Name: Raum-Zeit-Mapping der Motilität in Ex Vivo Vorbereitung des Darms (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-27T16:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Erfahren Sie die räumlich-zeitliche Kartierung der Darmmotilität mit dem GIMM-System an ex vivo Meerschweinchen-Darmpräparaten. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung komplexer Kontraktionsmuster für pharmakologische Studien.

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DMK wurde durch einen Zuschuss aus NIGMS IRACDA (K12GM093857) an Virginia Commonwealth University unterstützt. Diese Arbeit wurde von NIDDKD Zuschuss DK34153 John R. Grider unterstützt.

Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss der Virginia Commonwealth University (IACUC) genehmigt alle Tiere und Euthanasie Verfahren in diesem Protokoll verwendet. 1. Herstellung der Lösungen <ol><li> Herstellung von 4 l Krebs-Puffer (zusammengesetzt [in mm]: 118 NaCl, 4,75 KCl, 1,19 KH 2 PO 4 1,2 MgSO 4, 2,54 CaCl 2, 25 NaHCO 3, 11 Glucose). Wiegen Sie die entsprechenden Mengen jedes feste Chemikalie, in das entsprechende Volumen an entionisiertem Wasser gegeben und mischen mit einem Vortex, bis die Lösung klar ist. </li><li> Dann Belüften der Lösung mit carboxygen (95% O 2, 5% CO 2) für 30 min unter Erwärmen auf 37 ° C. </li><li> Bestimmung des pH-Wertes der Lösung, während bei 37 ° C (die gleiche Temperatur wie im Organbad) und auf pH 7,4 bei Bedarf mit HCl. Halten den Krebs-Puffer kontinuierlich carboxygenated und bei 37 ° C über die Länge des Experiments. </li><li> SetzenZulauf und Ablauf Schläuche von den Schlauchpumpen in den Pufferspeicher und wiederum auf den Schlauchpumpen, um die Perfusion des Puffers in der gesamten Rohrleitung und Organbad System beginnen. HINWEIS: Puffer anfänglich wieder in den ursprünglichen Behälter gepumpt werden, bis die Zugabe entweder von Gewebe in die Organbäder oder Chemikalien in das Perfusionssystem Puffer. Dies reduziert die Gesamtmenge an Puffer für Experimente benötigt. Dann sollte die ausgehenden Puffer Perfusion Linien in einen leeren Behälter platziert werden, so dass die ein- und ausgehenden Puffer nicht mischen. </li><li> Korrektur der Temperatur der Heizungsanlage auf dem Bad Zirkulator so daß der Puffer in den Organbädern wird und bleibt 37,0 ± 0,5 ° C für die Dauer des Experiments. Zu bestätigen und zu ändern, wenn erforderlich, auch der pH-Wert der Krebs-Puffer mindestens ein weiteres Mal bevor Gewebesegmente in dem Bad in Schritt 2.8. </li></ol> 2. Herstellung von Tissues <ol><li> Euthanizeein Meerschweinchen durch Verwendung von Kohlendioxid Einatmen / Ersticken in einer abgedichteten Kammer oder eine andere von der örtlichen Tierpflege und Verwendung Kommission genehmigt Euthanasieverfahren. </li><li> Nach der Bestätigung, die Euthanasie des Tieres aufgeschnitten das Bauchwand in Längsrichtung mit Dissektion Schere und suchen Sie den Darm. Schneiden Sie das Mesenterium in den Dünndarm angeschlossen, um zu helfen setzen den Blinddarm. HINWEIS: Um zu bestätigen, Euthanasie führen eine sekundäre Verfahren, wie die bilaterale Thorakotomie wie von einem Tier Pflege und Gebrauch Ausschuss genehmigt. </li><li> Zu lokalisieren, das distale Ende des Blinddarms und durchschneiden das proximale Kolon distal seiner Verbindung mit dem Blinddarm. Dann durchschneiden proximalen Kolon wieder ~ 8 cm distal des ersten Durchtrennung. </li><li> Setzen Sie den Doppelpunkt Gewebe in erwärmt und carboxygenated Krebs-Lösung (in Kapitel 1 beschrieben) für die weitere Präparation. Pin der Doppelpunkt in die Dissektion Bad und eine kleinere Menge der Schere, um so viel Mesenterium und Fett wie möglich zu entfernen. </li><li> In heated Dissektion Tablett, entfernen Sie alle intraluminale Inhalt durch leichtes Durchblutung der Krebs-Puffer durch das Lumen mit einer zu einem stumpfen Ende Katheter gekoppelt Spritze (um zu verhindern, Perforation des Gewebes). Vermeiden Sie Überdehnung des Segments während dieser Perfusion Prozess. </li><li> Erhalten zwei feuerpolierten Glasrohr-Katheter (3 mm Durchmesser) und legen ein kurzes Stück Polyethylenschlauch (~ 3 mm lang und ca. 3 mm Durchmesser), um den Abschnitt des Glasrohrs Eingeben der Gewebelumen. ANMERKUNG: Dies ermöglicht es dem Nahtmaterial um das Gewebe und Glasrohr sicher zu bleiben und nicht verrutschen, wie die Zubereitung in das Organbad und während Veränderungen in der Gewebelänge platziert. </li><li> Stecken Sie ein Katheter in die Mund Ende der Gewebepräparation und binden einen Faden um die kleine Schlauchstück rund um den Katheter unter Verwendung eines Chirurgen Knoten. Vorsichtig versuchen, den Katheter wieder herausziehen, um sicherzustellen, der Knoten ist gemütlich. Führen Sie dann die gleiche Aktion auf der anderen Katheter Eingabe ter aboralen Ende des Gewebes. </li><li> Sobald die Katheter befestigt sind, bewegen Sie die komplette Vorbereitung (Gewebe zzgl Katheter) von der Dissektion Tablett in eine der Organbäder. Stellen die Herstellung in das Bad mit der oralen abgewandten Ende des Benutzers. </li><li> Nächste mount / Sicherung der Glasröhre Kathetern dem Organbad durch eine der zwei vorgeschlagenen Verfahren. HINWEIS: Die Sicherung der Glasrohre verhindern, dass das Gewebesegment aus wechselnden Länge während des Experiments oder kommen über dem Oberflächenniveau der Krebs-Puffer in der Badewanne. <ol><li> Option A: Den oberen Teil des Glasrohrs auf der Oberseite der Seite des Kunststoff Organbad durch die Verwendung von Ton Gießer oder einem Kunststoffclip. </li><li> Option B: Sichern Sie sich die Glasröhren zu den Metallstangen, die die Kameras über dem Organbad Vorbereitung durch die Verwendung von Kunststoffclips zu halten. </li></ol></li><li> Sobald die Katheter werden dem Bad befestigt ist, befestigen eine 5-cm-Stück Schlauch an dem offenen Ende jedes Katheters. Für die orale Katzeheter Befestigen dieser Schlauch in einen 10-ml-Spritze, die verwendet werden, um Puffer in das Lumen des proximalen Kolon Segment injiziert wird. Für aboralen Katheters wird dieses Schlauchstück kann der luminale Abfluss in einen Sammelbehälter (50 ml Becherglas, Reservoir, etc.) gerichtet werden. </li><li> Mit Hilfe der Spritze in die Mundende angebracht langsam bündig erwärmt Krebs-Puffer durch die Gewebelumen, dass Flüssigkeit durch das Gewebe fließen zu gewährleisten. Fluss wird durch austretende Flüssigkeit aboralen Katheter bestätigt. Kalibrieren Sie den Video-Aufzeichnungssystem (Protokoll Abschnitt 3), während das Gewebe im Gleichgewicht für 30 min. </li></ol> 3. Kalibrierung des Video-Aufzeichnungssystem <ol><li> Kalibrieren Sie die Kamerahöhe Platzierung, Video-Einstellungen für Helligkeit und Kontrast und horizontale Strecke mit Hilfe der Software. HINWEIS: Die besten Einstellungen für die intraluminale Perfusion Setups unterscheiden sich von den Einstellungen für die Geschwindigkeit der Antriebs Pellet 13 zu bestimmen sind. </li><li> Click auf der Registerkarte Experiment für die Kamera kalibriert werden. Dann im Menü &quot;Datei&quot; klicken Sie auf &quot;Kalibrieren&quot;. </li><li> Sobald das Video in der &quot;kalibrieren Arbeitsplatz &#39;angezeigt wird, stellen Sie die Kamera in einer Höhe, wo das Bild enthält die Enden der Katheter in das Darmlumen eingeführt. </li><li> Dann kalibrieren Sie den horizontalen Abstand in dem Bild mit dem durchscheinenden Herrscher Aufkleber auf jedem Bad angebracht angesehen. ANMERKUNG: Diese Kalibrierung ist entscheidend für die späteren Softwareberechnungen des Lumendurchmessers und der Geschwindigkeit der Kontraktionswellen. </li><li> Im gleichen Fenster &quot;Kalibrieren Workstation&quot;, stellen Sie die rote vertikale Richtlinien, so dass sie 10 mm voneinander nach dem Herrscher im Kamerabild. Geben Sie dann den angemessenen Abstand (10 mm) in das Fenster &quot;Abstand Cursor&quot; und klicken Sie auf &quot;CAL&quot; Taste. </li><li> Als nächstes stellen Sie die Verstärkung, die Helligkeit und Verschlussschieberegler innerhalb des Fensters &#39;kalibrieren Workstation&#39;, um das Bild der Kamera, so dass zu änderndas Gewebe Segment erscheint als dunkle Silhouette auf einem hellen Hintergrund. HINWEIS: Abbildung 4 zeigt gute und schlechte Beispiele für diesen Kalibrierungsverfahren. </li><li> Um das Bild richtig einzustellen, auch die Fokus- und Blenden Knöpfe auf der Kamera selbst eingestellt werden. </li><li> Die Kalibrierung ist damit abgeschlossen. Klicken Sie auf &quot;Speichern&quot; und anschließend auf &quot;OK&quot; im Pop-up, und schließlich klicken Sie auf die &quot;EXIT&quot; -Taste. </li></ol> 4. Allgemeine Experimentelle Verfahren <ol><li> Nach der Kamerakalibrierungsverfahren und 30 Minuten von Gewebeausgleich abgeschlossen sind, nennen die Prüfungen in den einzelnen Versuchsprotokoll. Probenamen können den Namen und die Konzentration der Verbindung, und das Volumen an Flüssigkeit, bezogen werden, die intraluminal in diesem Teil des Experiments in das Gewebe Segment perfundiert. </li><li> Dann verschließen den Schlauch vom aboral Katheters durch die Verwendung einer Schlauchklemme vorsteht. HINWEIS: Dies verhindert luminalen Flüssigkeit aus dem Verlassen des aboralen Ende während fuitere Experimente, was die Verwendung von spezifischen Volumina in dem Lumen, um verschiedene Niveaus der Ausdehnung hervorrufen (Figur 1). </li><li> Injizieren etwa 0,7 ml Krebs-Puffer in den proximalen Darmlumen genügend Dehnung um die Antriebs Kontraktionen am Meerschweinchen ex vivo Herstellung initiieren. ANMERKUNG: Diese Menge kann leicht variieren - je nach der Gesamtlänge des intakten Segment und der Menge der Ausdehnung zu dem Segment in dem Organbad aufgetragen (0.1 0.2 ml). </li><li> Sobald das Segment durch luminalen Flüssigkeit aufgetrieben, schalten Sie die Kamera und nehmen Sie dann die Beweglichkeit für einen vorher festgelegten Zeitraum (zB 10 min). <ol><li> Genauer gesagt, doppelklicken Sie auf die entsprechend benannten Studie zur Untersuchung der experimentellen Kameraansicht zu öffnen, und klicken Sie dann auf den Kippschalter auf die Position &quot;ON&quot;, um die Kamera-Feld anzuzeigen. Klicken Sie dann auf die Aufnahmetaste um die Aufnahme zu initiieren (Record-Taste wird rot bleiben, während sich die Kamera-Aufnahme) einnd klicken Sie auf die Aufnahmetaste erneut, um die Aufnahme zu stoppen. </li></ol></li><li> Am Ende dieser ersten Steuerspannungsgefühl Studie, lösen / entfernen Sie den Klemm Verschließen des aboralen Katheter, damit das Gewebesegment, um den Dehnungs Flüssigkeit aus dem Lumen zu treiben. </li><li> Nach 10 min erneut Äquilibrierungsperiode Das gleiche Verfahren mit irgendeiner einer Vielzahl von Nährstoffen, bioaktiven Mitteln, Wirkstoffen oder Agonisten / Antagonisten in der Lumenflüssigkeit, um die Antriebs Motilität des Segments (beispielsweise kurzkettige Fettsäuren oder Dekan modifizieren Säure) 10,18. <ol><li> Zu beurteilen, zu helfen, wenn die neue experimentelle Flüssigkeit in die Colon-Segment, lassen eine Luftblase in der Nähe des Hafens von der Spritze, so dass beim Durchblutung der neuen Lösung in das Darmlumen den Fortgang der Blase wird dem Benutzer erlauben, wenn die Versuchsflüssigkeit wissen hat das Lumen erreicht wird. </li><li> Weiter intraluminale Perfusion mit aboralen Katheter geöffnet, bis die Blase vollständig durch die gedrückt wordenLumen Perfusionssystem (kann 2-3 ml Perfusat erforderlich). Dann kann der Gewebesegment, um Flüssigkeit durch das offene aboralen Katheter für bis zu 5 min zu vertreiben. HINWEIS: Nach diesem Verfahren wird das Lumen ein vernachlässigbares Volumen an Fluid zu enthalten, so dass die Perfusion eines bekannten Volumens an Flüssigkeit in das Lumen. </li></ol></li><li> Wieder verschließen aboralen luminalen Katheterschlauch mit einer Schlauchklemme (wie in Schritt 4.3) injizieren das gleiche Volumen an Flüssigkeit zu dehnen, wie in der Kontrollgruppe durch die Spritze. Notieren Sie die Motilität Muster während des Versuchszeitraums für die spätere Analyse und Vergleich zur Kontroll Krebs Zustand (wie in Schritt 4.5). </li><li> Wiederholungs Abschnitte 4.4 - 4.7 des Protokolls mit unterschiedlichen Lumen Verbindungen oder verschiedene Konzentrationen desselben luminalen Verbindung. </li></ol> 5. Konstruktion von Raumzeitliche Maps (STmaps) <ol><li> Nach Beendigung der Aufzeichnung des Versuchs, doppelklicken Sie auf den Namen eines bestimmten Studie, die Analyse wind öffnenow für den Bau eines stmap. </li><li> Im Video-Wiedergabebereich, passen Sie die Kontrast- und Helligkeitsschieberegler in der Analysefenster, um das Bild für die Analyse geeigneten machen (schwarz Gewebe Silhouette auf hellem Hintergrund; Abbildung 4). HINWEIS: Wenn die Kamerakalibrierung wurde nicht entsprechend vor Beginn des Experiments wird das Bild nur in einem geringeren Ausmaß an dieser Stelle geändert werden, durchgeführt. </li><li> Sobald das Bild richtig kontrastiert, stellen Sie die horizontale und vertikale rote Richtlinien innerhalb des Videobildfenster, um den Gewebebereich für die Analyse zu isolieren und Bereiche enthalten Artefakte zu entfernen. Außerdem wählen Sie die entsprechende Zeitsegment von der Aufnahme durch die Bestimmung der Start- und Stopp-Zeitpunkte für die Analyse. <ol><li> Genauer gesagt, wählen Sie die Start- und Endpunkte innerhalb des Videos mit dem grünen &quot;A&quot; und gelb &#39;B&#39; Tasten innerhalb der Analyse-Software. Stellen Sie den Zeitschieberegler auf den Beginn des Videosegments zu analysieren und dien Sie auf den grünen &quot;A&quot; -Taste. Dann stellen Sie den Schieberegler, um das Ende des Segments, zu analysieren und klicken Sie auf die gelbe &quot;B&quot; Taste. </li></ol></li><li> Als nächstes klicken Sie auf die &quot;Motor-Analyse &#39;Reiter, um die stmap Fenster zu öffnen und klicken Sie auf&#39; Stoppuhr &#39;button. Nach einem Klick auf die Stoppuhr, nächstes klicken Sie auf die Fadenkreuz-Cursor innerhalb der schwarzen Silhouette des Gewebes innerhalb des aufgezeichneten Film zu stmap Generation beginnen. </li><li> Nach dem Klicken auf das Fadenkreuz im Gewebe silhouette, generiert die Software und zeigt die stmap für diese Region von Video. Anmerkung: Dies kann einige Minuten, abhängig von der Länge der Video zur Analyse ausgewählt werden. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Zoom&quot;, um ein vergrößertes Bild des stmap und Kontrollen zu sehen, um das Bild einzustellen. <ol><li> Klicken Sie auf die &quot;Farbe&quot; Option in der neu erstellten Fenster, um die stmap als Farb anstelle von Graustufen anzuzeigen. Auch auf die Option &quot;Aktivieren&quot;, um einen Cursor auf bestimmte Pixel innerhalb der Karte und v platzierenIEW eine Rückverfolgung von der Änderung der Lumendurchmesser für die jeweilige Gewebebereich. Klicken Sie auf &quot;Beenden&quot;, wenn Sie fertig. </li></ol></li><li> Exportieren eines stmap für den Einsatz in Papieren oder Präsentationen oder in ImageJ weiter zu analysieren, indem Sie das Menü &quot;Datei&quot;, gefolgt von der Auswahl &#39;Daten exportieren&#39; und dann &#39;Meta File &quot;. Nennen Sie den stmap, die als EMF-Datei gespeichert werden soll und klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;Speichern&quot;. </li><li> Alternativ Bilder der stmap sparen durch einen Screenshot erfassen. Dies ist notwendig, um Pseudo-Farb-Versionen des stmap speichern. </li></ol> 6. Analyse der Kontraktionswellengeschwindigkeit in STmaps <ol><li> Um die Geschwindigkeit des Kontraktionsausbreitung oder Kontraktion Dauer analysieren zunächst die stmap EMF-Datei zu konvertieren TIFF, GIF, JPG oder BMP-Formate, die akzeptabel, durch eine Dateikonvertierungsprogramm der Wahl ImageJ sind. HINWEIS: ImageJ nicht das EMF-Format Ausgabe der STmaps aus der Software zu öffnen. <ol><li> AlternativEly, Verwendung Screenshot-Capture-Software ein Bild von einem stmap auf dem Bildschirm zu nehmen und speichern Sie sie in einem geeigneten Dateiformat. </li></ol></li><li> Öffnen Sie dann das Re-formatierte stmap in ImageJ und öffnen Sie die GIMMProcessor Plugin von den &quot;&quot; -Menü und wählen Sie &quot;Plugins Öffnen GIMMProcessor GIMMProcessor&quot; und &quot;Messungen Tabelle&quot; Fenster &quot;. Dies wird sowohl zu öffnen &#39;. </li><li> Klicken Sie auf die &quot;rechteckige Auswahlwerkzeug&quot; im ImageJ-Fenster und dann verwenden, um durch Klicken und Ziehen den gesamten Bereich der Maßstabsleiste in der oberen rechten Ecke des stmap skizzieren. Danach Region ausgewählt ist, klicken Sie auf die &#39;Set-Kalibrierung&#39; Button in der Plugin. Schließlich legen Sie die entsprechende Abstand (mm) und die Zeit (sec) in die Eichfeld nach den Werten auf der Maßstabsleiste und klicken Sie auf &#39;Fertig&#39;. </li><li> Als nächstes klicken Sie auf die Linienzeichnung Werkzeug in der ImageJ Fenster. Zeichnen Sie eine Linie auf dem stmap durch das Zentrum eines sich ausbreitenden Kontraktion entlang der Winkel von the Steigung durch Klicken und Ziehen auf der stmap Bild. Alternativ ziehen Sie eine vertikale Linie durch ein Band aus nicht-fortpflanzenden Kontraktion zu Kontraktion Dauer zu bestimmen. </li><li> Nachdem die Leitung entsprechend gezeichnet (nur eine Zeile zu einem Zeitpunkt gezeichnet werden), klicken Sie auf &#39;übernehmen Messung &quot;Knopf im Plugin, um ein Auslesen der horizontale Abstand, vertikaler Abstand und Neigung der Linie zu erzeugen; die Länge (mm), Zeit (sec) und die Geschwindigkeit (mm / s) entsprechen. Diese Daten werden in dem Fenster &quot;Messungen Tabelle &#39;angezeigt. </li><li> Wiederholen Sie den Linienzeichnung und Analyseschritte mehrmals innerhalb einer bestimmten stmap und speichern Sie die Daten als .gmd Datei. Klicken Sie auf den Button &quot;Speichern&quot; in der Plugin und benennen Sie die Datei. Klicken Sie dann auf &quot;Speichern&quot; erneut, um den Vorgang abzuschließen. Diese Daten können später mit anderen Studiendaten verglichen oder verwendet werden, um Linien auf einer stmap Ziehwieder werden. </li></ol>

Catamount Research and Development, Inc., der Entwickler des GIMM-Systems, übernahm die Veröffentlichungsgebühren für dieses Manuskript.

Darmmotilität wurde angesehen, und aus einer Reihe von Perspektiven auf Basis der Art der Parameter aufgezeichnet werden beschrieben. Videoaufzeichnung und räumlich-zeitliche Zuordnung ist ein wertvolles Instrument, die Analyse der Gesamtbewegung und / oder Antriebs über lange Segmente des Darms sowie die Analyse der Tätigkeit können an bestimmten Stellen entlang des Segments erwiesen. Der Ansatz zur Videoaufzeichnung und Raum-Zeit-Mapping genommen kann eine zweifache und reflektierend ist der untersuchten Region und der Art der luminalen Inhalte. In Darmabschnitten, wo luminalen Inhalte sind flüssiger und proximalen Kolon, wo Inhalte sind halbfest wird die Aktivität von intraluminale Einführung des Fluids durch Bolus oder Infusion induziert. Raum-Zeit-Karten aus diesen Videoaufzeichnungen sind dazu bestimmt, die Bewegung des gesamten Segments wie oben beschrieben darstellen. Im Gegensatz dazu ist im mittleren bis distalen Kolon, wo die Inhalte sind solide, Aktivität wird durch Einfügung eines fäkalen pelle eingeleitett (epoxiert natürlichen oder künstlichen Pellet-Pellet) und Raum-Zeit-Karten wurden entwickelt, um die Bewegung des Pellets durch den Darm nach der JOVE Artikel von Hoffman et al. 13 dargestellt reflektieren. Wodurch der Aufbau des Experiments und Analyse entscheidend und hängt von der Art des Reizes und der Region untersucht. Daher werden die wichtigsten Schritte für die Erzeugung und Analyse von raumzeitlichen Karten von Fluid-induzierten Darmbewegung sind: 1) die richtige Entfernung von Gekröse vom seziert Gewebe; 2) die richtige Bildkalibrierung vor der Aufnahme; 3) die richtige Entfernung von Artefakten während stmap Generierung und Analyse; 4) die richtige Einstellung des Analysesystems; und 5) gewinnt die manuelle Geschicklichkeit, um katheterisieren und nähen die Segmente ohne sie zu beschädigen. Während die Verwendung von STmaps des Lumendurchmessers haben die Fähigkeit, über einen Bereich des Darms sichtbar zu machen und zu analysieren Voll Motilitätsmuster verbessert wird, wird das Verfahren am besten verwendet werden, wenn sie mitFunktionsmessungen von Druck oder Muskelkontraktion 2,15,20. Während beispielsweise einige Muskelkontraktionen luminalen Durchmesser geringfügig ändern und auf einigen STmaps (dh myogenen Welligkeiten) sichtbar werden sie nicht tatsächlich verursachen keine Antriebs oder Mischen von Darminhalt 25. Dies kann nicht ohne Kopplung dieser Technik auf andere funktionelle Messungen bekannt sein. Auch ist die Natur vieler Gewebezubereitungen in dieser Art von System (dh einem geschlossenen System oder luminalen konstanten luminale Perfusion durch ein Pumpsystem) führt zu Artefakten innerhalb STmaps. Somit muss der Benutzer wissen, wie ihre spezifischen Organ Zubereitung und Experiment kann zu Artefakten in den Daten und Wege zu vermeiden oder auszuschließen diese Artefakte in der Datenanalyse (zB Mesenterium-induzierte vertikale Linien oder dunkle Pixelbildung führen wegen Unfähigkeit des Gewebes Fluid auszustoßen aus dem System in einem geschlossenen luminalen Vorbereitung). Es gibt mehrere Methoden für die luminale Perfusion eines inwenden Darmsegment neben einem geschlossenen System. Eine Methode ist, stattdessen ein offenes System mit einem konstanten intraluminale / Gegendruck durch die Verwendung einer erhöhten Rohr und / oder Einwegventil auf der analen Ende der Herstellung 8-10,30 beibehält. Dies ermöglicht es dem Fluid, aus der Zubereitung im Vortriebs Kontraktionen zu bewegen. Da das System-Setup vor allem auf Änderungen der Lumendurchmesser zu erfassen, sind diese Kontraktionen oder Motilität Muster, die Sie Lumendurchmesser nicht stark beeinflussen oft schwierig, durch dieses Protokoll zu visualisieren. Da Änderungen in der Pixelschattierungs im stmap beruhen auf der Änderung des Lumendurchmessers basiert Motilitätsmuster die nicht im Durchmesser verursachen große Änderungen werden nicht gut in diesem Verfahren sichtbar gemacht werden, wenn starke Kontraktionen sind auch innerhalb der gleichen Aufnahme vorhanden ist. Wie für die Visualisierung und Analyse von Ripple-Typ-Kontraktion (Abbildung 3) beschrieben ist, die Einstellung der Analyselinien in der Video-Aufzeichnung näher to die Gewebewand können dieses Problem vermeiden. Dieses Verfahren verringert die maximalen Durchmesser innerhalb des stmap dargestellt, so Kontraktionen, die nur minimal Gewebe Durchmesser verändern kann visualisiert werden. Eine weitere Möglichkeit, dieses Problem zu lösen, ist die Änderung der Dauer der Videosegment analysiert, um die Kontraktionen, die einen großen Einfluss des Lumendurchmessers, so dass kleinere Kontraktionen werden leichter visualisiert auszuschließen. Dies führt zu dem Problem der Potential Motilität, die minimal ändert Lumendurchmesser sucht ähnlich einem separaten stmap wo Kontraktionen Lumendurchmesser stark verändert werden. Dies liegt daran, dass die Bestimmung von weißen Pixeln auf der Karte auf dem kleinsten Durchmesser in einem gegebenen Video basiert. Wenn es nicht viel Variabilität im Durchmesser innerhalb des Video (wenig oder keiner Kontraktion des Ringmuskel) sehr klein Kontraktionen, nicht den Durchmesser der Zubereitung erheblich ändern kann ähnlich peristaltischen Kontraktionen von einem anderen Video aussehen. Daher ist es wichtig, die Zahl betrachtenLegende in der oberen rechten Ecke der Karte. Wenn die Differenz zwischen den maximalen und minimalen Durchmesser klein ist es wichtig, die stmap zu dem Video aus, um die Gültigkeit des Pixels Farbtonänderung, wie in der stmap vertreten bestimmen generiert wurde zu vergleichen. Somit ist Prüfung der Maßstabsleiste in Verbindung mit der eigentlichen Aufnahme entscheidend für die Interpretation der Karte zu korrigieren. 30, Ratte 7,9,30 - - Videoaufzeichnung und räumlich-zeitliche Zuordnung von Darm und Kolon-Segmente haben zu einer Vielzahl von Arten, darunter 26 Zebrafisch, Maus 25,27 angewendet wurden 33 Meerschweinchen 5,6,8,13 - 19, 24,30,32,34,35, Fuchskusu 12,36, Kaninchen 2,30,37,38, Huhn 39, Schwein 40,41 und Menschen 42. Die am häufigsten untersuchten Arten ist das Meerschweinchen. Dies ist nicht überraschend, weil das Meerschweinchen enterische Nervensystem hwie die meisten vollständig charakterisiert worden und historisch war es das Tier die meisten in vitro im Hinblick auf die Vortriebs Motilität des Darms 43 untersucht. Raum-Zeit-Mapping wurde meist auf Rohrsegmente aus Därmen von Kleintieren angewendet; jedoch Studien in den Kaninchen und Schweine mit modifizierten Systeme zeigen die Anwendung dieser Methode, um größere Tiere. Im Fall von Kaninchen ist der Ansatz identisch mit der kleineren Tieren außer daß größere Segmente und Organbäder wurden verwendet 30. Die in der Schweine verwendete Ansatz war es, eine exteriorisierten Darmschlinge von einem narkotisierten Schwein statt Eintauchen eines sezierten Gewebesegment in einem Organbad verwenden. Außerdem wurden STmaps durch Kreuzkorrelation anstelle der in den meisten Studien 40 verwendet Durchleuchtungsmethode erzeugt. Die isolierte, gefäßtherapeutisch perfundierten Schleife Vorbereitung für Videoaufzeichnung und räumlich-zeitliche Zuordnung ist auch für kleinere Arten wie Ratten angewendet worden <sup&gt; 33. Eine aktuelle Studie von Kuizenga et al. ist der erste Einsatz von STmaps der Video aufgezeichnet Motilität Muster in ex vivo Segmente menschlichen Darm 42; Obwohl STmapping Ansätze zur Analyse von manometrischen (Druck) Aufnahmen im Menschen in vivo 3,44 angewandt. Die aufgezeichneten Motilitätsmuster in menschlichem Gewebe sind ähnlich jenen unter Verwendung ähnlicher Techniken und validiert die Ausdehnung dieses Ansatzes auf menschliche Gewebe bereits in Tiermodellen erfasst. Es ist bemerkenswert, dass diese Studie in Kombination STmaps von Videoaufnahmen mit der Messung der Muskelkontraktion durch Kraftaufnehmer erfasst abgeleitet. Messung der intraluminale Druck über ein Glasfaser manometrischen Katheter in die ex vivo-Segment eingefügt wurde, auch in eine stmap umgewandelt, welche die Vielseitigkeit der stmap mehr als Veränderungen Lumendurchmesser zu visualisieren. Dieser kombinierte Ansatz Korrelieren Muskelspannung, können intraluminale Druck und Wandbewegungfür eine tiefer gehende funktionelle Analyse der von der Videoaufzeichnung erzeugt STmaps. Studium der STmaps von Wandbewegungen und Veränderungen der Lumendurchmesser (auch dMAPS) generiert haben detaillierte Beschreibungen der Motilität Muster erlaubt, wie Vortriebs peristaltischen Wellen und lokalisierte segmentale Kontraktionen. Während diese Muster wurden von früheren experimentellen Methoden identifiziert, kann der derzeitige Ansatz eine verfeinerte Definition des lokalisierten Kontraktionsbewegungen wie Wellen und neuartige Anti peristaltischen Kontraktionen 9,24,25,30,31,42. Der Bau STmaps und Analyse von Veränderungen in der Motilität Muster haben, um Schlüsselfragen in der Magen-Darm-Motilität Darm und Dickdarm angewendet. Dazu gehören: die Differenzierung von neurogenen und myogenen Kontraktionen und Festlegung der Rolle der interstitiellen Cajal-Zellen 6,9,11,12,16,24,26,27,29 - 31,33,37 - 40,42, das Verständnis der komplexenWechselwirkungen zwischen den Ring- und Längsmuskelschichten 2,7,8,11,12,32,39,40, Prüfung der Auswirkungen der intraluminale Nährstoffe 10,18,19, mikrobielle Stämme 34 und Viskositäten 12,36 auf verschiedenen Motilität Muster, und Verstehen der Rolle verschiedener endogener und exogener neurohormonal Mittel pharmakologische Mittel 2,4 - 7,9,10,13 - 17,28,35,40 bei der Erzeugung und Modifizierung der Beweglichkeit. Die Zukunft dieser Technik beinhaltet Kopplung mit anderen Messungen, einschließlich Druck, Elektrophysiologie und Spannung / Kontraktilität. Jüngste Studien haben häufig ein oder mehrere dieser Messungen in Verbindung mit der Video-Aufzeichnung und Raum-Zeit-Mapping zusätzliche korrelative Details 2,42 bereitzustellen eingebaut. Darüber hinaus kann das System verwendet werden, um die Motilität in anderen rohrförmigen und nicht-röhrenförmigen Organen zu messen. Zum Beispiel haben Versuche, Messen Magenmotilität Verwendung gemachtein solches System, aber die Technik und Software benötigen Verfeinerung zur besseren Quantifizierung Motilität in einem solchen nicht-röhrenförmigen Organs 45. Es besteht kein Zweifel, dass die Verwendung von Raum-Zeit-Mapping-Techniken allein und in Kombination mit traditionellen Methoden der Analyse wird auf eine tiefergehende und umfassende Verständnis für die gastrointestinale Motilität in der Zukunft führen.

Verschiedene Verfahren zur Erfassung und Analyse Darmmotilität haben sich in den letzten 150 Jahren 1 entwickelt. Diese wurden von der anfänglichen lag in vivo Beobachtungen und Beschreibungen von William Beaumont und von Walter Cannon In den neueren Verfahren zur Messung und Interpretation der Multisite-Aufzeichnung der Muskelspannung, intraluminale Druck und / oder Membranpotential (dh Knoten-Potentiale) 2 - 6. Diese letzteren Ansätze eine Momentaufnahme des Gesamt Motilitätsmuster, sind jedoch durch die Anzahl der Stellen der Aufzeichnung und die Gültigkeit der Interpolation der Daten in Bereiche zwischen den Aufzeichnungs Sites beschränkt. Die jüngste Entwicklung der Videoaufzeichnung und räumlich-zeitliche Zuordnung (stmap) Techniken haben es möglich gemacht, zu beobachten und zu analysieren komplexe Motilität Muster in ex vivo ganze Segmente der Doppelpunkt und Darm. Erste Ansätze, zunächst für intes beschriebenDarm-Segmenten in der Ende der 1990er Jahre 7,8, auf den Forschern selbst entwickelten Software angewiesen, um Videoaufnahmen zu analysieren; haben nun mehrere Gruppen erzeugt oder modifiziert Software für diesen Zweck 2,8 - 12. Während viele Gruppen haben ihre eigenen Software-Pakete oder Plugins erzeugt werden, sie alle Durchmesser eines Gewebesegments zu analysieren und diese mit verschiedenen Durchmessern zu konvertieren Graustufendarstellung. Ein handelsübliches Aufzeichnung und Analyse-System namens der gastrointestinalen Motilität Überwachungssystem (GIMM) bietet eine schlüsselfertige Ansatz, der für die Analyse von sowohl propulsiven Motilität über fäkal Pellets Geschwindigkeitsbestimmung im Meerschweinchen distalen Kolon 13 sowie Analyse der treibenden und Misch Motilität Muster erlaubt mit einem Fluid Stimulus in intakten Darmabschnitten 4,5,14 - 19. Dieser letztere Ansatz ist abhängig von der Herstellung und Analyse von STmaps und wird in diesem Dokument beschrieben. Das Ziel dieses Verfahrens ist die Steigerung ter Fähigkeit, qualitativ und quantitativ zu analysieren verschiedene Motilität im Darm vorhanden Mustern. Während andere Gruppen haben die stmap für Motilität Analyse durch eigene Software verwendet wird, ist dies die erste Beschreibung, wie Sie die GIMM verwenden, um Motilität Muster, die durch Erzeugung von STmaps analysieren. In der vorliegenden Arbeit stellen wir ausführliche Schritt-für-Schritt-Anleitungen auf: die Herstellung von Darmgewebe für die Videoaufzeichnung, richtige Einstellung der Videoaufnahmeparameter an Fähigkeit, Veränderungen in der Gewebedurchmesser zu erfassen, die Schaffung von STmaps zu maximieren, sowie die Interpretation und Analyse der STmaps Verwendung des GIMM System und ImageJ Software. Das hier beschriebene Verfahren ist spezifisch für Analyse der luminalen Perfusion von Flüssigkeiten oder Halbfeststoffe enthaltende Verbindungen, die Darmmotilität Muster beeinflussen. Ein Verfahren zur Analyse von Stuhl Pellet Fortbewegung ist in einer Veröffentlichung von Mawe und Kollegen 13 beschrieben. Die hier beschriebene allgemeine Methode könntezu anderen Rohr glatten Muskulatur Organe wie angewendet: Dünndarm, Blutgefäße, Harnröhre, Harnleiter usw. Obwohl dieses Verfahren für sich allein keine Daten auf Druckänderungen oder die Muskelspannung bereitzustellen, könnte sie mit der Verwendung von Druck kuppelbar Wandler, Kraftaufnehmern oder elektrophysiologischen Messungen, um ein vollständigeres Bild der Motilität Muster wie einige andere Gruppen haben 2,15,20,21 gezeigt.

<table><tbody><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Fisher</td><td>BP358</td><td>Für Krebspuffer.</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid (KCl)</td><td>Fisher</td><td>BP366</td><td>Für Krebspuffer.</td></tr><tr><td>Kaliumphosphat (KH2PO4)</td><td>Fisher</td><td>P285</td><td>Für Krebspuffer.</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat (MgSO4)</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td>für Krebspuffer.</td></tr><tr><td>Calciumchlorid (CaCl2)</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td>für Krebspuffer.</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat (NaHCO3)</td><td>Fisher</td><td>BP328</td><td>Für Krebspuffer.</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td>Für Krebspuffer.</td></tr><tr><td>Carboxygen (95% O2/5% CO2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Präparierstifte</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Präparierschalen/-schalen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dunkin Hartley Meerschweinchen</td><td>Charles River</td><td>Stamm 051</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td> <td>Frei verfügbar.</td></tr><tr><td>Gastrointestinaler Motilitätsmonitor (GIMM)</td><td>Catamount Inc., St. Albans, Vermont</td><td></td><td>Enthält die unten aufgeführten Teile.</td></tr><tr><td>Peristaltische Pumpen</td><td></td><td></td><td>im Lieferumfang von GIMM enthalten.</td></tr><tr><td>Badkameras</td><td></td><td></td><td>im Lieferumfang von GIMM enthalten.</td></tr><tr><td>Bath TransIllumination Hintergrundbeleuchtung</td><td></td><td></td><td>im Lieferumfang von GIMM enthalten.</td></tr><tr><td>Orgelbäder</td><td></td><td></td><td>im Lieferumfang von GIMM enthalten.</td></tr><tr><td>Intensitätsregler</td><td></td><td></td> für die Hintergrundbeleuchtung <td>Im Lieferumfang von GIMM enthalten.</td></tr><tr><td>GIMM-Prozessor ImageJ Plugin</td><td></td><td></td><td>im Lieferumfang von GIMM enthalten.</td></tr><tr><td>Polyethylenschlauch</td><td></td><td></td><td>im Lieferumfang von GIMM enthalten.</td></tr><tr><td>Schlauchverbinder</td><td></td><td></td><td>Im Lieferumfang von GIMM enthalten.</td></tr><tr><td>Masterflex-Schläuche für Schlauchpumpen</td><td></td><td></td><td>Im Lieferumfang von GIMM enthalten.</td></tr><tr><td>Heizbad/Wasserzirkulation</td><td></td><td></td><td>im Lieferumfang von GIMM enthalten.</td></tr></tbody></table>

raum-zeit-mapping der motilität in<em&gt; ex vivo</em&gt; vorbereitung des darms

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Mehrere Ansätze wurden verwendet, zu erfassen und auszuwerten gastrointestinale Motilität, einschließlich: Aufzeichnen Veränderungen der Muskelspannung, intraluminale Druck und Membranpotential. Alle diese Ansätze stehen und Messung der Aktivität an einer oder mehreren Stellen längs des Darm gleichzeitig die dann interpretiert werden, um ein Gefühl der Gesamt Motilitätsmuster bereitzustellen. Vor kurzem hat die Entwicklung von Video-Aufzeichnungs- und Raum-Zeit-Mapping (stmap) Techniken haben es möglich gemacht, zu beobachten und zu analysieren, komplexe Muster in ex vivo ganze Segmente des Dickdarms und des Darms. Einmal erfasst und digitalisiert, kann Video-Aufzeichnungen STmaps in dem der Lumendurchmesser wird in Graustufen umgewandelt oder konvertiert werden color [genannte Durchmesser Karten (dMAPS)]. STmaps Daten auf Motilität Richtung (dh stationär, peristaltische, antiperistaltische), Geschwindigkeit, Dauer, Frequenz und Stärke der kontraktilen Motilitätsmuster bereitzustellen. Vorteile dieses Ansatzes sind: analysis Wechselwirkungen oder gleichzeitige Entwicklung verschiedener Motilitätsmuster in unterschiedlichen Bereichen desselben Segments, Visualisierung der Motilität Muster über die Zeit ändert, und Analyse der Aktivität in einem Bereich Einflüsse Aktivität in einer anderen Region. Videoaufnahmen können mit verschiedenen Zeitskalen und Analyseparameter wiedergegeben werden, so dass getrennte STmaps und Motilität Muster können im Detail analysiert werden. Dieses Protokoll spezifisch erläutert die Auswirkungen der intraluminalen Flüssigkeit Blähungen und intraluminale Reize, die Motilität Generation beeinflussen. Die Verwendung von luminalen Rezeptoragonisten und -antagonisten und Mechanismus Informationen über spezifische Muster eingeleitet werden und wie ein Muster in ein anderes Muster umgewandelt werden. Die Technik wird durch die Fähigkeit, messen nur die Veränderungen in der Motilität des Lumendurchmessers bewirkt, ohne dass die Daten intraluminale Druckänderungen oder die Muskelspannung, und durch die Erzeugung von Artefakten auf der Basis experimenteller Aufbau beschränkt; obwohl, analysis Verfahren können für diesen Fragen Rechnung zu tragen. Bei den bisherigen Techniken verglichen die Videoaufzeichnung und stmap Ansatz bietet ein umfassenderes Verständnis der gastrointestinalen Motilität.

Das Verständnis Spatiotemporal Maps (STmaps) als Durchmesser Maps (dMAPS) Während die durch diese Technik erzeugten Karten sind raumzeitlichen, Änderung des Lumendurchmessers des Gewebes ist der Parameter, auf den in den Abstand und die Zeit sichtbar gemacht. Die stmap schildert horizontalen Abstand entlang des Gewebesegments auf der x-Achse (in mm) und die Zeit auf der y-Achse (in sec) mit dem Startzeitpunkt an der Oberseite und Endzeit an der Unterseite. In der oberen rechten Ecke ist eine Legende, die minimalen und maximalen Lumendurchmesser zeigt, sowie die Skalierung sowohl für die x und y-Achse (Abbildungen 1-4). So unterschiedliche Pixel Schattierungen innerhalb des Graustufenbild entsprechen unterschiedlichen Lumendurchmesser. Dunklere Pixel entsprechen den größeren Durchmessern und heller Pixel entsprechen den kleineren Durchmessern. Somit wird Kontraktionswellen des Ringmuskel als Bereiche leichterer Pixelbildung aufgrund der Verringerung des Lumendurchmessers auf ( <strong&gt; 1 schwarze Pfeile). Im Gegensatz dazu wird luminal Distension durch kreis Muskelrelaxation oder eine große Fluidbolus zu einem Anstieg der Lumendurchmesser und dunkler Pixel in den stmap / DMAP (1C weiße Pfeile). Eine weitere Diskussion der Ausbildung und Bedeutung STmaps kann in einem Artikel von Lammers Gruppe 11. Luminal Distension-induzierten Kontraktionen Pflanzgut In Abbildung 1 wurde Meerschweinchen proximalen Kolon mit 0,5, 1,0, 1,5 und 2,0 ml Krebs-Puffer für 5 Minuten bei jeder Volumen aufgebläht. Vermehrungs Kontraktionen wurden von allen Volumes ≥1.0 ausgelöst ml und erscheinen als dünne weiße Bänder in der stmap (Abbildung 1). Ausdehnung der Darmlumen bewirkt die Einleitung von Vermehrungs Kontraktionen. Wie in 1 gezeigt, ist der Durchmesser des Lumens nimmt mit größer intraluminal Volumina und die Pixel in der stmapentsprechend diesem Durchmesser dunkler die Schaffung einer allgemeinen dunkleren Hintergrund. Auf einer bestimmten Ebene der Ausdehnung die peristaltische Reflex aktiviert (1,0 ml; 1), die Antriebswellen der Kontraktion bei der Mundende, die den Durchmesser des Lumens zu verringern und in Richtung auf die anale Ende des Segments initiiert (als weiße Banden gezeigten in den Figuren 1 und 4). Die weiße Bande, die Kontraktion wird oft durch ein dunkles Band, die den aboral Entspannung vor der peristaltischen Welle (1C weiße Pfeile) darstellt voraus. Diese weißen und dunklen Pixeln entsprechen dem aufsteigender und absteigender Kontraktion Entspannung Komponenten der peristaltische Reflex bzw. 22,23. Im stmap in 1 Tafel A gibt es 0 Antriebswellen bei 0,0 ml, 0 Antriebswellen bei 0,5 ml Blähungen, 3 Antriebswellen bei 1,0 ml Blähungen, 6 Antriebswellen bei 1,5 ml Blähungen, und 5 Antriebswellen eint 2,0 ml Blähungen. Nährstoff-induzierten Schreibwaren / Misch Kontraktionen Wellen ausbreite Kontraktion sind nicht das einzige Muster, das durch die Motilität STmaps visualisiert werden kann. Mischmustern Motilität wie Segmentierung kann auch in STmaps und dem entsprechenden Bild (2A) ersichtlich. Dieses Muster unterscheidet sich ausbreitenden Kontraktionen. Während des Mischens Muster vielen kleinen, stationären Kontraktionen in verschiedenen Bereichen gleichzeitig auftreten (sichtbar als mehrere kleine weiße Quadrate in der gleichen horizontalen Linie, aber nicht berühren). Während jede Segment Kontraktion stationär ist und nicht in der Mund bewegen Anal Weise wie zum Ausbreiten Kontraktionen beschrieben, wird die Fähigkeit der STmaps komplexe Kontraktionsmuster über lange Zeiträume veranschau ermöglicht die Visualisierung des langsamen Fortschreiten der Wehen anally über die Zeit (2A schwarzer Pfeil). Die Dauerjeder einzelne Kontraktion kann auch durch Ziehen einer vertikalen Linie durch den weißen Kontraktion Quadrat mit ImageJ und der zugehörigen Plugin (2A) bestimmt werden. In diesem speziellen stmap von intra-Kolon-Perfusion von kurzkettigen Fettsäuren erzeugt wird, ist die durchschnittliche stationäre Kontraktionsdauer ~ 2 sec (Bereich: 1,9 bis 2,1 s). Aber dennoch auf einem Gewebesegment Mesenterium können Artefakte in der Analyse verursacht, kann die vertikale Linie Artefakte Mesenterium (1B, 2B) erzeugt zur Längsmuskelbewegungen zu bestimmen. In den 1B und 2B die horizontale Bewegung der schwarze vertikale Linie ist aufgrund von Kontraktion und Entspannung der Längsmuskulatur. Diese seitliche Bewegung der Längsmuskel auf STmaps horizontale Bewegungen der senkrechten Streifen durch Mesenterium Artefakte erzeugt (Figuren 1B, 2B) visualisiert werden. ImageJ und Plugin Analyse von STmaps Sowohl die Geschwindigkeit eines sich ausbreitenden Welle (3) sowie die Dauer der Kontraktion (Figur 2) kann durch die Verwendung ImageJ und GIMMProcessor Plugin bestimmt werden. In 3 wird die Ausbreitungsgeschwindigkeit der beiden ortho und retrograde Wellen betrug etwa 0,25 mm / sec (Bereich: 0,21 bis 0,35 mm / sec). Wie in dem Videobild oberhalb des ST Karte gesehen werden kann, wurden die Analyseleitungen (rote Linien, die ein Feld auf dem Videobild) präzise um einen Rand der Gewebesegment statt um das gesamte Segment eingestellt. Dies ist eine wichtige Anwendung der Richtlinien in der Software. Genaue Einstellung dieser Richtlinien ist entscheidend für die korrekte Analyse des Videos in der Diskussion Schnitt wie weiter analysiert. Dies ermöglicht die Erzeugung eines stmap die myogenen Welligkeit Kontraktionen 24 visualisiert. Diese Kontraktionen sind myogenen Ursprungs und nicht Lumendurchmesser erheblich ändern. Auch verschiedene dirÜberlegungen der Fortpflanzung (orthograde oder retrograde), die gemeinsam für die Wellen sind, können mit dieser Technik (Abbildung 3) untersucht werden. Wie in Figur 2 dargestellt die Dauer der Kontraktion in den verschiedenen Regionen des Gewebesegments variieren. Die richtige Analyse von STmaps Ein mögliches Problem mit der Schaffung von STmaps möglich Artefakterzeugung aufgrund der experimentellen Methodologie. Zum Beispiel wird Mesenterium links auf der Außenseite des Gewebes der Durchmesser Lesen für das Segment des Gewebes schaffen eine vertikale schwarze Linie auf dem stmap (Figuren 1, 2B) zu erhöhen. Das Vorhandensein Mesenterium auch künstlich verbreitert den Graustufenkarte durch Erhöhung der breiteste luminale Messung, die in einer Abstumpfung der Kontrastmessung der Waage führt. Aus diesem Grund ist es am besten, das Mesenterium möglichst vollständig aus dem Segment ohne Perforieren des Gewebes zu entfernen. Ein<html> andere mögliche stmap Artefakt ist eine weiße vertikale Linie aufgrund von Blasen innerhalb der Lumenflüssigkeit, die nicht auf schwarz (4B) gegenübergestellt werden können. Diese Blasen können machen das Lumendurchmesser kleiner ist, um die Analyse-Software angezeigt oder überlagern weiße / helle Bereiche auf die Motilität Muster in der stmap. Daher Setup des Gewebesegments und richtige Kontrastierung der Videoaufzeichnung vor der Analyse sind absolut entscheidend für den Erfolg bei der Konstruktion STmaps (Abbildung 4). Und unzulässige kontrasAufbauten sind in Abbildung 4 dargestellt. Es ist zu beachten, dass Videoeinstellung sowohl in den Vorversuch Kamerakalibrierung und post-Experiment Analysefenster sind entscheidend für die richtige stmap Erzeugung und Analyse. Unsachgemäße Bildkalibrierung kann STmaps mit unbrauchbaren Daten (4A) zu führen. 700 &quot;/&gt; Abbildung 1. ausbreitenden Wellen im proximalen Kolon. (A) eine Dehnung-Antwort-Kurve (in Meerschweinchen proximalen Kolon durchgeführt) verwendet wurde, um die entsprechende intraluminale Flüssigkeitsvolumen zu bestimmen, um zu initiieren ausbreitende Wellen in diesem Bereich (weiß Querbänder). Schwarze Pfeile zeigen Beispiele von Volllängen-ausbreitenden Wellen. Weiße Pfeile veranschaulichen die Linie Artefakt durch unvollständige Mesenterium Entfernung verursacht. (B) Ein genauerer Blick auf Vermehrungs Kontraktionen durch stmap Erzeugung aus einem ähnlichen Versuch wie Panel A erreicht, aber ein Video von kürzerer Dauer. Es ist einfacher, beachten Sie, dass die Wehen Fortschritte in der Mund anal Richtung und um die vorangehenden aboralen Entspannung als dunkler Bereich vor dem weißen Band im Vergleich zum Panel A. Diese Karte bietet auch einen anderen Blick auf Mesenterium Artefakte dargestellt identifizieren. Die roten Feld identifiziert die Umgebung von diesem stmap Panel-C (C) erweitert Dieses Panel zeigt eine noch engere Ansicht of die gleiche Video- und Karte, wie in Feld B Weiße Pfeile &#39;flüssig Distension&#39; Punkt, um dunkle Bildpunkte, die aufgrund der Ausdehnung durch Flüssigkeits aboralen auf die sich ausbreitende Welle luminalen sind beschriftet. Dies sind Bereiche, in denen kreisförmigen Muskelentspannung auftritt aboralen um kreisförmige Muskelkontraktion. Beachten Sie, dass die Vermehrungs Kontraktionen sehen aus wie ganz horizontalen Linien in Panel A aufgrund der langen Zeitskala der Karte. In Platten B und C der Zeitskalen sind immer kürzer, so dass die Kontraktionswelle hat eine Steigung, die gemessen und als die Geschwindigkeit der Wellenbewegung gemeldet werden können. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53263/53263fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53263/53263fig2highres.jpg" width="700" /> Abbildung 2. Bestimmung der Kontraktion Dauer von stmap. (A) Meerschweinchen proximalen Kolon shOWS einer Misch- / segmentale Beweglichkeit Muster in Reaktion auf intraluminale Perfusion kurzkettige Fettsäure (Butyrat). Vertikalen roten Linien haben durch die Zeiten der Schrumpfung gezeichnet sind Kontraktion Dauer zu bestimmen mit Hilfe von Image J und die GIMMProcessor Plugin. Der schwarze Pfeil zeigt die aboral Ausbreitungsrichtung der stationären Kontraktionen. (B) Vermehren Kontraktionen in Maus Ileum zeigen oft Regionen anhaltende Kontraktion. Vertikalen Pfeile an dieser Stelle zeigen, dass mehr Mundregionen blieb für eine längere Dauer gezogen gezeichnet. In dieser Zubereitung wurde die anal Ende der Herstellung geschlossen wird, um Flüssigkeit vom Verlassen des geschlossenen Systems bei der Gewebekontraktionen verhindern. Das Bild an der Spitze der Platte zeigt eine Zeit, in der gesamten Mundende des Gewebes zusammengezogen wird (weiß auf stmap), während die gesamte anal Ende durch Fluid (schwarz auf stmap) ausgedehnt. Die horizontale / seitliche Bewegung der vertikalen schwarzen in der Mitte der Tafel B zeigt stmap Bewegung desLängsmuskelschicht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53263/53263fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53263/53263fig3highres.jpg" width="400" /> Abbildung 3. Bidirektionale Motilität Muster. Ausbreitende Wellen können sowohl ortho (oral anal) und retrograde (anal mündliche) Richtungen zu bewegen. Feste schwarze Pfeile zeigen normale ortho Ausbreitung und die gestrichelte schwarze Pfeile zeigen retrograde Ausbreitung. Die Ausbreitungsgeschwindigkeit der beiden ortho und retrograde Kontraktionen in diesem stmap wurden durch ImageJ Analyse bestimmt und waren ~ 0,25 mm / sek. Bildanalyselinien (rote Linien bilden ein Feld auf dem Videobild über dem stmap) wurden in der Nähe einer Kante des Gewebes eingestellt myogenen Welligkeit Kontraktionen, die geringer Amplitude sind, flache Kontraktionen häufig orthoorientiert zu visualisieren, retrograde, oder beide Richtungen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53263/53263fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53263/53263fig4highres.jpg" width="700" /> Abbildung 4. Bedeutung der richtigen Kontrast für stmap Generationen. (A) zeigt eine fehlerhaft gegen Bild und stmap, während Tafel B zeigt ein korrekt gegen Bild und stmap. In (A) die horizontalen weißen Streifen von der mit optimalem Kontrast Bild (B) erzeugt werden, sind nicht so offensichtlich, und es gibt mehrere Artefakte (White-Shading) aufgrund der erstmaligen Bildes in Graustufen. In der von der mit optimalem Kontrast Bild (B) erzeugt stmap die White-Shading-Artefakte der Graustufen verschwinden und die sich ausbreitenden Wellen sind stärker ausgeprägt. Auch die Black-Shading, die Entspannung ahead der sich ausbreitenden Kontraktionswelle kann in der analen Ende des stmap mit jeder Welle der Kontraktion zu sehen. In Tafel B Die weißen Pfeile zeigen eine stmap Artefakt durch eine Region des Bildes, die nicht richtig gegenübergestellt werden konnte erzeugt werden. Diese Art von Artefakt ist hauptsächlich auf intraluminale Luftblasen, die gelegentlich bei der Herstellung im Laufe der Versuchsprotokoll auftreten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53263/53263fig4highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Kürzlich verfügbare Videoaufzeichnungs- und STmap-Techniken (spatiotemporal mapping) ermöglichen es, sowohl Fortpflanzungs- als auch Mischmuster der Darmmotilität zu visualisieren und zu quantifizieren. Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Generierung und Analyse von STmaps mit Hilfe des GastroIntestinal Motility Monitoring (GIMM) Systems zu erklären.

Raum-Zeit-Mapping der Motilität in<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Vorbereitung des Darms

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, ...

Die allgemeinen Ziele bei der Erstellung einer umfassenden räumlich-zeitlichen Karte von ex vivo-Darmgeweben bestehen darin, die Reaktion auf luminalen Inhalt zu untersuchen, indem die detaillierte Bewegung der Darmwand über einen gesamten Segmentabschnitt hinweg beobachtet wird. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass Aktivitäten in verschiedenen Regionen desselben Gewebesegments räumlich und zeitlich erfasst und verglichen werden können, wodurch komplexe Motilitätsmuster identifiziert werden können, anstatt lediglich einfache Kontraktionen oder Relaxationen. Obwohl diese Methode Einblicke in die normale Darmmotilität ermöglicht, kann sie auch zur Identifizierung der Wirkungen verschiedener Arzneimittel und intraluminaler Substanzen wie Nährstoffe oder Motilitätsmuster eingesetzt werden.Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da räumlich-zeitliche Karten anfangs schwer zu interpretieren sein können. Mit der Zeit kann man jedoch komplexe Muster auf einen Blick erkennen. Beginnen Sie damit, den Darm oder das Intestinum von einem euthanasierten Meerschweinchen zu entfernen.Fixieren Sie es in warmer Krebs-Lösung. Entfernen Sie im Dissektionsbehälter sämtliche intraluminale Inhalte, indem Sie vorsichtig Krebs-Puffer durch das Lumen perfundieren. Verwenden Sie dazu eine Spritze mit einem stumpfen Katheter und vermeiden Sie eine übermäßige Dehnung des Kolonabschnitts während der Perfusion.Befestigen Sie anschließend zwei drei Millimeter lange Stücke aus Polyethylenschläuchen an zwei glasgeglühten Glaskathetern mit einem Durchmesser von drei Millimetern. Führen Sie in einer beheizten Präparationswanne einen Katheter in das orale Ende der Gewebeprobe ein und binden Sie eine Naht hinter dem kleinen Schlauckstück, wobei Sie den Katheter mit einem Chirurgenknoten umschließen. Versuchen Sie vorsichtig, den Katheter wieder herauszuziehen, um sicherzustellen, dass der Knoten fest sitzt.Das kleine Stück Polyethylen-Schlauch verhindert ein Verrutschen der Naht. Wiederholen Sie diesen Vorgang unter Verwendung des anderen Katheters am aboralen Ende des Gewebes. Entfernen Sie anschließend das Mesenterium aus der Gewebeprobe. Wenn beide Katheter befestigt sind, überführen Sie das Präparat vom Präparierrand in eines der GIMM-Organbäder und positionieren Sie das Gewebe so, dass das orale Ende vom Benutzer wegzeigt. Befestigen Sie anschließend die Glasröhrenkatheter mit Modelliermasse am Organbad, indem Sie das Ende der Glasröhre an der Seite des Bades befestigen, oder verwenden Sie Kunststoffklammern, um die Katheter an den über dem Bad befindlichen Stangen zu befestigen, die zur Fixierung der Kameras dienen. Bringen Sie nun an jedes offene Ende der Katheter ein fünf Zentimeter langes Stück Schlauch an.Verbinden Sie für den oralen Katheter das kurze Schlauchstück mit einem längeren Schlauchstück, das über eine Luer-Lock-Verbindung verfügt. Anschließend verbinden Sie die Fünf-Milliliter-Spritze mit dem Luer-Lock-Anschluss. Damit wird Puffer in die Gewebeprobe injiziert.Verwenden Sie für den aboralen Katheter das Schlauchsystem, um den luminalen Ausfluss in einen Sammelbehälter zu leiten. Spülen Sie nun das Gewebe mit der angebrachten Spritze langsam mit erwärmtem Krebs-Puffer durch, um einen guten Durchfluss sicherzustellen, wie er anhand der Flüssigkeitsabgabe am aboralen Katheter erkennbar ist. Kalibrieren Sie anschließend das Videoaufnahmesystem, während das Gewebe 30 Minuten lang equilibriert.Kalibrieren Sie die Kamerahöhe, die Videoeinstellungen für Helligkeit und Kontrast sowie die horizontale Distanz mithilfe der GIMM-Software. Klicken Sie auf den Experiment-Tab für die zu kalibrierende Kamera. Anschließend im Menü „Datei“ auf „Kalibrieren“ klicken.Sobald das Video im Kalibrierarbeitsplatzfenster erscheint, stellen Sie die Kamerahöhe so ein, dass das Bild die Enden der in das kolonale Lumen eingeführten Katheter erfasst. Kalibrieren Sie dann die auf dem Bildschirm sichtbare horizontale Distanz mithilfe des durchsichtigen Lineal-Aufklebers, der an jedem Bad befestigt ist. Stellen Sie im selben Kalibrierarbeitsplatzfenster die roten vertikalen Hilfslinien so ein, dass sie 10 Millimeter voneinander entfernt sind.Dann geben Sie diesen Abstand in das Eingabefeld des Abstandscursors ein und klicken Sie auf die Schaltfläche „Cal“. Als Nächstes stellen Sie die Regler für Verstärkung, Helligkeit und Verschlusszeit im Kalibrierungsarbeitsplatzfenster so ein, dass das Gewebestück als dunkle Silhouette vor hellem Hintergrund erscheint. Danach justieren Sie Fokus- und Blendenregler direkt an der Kamera, um das Bild weiter zu verbessern.Um die Bildkalibrierung abzuschließen, klicken Sie auf „Speichern“ und anschließend im Popup-Fenster auf „Ja“. Klicken Sie abschließend auf „Beenden“. Nach der halbstündigen Equilibrierungsphase beginnen Sie das Experiment.Beginnen Sie mit der Benennung des Versuchsdurchlaufs. Danach verschließen Sie das Lumen des Schlauchs, der aus dem aboralen Katheter austritt, mit der Kunststoffklemme. Anschließend injizieren Sie etwa 7 Milliliter Krebs-Puffer in das proximale kolonale Lumen.Das Ziel besteht darin, eine ausreichende Dehnung zu erzeugen, um propulsive Kontraktionen auszulösen. Sobald das Segment durch das luminalen Fluid gedehnt ist, beginnen Sie mit der Videoaufnahme. Doppelklicken Sie in der Software auf den benannten Versuch, um die experimentelle Kameraperspektive zu öffnen, und klicken Sie dann auf den Schalter, um ihn einzuschalten, um das Kamerabild zu sehen.Sammeln Sie eine vorbestimmte Länge an Videodaten. Lösen oder entfernen Sie am Ende dieses initialen kontrollierten Dehnungstests die Klemme, um dem Gewebestück zu ermöglichen, die Dehnungsflüssigkeit aus dem Lumen herauszutreiben. Lassen Sie das Gewebe 10 bis 20 Minuten lang re-äquilibrrieren und wiederholen Sie dann das Verfahren unter Verwendung der Behandlung.Eine einzelne Gewebepräparation kann bis zu fünf 10-minütigen Behandlungen mit den geeigneten Ruhephasen zwischen den Tests unterzogen werden. Achten Sie auf Schleimhautabschilferung, die auf eine Gewebedegeneration hinweist. Um die Aufzeichnung zu analysieren, doppelklicken Sie auf den Namen eines bestimmten Versuchs, um das Analysefenster zur Erstellung einer ST-Karte zu öffnen.Passen Sie im Bereich der Videowiedergabe die Kontrast- und Helligkeitsregler so an, dass das Bild für die Analyse geeignet ist. Erstellen Sie eine schwarze Gewebesilhouette auf hellem Hintergrund. Legen Sie anschließend die horizontalen und vertikalen roten Hilfslinien im Videobildfenster fest, um den für die Analyse relevanten Gewebebereich abzugrenzen und Bereiche mit Artefakten auszuschließen.Stellen Sie dann die Zeit für die Analyse ein. Klicken Sie auf die grüne A-Schaltfläche, um den Startpunkt auszuwählen, und klicken Sie auf die gelbe B-Schaltfläche, um den Endpunkt festzulegen, wenn sich der Zeitschieberegler in der richtigen Position befindet. Wählen Sie anschließend die Registerkarte Motoranalyse, um das ST-Kartenfenster zu öffnen, und klicken Sie dann auf die Stoppuhr-Schaltfläche.Beginnen Sie die Erstellung der ST-Karte, indem Sie mit dem Fadenkreuz-Cursor innerhalb der schwarzen Silhouette des Gewebes klicken. Die Erstellung der Karte kann einige Minuten dauern. Nachdem die ST-Karte erstellt wurde, wählen Sie die Vergrößerungsfunktion, um das Bild zu vergrößern.Dann wählen Sie die Farboption, um das Bild in Farbe anstelle von Graustufen anzuzeigen. Als Nächstes aktivieren Sie die Funktion, damit der Cursor verwendet werden kann, um das Pixel für die Analyse auszuwählen. Für das Gewebe, das mit den ausgewählten Pixeln assoziiert ist, wird die Änderung des luminalen Durchmessers über die Zeit analysiert und als Korn-Durchmesser-Verlauf rechts neben der ST-Karte dargestellt.Nach Abschluss der Analysen wählen Sie „Exit“. Exportieren Sie nun die ST-Karte für andere Zwecke, indem Sie nacheinander „File“ und dann „Export Data“ sowie anschließend „Metafile“ auswählen. Geben Sie einen Dateinamen ein und speichern Sie die Datei als emf-Datei, indem Sie auf „Save“ klicken.Die mit dieser Methode erzeugten Karten zeigen Änderungen des luminalen Durchmessers des Gewebes sowohl über die Distanz als auch über die Zeit an. Die horizontale Distanz befindet sich auf der X-Achse, die Zeit auf der Y-Achse, wobei die Startzeit oben und die Endzeit unten angezeigt wird. In der oberen rechten Ecke befindet sich eine Legende, die die minimalen und maximalen luminalen Durchmesser sowie die Skalierung für die X- und die Y-Achse anzeigt.Daher entsprechen unterschiedliche Graustufen innerhalb des Graustufenbilds unterschiedlichen luminalen Durchmessern. Dunklere Pixel entsprechen größeren Durchmessern, und hellere Pixel entsprechen kleineren Durchmessern. Kontraktile Wellen des Ringmuskels erscheinen als Bereiche hellerer Pixelung aufgrund der Verringerung des luminalen Durchmessers.Im Gegensatz dazu wird eine luminal bedingte Dehnung aufgrund einer Relaxation des Ringmuskels oder eines großen Flüssigkeitsbolus durch dunklere Pixel dargestellt. Neben kontrahierenden Wellen, die sich fortpflanzen, kann auch das als Segmentierung bezeichnete Mischbewegungsmuster sichtbar gemacht werden. Kleine stationäre Kontraktionen treten gleichzeitig in verschiedenen Bereichen auf.Im Laufe der Zeit bewegen sich diese kleinen Kontraktionen in Richtung des aboralen Anals. Reste des Mesenteriums im Gewebe können Artefakte verursachen, die als dunkle vertikale Linien erscheinen. Die horizontale Bewegung dieser artefaktbedingten vertikalen Linien kann verwendet werden, um den Zeitpunkt der longitudinalen Muskelbewegung zu bestimmen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Darmsegmente für die Videobearbeitung vorbereitet und anschließend die Darstellung der Darmmotilität als räumlich-zeitliche Karten erzeugt. Mithilfe dieses Verfahrens können verschiedene Nährstoffe der Luminalösung hinzugefügt werden, um zu bestimmen, wie natürliche Bestandteile spezifische Motilitätsmuster hervorrufen, um Verdauung und Resorption zu unterstützen. Die Verwendung spezifischer pharmakologischer Agonisten oder Antagonisten von Rezeptoren für neuronale humoralen Substanzen kann dazu dienen, die Mechanismen aufzuklären, durch die die Motilität ausgelöst und weitergeleitet wird.Diese Technik könnte dazu beitragen, Daten zu erzeugen, die für die Bestimmung von Verbindungen nützlich sind, die bei der Behandlung von Motilitätsstörungen eingesetzt werden können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Echtzeit-Imaging von myeloischen Zellen in Dynamics Apc Min / + Darmtumoren durch Spinning-Disk-konfokale Mikroskopie

Das enterische Nervensystem (ENS) ist ein Netzwerk von Neuronen und Gliazellen in der Darmwand, das die Darmreflexe steuert. Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur Aufzeichnung der Aktivität von enterischen Neuronen und Gliazellen in Lebendpräparaten von ENS unter Verwendung von Ca2+-Bildgebung.

In Situ Ca 2+ Imaging des enterischen Nervensystems

Dieser Artikel beschreibt eine Videobildgebungstechnik und hochauflösende raumzeitliche Kartierung, um Veränderungen in der neuronalen Regulation der Dickdarmmotilität bei erwachsenen Mäusen zu identifizieren. Subtile Auswirkungen auf die gastrointestinale Funktion (GI) können mit diesem Ansatz in isolierten Gewebepräparaten nachgewiesen werden, um unser Verständnis von GI-Erkrankungen zu verbessern.

Video Imaging und Raum-Zeit-Karten zur Analyse Gastrointestinale Motilität bei Mäusen

Die transparente C. Elegans Darm kann als eine"in-Vivo Gewebe Kammer" für das Studium Apicobasal Membran und Lumen Biogenese einzellige und subzellulärer Ebene bei mehrzelligen Tubulogenesis dienen. Dieses Protokoll beschreibt die Standardbeschriftung kombinieren, Verlust der Funktion genetische/RNAi und mikroskopische Ansätze, diese Prozesse auf molekularer Ebene zu zergliedern.

C. Elegans Darm als ein Modell für die interzelluläre Lumen Morphogenese und In Vivo polarisiert Membrane Biogenesis Ebene der einzelligen: Kennzeichnung durch Antikörper Färbung, RNAi Verlustfunktion Analyse und Bildgebung

Wir beschreiben eine Methode zur Visualisierung von GFP-markierten IELs mit intravitaler Bildgebung des murinen Dünndarms durch invertierte Konfokalmikroskopie der Spinnscheibe. Diese Technik ermöglicht die Verfolgung von lebenden Zellen innerhalb der Schleimhaut für bis zu 4 h und kann verwendet werden, um eine Vielzahl von darmen immun-epitheliale Wechselwirkungen zu untersuchen.

Intravitale Bildgebung von intraepitheliale Lymphozyten im murinen Dünndarm

Unter Ausnutzung der intravitalen Mikroskopie ermöglicht die hier vorgestellte Methode die Echtzeit-Visualisierung des Darmepithelzellvergießens bei lebenden Tieren. Daher wird topisch gefärbte Darmschleimhaut (Acriflavine und RhodamineB-Dextran) von anästhesierten Mäusen bis zur einzelzelligen Auflösung mittels konfokaler Mikroskopie abgebildet.

Ein intravitaler, auf Mikroskopie basierender Ansatz zur Bewertung der Darmdurchlässigkeit und der Epithelzellvergießen-Performance

Um zu untersuchen, wie der Dünndarm mit Partikeln unterschiedlicher Größe umgeht, haben wir eine etablierte in vivo-Methode zur Bestimmung des Dünndarmtransits modifiziert.

Untersuchung der Mechanosensorik von luminalen Partikeln im murinen Dünndarm

Erfahren Sie die räumlich-zeitliche Kartierung der Darmmotilität mit dem GIMM-System an ex vivo Meerschweinchen-Darmpräparaten. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung komplexer Kontraktionsmuster für pharmakologische Studien.

Raum-Zeit-Mapping der Motilität in

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