Ein optimiertes Verfahren zur Isolierung und Ausbau unveränderlichen natürlichen Killer T-Zellen aus der Milz der Maus

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, invariante natürliche Killer-T-Zellen oder INKT-Zellen, die aus der Mausmilz gewonnen wurden, zu vermehren. Dies wird erreicht, indem zunächst milzische mononukleäre Zellen isoliert werden, gefolgt von einer Anreicherung der CD5-positiven Lymphozytenpopulation mittels magnetischer Zellseparation. Der milzische INKT-Zellanteil wird anschließend durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung weiter isoliert.

Im letzten Schritt werden die sortierten INKT-Zellen zur Expansion in vitro kultiviert. Abschließend kann das Zytokinprofil der expandierten INKT-Zellen mittels ELISA bestimmt werden. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode neu beginnen, Schwierigkeiten, da die Anreicherung und Expansion von INKT-Zellen die Kombination verschiedener Techniken erfordert.

Dieses Verfahren wird von einem Doktoranden aus meinem Labor durchgeführt. Nach der Entnahme der Milz überführen Sie das Gewebe in einen 70-Mikron-Nylonfilter und verwenden anschließend den Kolben einer 2-Milliliter-Spritze, um die Milz vorsichtig durch das Sieb in ein 50-Milliliter-Konischglas zu zermahlen. Spülen Sie den Filter mit fünf Millilitern PBS aus. Geben Sie danach drei Milliliter des Coal-Pack-Mediums in ein 15-Milliliter-Röhrchen und überlagern Sie das Dichtegradienten mit den fünf Millilitern der Zellsuspension.

Die Zellen durch Zentrifugation trennen und das Interface in ein neues 15-Milliliter-Gefäß überführen. Anschließend die Zellen mit 10 Millilitern kaltem PBS waschen und den Zellpellet in zwei Millilitern Fax-Puffer resuspendieren, um die CD5-positiven splenischen Lymphozyten anzureichern. Die Zellverdünnung mit zusätzlichem Fax-Puffer auf 1 × 10⁷ Zellen pro 90 µL einstellen und 10 µL Anti-CD5-Mikroperlen zu den Zellen hinzufügen.

Nach 15 Minuten bei vier Grad Celsius die Zellen mit vier Millilitern Fax-Puffer waschen und den Pellet in 500 Mikrolitern frischem Fax-Puffer resuspendieren. Isolieren Sie die CD5-positiven Zellen mittels magnetischer Zellseparation gemäß den Empfehlungen des Herstellers. Anschließend die angereicherten CD5-positiven Lymphozyten im Verhältnis von 1 × 10⁶ Zellen pro 20 Mikroliter Fax-Puffer, der anti-CD16, CD32 und PE-konjugiertes α-GalCer-CD1d-Tetramer enthält, bei Raumtemperatur im Dunkeln verdünnen. Nach 30 Minuten die Zellen mit den gewünschten Antikörpern bei vier Grad Celsius im Dunkeln weitere 30 Minuten inkubieren.

Waschen Sie die Zellen anschließend in frischem Fax-Puffer und färben Sie sie mit 10 µL einer 20 µM-Arbeitslösung von DPI pro 1 × 10⁶ Zellen für fünf Minuten. Erfassen Sie nun bei Raumtemperatur etwa 1 × 10⁴ angereicherte CD5-positive Lymphozyten-Ereignisse am Durchflusszytometer, wobei elektronisch über die Vorwärtsstreuung mit niedriger Zellgröße auf Einzelzellen zur Ausschließung von Zelldoubletts und Aggregaten gegated wird. Schließen Sie die DAPI-positiven, CD8-positiven und CD19-positiven Zellen innerhalb der Population mit niedriger Vorwärtsstreuung aus und verwenden Sie Seitenstreuungs- und Vorwärtsstreuungs-Arealplots.

Um die Lymphozyten elektronisch auszuwählen, tragen Sie die Alpha-Gal-SER-CD-1d-Tetramere gegen CD3ε auf und kennzeichnen elektronisch die Alpha-Gal-SER-CD-1d-Tetramer-positiven, CD3ε-positiven iNKT-Zellen, wie angegeben. Anschließend ermitteln Sie, nachdem nicht mehr als 2 × 10⁵ CD5-positive angereicherte Lymphozyten erfasst wurden, den Prozentsatz der Alpha-Gal-SER-CD-1d-Tetramer-positiven, CD3ε-positiven iNKT-Zellen in der angereicherten Zellfraktion. Nutzen Sie dieses Gate für eine niedrige Sortierung, um die Alpha-Gal-SER-CD-1d-Tetramer-positiven, CD3ε-positiven iNKT-Zellen in ein FACS-Röhrchen mit einem Milliliter Fötales Rinderserum am Ende der Sortierung einzubringen.

Spülen Sie die isolierten NKT-Zellen von der Wand des FACS-Röhrchens mit 10 Milliliter RPMI 1640-Medium ab. Zentrifugieren Sie anschließend die Zellen, resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter RPMI 1640 und verwenden Sie einen 40-Mikroliter-Aliquot der Zellen, um die Reinheit der sortierten Zellen zu bestimmen. Verwenden Sie dabei dieselbe Gating-Strategie.

Bezüglich der Einstellung der Sortierparameter zur Expansion der INKT-Zellen werden die Zellen abzentrifugiert und die isolierten Zellen in komplettem RPMI 1640-Medium, ergänzt mit IL-2, IL-12 und anti-CD28, auf eine Konzentration von fünf mal 10 hoch 5 Zellen pro Milliliter resuspendiert. Anschließend werden die Zellen mit je einer mal 10 hoch 5 INKT-Zellen pro Vertiefung in eine 96-Loch-Platte mit flachem Boden und Beschichtung mit anti-CD3ε ausgesät und bei 37 Grad Celsius in einem Zellkultur-Inkubator inkubiert. Nach zwei Tagen werden die Zellen in eine frische, unbeschichtete 96-Loch-Platte mit flachem Boden überführt, um sie unter Ruhebedingungen in komplettem RPMI 1640 weiterzukultivieren.

Medium für eine weitere zweitägige Inkubation. Am vierten Tag nach der Sortierung vorsichtig den Überstand in jedem Well pipettieren, um die Zellen zu lösen, und diese in einem 15-Milliliter-Konischgefäß zu sammeln. Nach der Zentrifugation das Pellet erneut suspendieren bei einer Dichte von fünf mal 10 hoch fünf Zellen pro Milliliter.

In komplettem RPMI 16-Medium, ergänzt mit IL-sieben, je Brunnen eine mal zehn hoch fünf Zellen ansiedeln. Nach vier Tagen die Zellen in eine neue, flachbodige 96-Loch-Platte überführen, anschließend in ein frisches 15-Milliliter-Konischgefäß zur Zentrifugation übertragen. Den Zellpellet in komplettem RPMI 1640-Medium, das lösliches Anti-CD-28 enthält, resuspendieren und die Zellen auf eine mit Anti-CD-drei-Epsilon beschichtete 96-Loch-Flachbodenplatte mit einer Dichte von einer mal zehn hoch fünf Zellen pro Brunnen ansiedeln. Die Zellen danach für weitere drei bis vier Tage, Tage elf bis achtzehn, in den Inkubator zurückbringen.

Wiederholen Sie die IL-7-, Anti-CD28- und Anti-CD3ε-Behandlung wie am Tag 19 gezeigt. Überführen Sie die Zellen in ein neues 15-Milliliter-Konischglas. Zentrifugieren Sie sie und resuspendieren Sie das Pellet bei 5 × 10⁵ Zellen pro Milliliter in vollständigem RPMI 1640-Medium.

Anschießend säen Sie die Zellen mit einer Dichte von einer mal 10 hoch 5 Zellen pro Vertiefung in eine flache 96-Loch-Platte aus und lassen die Zellen zwei Tage lang im Zellkultur-Inkubator ruhen. Die Stimulation sortierter iNKT-Zellen mit plattenfixiertem anti-CD3ε in Gegenwart von IL-2, IL-12 und löslichem anti-CD28 führt nach zweitägiger Kultur zu einer etwa dreifachen Vermehrung der iNKT-Zellen. Eine anschließende Vermehrung der iNKT-Zellen in Gegenwart von IL-7 führt zu einer dreifachen bis vierfachen Erhöhung der Anzahl der iNKT-Zellen am vierten Kulturtag.

Bemerkenswerterweise kann die Wiederholung dieser Kulturbedingungen im Durchschnitt sieben mal zehn hoch sieben iNKT-Zellen nach zwei Durchgängen der Expansion ergeben, und zwar ohne sichtbaren Zellverlust zwischen den Wechseln der Kulturmedien an verschiedenen Tagen, was einer mindestens 70-fachen Vermehrung innerhalb von 18 Tagen entspricht. Weitere expandierte iNKT-Zellen, die mit plattenfixiertem rekombinantem murinen CD1D, beladen mit Alpha-GalCer, aktiviert wurden, produzieren 48 Stunden nach Stimulation IL-2, IL-4, IFN-Gamma, TNF-Alpha und IL-6, was zeigt, dass die iNKT-Zellen nach der Expansion ihre Fähigkeit beibehalten, TH1- und TH2-Zytokine zu produzieren.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass die korrekte Färbung von INKT-Zellen mit Alpha-Ceramid-beladenem CD1e unbedingt erforderlich ist, um die INKT-Zellen mittels Durchflusszytometrie zu identifizieren.