Eine schnelle und quantitative fluorimetrische Verfahren zur Protein-Targeting kleines Molekül als Wirkstoff-Screening

Das übergeordnete Ziel dieser neuen fluormetrischen Wirkstoffscreening-Methode ist es, die Bindungsaffinität kleiner Wirkstoffmoleküle an ein Zielprotein zu bestimmen, indem fluoreszierende Gold-Nanocluster innerhalb des wirkstoffbeladenen Protein-Templates gebildet werden. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Protein-Targeting-Wirkstoffentdeckung zu beantworten, z. B. wie die Vidding-Stärke von Wirkstoffmolekülen die Stabilität von Proteinen beeinflussen kann, die sich entfalten, was zur def-Bildung von fluoreszierenden Gold-Nanoclustern unterschiedlicher Intensität führt. Der Hauptvorteil dieses Tenix besteht darin, dass wir ein Proteintarget in einen fluoreszierenden Biosensor verwandeln können, um ein schnelles Screening von kleinen molekularen Wirkstoffen zu ermöglichen, ohne dass ein ausgeklügeltes Instrument und langwierige Markierungsschritte erforderlich sind.

Die Kombination aus meinem eigenen Wissen sowie der Co-Autorin, ihrer Entdeckung, dass das Protein beladen ist, hat einen deutlichen stabilisierenden Effekt auf die Plasmonik. Nanopartikel inspirierten die Idee zu dieser Methode. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Vorbereitung der chemischen Reagenzien für das Wirkstoffscreening, wie im Textprotokoll beschrieben, um das menschliche Serumalbumin oder die HSA-Schablonen-Goldnanocluster vorzubereiten, und platzieren Sie zwei Glasfläschchen, die jeweils einen mikromagnetischen Rührstab enthalten, auf zwei separate temperatursteuerbare magnetische Rührstäbchen.

Stellen Sie die Temperatur eines magnetischen Rührwerks auf 60 Grad Celsius ein. Als nächstes fügen Sie 200 Mikroliter humane Serumalbuminlösung, 200 Mikroliter Reinstwasser und 200 Mikroliter Goldchloridlösung in jedes Fläschchen unter ständigem Rühren hinzu, um die Verkapselung von Goldionen innerhalb der Proteinmatrize zu ermöglichen, zwei Minuten später fügen Sie 20 Mikroliter Natriumhydroxidlösung in jedes Fläschchen hinzu, um die Reduktionsfähigkeit von humanem Serumalbumin zu aktivieren, das Goldnanocluster informiert. Beginnen Sie, die Reaktionszeit alle 20 Minuten bei null Minuten aufzuzeichnen.

Entnehmen Sie 50 Mikroliter jeder Probe und geben Sie sie auf eine schwarze Platte mit 384 Vertiefungen. Messen Sie das Emissionsspektrum mit einem Mikroplatten-Reader. Stoppen Sie das magnetische Rühren nach 100 Minuten.

Kühlen Sie die Glasfläschchen unter fließendem Wasser in einem Waschbecken ab. Die Photoemissionsspektren können jederzeit für jede Probe aufgetragen werden, um die Entstehungskinetik von Gold-Nanoclustern bei verschiedenen Temperaturbedingungen zu erfassen. Zur Herstellung des Rinderserumalbumins oder der BSA-Schablonen-Gold-Nanocluster stellen Sie ein Glasfläschchen mit einem mikromagnetischen Rührstab auf die Oberseite eines magnetischen Rührwerks.

Belassen Sie die Temperatur bei Raumtemperatur. Mischen Sie 200 Mikroliter BSA-Lösung, 200 Mikroliter Harnstoff und 200 Mikroliter Goldchloridlösung in der Durchstechflasche aus Glas unter ständigem Rühren. Zwei Minuten später bei 20 Mikrolitern Natronlauge.

Um die Reduktionsfähigkeit von BSA zu aktivieren, um Gold-Nanocluster zu bilden und die Reaktionszeit als null Minuten aufzuzeichnen. Messen Sie stündlich das Photoemissionsspektrum des Reaktionsgemisches. Platzieren Sie fünf Glasfläschchen mit jeweils einem magnetischen Rührstab, die mit einem Arzneimittel oder reinem HSA vormarkiert sind, auf ein temperatursteuerbares Mehrpunkt-Magnetrührwerk.

Geben Sie 200 Mikroliter HSA in jede Durchstechflasche. Geben Sie dann jeweils einen Mikroliter jeder zuvor vorbereiteten Wirkstofflösung in die vier entsprechenden Dateien. Geben Sie außerdem einen Mikroliter DMSO in den Steuerschalter am Rührer.

Stellen Sie die Schleuderdrehzahl auf 360 U/min ein und inkubieren Sie eine Stunde lang, damit das Medikament eine Stunde später bei 200 Mikrolitern Milli Q Wasser und 200 Mikrolitern Goldchloridlösung unter ständigem Rühren an HSA an HSA binden kann. Stellen Sie die Temperatur unter ständigem Rühren 10 Minuten lang auf 60 Grad Celsius ein. Nach 10 Minuten bei 20 Mikrolitern 1,5 molares Natriumhydroxid in jede Datei geben und beginnen, die Reaktionszeit bei null Minuten aufzuzeichnen.

Gemeinsame Reaktionslösungen für die Messung sollten der gleichen Reihenfolge der Zugabe von Arzneimitteln folgen und so schnell wie möglich praktiziert werden, um den Zeitverzögerungseffekt zu minimieren. Ziehen Sie schnell 50 Mikroliter Lösung aus jedem Fläschchen. Auf eine 384-Well-Schwarzplatte umfüllen und das Emissionsspektrum messen. Die Emissionsspektren jeder Probe werden alle 10 Minuten aufgezeichnet und mindestens vier Spektren zu vier verschiedenen Zeiten gesammelt.

Wiederholen Sie diese Schritte mehrmals, um Ergebnisse mit einem konsistenten Trend zu erhalten. Plotten Sie die zeitaufgelösten Photoemissionsspektren für jede Probe. Identifizieren Sie die Spitzenintensität aller Proben und stellen Sie ein Diagramm gegen die Zeit her, um die Bildungskinetik von Gold-Nanoclustern in verschiedenen wirkstoffbeladenen Protein-Templates zu vergleichen und so die Bindungskonstante zwischen den einzelnen Wirkstoffen und dem HSA zu messen.

Ersetzen Sie die Arzneimittellösungen durch Ibuprofen-Lösungen in vier verschiedenen Konzentrationen. Kühlen Sie die Glasfläschchen 10 Minuten später unter fließendem Wasser in einem Waschbecken ab. Ziehen Sie 50 Mikroliter der oben genannten Lösungen aus jedem Fläschchen in eine schwarze Platte mit 384 Vertiefungen und messen Sie das Emissionsspektrum.

Wiederholen Sie diese Schritte noch zweimal, um zwei weitere Ergebnisse bei unterschiedlichen Wirkstoffkonzentrationen zu erhalten, bevor Sie das magnetische Rühren stoppen. Plotten Sie dann die Photoemissionsspektren und analysieren Sie die Ergebnisse für das Rohmaterial, das in jeder einzelnen Charge erhalten wurde. Plotten Sie die Photoemissionsspektren jeder Probe in einer Software wie Origin Pro und bestimmen Sie die Spitzenintensität.

Berechnen und plotten Sie die relative Fluoreszenzintensität gegen die Wirkstoffkonzentration. Berechnen Sie dann die Bindungskonstante, indem Sie die Daten an ein Bindungsmodell für eine einzelne Site anpassen. Die Verwendung der Mics-Zementin-Gleichung, um dies in Software wie Origin Pro zu tun.

Wählen Sie das Menü Analyseanpassung nichtlineare Kurvenanpassung aus, und wählen Sie dann Hagelfunktion aus der Kategorie Wachstumssigmoidal auf der Auswahlseite der Einstellungsfunktion aus. Klicken Sie auf Zur Anzeige anpassen. Die hier gezeigten angepassten Ergebnisse sind repräsentative Ergebnisse der zeitaufgelösten Photoemissionsspektren von Gold-Nanoclustern, die unter verschiedenen Proteindenaturierungsbedingungen erzeugt wurden.

Es kann beobachtet werden, dass sich Gold-Nanocluster bei höheren Temperaturen schneller bilden. Die Denaturierung von Harnstoff kann auch die direkte Synthese von Gold-Nanoclustern unter Verwendung des BSA-Proteins als Template erleichtern. Typische Ergebnisse des schnellen fluormetrischen Wirkstoffscreenings basierend auf der Fluoreszenzintensität von Gold-Nanoclustern unter Verwendung von wirkstoffbeladenem HSA als Template sind hier dargestellt.

Je höher die Fluoreszenzintensität, desto schwächer ist die Bindungsstärke eines Wirkstoffmoleküls an HSA. Diese Spektren zeigen den Einfluss der Wirkstoffbeladungskonzentration auf die Bildungsrate von fluoreszierenden Gold-Nanoclustern innerhalb des Ibuprofen-beladenen HSA. Je höher die Wirkstoffkonzentration, desto niedriger ist das Fluoreszenzsignal der resultierenden Gold-Nano-Cluster, die hier gezeigt werden, ein repräsentatives Ergebnis der Bestimmung der Protein-Wirkstoffbindungskonstante.

Sie wird berechnet, indem die relative Fluoreszenzintensität von Gold-Nanoclustern angepasst wird, die in der HSA-Vorlage synthetisiert wurden, die mit Ibuprofen-Medikament in unterschiedlichen Konzentrationen vorgeladen ist, unter Verwendung der MICUs-Zementin-Gleichung. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 30 Minuten für mehrere parallele Wirkstoffscreenings durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie nun ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Rein, den Nanocluster im wirkstoffgeladenen Protein synthetisiert und die Bindungsaffinität von Arzneimitteln an ein Zielprotein bestimmt, wie sie durch das Fluoreszenzsignal nachgewiesen werden kann, das von den resultierenden Goldnanoclustern emittiert wird.