Name: Ein optimiertes Verfahren zur Isolierung und Ausbau unveränderlichen natürlichen Killer T-Zellen aus der Milz der Maus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Lernen Sie die Isolierung und Expansion von iNKT-Zellen aus der Milz der Maus mit magnetischer Zellseparation und FACS. Dieses optimierte Protokoll ermöglicht Forschern eine effiziente Zellvermehrung für immunologische Studien.

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D.E. und M.B.D. sind Mitglieder einer multidisziplinären Forschungsplattform (MRP) der Universität Gent und des Konsortiums Gent Researchers on Unfolded Proteins in Inflammatory Disease (GROUP-ID).

In dieser Studie wurden erwachsene (6-8 Wochen) weiblichen C57BL / 6-Mäuse verwendet. Die Mäuse wurden nach den Richtlinien der Ghent University Vivarium gehalten und gezüchtet. Alle tierischen Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Ethik-Kommission genehmigt. 1. Herstellung von mononuklearen Zellen (MNC) aus Maus-Milz <ol><li> Opfern Sie die Maus durch Genickbruch. </li><li> Platzieren Sie die Maus wieder auf den Seziertisch Platte und befestigen Sie die hinteren und Vorderbeine mit Stiften. </li><li> Sterilisieren der Haut-Oberfläche mit 70% (vol / vol) Ethanol / H 2 O. </li><li> Schneiden Sie die Haut an der Bauchmittellinie, um den Brustkorb und setzen die Milz mit sterilen chirurgischen Instrumenten. </li><li> Nach dem Trimmen die umliegenden Fettgewebe, legen Sie die Milz in eine 24 Well-Platte mit 1 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei RT. </li><li> Präparieren Sie die Milz mit einem sterilen Skalpell und übertragen Sie die Stücke in eine 70 &amp; mgr; m Nylon-Filter in einem 50 ml Wanne platzierte. </li><li> Unter Verwendung eines 2 ml Spritzenkolben vorsichtig zerdrücken die Milz Stücke durch die Zelle Sieb und Waschen mit 5 ml 1x PBS. </li><li> 3 ml Ficoll-Paque in ein 15 ml-Röhrchen und überlagern das Dichtegradientenmedium mit 5 ml Zellsuspension. </li><li> Zentrifuge bei 400 × g für 20 min bei RT ohne Bremse. </li><li> Übertragen Sie die Interphase in ein frisches 15-ml-Tube, 10 ml kaltem 1x PBS und zentrifugieren bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Resuspendieren der Zellen in 2 ml 1x PBS, enthaltend 0,5% Rinderserumalbumin (BSA) und 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (FACS-Puffer). Transfer 10 ul der Zellsuspension in ein kleines Röhrchen mit 10 ul 0,4% mischen </li></ol> 2. Anreicherung zur Erkennung und Reinigung von Maus iNKT Cells <ol><li> Bereicherung der Maus Milz CD5positive (CD5 +) Lymphozyten. <ol><li> (Optional) Flecken 10 5 Zellen mit FITC-konjugiertem anti-CD5 (4 ul von 1:30 Verdünnung / 10 6 Zellen)für 30 min bei 4 ° C im Dunkeln, Waschen mit 200 ul FACS-Puffer und resuspendieren in 500 &amp; mgr; l FACS-Puffer. Vorbereitung einer 20 &amp; mgr; M Arbeitslösung von 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) in 1x PBS wird mit 1 &amp; mgr; l davon auf 10 5 Zellen in FACS-Puffer und Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min. Erwerben Sie 10 4 pre-angereicherten Zellen am Durchflusszytometer. <ol><li> Verwendung von FCS-H und FCS-W, elektronisch Tor auf FSC-W lo Zellen, Zell Dubletts und Zuschlagstoffen (1A) auszuschließen. Dann elektronisch Gate aus DAPI + (toten) Zellen innerhalb des FSC-W lo Bevölkerung (1B), und verwenden Sie SSC-A und FCS-A elektronisch wählen Sie die Lymphozytenpopulation nach Größe (1C). </li><li> Verwendung von Zellen in der Lymphocyten-Schranke, plotten SSC-A gegenüber CD5 und elektronisch Gate CD5 + Lymphozyten, wie in Figur 1D gezeigt. Erwerben den Rest der Pre-angereicherten Probe auf dem Durchflusszytometer. </li&gt; </ol></li><li> Passen Zellzahlen bis 10 7 Zellen pro 90 &amp; mgr; l in FACS-Puffer und fügen Sie 10 ul anti-CD5 Mikroperlen. </li><li> Inkubation bei 4 ° C für 15 Minuten, einmal mit 4 ml FACS-Puffer und resuspendieren in 500 ul kaltem FACS-Puffer waschen. Bereichern Sie für CD5 + Lymphozyten unter Verwendung von Magnetzellseparation (MACS) Spalten nach den Empfehlungen des Herstellers. </li><li> Optional) Stain 10 5 Zellen mit FITC-konjugiertem anti-CD5 (4 ul von 1:30 Verdünnung / 10 6 Zellen) und DAPI, wie in 2.1.1. Erwerben Sie 10 4 angereicherten Lymphozyten auf dem Durchflusszytometer und überprüfen, ob die elektronischen Tore in 2.1.1 erstellt. Wählen CD5 + Lymphozyten in der angereicherten Zellfraktion. Erwerben Sie 10 5 Zellen am Durchflusszytometer und analysieren die Prozent CD5 + Lymphozyten in der angereicherten Fraktion vorhanden, wie in 1E gezeigt - H. </li></ol></li><li> Nachweis und zur Isolierung von Maus iNKT cells durch FACS. <ol><li> Resuspendieren angereichert CD5 + Lymphozyten in einer Konzentration von ca. 10 6 Zellen pro 20 ul in FACS-Puffer, enthaltend anti-CD16 / CD32 (4 &amp; mgr; l 1:50 Verdünnung / 10 6 Zellen) und PE-konjugiertem αGalCer / CD1d Tetramer (1 ug / 10 6 Zellen). </li><li> Inkubation für 30 min bei RT im Dunkeln. </li><li> Verdünnte Maus-Antikörpern (mAbs) gegen CD3 &amp; egr; V500 (4 &amp; mgr; l 1:20 Verdünnung / 10 6 Zellen), Anti-CD19-E450 (4 &amp; mgr; l 1:50 Verdünnung / 10 6 Zellen) und Anti-CD8a E450 (4 ul Verdünnung 1:50 / 10 6 Zellen) in FACS-Puffer, CD5 + Lymphozyten hinzuzufügen und Inkubation für 30 min bei 4 ° C im Dunkeln. </li><li> Waschen der Zellen mit 1 ml FACS-Puffer durch Zentrifugation bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C und resuspendieren in 4 ml FACS-Puffer bei einer Endkonzentration von 10 7 Zellen / ml. </li><li> Filtern Sie die Zellen durch ein 30 &amp; mgr; m Zellsieb und legen Sie die Zellen auf Eis. </li><li> Kalibrierung des Durchflusszytometers Zellsortierung nach den Empfehlungen des Herstellers 14,15. Hinweis: Kalibrierung von einem Durchflusszytometer für Zellsortierung erfordert Training und kann von einem erfahrenen Bediener oder einen ausgebildeten Techniker durchgeführt werden. </li><li> Zugabe von 10 ul einer 20 uM Lösung von Arbeits DAPI pro 10 6 Zellen und Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min. Erwerben etwa 10 4 angereichert CD5 + Lymphozyten auf dem Durchflusszytometer. Elektronisch Tor auf FSC-W lo Zellen, Zell Dubletts und Zuschlagstoffen (2A) auszuschließen. Dann elektronisch Gate aus DAPI + CD8 + CD19 + Zellen (Dump-Kanal) innerhalb des FSC-W lo Bevölkerung (2B), und verwenden Sie SSC-A und FCS-A elektronisch zu wählen Lymphozyten (2C), wie in 2.1.1.1 beschrieben, . <ol><li> Plot αGalCer / CD1d Tetramer von CD3 &amp; egr; und elektronisch Gate αGalCer / CD1dTetramer + CD3 &amp; egr; + iNKT Zellen, wie in 2D gezeigt. Erwerben nicht mehr als 2 x 10 5 CD5 + Lymphozyten angereichert, um den Prozentsatz zu bestimmen αGalCer / CD1d Tetramer + CD3 &amp; egr; + iNKT Zellen in der angereicherten Zellfraktion vorhanden ist. </li></ol></li><li> Verwendung der elektronischen Tore in 2.2.7 erstellt., FACS sortiert αGalCer / CD1d Tetramer + CD3 &amp; egr; + iNKT Zellen am Durchflusszytometer bei 70 psi unter Verwendung eines 70 &amp; mgr; m Düse bei einer Flussrate von &quot;1,5&quot;. Sammeln sortierten iNKT Zellen in einem FACS-Röhrchen mit 1 ml 100% FCS. Anschließend Spülen sortiert iNKT Zellen von der Seite der FACS-Röhrchen mit 10 ml RPMI 1640-Medium und Zentrifugation der Zellen bei 300 g 10 min bei 4 ° C. </li><li> Resuspendieren sortiert iNKT Zellen in 1 ml RPMI 1640-Medium und 40 &amp; mgr; l davon zu erwerben mit einem Durchflusszytometer, um die Reinheit der sortierten iNKT Zellen beurteilen. Wählen FSC-W lo DAPI - Lymphozytens wie in 2.2.7 beschrieben. (2E - G) und elektronisch Gate αGalCer / CD1d Tetramer + CD3 &amp; egr; + iNKT Zellen, wie in Figur 2H gezeigt ist. </li></ol></li></ol> 3. Kultur und Ausbau der Maus iNKT Cells Tag 0 <ol><li> Coat eine Flachboden-96-Well-Platte mit gereinigtem anti-CD3 &amp; egr; (3 ug / ml) pro Vertiefung für 1 h bei RT. Wasche zweimal mit 200 ul 1x PBS und einmal mit 200 ul vollständigem RPMI 1640-Medium (10% vol / vol FCS, 100 U / ml Penicillin-Streptomycin, 5,5 &amp; mgr; M β-Mercaptoethanol). </li><li> Zählen die Anzahl von lebensfähigen Zellen nach iNKT (Schritt 2.2.8) unter Verwendung von 0,4% einer Zählkammer nach 1.11., Bei 300 g zentrifugiert für 10 min bei 4 ° C und resuspendieren in 5 x 10 5 Zellen / ml in komplettem RPMI 1640-Medium, die rekombinantes murines IL-2 (10 ng / ml), rekombinantem murinem IL-12 (1 ng / ml) und löslichen Anti-Maus-CD28 (5 &amp; mgr; g / ml). Platte sorted iNKT Zellen bei 10 5 Zellen / Vertiefung in anti-CD3 &amp; egr beschichteten Platten und Inkubieren bei 37 ° C in einem CO 2 -Inkubator für 2 Tage. </li></ol> Tag 2 <ol start="3"><li> Übertragen Sie die Zellen in ein frisches unbeschichteten Flachboden-96-Well-Platte und die Kultur der Zellen unter Ruhebedingungen in vollständigem RPMI-1640-Medium bei 37 ° C in einem CO 2 -Inkubator für 2 Tage. </li></ol> Tag 4 <ol start="4"><li> Verdrängen die Zellen von der Platte durch vorsichtiges Pipettieren und übertragen Sie die Zellen in ein frisches 15-ml-Tube. Zentrifuge bei 300 g 10 min bei 4 ° C, resuspendieren in 5 x 10 5 Zellen / ml in komplettem RPMI 1640-Medium mit rekombinantem murinem IL-7 (5 ng / ml), und die Platte 10 5 Zellen / Vertiefung in einer Flach Boden 96-Well-Platte für 4 Tage bei 37 ° C in einem CO 2 -Inkubator. </li></ol> Tag 8 <ol start="5"><li> Sammeln der Zellen in ein frisches Röhrchen, Zentrifuge bei 300 xg für 10 min bei 4 ° C und resuspendieren in 5 x 10 5 Zellen / ml in komplettem RPMI 1640-Medium, das lösliche anti-CD28 (5 &amp; mgr; g / ml). </li><li> Coat eine Flachboden-96-Well-Platte mit gereinigtem anti-CD3 &amp; egr; (3 ug / ml) pro Vertiefung und waschen wie in 3.1. Platte 10 5 Zellen / Vertiefung in anti-CD3 &amp; egr beschichteten Platten und Inkubieren bei 37 ° C in einem CO 2 -Inkubator bis Tag 11. </li></ol> Tag 11-18 <ol start="7"><li> Wiederholen Sie die Schritte 3,4 bis 3,6. </li></ol> Tag 19-20 <ol start="8"><li> Übertragen der Zellen in ein frisches 15-ml-Röhrchen, bei 300 g zentrifugiert und resuspendieren in 5 x 10 5 Zellen / ml in vollständigem RPMI-1640-Medium. </li><li> Platten Zellen bei 10 5 Zellen / Vertiefung in eine Flachboden-96-Well-Platte und damit die Zellen für 2 Tage bei 37 ° C in einem CO 2 -Inkubator vor dem Einsatz in einem Experiment zu verwenden ruhen. </li></ol> 4. Zytokinproduktion durch Maus iNKT Zellen unter Verwendung eines CD1d Plate-gebundenen Assay <ol><li> Coat eine Flachboden-96-Well-Platte mit 100 &amp; mgr; l an rekombinantem murinem CD1d (10 ug / ml in 1x PBS) pro Well und Inkubation für 1 h bei 37 ° C. </li><li> Mit 200 ul 1x PBS waschen viermal mit 200 ul 2% FCS in 1x PBS (Blocklösung) pro Vertiefung und Inkubation für 2 h bei 37 ° C. </li><li> Entfernen Sie die Blockierlösung, fügen Sie 200 ul αGalCer (5 ng / &amp; mgr; l) pro Vertiefung und inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C für 16 Stunden. [Zur Herstellung des αGalCer Lösung werden 1,085 μ 1x PBS auf 55 &amp; mgr; g αGalCer in Vehikel, das 96 mg / ml Saccharose, 10 mg / ml Natriumdesoxycholat und 5 mg / ml Tween 20 gelöst]. </li><li> Nach der Inkubation, entsorgen Sie die αGalCer Lösung und waschen Sie das auch mal mit 200 ul 1x PBS, gefolgt von 200 ul vollständigem RPMI-1640-Medium. </li><li> Sammeln die in vitro expandiert iNKT Zellen am Tag 21, Zentrifugation der Zellen bei 300 g 10 min bei 4 ° C und resuspendieren in komplettem RPMI-1640-Medium in einer Konzentration von 0,5 x 10 6 Zellen / ml. </li><li> Fügen Sie 200 ul der Zell iNKT Resuspension pro Well und Inkubation für 72 h bei 37 ° C in einem CO 2 -Inkubator. </li><li> Die überstehende Flüssigkeit und messen Zytokine von Interesse durch Enzym-gebundenen Immunosorbent-Assay (ELISA) nach dem Protokoll des Herstellers. </li></ol>

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<li>Watarai, H., Nakagawa, R., Omori-Miyake, M., Dashtsoodol, N., Taniguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+detection%2C+isolation+and+culture+of+mouse+and+human+invariant+NKT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Methods for detection, isolation and culture of mouse and human invariant NKT cells.</a> Nature protocols. 3, 70-78 (2008).</li>
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<li>Drennan, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thymic+microenvironment+differentially+regulates+development+and+trafficking+of+invariant+NKT+cell+sublineages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The thymic microenvironment differentially regulates development and trafficking of invariant NKT cell sublineages.</a> J Immunol. 193, 5960-5972 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine konkurrierenden Interessen offenzulegen.

Kritische Schritte in der aktuellen Protokoll gehören die Isolierung und anschließende Anreicherung von CD5 + Lymphozyten (Abschnitt 1 &amp; 2), FACS-Sortierung (Abschnitt 3) und die anfängliche Plattierung iNKT Zellen (Abschnitt 4). Der Schritte in Abschnitt 1 durchgeführt wird, denken Sie daran, vorsichtig Schicht die Milz-Zellsuspension über das Dichtegradienten-Medium, so dass eine deutliche zelluläre Interphase wird nach der Zentrifugation generiert. Die anschließende Bereicherung für CD5 + Ly...

Murine invarianten natürlichen Killer-T (iNKT) Zellen sind eine deutliche Bevölkerung von angeborenen T-Lymphozyten im Thymus durch CD1d-exprimierenden kortikalen Thymozyten 1,2 ausgewählt. iNKT Zellen einen T-Zellrezeptor (TCR) von einer invarianten Vα14-Jα18 TCR-Kette gepaart mit entweder Vβ8, Vβ7 oder Vβ2 TCRs 3, die in der Lage ist Erkennung von endogenem sowie fremde Lipidantigene im Kontext von CD1d ist besteht. B. murine iNKT Zellen erkennen und werden durch eine endogene Lipid Antigen genannt isoglobotrihexosylceramide (iGb3) 4, sowie α-Galactosylceramid (αGalCer) 5,6, einem Glykolipid aus marinen Schwämmen isoliert aktiviert. TCR-abhängige Aktivierung von iNKT Zellen fördert die Grundierung von der adaptiven Immunantwort, und als ein Ergebnis haben iNKT Zellen gezeigt wurde in der Linderung oder Entwicklung einer Reihe von Erkrankungen, einschließlich rheumatischen Erkrankungen und Krebs 7 funktionell beteiligt werden &lt;sup&gt; 8. Derzeit synthetischen iNKT Zellliganden bilden vielversprechende neue Impfstoff-Adjuvantien, die in der Lage, die Regulierung eine Reihe von immunpathologischen Bedingungen sein kann. Es ist zuvor gezeigt worden, daß iNKT Zellen können in vitro nach der Isolierung aus Mausgewebe jedoch erzeugt werden; viele dieser Untersuchungen beschäftigen die Verwendung von primären Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) und / oder Zelllinien 9, Vα14 TCR transgenen (Tg) Mäuse 10 oder thymomas zur Erzeugung iNKT Zellen abgeleiteten Hybridome 11,12. Darüber hinaus eine große Anzahl von Mäusen, stellen große Mengen an Reagenzien, wie αGalCer belasteten CD1d Dimere, und langwierige Kultur mal einige veröffentlichten Protokollen weniger ethisch und wirtschaftlich attraktiv 9,13. In diesem Bericht beschreiben wir ein angepasstes Verfahren zur Isolierung und in vitro-Expansion der iNKT Zellen aus der Milz der Maus. Genauer gesagt, das Protokoll beschreibt ein Verfahrenzur Anreicherung iNKT Zellen aus der Milz der Maus, die die Mäuse, Reagenzien und Zeit für FACS Zellsortierung erforderlich, reduziert, und schlägt vor, einen optimierten Ansatz für den Ausbau der sortierten Milz iNKT Zellen in vitro.

<table><tbody><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>rekombinante Maus IL-2</td><td>eBiosciences</td><td>14-8021</td><td></td></tr><tr><td>rekombinante Maus IL-12</td><td>eBiosciences</td><td>39-8122-65</td><td></td></tr><tr><td>rekombinante Maus IL-7</td><td>eBiosciences</td><td>14-8071</td><td></td></tr><tr><td>gereinigt Anti-Maus CD3e (145-2C11)</td><td>eBiosciences</td><td>16-0032-86</td><td></td></tr><tr><td>gereinigt Anti-Maus-CD28 (37.51)</td><td>eBiosciences</td><td>16-0281-85</td><td></td></tr><tr><td>e450-konjugiertes Anti-Maus-CD19 (eBio1D3)</td><td>eBiosciences</td><td>48-0193-82</td><td></td></tr><tr><td>e450-konjugiertes Anti-Maus-CD8&alpha; (53-6,7)</td><td>eBiosciences</td><td>48-0081-82</td><td></td></tr><tr><td>FITC-konjugiertes Anti-Maus-CD5 (53-7.3)</td><td>eBiosciences</td><td>11-0051-81</td><td></td></tr><tr><td>V500-konjugiertes Anti-Maus-CD3&epsilon; (500A2)</td><td>BD biosciences</td><td>560771</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus CD5 (Ly-1) Mikrokügelchen</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-049-301</td><td></td></tr><tr><td>gereinigte Anti-Maus CD16/32 (2.4G2)</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>MACS MS Säulen</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau, 0,4% (wt/vol)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 mittel</td><td>Gibco</td><td>12633-020</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-056</td><td>[Ca2+/Mg2+ - frei]</td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030-123</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100MG</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque plus</td><td>GE Healthcare</td><td>71-7167-00 AF</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platte F-Boden</td><td>Greiner-bio one</td><td>657-160</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Platte</td><td>Greiner-bio one</td><td>665-180</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platte</td><td>Greiner-bio one</td><td>655-180</td><td></td></tr><tr><td>15 ml falcon Tube</td><td>Greiner-bio one</td><td>188-271</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tube Falcon Tube</td><td>Greiner-bio one</td><td>227-261</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m Filter</td><td>Greiner-bio one</td><td>542-070</td><td></td></tr><tr><td>30 &micro; m Filter</td><td>Millipore</td><td>SVGP01050</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS Separator</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>MS Säulen</td><td>Macs Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>CO2-Inkubator mit Wassermantel</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissektionskit</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria III</td><td>BD Biowissenschaften</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ein optimiertes verfahren zur isolierung und ausbau unveränderlichen natürlichen killer t-zellen aus der milz der maus

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

Die Fähigkeit, schnell zu sezernieren Zytokine bei Stimulation ist ein funktionelles Merkmal der invarianten natürlichen Killer-T (iNKT) Zelllinie. iNKT Zellen werden daher als einer angeborenen T-Zellpopulation in der Lage, die Aktivierung und Steuerung der adaptiven Immunantwort aus. Die Entwicklung von verbesserten Techniken zur Kultivierung und Expansion murine iNKT Zellen erleichtert die Untersuchung der Zellbiologie iNKT in in vitro und in vivo-Modellsystemen. Hier beschreiben wir ein optimiertes Verfahren zur Isolierung und Expansion von murinen Milz iNKT Zellen. Milz von C57BL / 6-Mäusen entfernt, seziert und gespannt, und die resultierende Zellsuspension wird über Dichtegradientenmedien geschichtet. Nach der Zentrifugation werden Milz mononuklearen Zellen (MNC) gesammelt und CD5-positive (CD5 +) Lymphozyten werden für die Verwendung von magnetischen Kügelchen angereichert. iNKT Zellen innerhalb des CD5 + -Fraktion anschließend mit gefärbten ^5; GalCer belasteten CD1d Tetramer und durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) gereinigt. FACS sortiert iNKT Zellen werden dann zunächst in vitro unter Verwendung einer Kombination von rekombinanten murinen Zytokine und plattengebundenen T-Zell-Rezeptor (TCR) Stimuli, bevor sie in der Gegenwart von rekombinantem murinem IL-7 erweitert. Unter Verwendung dieser Technik etwa 10 8 iNKT Zellen können innerhalb von 18-20 Tagen Kultur, wonach sie für funktionelle Assays in vitro, oder in vivo Transferexperimente bei Mäusen verwendet werden, erzeugt werden.

Isolierung von Milz mononukleären Zellen mit einem Dichtegradienten dauert etwa 1 Stunde und eliminiert die Verwendung von Reagenzien erforderlich ist, um rote Blutkörperchen (RBCs) lysiert. Eine hohe Ausbeute an lebensfähigen Zellen unter Verwendung dieses Verfahrens und Schmutz während des Pressen des Organs entfernt erzeugten erhalten. Typischerweise liegt die Frequenz der iNKT Zellen innerhalb der Milz-Lymphozyten-Pool im Bereich zwischen 1 und 5% der gesamten T-Lymphozyten kann dies jedoch je nach Alter, Geschlecht...

Hier stellen wir ein angepasstes Protokoll vor, das zur Erzeugung einer großen Anzahl von murinen invarianten natürlichen Killer-T-Zellen aus der Milz der Maus verwendet werden kann. Das Protokoll beschreibt einen Ansatz, mit dem Milz-iNKT-Zellen in vitro mit einer begrenzten Anzahl von Tieren und Reagenzien angereichert, isoliert und expandiert werden können.

Ein optimiertes Verfahren zur Isolierung und Ausbau unveränderlichen natürlichen Killer T-Zellen aus der Milz der Maus

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, invariante natürliche Killer-T-Zellen oder INKT-Zellen, die aus der Mausmilz gewonnen wurden, zu vermehren. Dies wird erreicht, indem zunächst milzische mononukleäre Zellen isoliert werden, gefolgt von einer Anreicherung der CD5-positiven Lymphozytenpopulation mittels magnetischer Zellseparation. Der milzische INKT-Zellanteil wird anschließend durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung weiter isoliert.Im letzten Schritt werden die sortierten INKT-Zellen zur Expansion in vitro kultiviert. Abschließend kann das Zytokinprofil der expandierten INKT-Zellen mittels ELISA bestimmt werden. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode neu beginnen, Schwierigkeiten, da die Anreicherung und Expansion von INKT-Zellen die Kombination verschiedener Techniken erfordert.Dieses Verfahren wird von einem Doktoranden aus meinem Labor durchgeführt. Nach der Entnahme der Milz überführen Sie das Gewebe in einen 70-Mikron-Nylonfilter und verwenden anschließend den Kolben einer 2-Milliliter-Spritze, um die Milz vorsichtig durch das Sieb in ein 50-Milliliter-Konischglas zu zermahlen. Spülen Sie den Filter mit fünf Millilitern PBS aus. Geben Sie danach drei Milliliter des Coal-Pack-Mediums in ein 15-Milliliter-Röhrchen und überlagern Sie das Dichtegradienten mit den fünf Millilitern der Zellsuspension.Die Zellen durch Zentrifugation trennen und das Interface in ein neues 15-Milliliter-Gefäß überführen. Anschließend die Zellen mit 10 Millilitern kaltem PBS waschen und den Zellpellet in zwei Millilitern Fax-Puffer resuspendieren, um die CD5-positiven splenischen Lymphozyten anzureichern. Die Zellverdünnung mit zusätzlichem Fax-Puffer auf 1 × 10⁷ Zellen pro 90 µL einstellen und 10 µL Anti-CD5-Mikroperlen zu den Zellen hinzufügen.Nach 15 Minuten bei vier Grad Celsius die Zellen mit vier Millilitern Fax-Puffer waschen und den Pellet in 500 Mikrolitern frischem Fax-Puffer resuspendieren. Isolieren Sie die CD5-positiven Zellen mittels magnetischer Zellseparation gemäß den Empfehlungen des Herstellers. Anschließend die angereicherten CD5-positiven Lymphozyten im Verhältnis von 1 × 10⁶ Zellen pro 20 Mikroliter Fax-Puffer, der anti-CD16, CD32 und PE-konjugiertes α-GalCer-CD1d-Tetramer enthält, bei Raumtemperatur im Dunkeln verdünnen. Nach 30 Minuten die Zellen mit den gewünschten Antikörpern bei vier Grad Celsius im Dunkeln weitere 30 Minuten inkubieren.Waschen Sie die Zellen anschließend in frischem Fax-Puffer und färben Sie sie mit 10 µL einer 20 µM-Arbeitslösung von DPI pro 1 × 10⁶ Zellen für fünf Minuten. Erfassen Sie nun bei Raumtemperatur etwa 1 × 10⁴ angereicherte CD5-positive Lymphozyten-Ereignisse am Durchflusszytometer, wobei elektronisch über die Vorwärtsstreuung mit niedriger Zellgröße auf Einzelzellen zur Ausschließung von Zelldoubletts und Aggregaten gegated wird. Schließen Sie die DAPI-positiven, CD8-positiven und CD19-positiven Zellen innerhalb der Population mit niedriger Vorwärtsstreuung aus und verwenden Sie Seitenstreuungs- und Vorwärtsstreuungs-Arealplots.Um die Lymphozyten elektronisch auszuwählen, tragen Sie die Alpha-Gal-SER-CD-1d-Tetramere gegen CD3ε auf und kennzeichnen elektronisch die Alpha-Gal-SER-CD-1d-Tetramer-positiven, CD3ε-positiven iNKT-Zellen, wie angegeben. Anschließend ermitteln Sie, nachdem nicht mehr als 2 × 10⁵ CD5-positive angereicherte Lymphozyten erfasst wurden, den Prozentsatz der Alpha-Gal-SER-CD-1d-Tetramer-positiven, CD3ε-positiven iNKT-Zellen in der angereicherten Zellfraktion. Nutzen Sie dieses Gate für eine niedrige Sortierung, um die Alpha-Gal-SER-CD-1d-Tetramer-positiven, CD3ε-positiven iNKT-Zellen in ein FACS-Röhrchen mit einem Milliliter Fötales Rinderserum am Ende der Sortierung einzubringen.Spülen Sie die isolierten NKT-Zellen von der Wand des FACS-Röhrchens mit 10 Milliliter RPMI 1640-Medium ab. Zentrifugieren Sie anschließend die Zellen, resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter RPMI 1640 und verwenden Sie einen 40-Mikroliter-Aliquot der Zellen, um die Reinheit der sortierten Zellen zu bestimmen. Verwenden Sie dabei dieselbe Gating-Strategie.Bezüglich der Einstellung der Sortierparameter zur Expansion der INKT-Zellen werden die Zellen abzentrifugiert und die isolierten Zellen in komplettem RPMI 1640-Medium, ergänzt mit IL-2, IL-12 und anti-CD28, auf eine Konzentration von fünf mal 10 hoch 5 Zellen pro Milliliter resuspendiert. Anschließend werden die Zellen mit je einer mal 10 hoch 5 INKT-Zellen pro Vertiefung in eine 96-Loch-Platte mit flachem Boden und Beschichtung mit anti-CD3ε ausgesät und bei 37 Grad Celsius in einem Zellkultur-Inkubator inkubiert. Nach zwei Tagen werden die Zellen in eine frische, unbeschichtete 96-Loch-Platte mit flachem Boden überführt, um sie unter Ruhebedingungen in komplettem RPMI 1640 weiterzukultivieren.Medium für eine weitere zweitägige Inkubation. Am vierten Tag nach der Sortierung vorsichtig den Überstand in jedem Well pipettieren, um die Zellen zu lösen, und diese in einem 15-Milliliter-Konischgefäß zu sammeln. Nach der Zentrifugation das Pellet erneut suspendieren bei einer Dichte von fünf mal 10 hoch fünf Zellen pro Milliliter.In komplettem RPMI 16-Medium, ergänzt mit IL-sieben, je Brunnen eine mal zehn hoch fünf Zellen ansiedeln. Nach vier Tagen die Zellen in eine neue, flachbodige 96-Loch-Platte überführen, anschließend in ein frisches 15-Milliliter-Konischgefäß zur Zentrifugation übertragen. Den Zellpellet in komplettem RPMI 1640-Medium, das lösliches Anti-CD-28 enthält, resuspendieren und die Zellen auf eine mit Anti-CD-drei-Epsilon beschichtete 96-Loch-Flachbodenplatte mit einer Dichte von einer mal zehn hoch fünf Zellen pro Brunnen ansiedeln. Die Zellen danach für weitere drei bis vier Tage, Tage elf bis achtzehn, in den Inkubator zurückbringen.Wiederholen Sie die IL-7-, Anti-CD28- und Anti-CD3ε-Behandlung wie am Tag 19 gezeigt. Überführen Sie die Zellen in ein neues 15-Milliliter-Konischglas. Zentrifugieren Sie sie und resuspendieren Sie das Pellet bei 5 × 10⁵ Zellen pro Milliliter in vollständigem RPMI 1640-Medium.Anschießend säen Sie die Zellen mit einer Dichte von einer mal 10 hoch 5 Zellen pro Vertiefung in eine flache 96-Loch-Platte aus und lassen die Zellen zwei Tage lang im Zellkultur-Inkubator ruhen. Die Stimulation sortierter iNKT-Zellen mit plattenfixiertem anti-CD3ε in Gegenwart von IL-2, IL-12 und löslichem anti-CD28 führt nach zweitägiger Kultur zu einer etwa dreifachen Vermehrung der iNKT-Zellen. Eine anschließende Vermehrung der iNKT-Zellen in Gegenwart von IL-7 führt zu einer dreifachen bis vierfachen Erhöhung der Anzahl der iNKT-Zellen am vierten Kulturtag.Bemerkenswerterweise kann die Wiederholung dieser Kulturbedingungen im Durchschnitt sieben mal zehn hoch sieben iNKT-Zellen nach zwei Durchgängen der Expansion ergeben, und zwar ohne sichtbaren Zellverlust zwischen den Wechseln der Kulturmedien an verschiedenen Tagen, was einer mindestens 70-fachen Vermehrung innerhalb von 18 Tagen entspricht. Weitere expandierte iNKT-Zellen, die mit plattenfixiertem rekombinantem murinen CD1D, beladen mit Alpha-GalCer, aktiviert wurden, produzieren 48 Stunden nach Stimulation IL-2, IL-4, IFN-Gamma, TNF-Alpha und IL-6, was zeigt, dass die iNKT-Zellen nach der Expansion ihre Fähigkeit beibehalten, TH1- und TH2-Zytokine zu produzieren.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass die korrekte Färbung von INKT-Zellen mit Alpha-Ceramid-beladenem CD1e unbedingt erforderlich ist, um die INKT-Zellen mittels Durchflusszytometrie zu identifizieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video beschreibt die Anreicherung von T-Zellen aus der Milz einer Maus durch Negativselektion mit einem Magnetseparator. Bei der Technik werden die anderen Zellen in der Probe mit Antikörpern oder Liganden, die gegen spezifische Zelloberflächenantigene gerichtet sind, gezielt depletiert.

T-Zell-Anreicherung: Eine Technik zur Isolierung von T-Zellen aus gemischten Zellpopulationen durch magnetische Trennung

Dieses Video zeigt die Isolierung von Lymphozyten, einschließlich natürlicher Killerzellen oder NK-Zellen, aus menschlichem Lebergewebe für die selektive Expansion. Der enzymatische und mechanische Verdau, gefolgt von der Trennung durch Dichtegradienten, fördert die Isolierung von Lymphozyten, einschließlich NK-Zellen. Die gesammelten Lymphozyten können für die selektive Vermehrung von NK-Zellen weiter verwendet werden.

Isolierung natürlicher Killerzellen aus Lebergewebe für die selektive Expansion

Dieses Video beschreibt ein Protokoll zur Isolierung von seltenen Antigen-spezifischen CD8+ T-Zellen unter Verwendung von magnetischen Nanopartikel-basierten künstlichen antigenpräsentierenden Zellen (aAPCs), die mit antigenen, peptidbeladenen MHC-Igs und Anti-CD28-Antikörpern funktionalisiert sind. Die Interaktion der aAPCs mit CD8+ T-Zellen, die spezifisch die antigenen Peptid-Targeting T-Zell-Rezeptoren exprimieren, gefolgt von deren Expansion in vitro, führt zur Anreicherung und Expansion...

Nanopartikelbasierte Anreicherung und Expansion von antigenspezifischen CD8+ T-Zellen

Dieses Video zeigt die Induktion der Darmtransplantat-gegen-Wirt-Krankheit, GvHD, bei einer tödlich bestrahlten Empfängermaus unter Verwendung von allogenen hämatopoetischen Stammzellen und GvHD-induzierenden Milz-alloreaktiven T-Lymphozyten. Dieses Protokoll hilft bei der Etablierung eines schweren akuten intestinalen GvHD-Modells, um den Mechanismus der Krankheit zu verstehen und innovative Therapieoptionen zu entwickeln.

Induktion der Graft-versus-Host-Krankheit in Mausmodellen durch allogene Knochenmark- und Milzzelltransplantation

Dieses Video zeigt eine Methode zur Isolierung von invarianten natürlichen Killer-T-Zellen, auch bekannt als iNKT-Zellen. Das Verfahren beginnt mit der Injektion eines synthetischen Glykolipids in eine Maus, um die Aktivierung und Proliferation von iNKT-Zellen in der Milz zu stimulieren. Anschließend werden einzellige Suspensionen aus der Milz hergestellt und mit iNKT-Zell-erkennenden Komplexen, die mit Fluorophoren markiert sind, inkubiert, gefolgt von einer magnetischen Bead-basierten...

Isolierung invarianter natürlicher Killer-T-Zellen aus einem Mausmodell

Naive CD4+ T-Zellen polarisieren in verschiedene Untergruppen, abhängig von der Umgebung zum Zeitpunkt der Aktivierung.  Die Differenzierung naiver CD4+ T-Zellen zu verschiedenen Effektor-Untergruppen kann in vitro durch die Zugabe von T-Zell-Rezeptor-Stimuli und spezifischen Zytokinsignalen erreicht werden.

Maus Naive CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zell-Isolierung und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Differenzierung in T-Zell-Populationen

Unterschiedliche dendritische Zelluntergruppen existieren als seltene Populationen in lymphatischen Organen und sind daher für immunologische Experimente schwierig in ausreichender Anzahl und Reinheit zu isolieren. Hier beschreiben wir eine hocheffiziente Methode mit hoher Ausbeute zur Isolierung aller derzeit bekannten Hauptuntergruppen von dendritischen Milzzellen der Maus.

Eine effiziente und High-Yield-Methode zur Isolierung von Maus über dendritische Zellen Subsets

Hier präsentieren wir Ihnen eine Protokoll, die beschreibt allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation und ermöglicht sich wiederholenden Mini-endoskopische Auswertungen des distalen Colon an Ort und Stelle für die Präsenz, die Merkmale und die Schwere der Kolon Entzündung im live Mäuse Darm Graft - Versus - Host-Seuche leiden.

Induktion der intestinalen Graft - Versus - Host-Seuche und seiner Mini-endoskopische Beurteilung in Live Mäuse

Wir beschreiben ein schnelles und robustes Protokoll, um invariante natürliche Killer-T-Zellen (iNKT) aus Mausmilz anzureichern und sie in vitro auf geeignete Zahlen für In-vitro- und In-vivo-Studien zu erweitern.

Aufreinigung und Expansion von mausinvarianten natürlichen Killer-T-Zellen für in vitro und in vivo Studien

Hier stellen wir eine Methode zur Erweiterung von peripheren Blut-Naturkillern (PBNK), NK-Zellen aus Lebergeweben und chimären Antigenrezeptor (CAR)-NK-Zellen vor, die aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) oder Nabelschnurblut (CB) stammen. Dieses Protokoll demonstriert die Expansion von NK- und CAR-NK-Zellen unter Verwendung von 221-mIL-21-Feederzellen zusätzlich zur optimierten Reinheit expandierter NK-Zellen.

Natural Killer (NK) und CAR-NK Zellexpansionsmethode unter Verwendung der membrangebundenen IL-21-modifizierten B-Zelllinie

Lernen Sie die Isolierung und Expansion von iNKT-Zellen aus der Milz der Maus mit magnetischer Zellseparation und FACS. Dieses optimierte Protokoll ermöglicht Forschern eine effiziente Zellvermehrung für immunologische Studien.

Ein optimiertes Verfahren zur Isolierung und Ausbau unveränderlichen natürlichen Killer T-Zellen aus der Milz der Maus

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