Beschreiben ein Transkriptionsfaktor abhängige Regulation der MicroRNA Transkriptom

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik besteht darin, zu beschreiben, wie ein Transkriptionsfaktor von Interesse das Mikro-RNA-Transkriptom reguliert. Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen zu beantworten, ob Transkriptionsfaktoren, die die Transkription protein-codierender Gene modulieren, ebenfalls an der Transkription von Mikro-RNAs beteiligt sind. Der Hauptvorteil dieser Methodik liegt darin, dass sie Datenmining, Laborergebnisse und bioinformatische Analysen integriert, um eine umfassende Beschreibung der Transkription von Mikro-RNA-Genen bereitzustellen, die von der Aktivität des betreffenden Transkriptionsfaktors abhängt.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Wechselwirkung zwischen der Transkription von Mikro-RNA-Genen und der Aktivität des Transkriptionsfaktor-Status ermöglichen kann, ist es wichtig zu bedenken, dass es sich hierbei um eine deskriptive Methode handelt und eine Bestätigung einer solchen Assoziation mithilfe zusätzlicher Assays erfolgen sollte. Öffnen Sie zunächst einen Genombrowser, beispielsweise den Genombrowser der University of California Santa Cruz, um Sequenzierungsdaten aus Chromatin-Immunpräzipitationsexperimenten (ChIP-seq) zu extrahieren. Gehen Sie auf der Website nach dem Öffnen in die obere Menüleiste, wählen Sie dort „Tools“ aus und öffnen Sie den Table Browser.

Geben Sie die Spezifikationen wie hier gezeigt in die jeweiligen Felder ein und wählen Sie anschließend „Get Output“, um die Tabelle zu extrahieren. Speichern Sie die Ausgabe als Textdatei und importieren Sie die Datei dann in eine Tabellenkalkulation.

Öffnen Sie das Tabellenkalkulationsprogramm, sortieren Sie die Spalte mit den Namen und filtern Sie die Ergebnisse nach einem Transkriptionsfaktor Ihrer Wahl, beispielsweise STAT2. Kopieren Sie anschließend die Liste der Mikro-RNA-Promotoren basierend auf ihrer H3K4me3-epigenetischen Signatur und fügen Sie diese Liste in eine TXT-Datei ein. Verwenden Sie danach den im SQL verfassten ergänzenden Code, der in den ergänzenden Datendateien bereitgestellt ist, um die gesammelten Daten abzubilden und die mediane Bindungsaffinität zu bestimmen.

Zunächst 1,5 Millionen HEK293-Zellen in eine 10 cm große Petrischale geben und DMEM ergänzt durch 10 % FBS hinzufügen. Die Zellen 24 Stunden kultivieren, bis sie eine Konfluenz von etwa 50 % erreichen. Danach das Medium erneuern.

Dann fügen Sie ein Transvektionsmittel in Kombination mit fünf Mikrogramm eines grün fluoreszierenden Proteins enthaltenden Lentivirus mit der gezielten shRNA und fünf Mikrogramm Verpackungsvektoren gemäß den Herstelleranweisungen hinzu. Als Kontrolle transvektieren Sie eine identische Zellkultur mit einer unspezifischen shRNA und den Verpackungsvektoren. Inkubieren Sie die Transvektionsmischung 16 Stunden lang mit den Zellen und ersetzen Sie anschließend das Medium durch 10 Milliliter frisches DMEM-Medium, ergänzt mit 10 % FBS.

48 Stunden nach der Transvektion entfernen Sie das Medium von den Zellen. Anschließend zentrifugieren Sie fünf Minuten lang, um das infektiöse Überstandmedium zu sammeln. Filtern Sie den Überstand über einen 0,45-Mikron-Spritzenfilter, um eventuelle schwebende Zellen zu entfernen.

Fügen Sie anschließend das Medium einem ultrazentrifugalen Filtersystem mit einer Grenze von 100 Kilodalton hinzu. Zentrifugieren Sie das Medium, um das Lentivirus zu konzentrieren, bis das Volumen weniger als 250 Mikroliter beträgt. Überführen Sie die verbleibende Flüssigkeit in ein Kryoröhrchen und lagern Sie das konzentrierte Virus bei minus 80 Grad Celsius, bis es benötigt wird.

Wenn Sie fortfahren möchten, nehmen Sie das gefrorene Lentivirus aus dem Minus-80-°C-Gefrierschrank und bringen Sie das Gefäß auf Raumtemperatur. Übertragen Sie 100 µL virales Überstand auf ein frisches 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen und geben Sie 900 µL Medium ohne Serum hinzu. Fügen Sie anschließend 10 Nanogramm pro Milliliter Hexadimethrinbromid zur ein-Milliliter-Virus-Suspension hinzu.

Versetzen Sie das Gefäß vorsichtig und lassen Sie die Mischung fünf Minuten lang stehen. Sammeln Sie fünf Millionen Zellen für jede geplante Transduktion und resuspendieren Sie das Zellenpellet anschließend vorsichtig in 0,5 Milliliter Medium, das Virus enthält. Überführen Sie die Zellen in eine 12-Loch-Platte und inkubieren Sie sie vier bis 24 Stunden lang.

Fügen Sie anschließend weitere 0,5 Milliliter Medium mit 20 % FBS hinzu. 48 bis 72 Stunden nach der Transduktion sammeln Sie die Zellen ein und färben Sie diese gemäß den Herstelleranweisungen mit Propidiumiodid. Nach der Färbung schützen Sie die Zellen vor Licht und verwenden FACS, um die Transvektions-Effizienz durch Messung des Anteils GFP-positiver, Propidiumiodid-negativer Zellen zu bestimmen.

Danach sammeln Sie die sortierte Population der GFP-positiven Zellen und extrahieren deren Proteine. Schließlich verwenden Sie die Western-Blot-Analyse, um die Mengen des Zieltranskriptionsfaktors vor und nach der Infektion der Zellen mit dem definierten shRNA zu bestimmen. Nach der Transduktion von CLL-Zellen mit STAT3-shRNA gingen die Mengen an STAT3-mRNA und STAT3-Protein signifikant zurück.

Außerdem zeigte ein Micro-RNA-Array der CLL-Zellen 23 Micro-RNAs, deren Expression sich signifikant zwischen CLL-Zellen, die mit STAT3-shRNA transfiziert wurden, und CLL-Zellen, die mit einem leeren Vektor transfiziert wurden, unterschied. Die Ergebnisse des Micro-RNA-Arrays wurden für sieben der hier gezeigten Gene mittels quantitativer RT-PCR bestätigt. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie Chromatin-Immunpräzipitation, Elektrophoretischer Mobilitätsverschiebeassay und Differenzassay durchgeführt werden, um zu überprüfen, ob dieser Transkriptionsfaktor an den Promotor eines spezifischen Spiegelgens bindet und ihn aktiviert.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Bioinformatik-Analysen, öffentlich verfügbare Daten und die Stilllegung eines Transkriptionsfaktors mittels shRNA-Ansatz kombiniert, um herauszufinden, wie dieser Transkriptionsfaktor die Expression von microRNA-Genen reguliert.