Identifizierung von Metalloxid-Nanopartikeln in histologischen Proben durch verbesserte Dunkelfeldmikroskopie und hyperspektrale Kartierung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Identifizierung von Metalloxid-Nanopartikeln in histologischen Proben durch Dunkelfeldmikroskopie und hyperspektrales Mapping. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Region von Interesse in einer positiven Kontrollprobe mit Nanopartikeln identifiziert und ein Dunkelfeldbild aufgenommen wird. Der zweite Schritt besteht darin, mit der Hyperspektralkamera ein hyperspektrales Bild oder einen Datenwürfel des interessierenden Bereichs zu erstellen.

Als Nächstes wird eine Referenzspektralbibliothek aus dem Positivkontroll-Datenwürfel erstellt, der gegen eine Negativkontrolle gefiltert wird, um Fehlalarme zu entfernen. Der letzte Schritt besteht darin, die Referenzspektralbibliothek zu verwenden, um experimentelle Proben zu kartieren, um Nanopartikel derselben Zusammensetzung zu identifizieren und zu lokalisieren. Letztendlich werden verbesserte Dunkelfeldmikroskopie und hyperspektrales Mapping verwendet, um Metalloxid-Nanopartikel in histologischen Proben schneller und weniger ressourcenintensiv zu identifizieren als andere Techniken wie die Elektronenmikroskopie.

Diese Methode bietet mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Bildgebungs- und Charakterisierungstechniken für Nanomaterialien, wie z. B. der Elektronenmikroskopie. Dabei ist die Probenvorbereitung in der Regel minimal und zerstörungsfrei. Die Bilderfassung und -analyse ist weniger zeit- und kostenintensiv und kann für die Nanopartikel-Bildgebung in einer Vielzahl von Matrizen eingesetzt werden.

Die Teilnehmer wussten, dass die Methode manchmal Schwierigkeiten hatte, da die Erstellung der entsprechenden Positivkontrollproben und Referenzspektralbibliotheken sowohl herausfordernd als auch zeitaufwändig ist. Aber sobald diese ersten Schritte abgeschlossen sind, können experimentelle Proben ziemlich schnell bewertet werden. Während diese Methode Einblicke in die kutane Penetration von Nanopartikeln geben kann, kann sie auch auf andere biologische Proben wie bronchoalveoläre Lavage und Blutausstriche sowie auf nicht-biologische Proben wie Filter angewendet werden, die bei der Bewertung der beruflichen Exposition verwendet werden.

Plar Sosa, ein Medizinstudent aus meinem Labor, wird diese Technik demonstrieren. Beginnen Sie mit dem Einstecken und Einschalten der Lichtquelle, des Bühnencontrollers, der optischen Kamera, der Hyperspektralkamera und des Computersystems. Heben Sie dann Tisch und Kondensor in die Betriebsposition und tragen Sie vorsichtig drei bis fünf Tropfen Tauchöl Typ A auf die Kondensorlinse auf. Wenn Blasen entstehen, wischen Sie das Öl ab und tragen Sie es erneut auf die Linse auf.

Positionieren Sie dann die Probe auf dem Tisch und heben Sie den Kondensator langsam an, bis das Immersionsöl mit der Unterseite des Objektträgers in Kontakt kommt. Dies macht sich durch den schnell aufhellenden Beleuchtungsring bemerkbar, an dem das Öl mit dem Objektträger in Kontakt kommt. Wenn der Kondensor eingesetzt ist, wechseln Sie zum 10-fach-Objektiv und fokussieren und richten Sie den Kondensor aus, um die Helligkeit zu maximieren, und stellen Sie bei Bedarf die Ausrichtungsknöpfe des Kondensors ein, um den hellen Punkt zu zentrieren.

Öffnen Sie die optische Bildgebungssoftware. Fokussieren Sie die Probe mit dem feinen Objektivfokusknopf. Suchen Sie sich dann eine interessante Region aus.

Passen Sie den Kondensorfokus nach Bedarf an, um die Beleuchtung auszugleichen. Klicken Sie in der Menüleiste auf die Registerkarte "Einstellungen" und dann auf die Schaltfläche "Bildaufnahme". Für das Erfassungsereignis.

Wählen Sie das gewünschte Bildformat aus und vergeben Sie einen Dateinamen für das Bild. Wählen Sie außerdem den Standardwert für den Zeitraffer aus und klicken Sie schließlich auf OK. Gehen Sie als Nächstes zum Belichtungsmenü und wählen Sie die Belichtungseinstellungen aus, die das kontrastreichste Bild erzeugen.

Hier wird der Pegel auf 0,0 %, die Verstärkung auf 2,8 Dezibel und die Verschlusszeit auf 56 Millisekunden eingestellt. Nehmen Sie das Bild auf, indem Sie auf die Bildschaltfläche in der Menüleiste klicken. Ändere das Ziel auf 40 x und 100 x.

Wenn Sie Bilder mit höheren Vergrößerungen aufnehmen, stellen Sie sicher, dass der Lichtleiter auf die Hyperspektralkamera gerichtet ist, und öffnen Sie dann die Hyperspektral-Bildgebungssoftware für die Erfassung der HSI-Datenwürfel in der Software. Öffnen Sie Hyperspektralmikroskop in der Menüleiste und wählen Sie HSI-Mikroskopsteuerung. Stellen Sie hier die Objektivvergrößerung und den sicheren Weg ein. Ändern Sie als Nächstes die Flächenerfassung in den Einstellungen und die Anzahl der Linien.

In dieser Studie haben wir die Belichtungszeit mit 720 eingestellt. Hier haben wir 0,25 Sekunden verwendet. Lassen Sie alles andere auf Standard und klicken Sie auf Vorschau HSI, um das Bild anzuzeigen.

Beobachten Sie das resultierende Intensitätsdiagramm, das die Intensität der höchsten Wellenlänge darstellt, während sich der Benutzer über die x-Achse der Mitte des Kamerafelds bewegt. Bewegen Sie den Cursor, um einen genauen Umriss des Diagramms zu erstellen. Dadurch wird auf der linken Seite ein numerischer Intensitätsindikator angezeigt.

Fokussieren Sie das Bild basierend auf dieser Vorschau, indem Sie den Feinobjektivfokus anpassen, um die Spitzen in diesem Bild zu schärfen. Optimieren Sie als Nächstes die Lichtintensität, indem Sie den Fokus des Kondensators der Quelle anpassen, oder brechen Sie die Vorschau ab und passen Sie die Belichtungszeit in der Software an. Klicken Sie auf Erfassen und beobachten Sie als vier neue Fenster mit den verfügbaren Namen.

Liste der Bands. Zoom Nummer eins. Nummer eins, Scroll und Nummer eins RGB-Band erscheinen.

Maximieren Sie das RGB-Bandfenster Nummer eins, da dies der Datenwürfel ist, der für alle zukünftigen Referenzen verwendet wird. Rechts? Klicken Sie auf diesen Datenwürfel, speichern Sie ihn als TIFF-Datei und klicken Sie auf OK. Klicken Sie mit der rechten Maustaste in das Bildfenster des Datenwürfels und klicken Sie mit der linken Maustaste auf das Z-Profilspektrum.

Wenn das Popup-Fenster für das Spektralprofil links angezeigt wird, klicken Sie auf die gewünschten Pixel auf dem Datenwürfelziel. Die hellsten sind diejenigen, die mit Sicherheit als Repräsentanten des interessierenden Materials identifiziert werden können. Wählen Sie im Menü "Partikelanalyse" das Partikelfilterwerkzeug aus, um die im Datenwürfel vorhandenen Partikel zu identifizieren.

Im neuen Popup-Fenstersatz muss das Spektralmaximum den Wert überschreiten, sodass es höher als die Hintergrundpixel, aber niedriger als die interessierenden Materialien ist. Die maximal gültige Datenmenge beträgt 16.000. Klicken Sie im Fenster des Werkzeugs zur Überprüfung von Partikelfiltern auf Alle auswählen.

Klicken Sie dann auf In Spektralbibliothek exportieren und weisen Sie den Namen für Ihre Spektralbibliothek zu. Nachdem Sie eine Stichprobe ausgewählt haben, die als Negativkontrolle dienen soll, erhalten Sie mehrere Datenwürfel aus der Stichprobe. Mit der Hyperspektralkamera ist mindestens eine erforderlich, es können aber auch mehr aufgenommen werden.

Um die Selektivität bei geöffnetem Negativkontrolldatenwürfel zu erhöhen, klicken Sie auf Spektralbibliothek filtern Klicken Sie im Analysemenü in der Hauptsymbolleiste des Programms auf Neue Datei öffnen, wählen Sie die zuvor für die Positivkontrolle erstellte Spektralbibliothek als Eingabedatei aus und klicken Sie auf OK. Im Filter cyto viva spectral library Fenster. Klicken Sie auf das Bild, wählen Sie den Namen der Ausgabedatei für die Referenzspektralbibliothek aus und klicken Sie auf OK.

Klicken Sie anschließend auf den Dateinamen Ihres Negativkontroll-Datenwürfels als Quellbild. Die Software analysiert die Spektralbibliothek und entfernt jedes Spektrum, das mit einem beliebigen Spektrum des Negativkontrolldatenwürfels übereinstimmt. Rufen Sie Datenwürfel aus den experimentellen Stichproben ab, während der experimentelle Datenwürfel geöffnet ist.

Klicken Sie auf das Menü Spektral im Untermenü Mapping-Methoden Öffnen Sie den Spektralwinkel-Mapper. Wählen Sie im Popup-Fenster den Namen des experimentellen Datencubes aus und klicken Sie auf OK. Wenn keine Dateinamen aufgeführt sind, klicken Sie auf Neue Datei öffnen und wählen Sie den experimentellen Datenwürfel aus.

Klicken Sie dann im Popup-Fenster mit dem Namen End Member collection, SAM auf OK und klicken Sie in der Menüleiste auf Import. Wählen Sie dann aus der Spektralbibliotheksdatei aus. Öffnen Sie die zuvor erstellte Referenzspektralbibliothek, und klicken Sie auf OK.

Klicken Sie im neuen Popup-Fenster mit dem Namen "Input Spectral Library" auf "Alle Elemente auswählen" und dann auf "OK". Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste auf Farbe und wählen Sie aus. Standardfarben auf alle anwenden klicken Sie auf Alle auswählen, gefolgt von Anwenden, wählen Sie dann den Namen der Ausgabedatei aus und klicken Sie auf OK.

Öffnen Sie das Overlay-Menü im Datencube-Fenster, und wählen Sie Klassifizierung aus. Navigieren Sie dann zum Namen der Ausgabedatei und klicken Sie auf OK. Öffnen Sie im Menü des interaktiven Klassentoolfensters das Optionsmenü, und wählen Sie die zusammengeführten Klassen aus, um ein einheitliches Farbschema zu erstellen.

Um die Analyse der Daten mit anderer Software zu erleichtern, wählen Sie ein einzelnes Spektrum aus der Liste der Basisklassen aus. Wählen Sie dann alle Klassen außer nicht klassifiziert aus, um sie mit der Basis zusammenzuführen. Klicken Sie dann auf OK.

Klicken Sie anschließend auf die ausgewählte Grundfarbe und alle passenden Spektren werden in dieser Farbe angezeigt. Um ein amatisches Bild zu erhalten, das die passenden Spektren auf schwarzem Hintergrund zeigt, klicken Sie auf das Feld für nicht klassifizierte Farben, das schwarz ist. Standardmäßig ist der wichtigste Vorteil der Technik ihre Fähigkeit, Metalloxid-Nanopartikel in histologischen Proben durch Dunkelfeldmikroskopie und hyperspektrales Mapping zu identifizieren. Diese Bilder veranschaulichen diesen Prozess anhand histologischer Hautproben.

Während einige Teilchen im Dunkelfeld im optischen Bild leicht erkennbar sind, werden zusätzliche Teilchen mit Hilfe der hyperspektralen Bildgebung detektiert. Hier ist Schweinehautgewebe in der Epidermisschicht zu sehen, das mit Illumina-Nanopartikeln belichtet wurde. Es wurde ein kontrastreicher Cluster von Nanopartikeln gefunden, der sich über der Hornschicht in der Hautschicht ablagerte, die mit Siliziumdioxid-Nanopartikeln belichtet wurde.

Es sind mehrere kontrastreiche Nanopartikel zu sehen, die sich über dem Bindegewebe ablagern. Schließlich im Unterhautgewebe, das den syrischen Nanopartikeln ausgesetzt war. Mit dieser Methode können mehrere hochkontrastreiche dispergierte Nanopartikel entlang der Identifizierung von Adipozyten-Nanopartikeln abgelagert werden.

In anderen Gewebeproben wie Lunge, Leber, Milz, Nieren und Lymphknoten ist möglich. Im Anschluss an dieses Verfahren kann eine Bildanalyse durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Partikelanzahl und die Partikelposition zu beantworten. Bestimmte Überlegungen und Nachteile, wie z.B. der Bedarf an hochspezialisierten Kontrollen und die Einschränkungen der Auflösung der photonischen Bildgebung, müssen mit denen konventioneller Methoden abgewogen werden.

Bei der Auswahl der am besten geeigneten Analysetechniken zur Untersuchung spezifischer Forschungsfragen haben wir uns entschieden, diese spezielle Anwendung zu demonstrieren, da sie das Potenzial hat, die aktuelle und zukünftige nanotoxikologische Forschung zu ergänzen. Es kann auch die Forschung über die Absorption, Verteilung, den Stoffwechsel und die Ausscheidung von Nanopartikeln in Organen und Geweben informieren.