Quantifizierung von Kolon Stem Cell Mutationen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, phänotypische somatische Mutationen in der Glukose-Sechs-Phosphat-Dehydrogenase oder im G-Sechs-PD-Gen in Dickdarmstammzellen zu quantifizieren. Nach der Behandlung von Tieren mit mutmaßlichen genotoxischen Mitteln wird dies erreicht, indem zuerst Tiere mit dem Mittel behandelt werden, eine angemessene Zeit gewartet wird, damit die Nachkommen einer Stammzelle, die eine G-6-PD-Mutation trägt, eine Krypta vollständig bewohnen können, das Tier geopfert, der Dickdarm entfernt und zu einer Schweizer Rolle geformt und das Gewebe in flüssigem Stickstoff eingefroren wird. Der zweite Schritt besteht darin, sieben Mikrometer dicke Schnellschnitte auf Objektträgern aus dem Dickdarm mit einem Kryostaten zu präparieren.

Das Gewebe wird auf 37 Grad Celsius erwärmt und dann werden Vertiefungen pro Gewebefärbung um die Gewebeschnitte herum angelegt. Der letzte Schritt besteht darin, die Gewebeschnitte mit der G-6-PD-Färbemischung zu inkubieren und dann unter einem Lichtmikroskop zu analysieren. Zellen mit G-6-PD-Aktivität färben sich blau, während Zellen mit phänotypischen Mutationen weißlich erscheinen. Letztendlich wird die Quantifizierung von mutierten Crips verwendet, um die Mutationshäufigkeit zu bestimmen.

Diese Technik misst somatische Mutationen der Glucose-Six-Phosphat-Dehydrogenase in Stammzellen, und dies ist die kritische Zellpopulation bei der Dickdarmkarzinogenese. Durch die Identifizierung von somatischen Stammzellmutationen ist es möglich, die Mutationshäufigkeit mit dem Auftreten von Darmkrebs bei behandelten Tieren zu korrelieren. Diese Methode kann zwar Aufschluss über Stammzellmutationen im Dickdarm geben, kann aber auch auf andere Modellorganismen oder Organsysteme angewendet werden.

Wenn eine Stammzellnische identifiziert werden kann, werden Personen, die neu in dieser Methode sind, im Allgemeinen Schwierigkeiten mit der Herstellung der MBT-Lösung haben. Löslich. Die MBT-Lösung erfordert eine sorgfältige Beachtung detaillierter Anweisungen. Um mit der Vorbereitung der histologischen Färbelösung bei zwei Millilitern pH 7,4 Phosphatpuffer auf 35 Milliliter optimaler Schnitttemperatur oder OCT-Medium in ein 50-Milliliter-Röhrchen zu beginnen und kräftig zu schütteln, um es mit pH-Papier zu verbinden.

Es wurde bestätigt, dass die Lösung einen pH-Wert von etwa 7,4 hat. Als nächstes wurden bei Glucose sechs Phosphat und eine DP- und Magnesiumchloridlösung in Phosphatpuffer gelöst, wie im Textprotokoll angegeben, und erneut bestätigt, dass der pH-Wert der Lösung bei etwa 7,4 bleibt. M-M-P-M-S-Lösung zugeben und kräftig mischen.

Dies sollte zu einem klaren, dunkelroten Homogenat führen, das die Lösung in Folie einwickelt, um die Lichteinwirkung zu minimieren. Wenn die Lösung trüb wird, sollte sie verworfen werden, während ein Ölbad erhitzt wird. Bereiten Sie separat eine fünf Millimolare Nitroblau-zu-Teraz-Oleum- oder MBT-Lösung vor, indem Sie 0,4 Milliliter Dimethylformamid, 0,4 Milliliter wasserfreies Ethanol und MBT in einem Zwei-Milliliter-Röhrchen mit O-Ring-Deckel mischen, das Röhrchen locker verschließen und im Ölbad kräftig zum Kochen bringen, bis sich das MBT aufgelöst hat.

Lassen Sie anschließend die MBT-Lösung auf Raumtemperatur abkühlen und fügen Sie sie dann dem OCT-Reaktionsgemisch hinzu. Die Farbe der Lösung kann sich im Laufe der Zeit von einem anfänglichen Orangerot zu einem dunklen Rot oder Violett ändern. Nach der Behandlung von Tieren und der Vorbereitung von Schnellschnitten, wie im Textprotokoll angegeben, bauen Sie Vertiefungen für die Gewebefärbung mit zwei Stahlscheiben, die mit Silikonfett verbunden sind, und passen Sie das Parfum an den Boden der Unterlegscheibe an und schneiden Sie die Mitte aus, in der die Lösung platziert und ersetzt wird.

Vor dem Krieg gleitet das gefrorene Gewebe für 10 Minuten in einem feuchten, 37 Grad Celsius warmen Raum. Als nächstes platzieren Sie die Vertiefungen auf dem Objektträger, um die Gewebeschnitte mit etwa einem halben Milliliter der zuvor vorbereiteten G sechs PD-Färbemischung in jede Gewebeschnittvertiefung zu umgeben, und inkubieren Sie sie 45 bis 50 Minuten lang. Nehmen Sie die Objektträger aus dem warmen Raum und entfernen Sie vorsichtig die Edelstahlvertiefungen von den Objektträgern.

Legen Sie die Objektträger auf die lange Kante und lassen Sie das Reaktionsgemisch abtropfen, gefolgt von einer 30- bis 60-minütigen Wäsche und einem 100-millimolaren Phosphatpuffer. Um die letzten Spuren der G six PD-Färbelösung zu entfernen, spülen Sie die Objektträger und das deionisierte Wasser fünf bis 10 Minuten lang aus, um den restlichen Phosphatpuffer zu entfernen. Versiegeln Sie schließlich das Gewebe, indem Sie Fluorgel tropfenweise auf den Objektträger geben und 30 Minuten lang trocknen lassen, um Bilder für die spätere Analyse aufzunehmen.

Legen Sie den Objektträger auf ein Lichtmikroskop und stellen Sie ihn auf vier DX-Vergrößerungen ein. Machen Sie dann Fotos des gefärbten Gewebeschnitts mit einer 5,0-Megapixel-Kamera, um die Gesamtzahl der untersuchten Krypten zu schätzen. Wählen Sie für jede Maus einen Ausschnitt aus der Ebene mit der kleinsten Oberfläche aus und stellen Sie ihn mit 10-facher Vergrößerung dar.

Zähle die Anzahl der mutierten Crips. Nach den folgenden Kriterien ist die gesamte Krypta frei von blauer Farbe. Die äußere Struktur der Krypta ist intakt.

Die Mutante wird auf benachbarten sieben Mikrometern Schnitten beobachtet und zwei Beobachter identifizieren dieselbe Krypta als Mutante. Zählen Sie visuell die Anzahl der Krypten in diesem Abschnitt, und multiplizieren Sie sie mit der Anzahl der Ebenen, die für jeden Doppelpunkt überprüft wurden. Beispiele für mutierte Crips, die bei Mäusen beobachtet wurden, die mit dem DNA-schädigenden Wirkstoff Azoxymethan behandelt wurden, sind hier links zu sehen: Sie sehen eine vertikale oder Draufsicht auf eine mutierte Krypta.

Auf der rechten Seite befindet sich eine horizontale oder seitliche Ansicht, aber damit eine Krypta als Mutant deklariert werden kann, müssen alle Zellen in der Krypta erhalten bleiben. Weiße Krypten mit einem kleinen Anteil an Weiß sind auf die Schleimproduktion von Becherzellen zurückzuführen. Die Mutationshäufigkeit wird berechnet, indem die Anzahl der beobachteten Mutanten geteilt durch die Gesamtzahl der Krypten, die keine Mutante durchleuchtet haben.

Crips wurden im Dickdarm von Kontrollmäusen beobachtet, die eine Mutationshäufigkeit von weniger als eins mal 10 bis minus fünf darstellten, während mit Azoxymethan behandelte Mäuse eine Stammzellmutationshäufigkeit von 4,44 mal 10 bis minus vier aufwiesen. Andere Methoden, wie die genetische Analyse des Typs der Glukose-x-Phosphat-Dehydrogenase-Mutationen, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. wie der chemische Wirkstoff eine Mutation falsch kodiert. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie somatische Stammzellmutationen bei Mäusen gemessen werden können, die mit potenziell mutagenen und krebserregenden Verbindungen behandelt wurden.