Epithelialen Zellwiederbevölkerung und Herstellung von Nagetier extrazellulären Matrix Scaffolds für Nierengewebe Entwicklung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, azelluläre dreidimensionale Nagetier-Nieren-extrazelluläre Matrix-Gerüste mit menschlichen Nierenepithelzellen neu zu besiedeln. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Rattenniere mit einer Reihe von Detergenzlösungen, die über einen Zeitraum von 26 Stunden durch die Nierenarterie perfundiert werden, dezellularisiert wird. Die Niere wird dann sterilisiert und die azellulären extrazellulären Nierenmatrix-Gerüste werden mit 40 Millionen menschlichen Nierenrinden-tubulären Epithelzellen oder RCTE-Zellen unter kontinuierlicher antegrader arterieller Perfusion in einem speziell entwickelten Biore-Reaktorsystem injiziert.

Letztendlich kann die Fähigkeit der RCTE-Zellen, das Nierengerüst wieder zu besiedeln, durch ER- und Perfusionsassays sowie immunhistochemische Analysen beurteilt werden. Diese 3D-Zellkulturtechnik ermöglicht es den Forschern, die extrazelluläre Matrix des gesamten Organs wieder zu besiedeln. Gerüstzellen werden im peritubulären Raum innerhalb der extrazellulären Matrix abgelagert, um die Untersuchung und Bindung von Faktoren zu ermöglichen, die das Zellwachstum, die Differenzierung und die Reifung beeinflussen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber alternativen Methoden wie der Herstellung von synthetischen Polymergerüsten besteht darin, dass die renale extrazelluläre Matrix die Adhäsion, Proliferation und Reifung der perfundierten Zellen innerhalb eines komplizierten Netzwerks aus natürlichen Strukturproteinen, Wachstumsfaktoren und anderen biologischen Komponenten erleichtert. Beginnen Sie den Dezellularisierungsvorgang, indem Sie den Nierenarterienkatheter jeder aufgetauten Niere an das Ende des Perfusionsschlauchs hinter der Pumpe anschließen, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen im Katheter eingeschlossen sind. Wenn Luftblasen im Katheter vorhanden sind, verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Mikropipette, um die Blasen herauszuziehen und den Katheter mit Flüssigkeit zu füllen.

Hängen Sie die Niere an der Innenwand eines leeren Fünf-Liter-Bechers auf, so dass die Nierenarterie nicht geknickt oder gewickelt ist, und stellen Sie den Pumpenantrieb auf fünf Milliliter pro Minute ein. Drücken Sie dann auf Start, nachdem Sie bestätigt haben, dass jede Niere perfundiert ist, indem Sie das Tropfen von Lösungen aus der Unterseite des Organs plus jede Niere mit den entsprechenden Lösungen beobachten, wie im Flussdiagramm am Ende der Perfusion angegeben. Lagern Sie die dezellularisierten Nieren in PBS in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen bei vier Grad Celsius oder maximal zwei. Nachdem wir den Perfusionskreislauf zusammengebaut haben, entfernen wir den roten Schraubverschluss am Bioreaktorkopf und pipettieren 50 Milliliter einer 0,1%igen Essigsäure- und 4%Ethanollösung durch die Öffnung in das Mediumreservoir.

Verbinden Sie mit einer großen Pumpenkartusche das Schlauchsegment der peristaltischen Pumpe mit dem Pumpenkopf. Stellen Sie dann die Durchflussmenge auf fünf Milliliter pro Minute ein. Drücken Sie auf Start und lassen Sie den Kreislauf anfüllen, wenn die Flüssigkeit die Profusionsleitung füllt und den verbleibenden offenen Anschluss des Dreiwege-Stopphahns erreicht.

Verwenden Sie einen männlichen Köderstecker, um den Port zu verschließen. Lassen Sie den Kreislauf vollständig ansaugen, bis keine Luft mehr in den Rohren des Perfusionskreislaufs oder an der Innenseite des Einlasses zu sehen ist. Der Lockakzeptor stößt Blasen aus dem Perfusionskreislauf aus, indem er die Fördermenge der Pumpe vorübergehend erhöht.

Wenn das System vollständig angesaugt ist, stoppen Sie den Pumpenantrieb und sterilisieren Sie eine Sechs-Zoll-Pinzette. Um das weibliche Köderende des Nierenarterienkatheters vorsichtig in den männlichen Einlass zu stecken, legen Sie den Köderakzeptor auf die Innenfläche des Bioreaktorkopfes und stellen Sie sicher, dass die Verbindung fest ist und keine Luft im Katheter verbleibt. Lassen Sie die Niere sanft am Katheter der Nierenarterie hängen, damit sich die Nierenarterie nicht verdreht oder knickt.

Ziehen Sie dann die metallische Klemme, die den Bioreaktorkopf und den Bioreaktorkörper zusammenhält, so fest, dass das Bioreaktorreservoir fest verschlossen ist, und schließen Sie den Schraubverschluss. Sterilisieren Sie nun die Nieren mit einer raumwarmen Perfusion der Perfusion der Essigsäure-Ethanollösung bei fünf Millilitern pro Minute. Stoppen Sie nach einer Stunde die Pumpe und öffnen Sie den roten Schraubverschluss.

Mit einem sterilen Schädling saugt Ihre Pipette vorsichtig die gesamte Lösung aus dem Bioreaktorreservoir ab. Pipettieren Sie dann 50 Milliliter frisches PBS in das Bioreaktorreservoir. Schließen Sie den Schraubverschluss und starten Sie die Pumpe für drei aufeinanderfolgende einstündige Perfusionen bei Raumtemperatur bei fünf Millilitern pro Minute.

Nach der letzten PBS-Spülung saugen Sie die Kochsalzlösung aus dem Reservoir an und geben Sie 50 Milliliter Medium mit geschlossenem Schraubverschluss in das Reservoir. Überführen Sie den Bioreaktor mit dem angeschlossenen Perfusionskreislauf in einen Inkubator mit großer Kapazität bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Schließen Sie dann den Perfusionskreislauf des Bioreaktors an die Pumpe an und perfundieren Sie die Nieren mindestens eine Stunde lang vor der Aussaat mit vier Millilitern pro Minute.

Zur Zellularisierung sammeln die Nieren eine ausreichende Anzahl von Kulturflaschen für die gewünschte Sitzkonzentration. Nachdem das Kulturmedium aus jedem Kolben aspiriert worden ist, werden 10 Milliliter des entsprechenden zelldissoziierenden Enzyms verwendet, um die röhrenförmigen Epithelzellen der Nierenrinde bei 37 Grad Celsius aus dem Kolben zu heben. Beginnen Sie nach 10 Minuten mit der Überprüfung der Kolben an einem Gesichtskontrastmikroskop, bis eine Faltenablösung beobachtet wird.

Nachdem Sie ein kleines Aliquot von Zellen für die Zählung entnommen haben, verdünnen Sie die zugehörige Zellsuspension in einem gleichen Volumen Premed-Medium und zentrifugieren Sie die Wiederbelebung der Zellen. Das Pellet wird mit einem geeigneten Volumen des Kulturmediums suspendiert, um eine Endkonzentration von zweimal 10 bis 10 Zellen pro Milliliter zu erhalten. Übertragen Sie zwei Milliliter der Sitzaufhängung, eine 35-Millimeter-Kulturschale, und ziehen Sie dann die zwei Milliliter Volumen in eine sterile Fünf-Milliliter-Spritze.

Bringen Sie den Perfusionsbioreaktor in eine biologische Sicherheitswerkbank und drehen Sie das Absperrhahnventil, um den Durchfluss zur Sitzöffnung zu schließen. Entfernen Sie den männlichen Köderschlupf, stopfen Sie ihn vom Absperrhahn ab und schließen Sie die Spritze an. Übertragen Sie dann den Perfusionskreislauf schnell zurück in den Inkubator und befestigen Sie mit der großen Pumpenkartusche das Schlauchsegment der peristaltischen Pumpe am Pumpenkopf, um die Zellen zu setzen.

Schließen Sie den Absperrhahn-Ventilanschluss, der zur Pumpe zeigt, und injizieren Sie die Zellen langsam in das Nierengerüst. Drehen Sie dann das Absperrventil, um den Durchfluss aus der Spritze zu schließen, und starten Sie die Pumpe mit 25 Millilitern pro Minute. Senken Sie die Fördermenge der Pumpe nach 15 Minuten auf vier Milliliter pro Minute und wechseln Sie das Medium am nächsten Tag und danach alle zwei Tage.

Um die Lebensfähigkeit und Proliferation der Zellen zu beurteilen, tauschen Sie das Kulturmedium mit 10 Millilitern Zarin-Arbeitslösung aseptisch gegen eine Perfusion der Nierengerüste mit vier Millilitern pro Minute nach genau einer Stunde aus, sammeln Sie die konditionierte und teilweise reduzierte Zarinlösung und führen Sie eine weitere Perfusion von vier Millilitern pro Minute durch. Mit 100 Millilitern frischer Kultur wurden mittlere Nieren, die nacheinander mit Wasser und verdünnten Detergenzienlösungen überschwemmt wurden, über einen Zeitraum von 26 Stunden durch die abschließende Detergenzperfusion allmählich transparenter, das Gefäßnetzwerk der Nieren und insbesondere die Interlobergefäße werden im dezellularisierten Gerüst deutlich sichtbar. Das gesamte Organ wird von nativen Zellen befreit, wobei das intakte Basalmembrannetzwerk aus Glomeruli-Tubuli und Sammelkanälen sowie die extrazelluläre Matrix der dezellularisierten Blutgefäße zurückbleiben.

Neben den größeren Gefäßen behalten auch die mikrovaskulären Basalmembranen innerhalb der Glomeruli ihre strukturelle Integrität. RCTE-Zellen, die in das Nierengerüst ausgesät wurden, beheimateten sich vor allem in den kortikalen Regionen des Nierengerüsts, wo sie bevorzugt die glomerulären Tubuli der Pereg wieder besiedeln. Am ersten Tag nach der Aussaat betten sich nur wenige Zellen in die Glomeruli ein, und am siebten Tag sind die Glomeruli praktisch frei von Zellen, während die Mehrheit dieser Zellen die kortikalen Regionen der extrazellulären Nierenmatrix besetzt.

Nach siebentägiger antegrader Perfusionskultur sind viele Tubuli der RCTE-Linie in den äußeren medullären und papillären Tubuli vorhanden und sammeln Enten nach RCTE-Zellrepopulation und einer Woche Perfusionskultur. Die nach der Dezellularisierung beobachtete Transparenz geht jedoch verloren, und die isierte Niere erscheint undurchsichtig und ähnelt ihrem ursprünglichen Zustand näher. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die immunchemische Analyse von konditionierten Nährmedien durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. wie sich die metabolischen oder phänotypischen Zustände dieser Zellen innerhalb der renalen extrazellulären Matrix verändern.

Die Fähigkeit, extrazelluläre Gerüste zu entwickeln und die Spenderverkäufe wieder in die Matrix aufzunehmen, ermöglicht es den Forschern, Wachstum und Reifung in drei Dimensionen innerhalb natürlicher renaler Exomatrix-Gerüste abzugrenzen. Das ultimative Ziel ist es, diese Technologie als Werkzeug zu nutzen, um die Mechanismen der Nierenreparatur und -regeneration besser zu verstehen.