Zellsortierung von Neural Stamm- und Vorläuferzellen aus dem erwachsenen Maus Subventrikularzone und Live-Bildgebung ihrer Zellzyklus Dynamics

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, den Zellzyklusverlauf sortierter neuraler Stammzellen und ihrer Tochterzellen zu verfolgen, die aus der subventrikulären Zone transgener fluoreszenzmarkierter Ubiquitinierungszellzyklus-Mäuse, sogenannter FCI-Mäuse, isoliert wurden. Dies wird erreicht, indem zunächst die subventrikuläre Zone transgener erwachsener Maushirne disseziert wird. Der zweite Schritt besteht darin, das neuronale Gewebe mittels einer Papaya-Behandlung in eine Einzelzell-Suspension zu dissociieren.

Anschließend werden die verschiedenen neurogenen Zellpopulationen der subventrikulären Zone mithilfe von Antikörpern markiert, um ruhende neurale Stammzellen, aktivierte neurale Stammzellen, transitorisch amplifizierende Zellen sowie unreife und migrierende Neuroblasten zu identifizieren. Im letzten Schritt erfolgt die Sortierung der Zellen mittels FACS direkt in frisches Kulturmedium, bevor sie auf mit Poly-D-Lysin beschichteten Platten ausplattiert werden. Abschließend wird eine kontinuierliche Zeitraffervideomikroskopie durchgeführt, um den Zellzyklusverlauf der ausplattierten Zellen zu untersuchen, da die verschiedenen transgenen Zellen zu unterschiedlichen Zeitpunkten ihres Zellzyklus fluoreszieren.

Die Kombination der Zellsortiertechnik mit der Fuji-Technologie ermöglicht die Visualisierung und Isolierung der verschiedenen Zellpopulationen aus der subventrikulären Zone und erlaubt dadurch die Untersuchung der Eigenschaften und Dynamiken im erwachsenen bewegten Gehirn. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Zusammenhang mit Alterung und Gehirnerkrankungen zu beantworten. Am Tag vor dem Experiment: Geben Sie etwa 200 Mikroliter einer 10 Mikrogramm pro Milliliter Poly-D-Lysin-Lösung in jedes Loch einer sterilen, schwarzwandigen 96-Loch-Platte, um den Boden der Löcher zu beschichten. Decken Sie die Platte ab und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius.

Entfernen Sie die Poly-D-Lysin-Lösung und spülen Sie die Vertiefungen dreimal mit steriler destillierter Wasser aus, bevor Sie die Platte mindestens zwei Stunden lang im Sicherheitswerkbank unter laminarer Strömung trocknen lassen. Falls nicht sofort verwendet, bewahren Sie die getrocknete beschichtete Platte bis zu sieben Tage bei vier Grad Celsius auf.

Bereiten Sie als Nächstes die Papain-Dissociationslösung vor und sterilisieren Sie sie, indem Sie die Mischung durch einen 0,2-Mikron-Filter leiten. Erwärmen Sie die Lösung vor der Verwendung auf 37 Grad Celsius vor. Bereiten Sie außerdem eine Proteaseinhibitorlösung vor, indem Sie 0,7 Milligramm pro Milliliter Trypsin-Inhibitor Typ zwei dem sterilen TM F 12-Medium zugeben.

Filtern Sie die Lösung mithilfe eines 0,2-Mikron-Filters und erwärmen Sie die Lösung vor der Verwendung auf 37 Grad Celsius. Legen Sie die frisch präparierte subventrikuläre Zone aus dem Gehirn einer adulten Fucci-rot-Maus in eine Petrischale, die 0,6 % Glukose in PBS enthält, und zerkleinern Sie das Gewebe, bis keine größeren Stücke mehr vorhanden sind. Anschließend überführen Sie alles in ein 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren es fünf Minuten lang bei 200 × g.

Nachdem das Gewebe pelletiert wurde, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren das Gewebe in einem Milliliter vorgewärmter Papainlösung, ergänzt mit 0,01 Milligramm pro Milliliter DNAase. Inkubieren Sie die Mischung 10 Minuten lang in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius.

Anschließend erneut bei 200 × g für fünf Minuten zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Geben Sie einen Milliliter der vorgewärmten OVO MOID-Lösung hinzu, um die enzymatische Verdauung zu stoppen. Verwenden Sie danach eine P-1000-Mikropipettenspitze, um vorsichtig 20 Mal auf- und abzupipettieren, um das zerkleinerte Gewebe mechanisch in eine Einzelzell-Suspension zu dissoziieren, während Sie pipettieren.

Vermeiden Sie das Einführen von Luftblasen in die Mischung, da diese zusätzlichen Stress für die Zellen verursachen würden. Leiten Sie die Zellsuspension durch einen sterilen 20-Mikron-Filter in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen. Spülen Sie den Zellfilter mit zwei Millilitern PBS, der 0,15 % BSA enthält, um Zellverluste zu vermeiden.

Anschließend die Zellsuspension 10 Minuten bei 200 × g zentrifugieren. Den Überstand verwerfen. Die Färbung durchführen, indem die Zellen von jedem Maus in 100 Mikroliter PBS mit 0,15 % BSA suspendiert werden.

Verwenden Sie ein Zehntel der Zellen von einer der Mäusen, um jede der vier Kontrollen wie in dem begleitenden textlichen Protokoll beschrieben vorzubereiten. Geben Sie die hier aufgeführten primären Antikörper zu jedem der für die Zellsortierung verwendeten Röhrchen hinzu und inkubieren Sie die Gemische 20 Minuten im Dunkeln bei vier Grad Celsius. Nach der Inkubation mit den primären Antikörpern waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter PBS, der 0,15 % BSA enthält, und zentrifugieren Sie die Zellen anschließend bei 200 × g für 10 Minuten.

Suspendieren Sie die Zellen in 200 Mikrolitern PBS mit 0,15 % BSA pro Gehirn und überführen Sie sie in geeignete Sortiergefäße. Stellen Sie die Zell-Sortiergefäße auf Eis und geben Sie unmittelbar vor der Zellsortierung einen Vitalfarbstoff wie Hoechst 33258 in einer Konzentration von zwei Mikrogramm pro Milliliter zu den Zellen hinzu, um lebende von toten Zellen zu unterscheiden.

Als Nächstes werden die Zellen aus dem Negativkontrollgefäß durch die FACS-Analyse geleitet und mithilfe der Seitenstreuung und der Vorwärtsstreuung ausgewählt. Tote Zellen werden ausgeschlossen, indem nur die Zellen im negativen Anteil selektiert werden, und Doppelzellen werden durch Auswahl des Signals mit negativem Anteil eliminiert. Führen Sie Einzelfarbkontrollen durch und passen Sie gegebenenfalls die Spannungen der Photomultiplierröhren an.

Führen Sie die Farbkompensation im Kompensationsfenster der Software durch. Führen Sie die drei Fluoreszenz-minus-eins-Kontrollen durch und zeichnen Sie die Sortiertore. Sobald alle Tore eingerichtet sind, sortieren Sie die markierten Zellen direkt in 100 Mikroliter Kultur ein.

Plattieren Sie die frisch sortierten Zellen mit einer Dichte von 1000 bis 3000 Zellen pro Vertiefung auf Poly-D-Lysin-beschichteten 96-Loch-Platten mit jeweils 300 Mikroliter Kulturmedium. Inkubieren Sie die Kulturplatten bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für mindestens eine Stunde.

Um die Zelladhäsion zu ermöglichen, bereiten Sie ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop für die Bildgebung vor, indem Sie die angeschlossene temperaturgesteuerte Kammer unter einer Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid auf 37 Grad Celsius vorheizen. Platzieren Sie die 96-Well-Platte in der vorgewärmten Mikroskopkammer und fokussieren Sie das erste Well. Öffnen Sie anschließend die Bildgebungssoftware und klicken Sie mit der rechten Maustaste im Hauptfenster, um die Aufnahmesteuerung und die DEAC-Aufnahme auszuwählen.

Um das TI-Pad zu öffnen und als Nächstes das Plan-A-PO-VC-20-XDIC-Objektiv auszuwählen, klicken Sie auf die Aufnahme-Steuerungen und öffnen anschließend die Zeitraffereinstellungen. Legen Sie das Zentrum jedes Wells als Objektträgerposition fest und wählen Sie die große Bildoption mit sieben mal sieben Millimeter quadrat. Beobachten Sie ein Mosaikbild um das Zentrum jedes Wells herum.

Legen Sie die Überlappung für das große Mosaikbild auf 5 % fest und stellen Sie die Aufnahmefrequenz so ein, dass alle 20 Minuten über einen Zeitraum von 24 Stunden Bilder aufgenommen werden. Wählen Sie unter den Einstellungen für „One Plus“ die Photomultiplier-Röhrenspannung für jede im Menü aufgeführte Fluoreszenz aus. Wählen Sie aus, um Bilder mit einem Hochgeschwindigkeits-Resonanzscanner im Format 512 × 512 Pixel aufzunehmen, und verwenden Sie DIC, um die Zellen sichtbar zu machen.

Danach einen Ordner auswählen, in dem die Datendateien gespeichert werden sollen. Im ND-Aufnahme-Fenster die Schaltfläche „Jetzt ausführen“ auswählen, um die Aufnahme zu starten. Während mindestens einer Schleife den Computerarbeitsablauf verfolgen, um sicherzustellen, dass alles ordnungsgemäß funktioniert.

Fuji-Rot-Mäuse wurden verwendet, um die G1-Phase mithilfe von Zeitraffervideomikroskopie über die rote Fluoreszenz zu verfolgen. Die isolierten Zellen sind während der ersten Wachstumsphase rot fluoreszierend und unsere Farbliste während der Synthese, der zweiten Wachstumsphase und der Mitose. Lex-positiv eeg FR-positiv und eeg.

FR-positive Zellen von jungen erwachsenen und mittelalten Mäusen wurden kultiviert und mittels Mikroskopie verfolgt. Die Länge der S- und G2/M-Phase zeigte weder bei jungen noch bei mittelalten Mäusen einen Unterschied zwischen Lex-positiven, EGFR-positiven und EGFR-positiven Zellen. Allerdings wurde festgestellt, dass die Dauer der anschließenden Wachstumsphase – von der ersten Teilung bis zum Abschalten der roten Fluoreszenz – in den älteren Zellen aufgrund der verlängerten G1-Phasenlänge länger war.

Neurosphären, die fünf Tage nach der Aussaat gewonnen wurden, sind kleiner in Lex-positiven EGFR-positiven Zellen, die aus älteren Mäusen stammen. Das gesamte Protokoll sollte drei Stunden für die Dissektion und die Vorbereitung der Fax nicht überschreiten und weitere drei Stunden für die Zellsortierung, wenn mit 12 Mäusen gearbeitet wird. Beachten Sie, dass die Arbeit mit zu vielen Mäusen am selben Tag zu einer verlängerten Dauer der Zellsortierung führen und möglicherweise zu einer erhöhten Zelltodrate oder Zelldifferenzierung führen kann.