Zellsortierung von Neural Stamm- und Vorläuferzellen aus dem erwachsenen Maus Subventrikularzone und Live-Bildgebung ihrer Zellzyklus Dynamics

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den Zellzyklusverlauf von sortierten neuralen Stammzellen und ihren Nachkommen zu verfolgen, die aus der subventrikulären Zone des transgenen Fluoreszenz-Ubiquitinierungszellzyklus, bekannt als FCI-Mäuse, isoliert wurden. Dies wird erreicht, indem zunächst die subventrikuläre Zone transgener adulter Mausgehirne präpariert wird. Der zweite Schritt besteht darin, das neuronale Gewebe mit Hilfe einer Papaya-Behandlung in eine Einzelzellsuspension zu dissoziieren.

Anschließend werden die verschiedenen neurogenen Zellpopulationen der subventrikulären Zone mit Antikörpern markiert, um ruhende neurale Stammzellen, aktivierte neurale Stammzellen, transitamplifizierende Zellen und unreife sowie migrierende Neuroblasten zu identifizieren. Der letzte Schritt besteht darin, die Zellen anhand von Fakten direkt in frisches Kulturmedium zu sortieren, bevor sie auf Poly-D-Lysin-beschichtete Platten aufgebracht werden. Letztendlich wird die kontinuierliche Zeitraffer-Videomikroskopie verwendet, um den Zellzyklusverlauf der plattierten Zellen zu untersuchen, da die verschiedenen transgenen Zellen zu unterschiedlichen Zeitpunkten während ihres Zellzyklus fluoreszieren.

Die Kombination der Zellsortiertechnik mit der Fuji-Technologie ermöglicht die Visualisierung und Isolierung der verschiedenen Zellpopulationen aus der subventrikulären Zone und ermöglicht so die Untersuchung der Eigenschaften und Dynamiken im Bewegungsgehirn des Erwachsenen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Zusammenhang mit dem Altern und Gehirnpathologien Am Tag vor dem Experiment zu beantworten. Bei etwa 200 Mikrolitern einer 10 Mikrogramm pro Milliliter Poly-D-Lysinlösung in jede Vertiefung einer sterilen, schwarz wandigen 96-Well-Platte, um den Boden der Vertiefung zu beschichten, die Platte abzudecken und am nächsten Tag über Nacht bei 37 Grad Celsius zu inkubieren.

Entfernen Sie die Poly-D-Lysinlösung und spülen Sie die Vertiefungen dreimal mit sterilem destilliertem Wasser aus, bevor Sie die Platte mindestens zwei Stunden lang in der Haube unter laminarer Strömung trocknen lassen. Wenn nicht sofort verwendet. Lagern Sie die getrocknete beschichtete Platte bis zu sieben Tage bei vier Grad Celsius.

Bereiten Sie als Nächstes die Papain-Dissoziationslösung vor und sterilisieren Sie sie, indem Sie die Mischung durch einen 0,2-Mikron-Filter leiten. Erwärmen Sie die Lösung auf 37 Grad Celsius, bevor Sie sie verwenden. Bereiten Sie außerdem eine Proteasehemmerlösung vor, indem Sie 0,7 Milligramm pro Milliliter Trypsin in Inhibitor Typ zwei zu TM F 12 Medium steril hinzufügen.

Filtrieren Sie die Lösung mit einem 0,2-Mikron-Filter und erwärmen Sie die Lösung auf 37 Grad Celsius, bevor Sie sie verwenden. Legen Sie die frisch präparierte subventrikuläre Zone eines erwachsenen Fucci-roten Mausgehirns in eine Petrischale mit 0,6 % Glukose in PBS und zerkleinern Sie das Gewebe, bis keine großen Stücke mehr übrig sind. Dann alles in ein 15-Milliliter-Röhrchen umfüllen und bei 200 mal G fünf Minuten zentrifugieren.

Sobald das Gewebe pelletiert wurde, entsorgen Sie die Schlinge und die Reanimation. Suspendieren Sie das Gewebe in einem Milliliter vorwarmem Papain, ergänzt mit 0,01 Milligramm pro Milliliter DNA. Eins. Inkubieren Sie die Mischung 10 Minuten lang in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius.

Dann erneut bei 200-fachem G für fünf Minuten zentrifugieren und das Snat. Fügen Sie einen Milliliter der Prewarm OVO MOID-Lösung hinzu, um den enzymatischen Verdau zu stoppen. Verwenden Sie anschließend eine P 1000 Mikropipettenspitze, um vorsichtig 20 Mal auf und ab zu pipettieren, um das zerkleinerte Gewebe während des Pipettierens mechanisch in eine Einzelzellsuspension zu dissoziieren.

Vermeiden Sie es, Luftblasen in die Mischung einzubringen, die die Zellen zusätzlich belasten würden. Die Zellsuspension wird durch einen sterilen 20-Mikron-Filter in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen geleitet. Waschen Sie den Zellfilter mit zwei Millilitern PBS mit 0,15 % BSA, um Zellverluste zu vermeiden.

Dann zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 200 mal G für 10 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand. Führen Sie die Faktenfärbung durch, indem Sie zuerst die Zellen jeder Maus in 100 Mikroliter PBS mit 0,15 % BSA suspendieren.

Verwenden Sie ein Zehntel der Zellen einer der Mäuse, um jede der vier Kontrollen vorzubereiten, wie im beigefügten Textprotokoll beschrieben. Geben Sie die hier aufgeführten Primärantikörper in jedes der Röhrchen, die für die Zellsortierung verwendet werden, und inkubieren Sie die Mischungen 20 Minuten lang im Dunkeln bei vier Grad Celsius. Nach der Inkubation mit den primären Antikörpern waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter PBS mit 0,15 % BS, A und zentrifugieren Sie die Zellen dann 10 Minuten lang bei 200 mal G.

Suspendieren Sie die Zellen in 200 Mikrolitern PBS, die 0,15 % BSA pro Gehirn enthalten, und übertragen Sie sie in geeignete Wirkungen. Sortieren von Rohren. Legen Sie die Zellsortierröhrchen auf Eis und geben Sie unmittelbar vor der Zellsortierung einen lebenswichtigen Farbstoff wie hooked 3 3 2 5 8 stain mit zwei Mikrogramm pro Milliliter in die Zellen, um lebende von toten Zellen zu unterscheiden.

Führen Sie als nächstes die Zellen im negativen Kontrollrohr durch die Fakten und wählen Sie die Zellen mit den Parametern Seitenstreuung und Vorwärtsstreuung aus. Schließen Sie die toten Zellen aus, indem Sie nur die Haken an den negativen Anteil binden und die Dubletten an den Puls mit negativem Anteil anpassen. Führen Sie eine einfarbige Steuerung durch und passen Sie bei Bedarf die Spannungen der Photomultiplier-Röhre an.

Führen Sie die Farbkorrektur im Kompensationsfenster der Software durch. Führen Sie die drei Regler für Fluoreszenz minus eins aus und zeichnen Sie die Sortiergates. Sobald alle Gates eingerichtet sind, sortieren Sie die markierten Zellen direkt in 100 Mikroliter Kultur.

Medium Plattieren Sie die frisch sortierten Zellen mit einer Dichte von 1000 bis 3000 Zellen pro Vertiefung auf das Poly de Lycine beschichtete. 96 Well-Platten mit 300 Mikrolitern Kulturmedium. Inkubieren Sie die Kulturplatten mindestens eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Um die Zelladhäsion zu ermöglichen, bereiten Sie ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop für die Bildgebung vor, indem Sie die angeschlossene temperaturgesteuerte Kammer unter einer Atmosphäre von 5 % Kohlendioxid auf 37 Grad Celsius vorheizen. Positionieren Sie die 96-Well-Platte in der vorwarmen Mikroskopkammer und bringen Sie die erste Vertiefung in den Fokus. Öffnen Sie dann die Imaging-Software und klicken Sie mit der rechten Maustaste in das Hauptfenster, um die Erfassungssteuerungen und die DEAC-Erfassung auszuwählen.

Um das TI-Pad zu öffnen und als nächstes das Ziel PLAN A PO VC 20 XDIC auszuwählen, klicken Sie auf Acquire-Acquisition-Steuerelemente und öffnen Sie dann die Zeitrafferoptionen. Legen Sie die Mitte jedes Wells als Tischposition fest, und wählen Sie die Option "Großes Bild" auf sieben x sieben Millimeter im Quadrat aus. Beobachten Sie ein Mosaikbild um die Mitte jedes Elements.

Stellen Sie die Überlappung für das große Mosaikbild auf 5 % ein und stellen Sie die Häufigkeit so ein, dass die Bilder 24 Stunden lang alle 20 Minuten aufgenommen werden. Wählen Sie unter einer Plus-Eins-Einstellung den Spannungspegel der Photomultiplier-Röhre für jede in der Menüleiste aufgeführte Fluoreszenz aus. Wählen Sie diese Option, um Bilder mit einem Hochgeschwindigkeits-Resonanzscanner in einem Format von fünf 12 x fünf 12 Pixeln aufzunehmen, und verwenden Sie DIC, um die Zellen zu visualisieren.

Wählen Sie dann einen Ordner aus, in dem die Datendateien gespeichert werden sollen. Wählen Sie die Schaltfläche Jetzt ausführen im ND-Aufnahmefenster, um die Erfassung zu starten. Befolgen Sie die Computerarbeit für die Dauer von mindestens einer Schleife, um sicherzustellen, dass alles ordnungsgemäß funktioniert.

Fuji-rote Mäuse wurden verwendet, um die G-Ein-Phase-Phase mit roter Fluoreszenz mittels Zeitraffer-Videomikroskopie zu verfolgen. Die isolierten Zellen sind während der ersten Wachstumsphase rot fluoreszierend und unsere Farbliste während der Synthese, der zweiten Wachstumsphase und der Mitose. Lex positive, eeg, FR positiv und eeg.

FR-positive Zellen von jungen Erwachsenen und Mäusen mittleren Alters wurden plattiert und mikroskopisch verfolgt. Die Phasenlänge von S und G zwei M zeigte keinen Unterschied zwischen Lex-positiven EGFR-positiven und EG FFR-positiven Zellen, weder bei jungen noch bei Mäusen mittleren Alters. Es zeigte sich jedoch, dass die Länge der nächsten Wachstumsphase von der ersten Teilung bis zum Ausschalten der roten Fluoreszenz bei den älteren Zellen aufgrund der Zunahme der einphasigen G-Länge länger war.

Neurosphären, die fünf Tage nach der Plattierung erhalten wurden, sind in Lex-positiven EGFR-positiven Zellen, die von älteren Mäusen gewonnen wurden, kleiner. Das gesamte Protokoll sollte bei der Arbeit mit 12 Mäusen drei Stunden für die Dissektion und Faxvorbereitung und weitere drei Stunden für die Zellsortierung nicht überschreiten. Denken Sie daran, dass unsere Arbeit mit zu vielen Mäusen am selben Tag zu einer verlängerten Zellsortierdauer und möglicherweise zu einem erhöhten Zelltod oder einer erhöhten Zelldifferenzierung führt.