Multifunktionale, Mikropipette-basierte Methode für den Einbau und Stimulation der bakteriellen mechanosensitiven Ionenkanäle in Droplet Schnittstelle Bilayers

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Mezcal-Kanäle funktionell zu einer Tröpfchengrenzfläche, einem Doppelschichtsystem, zu rekonstituieren und die Reaktion dieser mechano-empfindlichen Kanäle auf harmonische mechanische Reize zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der elektrischen Mechano-Aktivität der V 23 T Mezcal-Mutante als Reaktion auf harmonische mechanische Anregung nach der Rekonstitution in eine Tröpfchengrenzfläche durch ein Schichtsystem. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die technischen Vorteile sowohl der Patch-Clamp-Technik als auch der Tröpfchen-Grenzflächen-für-Schicht-Methoden nutzt, mit der Fähigkeit, miniaturisiert zu werden, sowie der Fähigkeit, die chemische Zusammensetzung jeder Seite der Membran zu kontrollieren.

Um Liposomen zu formulieren, bereiten Sie 10 Milliliter einer Lipidlösung von zwei Milligramm pro Milliliter her, indem Sie 10 Milliliter Kaliumchloridpuffer zu 20 Milligramm D-P-H-P-C-Syntheselipide hinzufügen, die als lyophilisiertes Pulver gekauft wurden. Stellen Sie sicher, dass sowohl die Lipidvehikel als auch die Pufferlösung gründlich vermischt sind. Die Mischung sollte homogen und trüb aussehen, wenn alles aufgelöst ist.

Frieren Sie die Mischung bei minus 20 Grad Celsius ein, tauen Sie nun die neue Lipidmischung vollständig auf, lassen Sie die Mischung bei Raumtemperatur und nicht in einer erhitzten Umgebung auftauen. Verwenden Sie nach insgesamt sechs Gefrier-Auftauzyklen einen handelsüblichen Extruder, um die Lipide zu extrudieren, indem Sie die gesamte Lipidsuspension zuerst durch einen 0,4-Mikron-Polycarbonat-Membranfilter und dann sechsmal durch einen 0,1-Mikron-Membranfilter drücken. Bei diesem Verfahren entstehen Partikel mit Durchmessern nahe 100 Nanometern.

Um das Ölreservoir herzustellen, bohren Sie zwei gegenüberliegende Löcher durch die Wand eines 1,5 Zentimeter langen Acrylzylinders mit einem Durchmesser von zwei Zoll. Die Löcher sollten einen Durchmesser von einem Millimeter und einen Zentimeter von der Unterseite entfernt sein. Bohren Sie dann zwei Vier-Millimeter-Löcher konzentrisch zu den zuvor gebohrten Ein-Millimeter-Löchern.

Die Tiefe der Löcher sollte jeweils einen Millimeter betragen. Achte darauf, dass du sie nicht ganz durchbohrst. Diese Löcher sind so gefertigt, dass sie auf die Gummidichtungen passen.

Platzieren und kleben Sie zwei Gummidichtungen mit einem Millimeter Innendurchmesser in die größeren Löcher, um ein Austreten von Öl zu verhindern. Kleben Sie dann die Maschine am Tag des Experiments mit einem beliebigen Mehrzweck-Epoxidharz auf einen Zylinder auf eine 10 Zentimeter mal 10 Zentimeter dünne Acrylplatte, schneiden Sie eine Länge von sieben Zentimetern aus Silberdrähten mit einem Durchmesser von 2 250 Mikrometern ab und tauchen Sie ihre Spitzen dann zwei Stunden lang in Bleichmittel. Um eine Silberchloridbeschichtung zu bilden, zeigt eine graue Farbe an, dass eine Silberchloridbeschichtung gebildet wurde.

Teilen Sie mit einem Glasschneider eine 10 Zentimeter lange Silikatglaskapillare mit einem Millimeter Außendurchmesser und einem Spitzendurchmesser von 58 Millimetern in zwei fünf Zentimeter lange Kapillaren. Füllen Sie die Kapillaren mit einer Ein-Milliliter-Spritze und einer 18-Gauge-Nadel mit stumpfer Spitze mit dem P-E-G-D-M-A-Hydrogel, um zu verhindern, dass das hydratisierte Hydrogel aus der Kapillare herausquillt. Halten Sie an den Spitzen einen Abstand von drei Millimetern ein und stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen in den Kapillaren befinden.

Führen Sie die Silber- und Silberchloridelektroden in die mit Hydrogel gefüllten Kapillaren ein. Das P-E-G-D-M-A-Hydrogel wird durch Photopolymerisation durch freie Radikale ausgehärtet, nachdem es zwei Minuten lang ultraviolettem Licht bei einem Watt mit einem ultravioletten Spot ausgesetzt wurde. Das Experiment wird unter einem Faradayschen Käfig aufgebaut, der an einer Masseverbindung am Patch-Verstärker geerdet ist. Befestigen Sie eine der Mikropipetten an einem geraden Mikroelektrodenhalter mit einem Stecker.

Verbinden Sie dann den Mikroelektrodenhalter mit der Kopfstufe des Patch-Verstärkers. Um den Kopftisch mit der Erdung zu verbinden, löten Sie einen isolierten 18-Gauge-Kupferdraht an einen geeigneten Anschluss für den Kopftisch, montieren Sie den Kopftisch auf einem dreiachsigen manuellen Mikromanipulator, indem Sie zuerst die Montageplatte des Kopftisches am Mikromanipulator befestigen und dann den Kopftisch mit der Montageplatte verbinden. Befestigen Sie die zweite Mikropipette mit den entsprechenden Schrauben über einen im Labor hergestellten Stecker am Linearantrieb und montieren Sie dann beide an einem zweiten Mikrom-Manipulator.

Die Mikropipetten sollten gegeneinander, ausgerichtet und horizontal nivelliert sein. Mischen Sie anschließend in einem Glasfläschchen 0,1 Milliliter der D-P-H-P-C-Liposomen mit 0,01 Milliliter der V 23 T Mescal-Protea-Liposomenlösung. Füllen Sie mit einer 34-Gauge-Microfill-Nadel die Spitzen beider Mikropipetten mit einer Proteosomenlösung.

Platzieren Sie das Reservoir auf der Oberseite eines aufrechten Mikroskops und führen Sie die Mikropipetten durch die gegenüberliegenden ein Millimeter großen Löcher. Füllen Sie dann das Reservoir bis zur Oberfläche mit Hexa-Dekan, um die kugelförmigen Tröpfchen an der Spitze der Mikropipetten zu bilden. Verwenden Sie eine dritte Mikropipette aus Bo-Silikatglas mit einem Durchmesser von 10 Mikrometern, die auf einem dritten Mikrom-Manipulator montiert ist, um verdünnte V 23 T Mezcal-Protea-Liposomenlösung an den Spitzen der Mikropipetten abzugeben und die Tröpfchen zu formen.

Kontrollieren Sie die Größe der Tröpfchen, indem Sie das Volumen nach Belieben verringern oder vergrößern, und lassen Sie sie 10 Minuten ruhen, damit sich die Monoschichten vollständig bilden können. Bringen Sie dann die Tröpfchen Schicht für Schicht in Kontakt. Die Bildung erfolgt innerhalb von ein bis zwei Minuten.

Nachdem Sie die Software und das Gerät wie im Textprotokoll beschrieben eingerichtet haben, verwenden Sie ein BNC-Kabel, um den Ausgang eines Signalgenerators mit dem Frontschalter des externen Befehlseingangs zu verbinden. Senden Sie eine Dreieckswellenform mit 10 Hertz und 500 Millivolt Spitze an die Kopfstufe. Mit dem microm-Manipulator.

Bewegen Sie die Mikropipetten aus Glas horizontal, um Tröpfchen in Kontakt zu bringen, bis sie sich leicht berühren, und warten Sie, bis die Doppelschicht dünner wird. Der Verlauf des Doppelschichtbildungsprozesses kann visuell durch das Mikroskop gesehen und durch Strommessung überwacht werden. Stellen Sie die Doppelschichtgröße auf einen Durchmesser von etwa 250 Mikrometern ein, indem Sie die Position des auf dem Aktuator montierten Tröpfchens mit dem Manipulator steuern, die Doppelschichtgröße kann visuell durch das Mikroskop geschätzt werden.

Sobald sich die Doppelschicht gebildet hat und stabil ist, stimulieren Sie die Tröpfchen, indem Sie ein sinusförmiges Signal mit einem Funktionsgenerator senden, um das in der Doppelschicht eingebaute Mezcal-Protein zu stimulieren. Senden Sie eine sinusförmige Wellenform mit einer Peak-to-Peak-Amplitude von 175 Mikrometern, einer Frequenz von 0,2 Hertz und einem Tastverhältnis von 50 % an den elektrischen Pieto-Server-Controller. Hier wird eine atypische Echtzeit-Stromaufzeichnung gezeigt.

Die gemessene Kapazität der Doppelschicht steigt schlagartig an, was auf eine Ausdünnung und Bildung von Doppelschichten hinweist, bevor sie einen stationären Zustand erreicht. Die Doppelschicht könnte gesteuert werden, indem die Position der Tröpfchen geändert wird, wenn der DIB mechanisch stimuliert wird, während ein konstantes Gleichstrompotential über die Membran aufrechterhalten wird. Die V 23 T-Mutante von Mezcal erzeugt zuverlässige Aktivitäten, die hauptsächlich subleitende Zustände und gelegentlich vollständige Öffnungsereignisse umfassen.

Das Gating tritt hauptsächlich bei maximaler Kompression auf, was darauf hindeutet, dass es mit einer Zunahme der Doppelschichtspannung zusammenhängt, wie es im Polardiagramm dargestellt ist. Hier wird die Fähigkeit dieser Technik hervorgehoben, andere Arten von Biomolekülen zu testen. Ethin, ein spannungsgesteuerter Ionenkanal, erhöht die Membranpermeabilität bei Anwendung eines DC-Transmembranpotentials One Master.

Diese Technik kann in zwei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Glaskapillaren nicht versehentlich zu zerbrechen oder auf andere Weise. Sie müssen das Setup neu starten und sicherstellen, dass alle Drähte nach der Entwicklung angeschlossen sind.

Diese Technik ebnete den Weg für Forscher auf dem Gebiet der dehnungsaktivierten Kanäle, um neue Methoden zu erforschen, mit denen äußere Kräfte zum Tor von DIB-eingebetteten Mechanismen-empfindlichen Kanälen übertragen werden können. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Tröpfchengrenzfläche für Schicht bildet, mechanoempfindliche Kanäle in die künstlichen Membranen einbaut und diese Kanäle mechanisch stimuliert.