Ein optimiertes Verfahren zur Isolierung und Ausbau unveränderlichen natürlichen Killer T-Zellen aus der Milz der Maus

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, in Varianten natürlicher Killer-T- oder INKT-Zellen zu expandieren, die aus der Milz der Maus gewonnen werden. Dies wird erreicht, indem zunächst Milzzellen isoliert werden, gefolgt von der Anreicherung der fünf positiven Zöliacken-Lymphozytenpopulation durch magnetische Zelltrennung. Die Milz-INKT-Zellfraktion wird dann durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung weiter isoliert.

Im letzten Schritt werden die sortierten INKT-Zellen für die Expansion in vitro platziert. Letztendlich kann das Zytokinprofil der expandierten INKT-Zellen durch Eliza beurteilt werden. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da die Reinigung und Expansion von INKT-Zellen die Kombination verschiedener Techniken erfordert.

Dieses Verfahren wird von einem Doktoranden aus meinem Labor durchgeführt. Übertragen Sie das Gewebe nach der Milzentnahme in einen 70-Mikron-Nylonfilter, verwenden Sie dann einen Zwei-Milliliter-Spritzenkolben, um die Milz vorsichtig durch das Sieb in ein konisches 50-Milliliter-Rohr zu zerdrücken, und waschen Sie den Filter mit fünf Millilitern PBS. Geben Sie dann drei Milliliter des Kohlepakets in ein 15-Milliliter-Rohr und überlagern Sie den Dichtegradienten mit den fünf Millilitern Zellsuspension.

Trennen Sie die Zellen durch Zentrifugation und übertragen Sie die Grenzfläche in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen. Waschen Sie dann die Zellen in 10 Millilitern kaltem PBS und resuspendieren Sie das Pellet in zwei Millilitern Faxpuffer, um für die Zöliakie fünf positive Milzlymphozyten anzureichern. Stellen Sie die Zellverdünnung auf eins mal 10 bis zu den siebten Zellen pro 90 Mikroliter mit mehr Faxpuffer ein und fügen Sie den Zellen 10 Mikroliter Anti-CD fünf Mikrokügelchen hinzu.

Waschen Sie die Zellen nach 15 Minuten bei vier Grad Celsius mit vier Millilitern Faxpuffer und resuspendieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern frischem Faxpuffer. Isolieren Sie die CD mit fünf positiven Zellen durch magnetische Zelltrennung gemäß der Empfehlung des Herstellers. Verdünnen Sie dann die angereicherten CD fünf positive Lymphozyten zu einem mal 10 zu den sechs Zellen pro 20 Mikroliter Inax-Puffer, der Anti-CD 16, CD 32 und PE konjugiertes Alpha-Mädchen-Luft-CD-1D-Tetramer bei Raumtemperatur im Dunkeln nach 30 Minuten enthält, inkubieren Sie die Zellen mit den Antikörpern von Interesse bei vier Grad Celsius im Dunkeln für weitere 30 Minuten.

Waschen Sie dann die Zellen in frischem Faxpuffer und färben Sie sie fünf Minuten lang mit 10 Mikrolitern einer 20-mikromolaren Arbeitslösung von DPI pro einmal 10 auf die sechs Zellen. Bei Raumtemperatur erfassen nun etwa einmal 10 bis zur vierten angereicherten CD fünf positive Lymphozytenereignisse auf dem Durchflusszytometer, die elektronisch auf die Vorwärtsstreuung mit niedrigen Zellen gleiten, um die Zelldubletten und Aggregate elektronisch auszuschließen. Gate-out der DAPI-positiven CD mit acht positiven CD 19-positiven Zellen innerhalb der Vorwärtsstreuung mit geringer Grundgesamtheit und Verwendung von Seitenstreu- und Vorwärtsstreuflächendiagrammen.

Zur elektronischen Selektion der Lymphozyten zeichnen Sie die alpha gal SER CD 1D Tetramere nach CD drei Epsilon und elektronisch ga die alpha gal ser CD 1D Tetramer positive CD drei Epsilon positive INKT Zellen wie angegeben auf. Dann, wenn sie nicht mehr als zweimal 10 bis zur fünften CD erwerben, bestimmen fünf positiv angereicherte Lymphozyten den Prozentsatz der Alpha-Gal SER CD 1D Tetramer positiven CD drei Epsilon positiven INKT-Zellen, die in der angereicherten zellulären Fraktion vorhanden sind. Unter Verwendung dieser Gate-Low-Sortierung wird das alpha alser CD 1D Tetramer positive CD drei Epsilon-positive INKT-Zellen in ein Faxrohr gegeben, das am Ende der Sortierung einen Milliliter fötales Kälberserum enthält.

Spülen Sie die isolierten NKT-Zellen von der Seite des Faxrohrs mit 10 Millilitern RPMI 1640 Medium. Schleudern Sie dann die Zellen herunter, resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter RPMI 1640 und verwenden Sie ein 40-Mikroliter-Aliquot der Zellen, um die Reinheit der sortierten Zellen zu beurteilen. Verwenden Sie die gleiche Gating-Strategie.

Was das Einrichten der Sortierparameter zum Expandieren der INKT-Zellen betrifft, so drehen Sie die Zellen herunter und resuspendieren Sie die isolierten Zellen bei fünfmal 10 bis zu den fünften Zellen pro Milliliter in vollständigem RPMI 1640-Medium, ergänzt mit IL, zwei, IL 12 und Anti-CD 28. Dann säen Sie die Zellen zu einem mal 10 bis zu einem fünften INKT-Zellen pro Vertiefung in einer 96-Well-Anti-CD-beschichteten Platte mit flachem Boden und drei Epsilon und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius in einem Zellkultur-Inkubator. Nach zwei Tagen werden die Zellen auf eine frische, unbeschichtete 96-Well-Platte mit flachem Boden überführt, um sie unter Ruhebedingungen in vollständigem RPMI 1640 zu kultivieren.

Medium für eine weitere zweitägige Inkubation. Am vierten Tag nach der Sortierung pipettieren Sie den Überstand vorsichtig in jede Vertiefung, um die Zellen zu entfernen und in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen zu poolen. Nach der Zentrifugation den Gaumen bei fünfmal 10 bis zu den fünften Zellen pro Milliliter resuspendieren.

In vollständigem RPMI 16 Medium ergänzt mit IL sieben und Samen einmal 10 bis zu den fünften Zellen pro Well. In einer neuen 96-Well-Platte mit flachem Boden legen Sie die Zellen nach vier Tagen wieder in den Inkubator und ziehen sie zur Zentrifugation in ein frisches konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Das Pellet wird in vollständigem RPMI 1640-Medium, das lösliches Anti-CD 28 enthält, wieder suspendiert und die Zellen auf eine 96-Well-Platte mit flachem Boden ausgesät, die mit Anti-CD drei Epsilon beschichtet ist, und zwar einmal 10 der fünften Zellen pro Well, und die Zellen werden für weitere drei Tage, vier Tage, 11 bis 18 in den Inkubator zurückgeführt.

Wiederholen Sie die Behandlung mit IL seven anti CD 28 und anti CD drei Epsilon, wie gerade an Tag 19 gezeigt. Übertragen Sie die Zellen in ein neues konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Schleudern Sie sie herunter und resuspendieren Sie das Pellet mit fünfmal 10 bis fünf Zellen pro Milliliter in vollem RPMI 1640.Medium.

Dann säen Sie die Zellen zu einem Mal 10 bis zu den fünften Zellen pro Well in eine 96-Well-Platte mit flachem Boden und lassen Sie die Zellen zwei Tage lang im Zellkultur-Inkubator ruhen. Die Stimulation sortierter INKT-Zellen mit plattengebundenem Anti-CD 3-Epsilon in Gegenwart von IL 2, IL 12 und löslichem Anti-CD 28 führt zu einer etwa dreifachen Vergrößerung der INKT-Anzahl nach zweitägiger Kultur. Die anschließende Vermehrung der INKT-Zellen in Gegenwart von IL seven führt zu einer drei- bis vierfachen Erhöhung der Anzahl der INKT-Zellen, die am vierten Tag in Kultur vorhanden sind.

Bemerkenswert ist, dass die Wiederholung dieser Kulturbedingungen nach zwei Expansionsrunden durchschnittlich siebenmal 10 bis zu den siebten INKT-Zellen ergeben kann, ohne dass es zu einem sichtbaren Zellverlust zwischen den Veränderungen des Kulturmediums an verschiedenen Tagen kommt, was zu einer mindestens 70-fachen Expansion in 18 Tagen führt. Weiter expandierte INKT-Zellen, die mit plattengebundenen rekombinanten Mauszellen aktiviert wurden. CD 1D, beladen mit alpha alser, produzieren IL zwei, IL vier, IFN gamma, TNF alpha und IL sechs 48 Stunden nach der Stimulation, was zeigt, dass die INKT-Zellen ihre Fähigkeit behalten, nach der Expansion TH eins und TH zwei Zytokine zu produzieren.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die richtige Färbung von INKT-Zellen mit alpha-Ceramid-beladenem cdre für die Identifizierung der INKT-Zellen während der Durchflusszytometrie unerlässlich ist. Sicher.