Quantifizierung von Kolon Stem Cell Mutationen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, phänotypische somatische Mutationen im Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase- oder G6PD-Gen in kolonischen Stammzellen zu quantifizieren. Nach der Behandlung von Versuchstieren mit potenziell genotoxischen Substanzen erfolgt dies zunächst durch die Behandlung der Tiere mit dem Wirkstoff, wobei eine angemessene Wartezeit einzuhalten ist, um es den Nachkommen einer Stammzelle, die eine G6PD-Mutation trägt, zu ermöglichen, eine Krypta vollständig zu besiedeln; anschließend wird das Tier getötet, der Darm entfernt, zu einer Schweizerrolle geformt und das Gewebe in flüssigem Stickstoff eingefroren. Der zweite Schritt besteht darin, mithilfe eines Kryostaten sieben Mikrometer dicke gefrorene Schnitte des Darms auf Objektträger vorzubereiten.

Das Gewebe wird auf 37 Grad Celsius erwärmt, anschließend werden pro Gewebefärbung Brunnen um die Gewebeschnitte herum angelegt. Im letzten Schritt werden die Gewebeschnitte mit der G-6-PD-Färbemischung inkubiert und danach unter dem Lichtmikroskop untersucht. Zellen mit G-6-PD-Aktivität färben sich blau, während solche mit phänotypischen Mutationen weißlich erscheinen. Schließlich wird die Quantifizierung mutierter Krypten verwendet, um die Mutationsfrequenz zu bestimmen.

Diese Technik misst somatische Mutationen der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase in Stammzellen, welche die entscheidende Zellpopulation in der kolorektalen Karzinogenese darstellen. Durch die Identifizierung somatischer Stammzellmutationen lässt sich die Mutationsfrequenz mit der Inzidenz von Kolonkarzinomen bei behandelten Tieren korrelieren. Obwohl diese Methode Einblicke in Stammzellmutationen im Kolon ermöglicht, kann sie ebenfalls auf andere Modellorganismen oder Organsysteme angewendet werden.

Wenn eine Stammzellnische identifiziert werden kann, haben in der Regel Personen, die mit dieser Methode neu sind, Schwierigkeiten bei der Herstellung der MBT-Lösung. Die MBT-Lösung erfordert eine sorgfältige Beachtung der detaillierten Anweisungen. Um mit der Zubereitung der histologischen Färbungslösung zu beginnen, geben Sie zwei Milliliter pH-7,4-Phosphatpuffer zu 35 Milliliter Optimal Cutting Temperature (OCT)-Medium in einem 50-Milliliter-Röhrchen und schütteln Sie kräftig, um die Lösungen zu verbinden, wobei der pH-Wert mit pH-Papier überprüft wird.

Bestätigt, dass die Lösung einen pH-Wert von etwa 7,4 aufweist. Als Nächstes Glucose-6-phosphat und eine DP- und Magnesiumchlorid-Lösung in Phosphatpuffer gemäß der schriftlichen Anleitung auflösen und erneut überprüfen, ob der pH-Wert der Lösung bei etwa 7,4 bleibt. M-M-P-M-S-Lösung hinzufügen und kräftig mischen.

Dies sollte zu einem klaren, dunkelroten Homogenat führen. Wickeln Sie die Lösung in Folie ein, um die Belichtung durch Licht zu minimieren. Falls die Lösung trüb wird, sollte sie verworfen werden, während ein Ölbad erhitzt wird. Bereiten Sie separat eine fünfmillimolare Nitroblau- bis Terazoliumlösung oder MBT-Lösung vor, indem Sie 0,4 Milliliter Dimethylformamid, 0,4 Milliliter wasserfreies Ethanol und MBT in einem 2-Milliliter-Röhrchen mit O-Ring-Verschluss mischen. Verschließen Sie das Röhrchen locker und erhitzen Sie es im Ölbad unter heftigem Sieden, bis das MBT gelöst ist.

Als Nächstes lässt man die MBT-Lösung auf Raumtemperatur abkühlen und gibt sie dann dem OCT-Reaktionsgemisch hinzu. Die Lösung kann sich im Laufe der Zeit von der anfänglichen orangeroten Farbe zu einem dunkelroten oder violetten Ton verfärben. Nach der Behandlung der Tiere und der Herstellung von Gefrierschnitten gemäß der schriftlichen Anleitung baut man Vertiefungen für die Gewebefärbung mittels zweier mit Silikonfett zusammengefügter Stahlringe, die mit Parfüm an der Unterseite des Rings befestigt und in der Mitte ausgeschnitten werden, wo die Lösung platziert wird, ersetzt.

Vor der Färbung die gefrorenen Gewebeschnitte 10 Minuten lang in einem feuchten Raum bei 37 Grad Celsius vorwärmen. Anschließend die Vertiefungen auf dem Objektträger so platzieren, dass sie die Gewebeschnitte umgeben, und etwa einen halben Milliliter der zuvor hergestellten G6-PD-Färbelösung in jede Vertiefung mit Gewebeschnitt geben. Die Probe 45 bis 50 Minuten inkubieren. Danach die Objektträger aus dem warmen Raum nehmen und die Edelstahlvertiefungen vorsichtig von den Objektträgern entfernen.

Legen Sie die Objektträger an der langen Kante ab und lassen Sie die Reaktionsmischung ablaufen, gefolgt von einer 30 bis 60 minütigen Waschung mit 100 Millimolar Phosphatpuffer. Um letzte Reste der G6PD-Färbungslösung zu entfernen, spülen Sie die Objektträger mit deionisiertem Wasser fünf bis zehn Minuten lang, um restlichen Phosphatpuffer zu entfernen. Versiegeln Sie das Gewebe abschließend, indem Sie Fluoro-Gel tropfenweise auf den Objektträger geben, und trocknen Sie ihn 30 Minuten lang, um Bilder für die spätere Analyse aufzunehmen.

Platzieren Sie den Objektträger auf einem Lichtmikroskop und stellen Sie auf eine Vierfach-Vergrößerung ein. Nehmen Sie dann mit einer 5,0-Megapixel-Kamera Bilder des gefärbten Gewebeschnitts auf, um die Gesamtanzahl der untersuchten Krypten abzuschätzen. Wählen Sie für jede Maus einen Schnitt aus der Ebene mit der kleinsten Oberfläche aus und bilden Sie diesen bei 10-facher Vergrößerung ab.

Zählen Sie die Anzahl der mutierten Krypten. Gemäß den folgenden Kriterien weist die gesamte Krypte keine blaue Färbung auf. Die äußere Struktur der Krypte ist intakt.

Der Mutant wird in benachbarten sieben Mikrometer dicken Schnittserien beobachtet, und zwei Beobachter identifizieren denselben Kryptus als mutiert. Zählen Sie visuell die Anzahl der Krypten in diesem Schnitt und multiplizieren Sie diese mit der Anzahl der untersuchten Ebenen pro Colon. Beispiele für mutierte Krypten, die bei Mäusen nach Behandlung mit dem DNA-schädigenden Wirkstoff Azoxymethan beobachtet wurden, sind hier zu sehen; links sehen Sie eine vertikale oder aufsichtsartige Ansicht eines mutierten Kryptus.

Während rechts eine horizontale oder Seitenansicht zu sehen ist, müssen für die Feststellung, dass ein Krypte mutiert ist, alle Zellen innerhalb der Krypte erhalten bleiben. Weiße Krypten mit einer geringen Menge Weiß sind auf die Schleimproduktion durch Becherzellen zurückzuführen. Die Mutationsfrequenz wird berechnet als die Anzahl beobachteter Mutanten dividiert durch die Gesamtzahl der untersuchten Krypten ohne Mutante.

Krypten wurden in Kolons von Kontrollmäusen beobachtet, was einer Mutationsfrequenz von weniger als 1 × 10⁻⁵ entspricht, während Mäuse, die mit Azoxymethan behandelt wurden, eine Stammzellmutationsfrequenz von 4,44 × 10⁻⁴ aufwiesen, nachdem dieses Verfahren durchgeführt wurde. Andere Methoden, wie beispielsweise die genetische Analyse der Art von Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase-Mutationen, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise, wie der chemische Wirkstoff eine Mutation falsch codiert. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man somatische Stammzellmutationen in Mäusen messen kann, die mit potenziell mutagenen und karzinogenen Verbindungen behandelt wurden.