Eine schnelle und quantitative fluorimetrische Verfahren zur Protein-Targeting kleines Molekül als Wirkstoff-Screening

Das übergeordnete Ziel dieser neuen fluorimetrischen Methode zur Wirkstoff-Screening ist es, die Bindungsaffinität kleiner Wirkstoffmoleküle an ein Zielprotein zu bestimmen, indem fluoreszierende Gold-Nano-Cluster innerhalb der proteingebundenen Wirkstoffvorlage gebildet werden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Wirkstoffentwicklung mit Proteinzielen zu beantworten, beispielsweise wie die Bindungsstärke von Wirkstoffmolekülen die Stabilität der Proteine gegenüber Entfaltung beeinflusst und somit zur Bildung fluoreszierender Gold-Nano-Cluster unterschiedlicher Intensität führt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir ein Proteinziel in einen fluoreszierenden Biosensor umwandeln können, um eine schnelle Identifizierung kleiner Wirkstoffmoleküle zu ermöglichen, ohne aufwändige Instrumente oder zeitraubende Markierungsschritte zu benötigen.

In Kombination mit meinem eigenen Wissen sowie der Entdeckung der Mitverfasserin, dass das Protein li eine spezifische stabilisierende Wirkung auf plasmonische Nanopartikel hat, inspirierte die Idee für diese Methode. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Herstellung der chemischen Reagenzien für das Wirkstoffscreening, wie im Textprotokoll beschrieben, um die mit menschlichem Serumalbumin oder HSA temperierten Goldnanocluster vorzubereiten. Stellen Sie zwei Glasgefäße, von denen jedes einen mikromagnetischen Rührstab enthält, auf zwei getrennte temperaturkontrollierbare Magnetheizplatten.

Stellen Sie die Temperatur eines magnetischen Rührers auf 60 Grad Celsius ein. Geben Sie anschließend unter ständigem Rühren je 200 Mikroliter Human-Albumin-Lösung, 200 Mikroliter ultrareines Wasser und 200 Mikroliter Goldchlorid-Lösung in jedes Gefäß, um die Einschließung von Goldionen innerhalb der Proteinstruktur zu ermöglichen. Zwei Minuten später werden je 20 Mikroliter Natriumhydroxid-Lösung zu jedem Gefäß hinzugefügt, um die reduzierende Wirkung des Human-Albumins zu aktivieren, wodurch sich Goldnanocluster bilden. Beginnen Sie, die Reaktionszeit ab null Minuten alle 20 Minuten aufzuzeichnen.

Entnehmen Sie 50 Mikroliter jeder Probe und überführen Sie sie in eine 384-Well-Schwarzplatte. Messen Sie das Emissionsspektrum mit einem Mikroplattenreader. Stoppen Sie den magnetischen Rührer nach 100 Minuten.

Kühlen Sie die Glasgefäße unter fließendem Wasser in einem Becken ab. Zeichnen Sie zu jedem Zeitpunkt die Photoemissionsspektren für jede Probe auf, um die Bildungskinetik von Goldnanoclustern unter verschiedenen Temperaturbedingungen zu erfassen. Um die mit bovinem Serumalbumin oder BSA templatierte Goldnanocluster herzustellen, stellen Sie ein Glasgefäß, das einen mikromagnetischen Rührstab enthält, auf einen magnetischen Rührer.

Lassen Sie die Temperatur auf Raumtemperatur. Geben Sie 200 µL BSA-Lösung, 200 µL Harnstoff und 200 µL Goldchloridlösung in das Glasfläschchen und mischen Sie unter ständigem Rühren. Zwei Minuten später geben Sie 20 µL Natronlauge hinzu.

Um die reduzierende Wirkung von BSA zur Bildung von Gold-Nanoclustern zu aktivieren, beginnen Sie gleichzeitig mit der Aufzeichnung der Reaktionszeit als null Minuten. Messen Sie stündlich das Photoemissionsspektrum des Reaktionsgemisches. Stellen Sie fünf Glasgefäße, jedes mit einem Magnetrührstab und vorbeschriftet mit einem Medikament oder reinem HSA, auf einen temperaturgesteuerten Mehrfach-Magneterrührer.

Fügen Sie 200 µL HSA zu jedem Ansatz hinzu. Anschließend geben Sie je einen µL jeder zuvor hergestellten Wirkstofflösung zu den vier entsprechenden Ansätzen. Geben Sie außerdem einen µL DMSO zur Kontrollprobe im Rührer r hinzu.

Stellen Sie die Drehzahl auf 360 U/min ein und inkubieren Sie eine Stunde lang, um die Bindung des Wirkstoffs an HSA zu ermöglichen. Geben Sie eine Stunde später jeweils 200 Mikroliter Milli-Q-Wasser und 200 Mikroliter Goldchloridlösung zu jedem Reagenzglas unter ständigem Rühren hinzu. Stellen Sie die Temperatur auf 60 Grad Celsius bei konstantem Rühren für 10 Minuten ein. Geben Sie nach 10 Minuten jeweils 20 Mikroliter 1,5-molare Natriumhydroxidlösung zu jedem Reagenzglas hinzu und beginnen Sie die Aufzeichnung der Reaktionszeit bei null Minuten.

Die Reaktionslösungen für die Messung sollten in der gleichen Reihenfolge zubereitet werden und so schnell wie möglich durchgeführt werden, um den Zeitverzugs-Effekt zu minimieren. Ziehen Sie schnell 50 Mikroliter Lösung aus jedem Fläschchen ab. Überführen Sie die Proben in eine 384-Well-Schwarzplatte und messen Sie das Emissionsspektrum. Nehmen Sie alle 10 Minuten das Emissionsspektrum jeder Probe auf und erfassen Sie mindestens vier Spektren zu vier verschiedenen Zeitpunkten.

Wiederholen Sie diese Schritte mehrmals, um Ergebnisse mit einem konsistenten Trend zu erhalten. Stellen Sie die zeitaufgelösten Photoemissionsspektren für jede Probe grafisch dar. Ermitteln Sie die Peakintensität aller Proben und tragen Sie diese in Abhängigkeit von der Zeit auf, um die Bildungskinetik von Gold-Nano-Clustern in verschiedenen arzneimittelbeladenen Proteinschablonen zu vergleichen, um die Bindungskonstante zwischen jedem Arzneimittel und HSA zu bestimmen.

Ersetzen Sie die Arzneilösungen durch Ibuprofen-Lösungen mit vier unterschiedlichen Konzentrationen. 10 Minuten später kühlen Sie die Glasgefäße unter fließendem Wasser in einem Becken ab. Entnehmen Sie 50 Mikroliter der oben genannten Lösungen aus jedem Gefäß in eine schwarze 384-Loch-Platte und messen Sie das Emissionsspektrum.

Wiederholen Sie diese Schritte noch zweimal, um zwei weitere Datensätze bei unterschiedlichen Wirkstoffkonzentrationen zu erhalten, bevor Sie den Magnetrührer stoppen. Zeichnen Sie anschließend die Photolumineszenzspektren auf und analysieren Sie die für jede einzelne Charge gewonnenen Rohdaten. Tragen Sie die Photolumineszenzspektren jeder Probe in einer Software wie Origin Pro auf und bestimmen Sie die Spitzenintensität.

Berechnen und plotten Sie die relative Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit von der Arzneimittelkonzentration. Berechnen Sie anschließend die Bindungskonstante, indem Sie die Daten an ein Einzelbindungsstellenmodell anpassen. Verwenden Sie hierfür die Mics-Cementin-Gleichung in Software wie Origin Pro.

Wählen Sie im Menü die Analyse für die nichtlineare Kurvenanpassung aus und anschließend die Hail-Funktion aus der Kategorie „wachsende sigmoidale Funktion“ auf der Seite zur Auswahl der Funktionseinstellungen. Klicken Sie auf „Anpassen“, um die Ergebnisse anzuzeigen. Die hier gezeigten angepassten Ergebnisse sind repräsentativ für die zeitaufgelösten Photoemissionsspektren von Goldnanoclustern, die unter verschiedenen Proteindenaturierungsbedingungen erzeugt wurden.

Es kann beobachtet werden, dass sich Goldnanocluster bei höherer Temperatur schneller bilden. Harnstoff-Entfaltungsbedingungen können ebenfalls die direkte Synthese von Goldnanoclustern unter Verwendung des BSA-Proteins als Template erleichtern. Typische Ergebnisse einer schnellen fluorometrischen Arzneimittelscreening-Methode, basierend auf der Fluoreszenzintensität von Goldnanoclustern unter Verwendung von arzneimittelbeladenem HSA als Template, werden hier gezeigt.

Je höher die Fluoreszenzintensität, desto schwächer ist die Bindungsstärke eines Wirkstoffmoleküls an HSA. Diese Spektren zeigen den Einfluss der Wirkstoffladekonzentration auf die Bildungsrate fluoreszierender Goldnanocluster innerhalb der mit Ibuprofen beladenen HSA. Je höher die Wirkstoffkonzentration, desto geringer ist das Fluoreszenzsignal der resultierenden Goldnanocluster; hier dargestellt ist ein repräsentatives Ergebnis der Bestimmung der Protein-Wirkstoff-Bindungskonstante.

Es wird berechnet, indem die relative Fluoreszenzintensität von in der HSA-Vorlage synthetisierten Goldnanoclustern, die mit verschiedenen Konzentrationen des Wirkstoffs Ibuprofen beladen wurden, mithilfe der MICUs-Cementin-Gleichung angepasst wird. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung innerhalb von 30 Minuten für die parallele Untersuchung mehrerer Wirkstoffe durchgeführt werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie nun ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Goldnanocluster in einem arzneimittelbeladenen Protein synthetisiert und wie man die Bindungsaffinität von Wirkstoffen an ein Zielprotein bestimmt, die anhand des von den resultierenden Goldnanoclustern emittierten Fluoreszenzsignals nachweisbar ist.