Bakterielle Blatt Infiltration Assay für Bildende Charakterisierung pflanzlicher Abwehrreaktionen mit Hilfe der Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Immunantwort von Arabidopsis diliana durch einen optimierten Spritzeninfiltrationsassay quantitativ zu charakterisieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Spritzeninfiltration verwendet wird, um Bakterien manuell durch die natürlichen Öffnungen, die Sada genannt werden, in das Blatt einzubringen. Der zweite Schritt besteht darin, Scheiben aus infiziertem Blattgewebe zu erhalten, nachdem sich Krankheitssymptome entwickelt haben.

Anschließend werden die Bakterien durch Hochdurchsatz-Homogenisierung aus den Blattscheiben extrahiert. Der letzte Schritt ist die serielle Verdünnung und das Aufleuchten auf Bakterienzählplatten, um die Kolonien zu zählen. Letztendlich kann das Bakterienwachstum in jedem Blattdiss mit der relativen Stärke der pflanzlichen Immunantwort korreliert werden.

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der pflanzlichen Immunität zu beantworten, wie z. B. die Identifizierung von Genen, die zu Abwehrreaktionen gegen biotischen Stress beitragen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass sie eine genaue Quantifizierung des Krankheitserregerwachstums im infizierten Pflanzengewebe ermöglicht und dazu beiträgt, experimentelle Fehler zu vermeiden, die durch die Probenahme von Blättern mit unterschiedlichem Entwicklungsstatus verursacht werden. Diese Methode kann Einblicke in die Immunantwort von Pflanzen auf eine Infektion mit einem virulenten bakteriellen Krankheitserreger geben und sie kann auch auf andere Systeme wie Salicylsäure oder mikrobenassoziierte molekulare Muster angewendet werden, die Immunreaktionen auslösen.

Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten, die Bakterien ohne Gewebeschäden in das Blatt zu bringen. Das folgende Verfahren wird von Postdoktoranden, Hindus und Doktoranden Shalu und Yali demonstriert. Demnächst wird der Assay für eine erhöhte Krankheitsanfälligkeit in meinem Labor in diesem Video demonstriert.

Vor dem Experiment werden King's B- oder KB-Medienplatten vorbereitet, ein Liter KB-Festmedium wie im Protokolltext beschrieben hergestellt und auf einer magnetischen Rührplatte abkühlen gelassen. Wenn das Medium abgekühlt wird, um es bei 80 % Glycerin, einem molaren Magnesiumsulfat und Streptomycin zu berühren, gießen Sie zwei verschiedene Größen von KB-Medienplatten auf das Medium. Die kleinere Petrischale dient als primäre Bakterienkulturplatte und die größere Petrischale als Bakterienzählplatte.

Lagern Sie die Platten zwei Tage vor dem Assay bei vier Grad Celsius. PSM ES 43 26. Bakterien aus einem negativen 80 Grad Celsius Glycerinbestand auf einer KB Streptokokken-Bakterien-Kulturplatte und inkubieren am folgenden Tag 24 bis 48 Stunden lang bei 28 Grad Celsius.

Die Flüssigkultur wird in einem sterilen Reagenzglas mit vier Millilitern flüssigem kb-Medium eingeleitet, das 50 Mikrogramm Streptomycin pro Milliliter enthält. Schütteln Sie über Nacht eine 250 U/min bei 28 Grad Celsius. Die Arabidopsis-Pflanzen für das Experiment werden unter den im Protokolltext beschriebenen Bedingungen am selben Tag gezüchtet, an dem die Flüssigbakterienkultur gestartet wird.

Markieren Sie die Blütenblätter der Blätter Nummer fünf und sechs mit einem stumpfen und wasserfesten Marker, um infiziertes Gewebe bei der Probenahme leicht zu identifizieren. Um die Öffnung von STA zu verbessern und das Eindringen von Erregerlösung in das Blattwasser zu erleichtern. Die Pflanzen gut, indem Sie die Wohnung 20 Minuten lang von unten einweichen.

Nach 20 Minuten das überschüssige Wasser abgießen. Die Infektion der Arabidopsis-Pflanzen wird durchgeführt. Am Tag nach Beginn der Flüssigkultur.

Übertragen Sie die Bakterienkultur in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und schleudern Sie sie zwei Minuten lang bei 9.600 g. Bei Raumtemperatur den Überstand entsorgen und das Bakterienpellet mit einem Milliliter sterilem 10 Millimolar Magnesiumchlorid resuspendieren; die Bakteriensuspension mit neun Millilitern 10 Millimolar Magnesiumchlorid in einem 50 Milliliter Zentrifugenröhrchen verdünnen. Nach Messung der optischen Dichte der Bakterien verdünnen Sie die Bakterien mit 10 Millimolar Magnesiumchlorid auf einen End-OD 600 von 0,0002.

Für den EDS-Infektionsassay. Für die Infiltration wird eine nadellose Spritze mit einem stumpfen Milliliter verwendet, die allgemein als Insulinspritze bekannt ist. Füllen Sie die Spritze mit 0,5 bis 0,6 Millilitern der verdünnten Bakterienlösung, um den Infiltrationsprozess viel besser kontrollieren zu können, füllen Sie die Spritze nicht bis zum vollen Fassungsvermögen.

Legen Sie die Unterseite des Blattes auf der Oberseite des Zeigefingers frei und passen Sie dann mit Hilfe des Daumens vorsichtig die Blattposition an. Positionieren Sie die Spritze senkrecht gegen die Blattoberfläche, um eine gleichmäßige Druckverteilung zu gewährleisten und Blattschäden zu reduzieren. Versuchen Sie, den Mittelrippenbereich während der Infiltration zu meiden.

Drücken Sie langsam auf den Kolben, um die Bakterienlösung zu infiltrieren. Der Eintritt von Flüssigkeit in das Blattmesophyll wird visualisiert, wie durch die dunklere Blattfarbe angezeigt, infiltriert die gesamte Oberfläche des Blattes, auch wenn mehrere Versuche erforderlich sind. Sobald die Infiltration abgeschlossen ist, tupfen Sie das Blatt vorsichtig mit saugfähigem Tuch ab, um die überschüssige Erregerlösung zu entfernen.

Untersuchen Sie das infizierte Blattgewebe visuell auf Beschädigungen. Lassen Sie die infiltrierten Pflanzen ein bis zwei Stunden trocknen und bringen Sie die Pflanzen in ihre ursprünglichen Wachstumsbedingungen zurück. Besprühen Sie eine durchsichtige Kuppel mit Wasser und decken Sie die befallenen Pflanzen zwei Stunden lang ab.

Knacken Sie dann die Kuppel, um eine zwei bis drei Zoll große Öffnung zu erzeugen, und lassen Sie sie für den Rest des Infektionsexperiments, das normalerweise drei Tage dauert, eingeschaltet. Einen Tag vor der Quantifizierung des Erregerwachstums. Trocknen Sie die 150 Millimeter x 15 Millimeter großen KB-Medienplatten vor.

Trocknen Sie die Platten, indem Sie sie etwa 24 Stunden lang bei Raumtemperatur aufbewahren. Verarbeiten Sie das infizierte Gewebe nach dem Auftreten von Sklerose, was durch die Gelbfärbung des infizierten Gewebes bei den anfälligen Genotypen angezeigt wird, jedoch vor der Entwicklung nekrotischer Läsionen. Bereiten Sie für jeden Genotyp sechs Mahlröhrchen vor.

Legen Sie eine Mahlkugel aus Edelstahl und geben Sie 500 Mikroliter steriles, 10 millimolares Magnesiumchlorid in jedes Röhrchen. Als nächstes lösen Sie das infizierte Blatt von der Pflanze und stanzen Sie eine Blattscheibe mit einer Einloch-Papierstanze nach dem Zufallsprinzip mit einer Pinzette, legen Sie zwei Blattscheiben von zwei verschiedenen Pflanzen in jedes Mahlrohr. Verschließen Sie die Röhrchen, homogenisieren Sie das Gewebe mit einem Homogenisator mit hohem Durchsatz bei maximaler Geschwindigkeit für 10 Minuten.

Wiederholen Sie diesen Vorgang bei Bedarf, bis das Gewebe gut homogenisiert ist und die Lösungen aufgrund der Chlorophyllfreisetzung aus den infizierten Blättern während des Wartens grün werden. Für die Homogenisierung wird jede Vertiefung in den ersten sechs Reihen einer 96-Well-Kulturplatte mit 180 Mikrolitern 10 millimolares Magnesiumchlorid gefüllt. Übertragen Sie 20 Mikroliter der gemahlenen Gewebesuspension in jede Vertiefung der ersten Reihe der 96-Well-Platte und mischen Sie, indem Sie die Flüssigkeit wiederholt auf und ab pipettieren.

Wenn kleine Gewebefragmente die Spitze verstopft haben, schneiden Sie sie um zwei bis drei Millimeter ab, um das richtige Volumen der Lösung zu erhalten und genügend Platz für den Tropfen auf der Oberseite der Platte zu schaffen, um das Gewebe verschiedener Genotypen in abwechselnden Reihen zu platzieren. Um eine zehnfache serielle Verdünnung herzustellen, geben Sie 20 Mikroliter Gewebesuspension in die zweite Reihe und wiederholen Sie diesen Vorgang bis zur sechsten Verdünnung. Übertragen Sie mit geteilten Pipettenspitzen 20 Mikroliter der Lösung von der Wandplatte 96 auf die 150 Millimeter x 15 Millimeter große KB-Platte.

Arbeiten Sie von der am stärksten verdünnten Suspension bis zur konzentriertesten, so dass es nicht erforderlich ist, die Pipettenspitzen zwischen der Verdünnung zu wechseln. Trocknen Sie die Platte bei Raumtemperatur mit rissigem Deckel. Sobald keine Flüssigkeit mehr auf der Plattenoberfläche zu sehen ist, schließen Sie den Deckel, drehen Sie ihn um und inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur.

Inkubieren Sie die Platten 40 bis 60 Stunden lang, bis die Bienenvölker sichtbar werden. Vergewissern Sie sich, dass die Bakterien auf den Platten das Vorhersagbare Zehnfache widerspiegeln. Rückgang der koloniebildenden Einheiten.

Zähle die Bakterien, bevor sie überwuchern und Kolonien verschmelzen. Bestimmen Sie die Anzahl der Bakterien in der geringsten Verdünnung, die keine überlappenden Kolonien aufweisen. In der Regel enthält die bevorzugte zu zählende Verdünnung zwischen 10 und 50 Völker und kann je nach technischem Replikat variieren.

Um den Grad der bakteriellen Vermehrung zu berechnen, bestimmen Sie die Anzahl der koloniebildenden Einheiten pro Blattscheibe mit dieser Formel, wobei R die Anzahl der Reihe und T die Anzahl der Bakterien innerhalb jedes technischen Replikats ist. Die Daten werden dann verwendet, um ein Diagramm zu erstellen. Jeder Datenpunkt wird als Mittelwert von sechs technischen Replikaten auf einer logarithmischen Skala dargestellt.

Aerobars stellen das 95%-Konfidenzintervall der mittleren verstärkten Erkrankung dar. Die Empfindlichkeit gegenüber P-S-M-E-S 43, 26 wurde durch Infektion mit einem Inokulum mit einem OD 600 von 0,0002 beurteilt. Die Ergebnisse zeigen, dass die hochanfälligen NPR-Mutanten mit einem Strich und einem Strich ein etwa 2,5-faches oder 300-mal höheres Erregerwachstum aufweisen als die Wildtyp-Columbia-Nullpflanzen.

Der Spritzeninfiltrationsassay kann modifiziert werden, um verschiedene Schichten der Immunantwort zu beurteilen. Um die durch Salicylsäure ausgelöste Immunität zu bewerten, wird die externe Applikation von Natriumsalicylat verwendet, um die Immunantwort auszulösen, die durch das Erregerwachstum quantifiziert wird. Der Verlust von NPR R one, das als Salicylsäurerezeptor fungiert und eine wichtige transkriptionelle Co-Regulation von Salicylsäure-abhängigen Zielgenen darstellt, führt zu einer Unempfindlichkeit gegenüber exogener Anwendung des Salicylsäurederivats.

Um die mikrobenassoziierte Immunität durch molekulare Muster zu charakterisieren, wurden die Pflanzen mit zwei bekannten Auslösern vorbehandelt. FLAG 22 und L 18, die mit FLAG 22 behandelten Wildtyp-Columbia-Nullpflanzen, unterstützten eine ein- oder 10-fache Reduzierung der Bakterienpopulation, während die beiden mutierten FLS-Pflanzen den bakteriellen Wachstumsrestriktionseffekt nicht auslösten. In ähnlicher Weise waren die EFR-mutierten Pflanzen unempfindlich gegenüber der L 18-Vorbehandlung.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die arabische opsys-Immunantwort durch den Spritzeninfiltrationsassay quantifizieren können. Bei diesem Eingriff ist es wichtig, daran zu denken, die Krankheitsentwicklung zu überwachen und das Gewebe nach dem Auftreten der Korsis zu beproben. Die Pseudomona pather cul cola S phos 3, 2 6 ist ein hemi-atrophischer Erreger.

Daher sollte die Probenahme vor dem Übergang in das neurotrophe Stadium durchgeführt werden. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie quantitative real-time PCR und westliche Blutanalyse durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. welcher bestimmte Immunsignalweg gestört ist. Vergessen Sie nicht, dass Sie mit lebenden Bakterien arbeiten.

Obwohl Pseudomona Senge beim Menschen nicht pathogen ist, denken Sie bitte daran, kontaminierte Verbrauchsmaterialien und infizierte Pflanzen ordnungsgemäß zu entsorgen, während Sie dieses Verfahren durchführen.