in einem Milliliter DMEM mit 10 % FBS auf die beschichtete Seite des Objektträgers.

Decken Sie die Kammer ab und inkubieren Sie die Zellen anschließend 120 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Danach bedecken Sie die Zellen mit zusätzlichem Medium und setzen die Inkubation fort, bis sie 70 bis 80 % konfluent sind. Schließen Sie den Flusskreislauf wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben und hier gezeigt an und stellen Sie sicher, dass die Dämpfungskammer und das Ultraschall-Durchflussmessgerät in der korrekten Strömungsrichtung angeordnet sind.

Füllen Sie als Nächstes den Durchfluss, die Zirkulation und das Reservoir mit entionisiertem Wasser. Stellen Sie sicher, dass sich das Auslassrohr des Reservoirs innerhalb des Reservoirvolumens unter Wasser befindet. Anschließend visualisieren Sie die Durchflussform mithilfe eines Durchflussmessgeräts.

Öffnen Sie das Entlüftungsventil an der Dämpfungskammer, um das Verhältnis von Flüssigkeit zu Luftvolumen zu ändern. Schließen Sie das Entlüftungsventil in verschiedenen Intervallen des Flüssigkeitsstands und berechnen Sie den Pulsatilitätsindex. Zur Berechnung des Index bewerten Sie die Flusswellenform, wobei das Maximum dem VM max entspricht.

Das Minimum repräsentiert das v_min, und der V_mittelwert ist der Mittelwert der Signalaufzeichnung. Notieren Sie die resultierenden Werte für Flüssigkeitsstand und Pulsatilitätsindex in einem Protokollheft. Kennzeichnen Sie den resultierenden Flüssigkeitsstand und den Pulsatilitätsindex am Dämpfungsgefäß mit einem wasserfesten Filzstift für zukünftige Verwendung.

Bestimmen Sie die gewünschten Pulsatilitätsindex-Werte anhand der im begleitenden Textprotokoll zitierten pathologischen Literatur, während Sie die Durchflusskammer für die Aufwärmphase vorbereiten. DMEM ergänzt mit 1 % FBS in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Entnehmen Sie eine der mit Zellen beschichteten Objektträger aus dem Medium, sobald sie 70 bis 80 % konfluent sind, und legen Sie eine Dichtung auf die Seite mit den angesiedelten Zellen.

Als Nächstes richten Sie den Vakuumkanal der Durchflusskammer mit den Löchern in der Dichtung aus. Anschließend befestigen Sie Vakuumschläuche an den Vakuumanschlüssen, wobei darauf zu achten ist, dass kein Medium in das Vakuum austritt. Legen Sie eine Polycarbonatplatte unter den Objektträger und befestigen Sie die Montage der Durchflusskammer mit je einer Federklemme an den kurzen Seiten und zwei Federklemmen entlang der langen Seiten der Durchflusskammer.

Als Nächstes verbinden Sie die Durchflusskammer sowie den Einlass und Auslass mit dem Durchflusskreislauf. Stellen Sie das Durchflusssystem in einen Inkubator, der auf 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid eingestellt ist, und füllen Sie den Kreislauf mit dem vorgewärmten Medium, indem Sie das Reservoir mit dem Medium befüllen und es mit geringer Pulsation hineinpumpen. Halten Sie diesen Durchfluss vier Stunden lang aufrecht, um die Zellen vorzuconditionieren.

Danach das Flüssigkeitsvolumen in der Dämpfungskammer auf das vormarkierte Niveau des Pulsatilitätsindex einstellen und die Zellen für die gewünschte Dauer kultivieren. Die hier gezeigten Endothelzellen wurden ohne Fluss, mit konstantem Fluss und mit pulsatilem Fluss kultiviert.

Veränderungen in der Morphologie können beobachtet werden, wenn die typische Endothelzellen-Morphologie nach 24-stündiger Exposition gegenüber hohem pulsatilem Fluss in eine spindelförmigere Morphologie übergeht. Sowohl statische als auch gleichmäßige Strömungsbedingungen zeigen hingegen kaum oder keine Unterschiede in der Morphologie. Auch glatte Muskelzellen werden durch die Kokultur mit Endothelzellen, die hohem pulsatilem Fluss ausgesetzt waren, beeinflusst, wie hier durch unterschiedliche Expression von alpha glatter Muskel-Aktin und Myosin-Schwerketten gezeigt wird.

Unter den unterschiedlichen Strömungsbedingungen wiesen Zellen, die pulsatilem Fluss ausgesetzt waren, die höchsten Mengen beider Proteine auf, was auf Hypertrophie und Kontraktilität hinweist. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, alle Dichtungen beizubehalten und sicherzustellen, dass die Flüssigkeitsstände nach dem Verfahren konstant bleiben. Andere Methoden wie die Ko-Kultur von endothelialen Zellen und vaskulären Zellen können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Wechselwirkungen zwischen Zellen zu beantworten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man den Flusskreislauf zusammenbaut, den Index steuert und endotheliale Zellen pulsierendem Fluss aussetzt.