In-vitro-Modell von physiologischen und pathologischen Blutfluss mit Anwendung auf Untersuchungen der Gefäßzell Remodeling

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Auswirkungen verschiedener pulsierender Strömungspathologien auf Endothelzellen zu beobachten. In vitro. Dies wird erreicht, indem Objektträger zunächst chemisch behandelt und mit Protein beschichtet werden, um die Zellanhaftung während der Strömung zu gewährleisten.

In einem zweiten Schritt wird der Pulsatilitätsindex der Strömung bestimmt, was einen Vergleich der in vitro Strömung mit den in der Literatur beschriebenen Werten ermöglicht. Als nächstes werden zellsitzende Objektträger mit dem Flusssystem verbunden, um die Zellreaktion auf Flusspathologien zu messen. Die Ergebnisse zeigen Veränderungen in der Morphologie und Proteinexpression basierend auf Flussprofilen mittels optischer Mikroskopie und Immunfluoreszenzfärbung.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber der peristaltischen oder pulsierenden Pumpe ist die Möglichkeit, die Pulsatilität des Flusses so einzustellen, dass sie eine kranke oder gesunde Reaktion nachahmt. Dies kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der arteriellen Verschlusskrankheit zu beantworten. Legen Sie zunächst neue Objektträger mit den Maßen 75 Millimeter x 50 Millimeter x 1 Millimeter in eine saubere Glasobjektträger-Färbeschale.

Fügen Sie dann genügend 20%ige Schwefelsäurelösung hinzu, um die Objektträger vollständig einzutauchen und sie am nächsten Tag über Nacht in der sauren Lösung zu inkubieren. Waschen Sie die Objektträger dreimal, indem Sie sie jeweils fünf Minuten lang in frisches, entionisiertes Wasser tauchen. Tauchen Sie die Objektträger nach dem Spülen 30 Minuten lang in Aceton und dann über Nacht in eine Lösung aus 6% drei Aminopropyltrixi Seline in Aceton.

Spülen Sie die Objektträger anschließend fünf Minuten lang dreimal in reinem Aceton und wechseln Sie das Aceton nach jedem Waschen. Waschen Sie die Objektträger dann dreimal fünf Minuten lang in entionisiertem Wasser und wechseln Sie das deionisierte Wasser nach jedem Waschen. Tauchen Sie die Objektträger anschließend in 1,5 % Glutaraldehyd und lassen Sie sie 60 Minuten lang eintauchen.

Nach dem Vernetzen waschen Sie die Objektträger zweimal in entionisiertem Wasser und wechseln Sie das deionisierte Wasser Nach jedem Waschen legen Sie die Objektträger dann 30 Minuten lang in 70%iges Ethanol, um sie zu sterilisieren. Entfernen Sie das Ethanol und lassen Sie alle verbleibenden Rückstände von den Objektträgern verdampfen. Nach dem Trocknen rehydrieren Sie die Objektträger, indem Sie sie kurz in steriles entionisiertes Wasser legen.

Entfernen Sie als Nächstes den Objektträgerhalter und legen Sie ihn in eine 100 Millimeter x 100 Millimeter große quadratische Petrischale. In der Laminar-Flow-Haube wird der funktionalisierte Objektträger mit einem Milliliter einer Fibronektinlösung von 25 Mikrogramm pro Milliliter beschichtet und damit der ungefähre Bereich bedeckt, der der Zellkulturkammer ausgesetzt wird. Decken Sie dann die Schale ab und inkubieren Sie die Objektträger ein bis zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation aspirieren Sie die restliche Lösung und säen Sie 600.000 Endothelzellen in einem Milliliter DMEM mit 10 % FBS auf die beschichtete Seite des Objektträgers.

Decken Sie die Kammer ab und inkubieren Sie die Zellen dann 120 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Decken Sie dann die Zellen mit zusätzlichem Medium ab und inkubieren Sie sie weiter, bis sie zu 70 bis 80 % konfluent sind. Schließen Sie den Durchflusskreislauf wie im beigefügten Textprotokoll beschrieben an und stellen Sie wie hier gezeigt sicher, dass die Dämpfungskammer und der Ultraschall-Durchflussmesser in der richtigen Durchflussrichtung angeordnet sind.

Füllen Sie anschließend den Durchfluss, den Kreislauf und das Reservoir mit entionisiertem Wasser. Stellen Sie sicher, dass das Auslassrohr des Behälters in das Volumen des Behälters eingetaucht ist. Visualisieren Sie dann die Durchflusswellenform mit einem Durchflussmesser.

Öffnen Sie das Entlüftungsventil an der Dämpfungskammer, um das Verhältnis von Flüssigkeit zu Luftvolumen zu ändern. Schließen Sie das Entlüftungsventil in unterschiedlichen Flüssigkeitsstandsintervallen und berechnen Sie den Pulsatilitätsindex. Um den Index zu berechnen, werten Sie die Flow-Wellenform aus, da der Peak das Maximum der VM darstellt.

Der Talpunkt stellt den v min dar und der V-Mittelwert ist der Mittelwert des Signaldatensatzes. Die Puls-Index-Werte in einem Notebook. Markieren Sie den resultierenden Flüssigkeitsstand und den Pulsatilitätsindex auf der Dämpfungskammer mit einem permanenten Tintenstift mit Filzspitze für die zukünftige Verwendung.

Bestimmen Sie die gewünschten Pulsatilitätsindexwerte aus der Pathologieliteratur, auf die im begleitenden Textprotokoll verwiesen wird, während Sie das Aufwärmen der Durchflusskammer vorbereiten. DMEM ergänzt mit 1%FBS in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad. Nehmen Sie einen der mit Zellen beschichteten Objektträger aus dem Medium, sobald sie zu 70 bis 80 % zusammenfließend sind, und legen Sie eine Dichtung auf die auf der Zellen sitzende Seite.

Richten Sie anschließend den Vakuumkanal der Durchflusskammer an den Löchern in der Dichtung aus. Befestigen Sie dann einen Vakuumschlauch an den Vakuumanschlüssen und stellen Sie sicher, dass kein Medium in das Vakuum gelangt. Legen Sie eine Polycarbonatplatte unter den Glasschieber und klemmen Sie die Durchflusskammerbaugruppe mit je einer Federklemme an den kurzen Seiten und zwei Federklemmen an den langen Seiten der Durchflusskammer.

Verbinden Sie anschließend die Durchflusskammer, den Einlass und den Auslass mit dem Durchflusskreislauf. Stellen Sie das Durchflusssystem in einen Inkubator, der auf 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid eingestellt ist, und füllen Sie den Kreislauf mit dem vorwärmten Medium, indem Sie das Reservoir mit dem Medium füllen und es mit geringer Pulsation einpumpen. Halten Sie diesen Fluss vier Stunden lang aufrecht, um die Zellen vorzukonditionieren.

Stellen Sie dann das Flüssigkeitsvolumen in der Dämpfungskammer auf den vormarkierten Pulsatilitätsindex und die Kultur ein. Die Zellen für die gewünschte Dauer. Die hier gezeigten Endothelzellen wurden ohne Fluss, mit stetigem Fluss und pulsierender Strömung kultiviert.

Veränderungen in der Morphologie können von der typischen Morphologie der Endothelzellen zu einer spindelartigen Morphologie nach 24-stündiger Exposition gegenüber einer hohen pulsierenden Strömung beobachtet werden. Sowohl die statische als auch die stationäre Strömung zeigen wenig oder keinen Unterschied in der Morphologie. Glatte Muskelzellen werden auch durch Co-Kultur mit Endothelzellen beeinflusst, die einem hohen pulsierenden Fluss ausgesetzt sind, wie hier durch unterschiedliche Konzentrationen von Alpha-, Glattmuskel-, Aktin- und Myosin-Schwerkette angezeigt wird.

Unter den unterschiedlichen Strömungsbedingungen zeigten Zellen, die einer pulsierenden Strömung ausgesetzt waren, die größten Mengen beider Proteine, was auf Hypertrophie und Kontraktilität hinweist. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, alle Dichtungen zu warten und sicherzustellen, dass der Flüssigkeitsstand nach diesem Verfahren konstant bleibt. Andere Methoden, wie z. B. die Co-Kultur von Endothelzellen, Gefäßzellen, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie z. B. Zell-zu-Zell-Interaktionen zu beantworten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den Flusskreislauf zusammenbauen, den Index steuern und Endothelzellen einer pulsierenden Strömung aussetzen.