Name: Beschreiben ein Transkriptionsfaktor abhängige Regulation der MicroRNA Transkriptom (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Erfahren Sie, wie Transkriptionsfaktoren das MicroRNA-Transkriptom regulieren. Diese bioinformatische Methode integriert Datenmining, shRNA-Transfektion und MicroRNA-Array-Analyse zur Untersuchung genregulatorischer Mechanismen.

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Diese Studie wurde unterstützt durch einen Zuschuss von der CLL Global Research Foundation unterstützt. Die University of Texas MD Anderson Cancer Center wird zum Teil durch die National Institutes of Health durch ein Cancer Center Support-Grant (P30CA16672) unterstützt.

1. Identifizieren Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen in dem Promoter von microRNA Gene, Data Mining-Ansatz <ol><li> Verwenden Sie die University of California Santa Cruz (UCSC) Genom-Browser Chromatinimmunpräzipitation (CHIP) Sequenzierungsdaten als Teil der Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) Projekt erzeugt zu extrahieren. <ol><li> Öffnen Sie die Tabelle Browser im UCSC Genom-Browser. </li><li> Verwenden Sie die folgenden Spezifikationen, die Tabelle zu extrahieren: Clade: (Säugetiere), Genom: (Mensch), Montage: (Feb2009 (GRch37 / hg18)), Gruppe: (Verordnung), Schiene (TxnFactorChIP), Tabelle: (weEncoderesTFbsCo7steredv3), Region : (Genome), Ausgabeformat (alle aus ausgewählten Tabelle Gene). </li><li> Speichern Sie die Ausgabe von 1.1.2 als TXT-Datei und in eine Tabelle. </li><li> Sortieren und Filtern für den Transkriptionsfaktor von Interesse (zB STAT2). </li></ol></li><li> Verwenden Sie die Liste von microRNA Vermittler auf Basis von H3K4me3 Epigenetik Signatur verfügbar bei Baeer et al. 9 </sup&gt;. Kopieren Sie diese Liste in eine .txt-Datei. </li><li> Zur Anpassung nach Koordinaten auf dem menschlichen Genom, zeichnen sie die Daten von 1.1 und 1.2 (zB Bindung von STAT3 auf mutmaßliche microRNA - Promotoren) und bestimmen Sie die mittlere Bindungsaffinität mit dem Code in C geschrieben scharf wie in ergänzenden skizzierte Codierung Datei 1. </li></ol> 2. Verwenden Sie shRNA Down-Regulierung der Expression eines Transkriptionsfaktors von Interesse <ol><li> Platte 1.5 x 10 6 Zellen von humanen embryonalen 293 - Nierenzelllinie in 10 cm Platte bei etwa 50% Konfluenz (DMEM mit 10% FBS). </li><li> Transfizieren Zellen von humanen embryonalen 293-Nierenzelllinie mit 5 ug grüne Fluoreszenz-Protein (GFP) Lentivirus shRNA enthält gerichtet an den Transkriptionsfaktor von Interesse und mit 5 ug Verpackungsvektoren Transfektionsreagenz für adhärente Zellen unter Verwendung von dem Protokoll des Herstellers entsprechend. </li><li> Als Kontrolle mit den Zellen aus 293 menschlichen embryonalen Nierenzelllinie zu transfizierenverwürfelten shRNA und die Verpackungsvektoren dem Protokoll des Herstellers entsprechend. </li><li> Halten Sie Transfektionsgemisch auf Zellen für 16 Stunden (bei ​​37 ° C, CO 2 Inkubator), dann wird ein neues Medium 10% DMEM - Medium mit 10% FBS auf 10 ml geändert werden . </li><li> Warten Sie 48 Stunden nach der Transfektion Zentrifugation der Zellkultur (300 × g, 5 min) und sammeln infektiösen Überstand. Filtriere den Überstand durch ein 0,45 &amp; mgr; m-Spritzenfilter (25 mm tensidfrei Celluloseacetat-Membran), um alle schwebenden Zellen zu entfernen. </li><li> Konzentrieren Sie den Überstand und sammeln die Lentiviren ein Ultrazentrifugalmühle Filtervorrichtung mit Schwellenwert von 100 kDa. Spin bei 950 xg für 30 - 60 min, bis das Volumen hat Konzentrats auf weniger als 250 &amp; mgr; l. Lagern Sie das konzentrierte Virus bei -80 ° C. </li><li> Transfizieren der Zellen mit der lentivirus. Entfernen Sie gefrorene Lentiviren von -80 ° C Gefrierschrank und tauen auf Raumtemperatur. Übertragen Sie 100 ul Virusüberstand in ein frisches 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. <ol><li> Bring das Volumen in dem Rohr zu 1 ml mit reduziertem Serum-Medium auf. In Hexadimethrinbromid zu 1 ml Virussuspension für die endgültige Konzentration von 10 ng / ml, vorsichtig mischen und lassen Sie die Mischung für 5 Minuten stehen. </li></ol></li><li> Zentrifuge 5 x 10 6 Zellen für jede Transduktion und sanft das Zellpellet in 0,5 ml Medium , das Virus resuspendieren. Lassen Sie die Zellen für 4 im Inkubator bleiben - 24 Stunden, dann wurden 0,5 ml Medium in einer Endkonzentration von 10% FBS mit 20% FBS hinzufügen. </li><li> Warten Sie 48 bis 72 Stunden und färben die Zellen mit Propidiumiodid (PI) und grün fluoreszierendem Protein (GFP) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Schützen Sie die Zellen , die aus Licht und mit einem FACS - Sorter die Raten der GFP + / PI zu messen - Zellen. Da PI Flecken nur tote Zelle, ist diese Rate eine Schätzung der Transfektionseffizienz in lebenden Zellen. </li><li> Sortieren Sie die positive Zellpopulation auf GFP - Expression (GFP +) durch FACS - Sorter wie zuvor 10 beschrieben. </li><li> Verwenden Western Immun Blotting wie zuvor beschrieben 10 die Pegel eines Transkriptionsfaktors von Interesse vor und nach der Infektion der Zellen von Interesse (zB CLL - Zellen) mit den benannten shRNA zu bestimmen. </li></ol> 3. Bestimmen Sie die Expression von microRNA Transkriptom in Zellen, die mit Transcription Factor-shRNA <ol><li> Isolieren RNA Kommerzielle Kits nach Herstellerprotokoll. </li><li> Beschriften Sie die RNA und hybridisieren es zu microRNA Microarray - 11. </li><li> Bestimmen Sie die differentiell exprimierte microRNA in Zellen , die mit Transkriptionsfaktor-shRNA oder mit leerem Vektor Kontrollen 5. </li><li> Überprüfen Sie die Microarray - Ergebnisse für die meisten differentiell exprimierten microRNAs unter Verwendung von Echtzeit - PCR - 5. </li></ol> 4. Bestimmen Sie die Überlappung zwischen den Bioinformatik und der shRNA-Ansatz in der Transkriptionsfaktor abhängige Transkriptom beschreiben <ol><li> detHermelin die erwarteten und beobachteten Verhältnisse von microRNA Gene , die Transkriptionsfaktor - Bindungsstellen in ihren Promotoren und wurden downregulated in Transkriptionsfaktor-shRNA transfizierten Zellen beherbergen, gehen Sie wie folgt vor : <ol><li> Beziehen Sie das Verhältnis von Genen, die den Transkriptionsfaktor von Interesse an ihrem Promotor / Gesamt microRNA aus der Liste erzeugt in 1.3 Hafen. Diese Liste ist das erwartete Verhältnis (zB microRNA Gene mit STAT3 - Bindungsstellen / Gesamt microRNA Gene getestet = 0,25). </li><li> Bestimmen Sie die Anzahl von Genen , die in Transkriptionsfaktor-shRNA transfizierten Zellen aus der Liste in 3.3 erzeugt downregulated wurden und hat Transkriptionsfaktor von Interesse Bindungsstellen aus der Liste in 1.3 erzeugt. Diese Nummer / Gesamtzahl der nach unten reguliert Gene ist das beobachtete Verhältnis (zB microRNA Gene mit STAT3 sites / Gesamtzahl der downregulated microRNAs = 0,6 Bindung). </li></ol></li&gt; <li> Verwenden χ2 Statistik zeigt den beobachteten und erwarteten Verhältnisse zu vergleichen, die oben erzeugt wurden, und zu bestimmen, ob die Liste von Genen, die in Transkriptionsfaktor-shRNA transfizierten Zellen herunterreguliert wurden in ihrem Promotor mit Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen angereichert sind. </li></ol>

<ol><li>Bentwich, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hundreds+of+conserved+and+nonconserved+human+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs.</a> Nat Genet. 37, 766-770 (2005).</li>
<li>Hata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+microRNAs+in+cardiovascular+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functions of microRNAs in cardiovascular biology and disease.</a> Annu Rev Physiol. 75, 69-93 (2013).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+target+recognition+and+regulatory+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136, 215-233 (2009).</li>
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<li>Rozovski, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transducer+and+activator+of+transcription+%28STAT%29-3+regulates+microRNA+gene+expression+in+chronic+lymphocytic+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Signal transducer and activator of transcription (STAT)-3 regulates microRNA gene expression in chronic lymphocytic leukemia cells.</a> Mol Cancer. 12, 50(2013).</li>
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<li>Baer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+promoter+DNA+hypermethylation+and+hypomethylation+is+associated+with+aberrant+microRNA+expression+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Extensive promoter DNA hypermethylation and hypomethylation is associated with aberrant microRNA expression in chronic lymphocytic leukemia.</a> Cancer Res. 72, 3775-3785 (2012).</li>
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<li>Lau, J. C., Hanel, M. L., Wevrick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+and+imprinted+epigenetic+modifications+of+the+human+NDN+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific and imprinted epigenetic modifications of the human NDN gene.</a> Nucl Acids Res. 32, 3376-3382 (2004).</li>
<li>Corcoran, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+mammalian+microRNA+promoters+emerge+from+polymerase+II+chromatin+immunoprecipitation+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Features of mammalian microRNA promoters emerge from polymerase II chromatin immunoprecipitation data.</a> PLoS One. 4, e5279(2009).</li>
<li>Bhattacharyya, M., Feuerbach, L., Bhadra, T., Lengauer, T., Bandyopadhyay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+transcription+start+site+prediction+with+multi-objective+feature+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Stat+Appl+Genet+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA transcription start site prediction with multi-objective feature selection.</a> Stat Appl Genet Mol Biol. 11, Article 6 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Der Mechanismus der RNA-Polymerase II- abhängige Transkription von Protein-codierenden Genen zugrunde liegenden wurde ausgiebig untersucht. Während diese Elemente nur 1% ausmachen - 2% des menschlichen Genoms, Beweise aus dem ENCODE - Projekt legen nahe , dass mehr als 80% des menschlichen Genoms 17 Transkription unterzogen werden kann und was reguliert die Transkription der nicht-kodierenden DNA - Elemente , bleibt weitgehend unbekannt 6 . Mehrere Studien, die zeigten ...

MicroRNAs sind endogene kleine, nicht kodierende regulatorische RNAs, die typischerweise als negative Regulatoren der mRNA-Expression auf der posttranskritionelle Ebene funktionieren. Etwa 1000 nicht-codierende 20 bis 25 Nucleotide langen mikroRNAs im menschlichen Genom zu finden sind 1,2. MicroRNAs regulieren die Genexpression durch kanonische Basenpaarungen zwischen dem Keimsequenz des mikroRNA und sein komplementärer seed Übereinstimmung Sequenz, die üblicherweise am 3&#39;-untranslatierten Region (UTR) der Ziel-mRNAs befindet. Zusammenfassend regulieren mikroRNAs mehr als 30% der Protein - codierenden Gene 3, aber nur wenig über die Transkription von DNA von mikroRNAs bekannt. Es wurde vorgeschlagen, dass die Regulation der Transkription MikroRNA , die der mRNA 4,5 ähnlich ist. Insbesondere ähnlich wie seine Aktivität Transkription von Protein - kodierenden Gene bei der Förderung, sind Transkriptionsfaktoren gedacht 6 Transkription von microRNAs zu aktivieren. Der Transkriptionsfaktor-microRNA Zusammenspiel wurde als Modulator Faktor der Genexpression 7, berichtet und kann auch Feedback- und Feedforward - Schleifen bilden. Zum Beispiel Yamakuchi et al. Berichteten von einer Rückkopplungsschleife , in der p53 die Expression von microRNA34a induziert, die wiederum Translation des p53 - Repressor SIRT hemmt und dadurch Erhöhung p53 Aktivität 8. Während spezifische Beispiele von Transkriptionsfaktor-abhängige Expression von microRNAs berichtet worden, die eine anerkannte Methode, um Informationen darüber, wie ein Transkriptionsfaktor von Interesse reguliert die Expression des microRNA-Transkriptom bietet fehlt. Der Zweck des Protokolls hier vorgeschlagen ist, eine eingehende Beschreibung der Transkriptionsfaktor-abhängige Regulation der microRNA-Transkriptom zu liefern. öffentlich verfügbaren Daten, Bioinformatik-Tools Durch die Kombination und Microarray-Technologie, die Forscher, die diesen Algorithmus folgen zu erfassen wäre in der Lage zu einer genomischen Maßstab, wie jederTranskriptionsfaktor in jedem Zelltyp von Interesse reguliert die Expression des microRNA-Transkriptom und ein mutmaßliches Beitrag des Transkriptionsfaktors-mRNA bei der Regulierung der microRNA Ausdruck zu erkunden.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamin 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668027</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &Mikro; m Spritzenvorsatzfilter</td><td>Thermo Scientific (Nalgene)</td><td>190-2545</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultrazentrifugalfiltergerät mit einem Schwellenwert von 100&nbsp; kDa</td><td>Merck Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Merck Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagenz</td><td>Life Tachnologies (Invitrogen)</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>293 Zelllinie</td><td>humane Sigma-Aldrich</td><td>85120602</td><td></td></tr></tbody></table>

beschreiben ein transkriptionsfaktor abhängige regulation der microrna transkriptom

Describing a Transcription Factor Dependent Regulation of the MicroRNA Transcriptome

Während die Transkriptionsregulation der Protein-kodierenden Gene ausgiebig untersucht wurde, ist nur wenig bekannt darüber, wie Transkriptionsfaktoren in der Transkription von nicht-kodierenden RNAs beteiligt sind, insbesondere von Mikro-RNAs. Hier schlagen wir eine Strategie, um die potentielle Rolle des Transkriptionsfaktors zu studieren an der Transkription von microRNAs regulieren öffentlich verfügbaren Daten, Rechenressourcen und hohem Durchsatz Daten. Wir verwenden die epigenetischen Signatur H3K4me3 zu microRNA Promotoren und Chromatinimmunpräzipitation (Chip-) -sequencing Daten aus dem ENCODE-Projekt identifizieren zu microRNA Promotoren zu identifizieren, die mit Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen angereichert sind. Durch Transfektion von Zellen von Interesse mit shRNA einen Transkriptionsfaktor von Interesse und Aussetzen der Zellen an microRNA Array Targeting untersuchen wir die Wirkung dieses Transkriptionsfaktors auf der microRNA Transkriptom. Als anschauliches Beispiel verwenden wir unsere Studie über die Wirkung von STAT3 auf der microRNA Transkriptom der chronischen lymphocytic Leukämie (CLL) Zellen.

STAT3 ist ein Transkriptionsfaktor , der typischerweise die Transkription von Genen induziert , die anti apoptotischen und proliferative Wirkungen 12. Ob STAT3 wirken sich auch auf die nicht-kodierende RNA Transkriptom derzeit nicht bekannt ist. In allen CLL - Zellen ist STAT3 konstitutiv phosphoryliert an Serin 707 Reste 10,13. Phosphoserin STAT3 Shuttles zum Kern, bindet an DNA und aktiviert Gene bekannt 10 durch Tyrosin pSTAT3 in anderen Zelltypen akti...

Hierin schlagen wir eine Strategie vor, um die Wirkung eines interessierenden Transkriptionsfaktors auf das microRNA-Transkriptom unter Verwendung öffentlich zugänglicher Daten, Rechenressourcen und Hochdurchsatzdaten von microRNA-Arrays nach der Transfektion von Zellen mit kleiner Haarnadel (sh)RNA zu untersuchen, die auf einen interessierenden Transkriptionsfaktor abzielt.

Beschreiben ein Transkriptionsfaktor abhängige Regulation der MicroRNA Transkriptom

While the transcription regulation of protein coding genes was extensively studied, little is known on how transcription factors are involved in ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik besteht darin, zu beschreiben, wie ein Transkriptionsfaktor von Interesse das Mikro-RNA-Transkriptom reguliert. Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen zu beantworten, ob Transkriptionsfaktoren, die die Transkription protein-codierender Gene modulieren, ebenfalls an der Transkription von Mikro-RNAs beteiligt sind. Der Hauptvorteil dieser Methodik liegt darin, dass sie Datenmining, Laborergebnisse und bioinformatische Analysen integriert, um eine umfassende Beschreibung der Transkription von Mikro-RNA-Genen bereitzustellen, die von der Aktivität des betreffenden Transkriptionsfaktors abhängt.Obwohl diese Methode Einblicke in die Wechselwirkung zwischen der Transkription von Mikro-RNA-Genen und der Aktivität des Transkriptionsfaktor-Status ermöglichen kann, ist es wichtig zu bedenken, dass es sich hierbei um eine deskriptive Methode handelt und eine Bestätigung einer solchen Assoziation mithilfe zusätzlicher Assays erfolgen sollte. Öffnen Sie zunächst einen Genombrowser, beispielsweise den Genombrowser der University of California Santa Cruz, um Sequenzierungsdaten aus Chromatin-Immunpräzipitationsexperimenten (ChIP-seq) zu extrahieren. Gehen Sie auf der Website nach dem Öffnen in die obere Menüleiste, wählen Sie dort „Tools“ aus und öffnen Sie den Table Browser.Geben Sie die Spezifikationen wie hier gezeigt in die jeweiligen Felder ein und wählen Sie anschließend „Get Output“, um die Tabelle zu extrahieren. Speichern Sie die Ausgabe als Textdatei und importieren Sie die Datei dann in eine Tabellenkalkulation.Öffnen Sie das Tabellenkalkulationsprogramm, sortieren Sie die Spalte mit den Namen und filtern Sie die Ergebnisse nach einem Transkriptionsfaktor Ihrer Wahl, beispielsweise STAT2. Kopieren Sie anschließend die Liste der Mikro-RNA-Promotoren basierend auf ihrer H3K4me3-epigenetischen Signatur und fügen Sie diese Liste in eine TXT-Datei ein. Verwenden Sie danach den im SQL verfassten ergänzenden Code, der in den ergänzenden Datendateien bereitgestellt ist, um die gesammelten Daten abzubilden und die mediane Bindungsaffinität zu bestimmen.Zunächst 1,5 Millionen HEK293-Zellen in eine 10 cm große Petrischale geben und DMEM ergänzt durch 10 % FBS hinzufügen. Die Zellen 24 Stunden kultivieren, bis sie eine Konfluenz von etwa 50 % erreichen. Danach das Medium erneuern.Dann fügen Sie ein Transvektionsmittel in Kombination mit fünf Mikrogramm eines grün fluoreszierenden Proteins enthaltenden Lentivirus mit der gezielten shRNA und fünf Mikrogramm Verpackungsvektoren gemäß den Herstelleranweisungen hinzu. Als Kontrolle transvektieren Sie eine identische Zellkultur mit einer unspezifischen shRNA und den Verpackungsvektoren. Inkubieren Sie die Transvektionsmischung 16 Stunden lang mit den Zellen und ersetzen Sie anschließend das Medium durch 10 Milliliter frisches DMEM-Medium, ergänzt mit 10 % FBS.48 Stunden nach der Transvektion entfernen Sie das Medium von den Zellen. Anschließend zentrifugieren Sie fünf Minuten lang, um das infektiöse Überstandmedium zu sammeln. Filtern Sie den Überstand über einen 0,45-Mikron-Spritzenfilter, um eventuelle schwebende Zellen zu entfernen.Fügen Sie anschließend das Medium einem ultrazentrifugalen Filtersystem mit einer Grenze von 100 Kilodalton hinzu. Zentrifugieren Sie das Medium, um das Lentivirus zu konzentrieren, bis das Volumen weniger als 250 Mikroliter beträgt. Überführen Sie die verbleibende Flüssigkeit in ein Kryoröhrchen und lagern Sie das konzentrierte Virus bei minus 80 Grad Celsius, bis es benötigt wird.Wenn Sie fortfahren möchten, nehmen Sie das gefrorene Lentivirus aus dem Minus-80-°C-Gefrierschrank und bringen Sie das Gefäß auf Raumtemperatur. Übertragen Sie 100 µL virales Überstand auf ein frisches 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen und geben Sie 900 µL Medium ohne Serum hinzu. Fügen Sie anschließend 10 Nanogramm pro Milliliter Hexadimethrinbromid zur ein-Milliliter-Virus-Suspension hinzu.Versetzen Sie das Gefäß vorsichtig und lassen Sie die Mischung fünf Minuten lang stehen. Sammeln Sie fünf Millionen Zellen für jede geplante Transduktion und resuspendieren Sie das Zellenpellet anschließend vorsichtig in 0,5 Milliliter Medium, das Virus enthält. Überführen Sie die Zellen in eine 12-Loch-Platte und inkubieren Sie sie vier bis 24 Stunden lang.Fügen Sie anschließend weitere 0,5 Milliliter Medium mit 20 % FBS hinzu. 48 bis 72 Stunden nach der Transduktion sammeln Sie die Zellen ein und färben Sie diese gemäß den Herstelleranweisungen mit Propidiumiodid. Nach der Färbung schützen Sie die Zellen vor Licht und verwenden FACS, um die Transvektions-Effizienz durch Messung des Anteils GFP-positiver, Propidiumiodid-negativer Zellen zu bestimmen.Danach sammeln Sie die sortierte Population der GFP-positiven Zellen und extrahieren deren Proteine. Schließlich verwenden Sie die Western-Blot-Analyse, um die Mengen des Zieltranskriptionsfaktors vor und nach der Infektion der Zellen mit dem definierten shRNA zu bestimmen. Nach der Transduktion von CLL-Zellen mit STAT3-shRNA gingen die Mengen an STAT3-mRNA und STAT3-Protein signifikant zurück.Außerdem zeigte ein Micro-RNA-Array der CLL-Zellen 23 Micro-RNAs, deren Expression sich signifikant zwischen CLL-Zellen, die mit STAT3-shRNA transfiziert wurden, und CLL-Zellen, die mit einem leeren Vektor transfiziert wurden, unterschied. Die Ergebnisse des Micro-RNA-Arrays wurden für sieben der hier gezeigten Gene mittels quantitativer RT-PCR bestätigt. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie Chromatin-Immunpräzipitation, Elektrophoretischer Mobilitätsverschiebeassay und Differenzassay durchgeführt werden, um zu überprüfen, ob dieser Transkriptionsfaktor an den Promotor eines spezifischen Spiegelgens bindet und ihn aktiviert.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Bioinformatik-Analysen, öffentlich verfügbare Daten und die Stilllegung eines Transkriptionsfaktors mittels shRNA-Ansatz kombiniert, um herauszufinden, wie dieser Transkriptionsfaktor die Expression von microRNA-Genen reguliert.

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Biotechnik

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MicroRNAs (miRNAs) sind wichtige Regulatoren der Genexpression und haben gezeigt, dass eine Rolle bei zahlreichen biologischen Prozessen spielen. Um besser zu verstehen miRNA-UTR-Interaktionen, haben wir eine genomweite Sammlung von 3 UTR Luciferase Reporter mit einem neuartigen Luciferase-Gen und Assay-Reagenz, das LightSwitch System gepaart erstellt.

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Wir beschreiben hier eine Methode zur Regulierung des Picornavirus-Tropismus, indem Sequenzen, die zu spezifischen microRNAs komplementär sind, in das virale Genom eingebaut werden.  Dieses Protokoll kann an alle verschiedenen Klassen von Viren angepasst werden, wobei es je nach Länge und Art ihres Lebenszyklus modifiziert wird.

MicroRNA-basierten Regulation der Picornavirus Tropism

Dieser Bericht beschreibt eine schnelle und zuverlässige Methode zur Validierung von mRNA Ziele der zellulären MiRNAs. Die Methode verwendet, die synthetische biotinylierte gesperrt Nukleinsäure LNA-basierte MiRNA imitiert erfassen gezielt mRNA. Anschließend Streptavidin beschichteten magnetische Beads werden eingesetzt, um Pulldown das Ziel mRNA zur Quantifizierung von qPCR-Polymerase-Kettenreaktion.

Biotin-basierte Pulldown Assay, Validate mRNA Ziele der zellulären miRNAs

Wir entwickelten einen intronischen microRNA-Biogenese-Reporter-Assay für den Einsatz in Zellen in vitro mit vier Plasmiden: eines mit intronischer miRNA, eines mit dem Ziel, eines zur Überexprimierung eines regulatorischen Proteins und eines für Renilla luciferase. Die miRNA wurde verarbeitet und konnte die Luciferase-Expression durch Bindung an die Zielsequenz steuern.

Ein Reporter-Assay zur Analyse der intronischen microRNA-Reifung in Säugetierzellen

Hier beschreiben wir eine optimierte Multiplex-Reverse-Transkriptase-quantitative PCR (qRT-PCR)-Protokoll in Kombination mit einer mikrofluidischen Plattform als zeit-und kosteneffektiver High-Throughput-Screening-Tool für microRNA (miRNA) Expression, besonders beim Arbeiten mit geringen Mengen der Probe.

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimierte Multiplex qRT-PCR in Nanoliter-Maßstab auf dem Fluidigm Dynamische ArrayTM IFCs

Zerstörungsfreie Volumen-Visualisierung können nur von tomographischen Techniken, von denen die am effizientesten ist die x-ray micro-Computertomographie (CT) erreicht werden.

Hochauflösende 3D Imaging von Ex-Vivo Biologische Proben von Micro-CT

Wir beschreiben die Verwendung eines Stopped-Flow-Gerät sowohl die reduktive und oxidative Reaktionen von...

Die Überwachung der reduktiven und oxidativen Halbreaktionen eines Flavin-abhängige Monooxygenase mit Stopped-Flow Spektrophotometrie

Wir präsentieren eine Kombination von Cryo-Elektronenmikroskopie, Lipid Nanotechnologie und Strukturanalyse angewandt, um die Membran-gebundene Struktur von zwei hoch homolog FVIII Formen lösen: Mensch und Schwein. Die in unserem Labor entwickelt, um spiralförmig organisieren die zwei funktionellen rekombinanten FVIII-Formulare auf negativ geladenen Lipid-Nanotubes (LNT)-Methode beschrieben.

Helical Organisation der Blutgerinnungsfaktor VIII auf Lipid-Nanotubes

Hier beschreiben wir einfache Methoden für die Herstellung von Vesikeln, die Verkapselung der Transkription und Translation Maschinen, und die Überwachung der Herstellung von Proteinen. Die resultierende zellfreie Systeme können als Ausgangspunkt, von dem zunehmend komplexen zellulären Mimik genutzt werden müssen.

Die Verkapselung von Zellfreie Transkription und Übersetzung Machinery in Vesikel über die Errichtung von Cellular Mimics

Erfahren Sie, wie Transkriptionsfaktoren das MicroRNA-Transkriptom regulieren. Diese bioinformatische Methode integriert Datenmining, shRNA-Transfektion und MicroRNA-Array-Analyse zur Untersuchung genregulatorischer Mechanismen.

Beschreiben ein Transkriptionsfaktor abhängige Regulation der MicroRNA Transkriptom

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