Raum-Zeit-Mapping der Motilität in Ex Vivo Vorbereitung des Darms

Das übergeordnete Ziel bei der Erstellung einer umfassenden raumzeitlichen Karte des ex vivo-Darms besteht darin, die Reaktion auf den luminalen Gehalt zu untersuchen, indem die detaillierte Bewegung der Darmwand über ein gesamtes Segment beobachtet wird. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Aktivität in verschiedenen Regionen desselben Gewebesegments aufgezeichnet und räumlich und zeitlich verglichen werden kann, was die Identifizierung komplexer Motilitätsmuster anstelle einer einfachen Kontraktion oder Entspannung ermöglicht. Obwohl diese Methode einen Einblick in die normale Darmmotilität geben kann, kann sie auch auf die Ideenifizierung von Wirkungen verschiedener Medikamente und intraluminaler Wirkstoffe, wie z. B. Nährstoffe oder Motilitätsmuster, angewendet werden.

Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da raumzeitliche Karten anfangs schwer zu interpretieren sein können. Doch mit der Zeit kann man komplexe Muster auf einen Blick erkennen. Entfernen Sie zunächst den Dickdarm oder den Darm eines euthanasierten Meerschweinchens.

Stecken Sie es in warme Krebslösung. Entfernen Sie in der Präparierschale den gesamten intraluminalen Inhalt, indem Sie Krebspuffer vorsichtig durch das Lumen perfundieren. Verwenden Sie eine Spritze mit einem stumpfen Endkatheter und vermeiden Sie eine übermäßige Aufblähung des Dickdarmsegments während der Perfusion.

Als nächstes wurden zwei bis drei Millimeter lange Stücke Polyethylenschläuche an zwei feuerpolierten Glasröhrenkathetern mit einem Durchmesser von drei Millimetern befestigt. Führen Sie in einer beheizten Dissektionsschale einen Katheter in das orale Ende der Gewebepräparation ein und binden Sie eine Naht hinter das kleine Stück Schlauch, das den Katheter mit einem chirurgischen Knoten umgibt. Versuchen Sie vorsichtig, den Katheter wieder herauszuziehen, um sicherzustellen, dass der Knoten fest sitzt.

Das kleine Stück Polyethylenschlauch verhindert ein Verrutschen der Naht. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit dem anderen Katheter am aboralen Ende des Gewebes. Entfernen Sie dann das Mesenterium aus der Gewebepräparation.

Wenn beide Katheter gesichert sind, übertragen Sie das Präparat aus dem Präpariertablett in eines der GIMM-Organbäder und positionieren Sie das Gewebe mit dem oralen Ende vom Benutzer abgewandt. Befestigen Sie als Nächstes die Glasröhrenkatheter mit Modelliermasse am Organbad, indem Sie das Ende des Glasrohrs an der Seite der Badewanne befestigen oder indem Sie die Katheter mit Plastikklammern an den Stangen über der Badewanne befestigen, die zur Befestigung der Kameras verwendet werden. Befestigen Sie nun ein fünf Zentimeter langes Stück Schlauch am offenen Ende jedes Katheters.

Verbinden Sie für den Mundkatheter das kurze Schlauchstück mit einem längeren Schlauchstück mit einem Luer-Lock-Aufsatz. Verbinden Sie dann die Fünf-Milliliter-Spritze mit der Luer-Lock-Armatur. Dies wird verwendet, um Puffer in die Gewebepräparation zu injizieren.

Für den Aboralkatheter verwenden Sie den Schlauch, um den luminalen Abfluss in einen Auffangbehälter zu leiten. Spülen Sie nun das Gewebe mit der beigefügten Spritze langsam mit erwärmtem Krebspuffer aus, um einen guten Fluss zu gewährleisten, wie man an der Flüssigkeit erkennen kann, die aus dem Aboralkatheter austritt. Fahren Sie fort, indem Sie das Videoaufzeichnungssystem kalibrieren, während sich das Gewebe 30 Minuten lang äquilibriert.

Kalibrieren Sie die Kamerahöhe, die Platzierung der Kamera, die Videoeinstellungen für Helligkeit und Kontrast sowie den horizontalen Abstand mit der GIMM-Software. Klicken Sie auf die Registerkarte Experiment, damit die Kamera kalibriert werden soll. Klicken Sie dann im Menü Datei auf Kalibrieren.

Sobald das Video im Fenster "Workstation kalibrieren" angezeigt wird, stellen Sie die Kamera auf eine Höhe ein, in der das Bild die Enden der Katheter enthält, die in das Dickdarmlumen eingeführt wurden. Kalibrieren Sie dann den horizontalen Abstand, der auf dem Bild auf dem Bildschirm angezeigt wird, mit dem durchscheinenden Linealaufkleber, der an jeder Badewanne angebracht ist. Stellen Sie im selben Fenster für die kalibrierte Workstation die roten vertikalen Hilfslinien so ein, dass sie 10 Millimeter voneinander entfernt sind.

Geben Sie dann diese Entfernung in das Fenster des Entfernungscursors ein und klicken Sie auf die Schaltfläche Cal. Passen Sie als Nächstes die Schieberegler für Verstärkung, Helligkeit und Verschluss im Fenster "Workstation kalibrieren" an, um das Gewebesegment als dunkle Silhouette auf hellem Hintergrund erscheinen zu lassen. Stellen Sie dann den Fokus und die Blendenknöpfe an der Kamera selbst ein, um das Bild weiter zu verbessern.

Um die Bildkalibrierung abzuschließen, klicken Sie im Popup-Fenster auf Speichern und dann auf Ja. Klicken Sie abschließend auf Beenden. Nach Ablauf der halbstündigen Äquilibrierungszeit beginnen Sie mit dem Experiment.

Beginnen Sie mit der Benennung der experimentellen Studie. Als nächstes verschließen Sie das Lumen des Schlauchs, das aus dem Aboralkatheter herausragt, mit der Kunststoffklemme. Injizieren Sie dann etwa 7 Milliliter Krebspuffer in das proximale Dickdarmlumen.

Ziel ist es, genügend Dehnung zu bieten, um treibende Kontraktionen auszulösen. Sobald das Segment durch Luminalflüssigkeit aufgebläht ist, starten Sie die Videoaufnahme. Doppelklicken Sie in der Software auf den benannten Versuch, um die experimentelle Kameraansicht zu öffnen, und klicken Sie dann auf den Kippschalter auf Ein, um das Kamerafeld anzuzeigen.

Erfassen Sie eine vorher festgelegte Länge von Videodaten. Lösen oder entfernen Sie am Ende dieses ersten kontrollierten Dehnungsversuchs die Klemme, damit das Gewebesegment die aufblähende Flüssigkeit aus dem Lumen befördern kann. Lassen Sie das Gewebe 10 bis 20 Minuten lang wieder ins Gleichgewicht kommen und wiederholen Sie dann den Vorgang mit der Behandlung.

Ein einzelnes Gewebepräparat kann bis zu fünf 10-minütige Behandlungen für die entsprechenden Ruhephasen zwischen den Tests durchlaufen. Achten Sie auf Schleimhautablösungen, die auf einen Abbau des Gewebes hinweisen. Um die Aufzeichnung zu analysieren, doppelklicken Sie auf den Namen eines bestimmten Versuchs, um das Analysefenster für die Erstellung einer ST-Karte zu öffnen.

Passen Sie im Videowiedergabebereich die Schieberegler für Kontrast und Helligkeit an, um das Bild für die Analyse geeignet zu machen. Erstellen Sie eine schwarze Gewebesilhouette auf hellem Hintergrund. Legen Sie als Nächstes die horizontalen und vertikalen roten Hilfslinien im Videobildfenster fest, um den Gewebebereich für die Analyse zu isolieren und Bereiche mit Artefakten zu entfernen.

Legen Sie dann die Zeit für die Analyse fest. Klicken Sie auf die grüne A-Schaltfläche, um den Startpunkt auszuwählen, und klicken Sie auf die gelbe B-Schaltfläche für den Stopppunkt, wenn sich der Zeitschieberegler an der richtigen Position befindet. Wählen Sie als Nächstes die Registerkarte Motoranalyse aus, um das ST-Kartenfenster zu öffnen, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Stoppuhr.

Beginnen Sie mit der Erstellung der ST-Map, indem Sie mit dem Fadenkreuz-Cursor in die schwarze Silhouette des Gewebes klicken. Die Erstellung der Karte kann einige Minuten in Anspruch nehmen. Nachdem die ST-Karte erstellt wurde, wählen Sie die Zoomfunktion aus, um das Bild zu vergrößern.

Wählen Sie dann die Farboption aus, um das Bild in Farbe statt in Graustufen zu sehen. Wählen Sie als Nächstes "Aktivieren" aus, damit der Cursor verwendet werden kann, um das Pixel für die Analyse auszuwählen. Für das Gewebe, das mit den ausgewählten Pixeln verknüpft ist, wird die Änderung des luminalen Durchmessers im Laufe der Zeit analysiert und als Korndurchmesser-Tracing rechts neben der ST-Karte angezeigt.

Wählen Sie nach den Analysen Beenden aus. Exportieren Sie nun die ST-Karte für andere Zwecke, indem Sie Datei und dann Daten exportieren und dann Metadatei auswählen. Benennen Sie die Datei und speichern Sie sie als EMF-Datei, indem Sie auf Speichern klicken.

Die mit dieser Technik erzeugten Karten zeigen Veränderungen des luminalen Durchmessers des Gewebes sowohl in der Entfernung als auch in der Zeit. Die horizontale Entfernung befindet sich auf der X-Achse und die Zeit auf der Y-Achse, wobei sich die Startzeit oben und die Endzeit unten befindet. In der oberen rechten Ecke befindet sich eine Legende, die den minimalen und maximalen Luminaldurchmesser sowie die Skalierung für die X- und Y-Achse anzeigt.

Unterschiedliche Pixelschattierungen innerhalb des Graustufenbildes entsprechen also unterschiedlichen luminalen Durchmessern. Dunklere Pixel entsprechen größeren Durchmessern und helleren Pixeln kleineren Durchmessern. Kontraktile Wellen des kreisförmigen Muskels erscheinen aufgrund der Verringerung des luminalen Durchmessers als Bereiche mit hellerer Pixelierung.

Im Gegensatz dazu wird die luminale Ausdehnung durch zirkuläre Muskelrelaxation oder einen großen Flüssigkeitsbolus mit dunkleren Pixeln dargestellt. Neben Wellen einer sich ausbreitenden Kontraktion kann auch das als Segmentierung bekannte Mischungsmotilitätsmuster sichtbar gemacht werden. Kleine stationäre Kontraktionen treten in verschiedenen Bereichen gleichzeitig auf.

Im Laufe der Zeit bewegen sich diese kleinen Kontraktionen in Richtung des aboralen Analendes. Mesenterien, die auf dem Gewebe verbleiben, können Artefakte verursachen, die sich als dunkle vertikale Linien darstellen. Die horizontale Bewegung dieser künstlichen vertikalen Linien kann verwendet werden, um das Timing der Längsbewegung der Muskeln zu bestimmen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Darmsegmente für die Videoaufzeichnung vorbereiten und wie Sie die anschließende Darstellung der Darmmotilität als raumzeitliche Karten erstellen. Nach diesem Verfahren können der luminalen Lösung verschiedene Nährstoffe zugesetzt werden, um zu bestimmen, wie natürliche Bestandteile bestimmte Motilitätsmuster induzieren, um die Verdauung und Resorption zu erleichtern. Die Verwendung spezifischer pharmakologischer Agonisten oder Antagonisten von Rezeptoren für neuronale humorale Wirkstoffe kann verwendet werden, um die Mechanismen zu bestimmen, durch die die Motilität initiiert und fortgepflanzt wird.

Diese Technik könnte dazu beitragen, Daten zu gewinnen, die für die Bestimmung von Verbindungen nützlich sind, die für die Behandlung von Motilitätsstörungen nützlich sind.