Name: Bakterielle Blatt Infiltration Assay für Bildende Charakterisierung pflanzlicher Abwehrreaktionen mit Hilfe der Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: Lernen Sie die optimierte Spritzeninfiltration zur quantitativen Charakterisierung der Immunantwort von Arabidopsis thaliana. Diese Methode ermöglicht präzise Quantifizierung des Bakterienwachstums.

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Wir danken Dr. Shahid Mukhtar für die Kritik am Manuskript und Dr. Xinnian Dong für die Beispieldatenanalysedatei. Diese Arbeit wird durch einen NSF-CAREER-Preis (IOS-1350244) der KPM und des UAB Biology Department unterstützt.

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Mit abnehmender verfügbaren Ackerland und wachsende Bevölkerung, sind die Forscher auf der ganzen Welt mit der dringendsten Bedürfnisse für die Verbesserung von Kulturpflanzen in Frage gestellt. Die Ausbeute kann stark durch verschiedene biotische und abiotische Stressfaktoren beeinflusst werden. Unter ihnen ist Pathogeninfektion eine der führenden Ursachen für Ernteertragsreduktion, für ca. 12% Verluste allein in den USA 45 verantwortlich. Um dieses Problem zu beheben, hat massive Forschung im Modell Arabido...

Aufgrund ihrer sessilen Natur werden Pflanzen ständig von einer Vielzahl von Krankheitserregern, die verschiedene Lebensweisen und Ernährungsstrategien 1 bedroht. In erster Näherung, biotrophen Erreger behalten ihre Gastgeber, am Leben zu Nährstoffen abzurufen, während nekrotrophe Krankheitserreger aktiv geheime Giftstoffe und Enzyme, um Wirtsgewebe töten und ernähren sich von den toten Zellen 1. Eine weitere Gruppe von Krankheitserregern, bezeichnet hemibiotrophs beginnt ihre Infektion natürlich mit der biotrophen Bühne und verschiebt sich nach nekrotrophe Stufe bei Erreichen einer bestimmten Schwelle von pathogenen Ansammlung 2. Um sich gegen diese Mikroorganismen wirksam zu verteidigen, haben Pflanzen einen komplizierten angeborenen Immunsystems mit mehreren Überwachungsmechanismen ausgestattet, um den Erreger Angriff zu erkennen und auslösen entwickelt lokalisiert programmierten Zelltod 3 sowie Systemische Akquirierte Resistenz (SAR) 4. Die aktuelle Forschung auf die Charakterisierung der wesentlichen sig konzentriertnaling Komponenten und Quer Gespräche innerhalb der Anlage Immunsystem 5. Wie in der &quot;Zig-Zag&quot; Modell 5 vorgeschlagen, die erste Schicht der Anlage angeborenen Immunantwort erfordert die Anwesenheit von Plasmamembran lokalisierte pattern recognition receptors (PRR), um die Invasion einer Mikrobe zu erkennen. PRRs können Microbe-associated molecular patterns (mAmps) zu erkennen und zu etablieren MAMP-Triggered Immunity (MTI) 6. Neben Induktion eines Transkriptions-Hochregulierung von Genen antimikrobielle PR-Proteinen 7 kodiert, führt MTI auf eine Vielzahl von Ereignissen, die das Wachstum des Pathogens, einschließlich der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und reaktive Stickstoffspezies (RNS), Abscheiden Callose an die Zellwand zu verhaften sowie die Aktivierung von mehreren Kinase Signalwege 8. Bis jetzt wurden mehrere MAMPS identifiziert MTI in Arabidopsis auslösen, einschließlich bakterieller flg22 9 </sup&gt; (Ein 22 Aminosäurefragment von Flagellin abgeleitet) elf18 10 (18 Aminosäuren aus dem bakteriellen Elongationsfaktor Tu Übersetzung) und einem strukturellen Zellwandkomponente Peptidoglykane 11. Um eine erfolgreiche Infektion zu etablieren, haben einige spezielle Krankheitserreger die Möglichkeit, geheime Virulenz Effektor-Proteine ​​in die intrazelluläre oder interzellulären Räumen entwickelt und damit zu unter MTI und lösen Effektor-Triggered Anfälligkeit (ETS) 12,13. Zum Beispiel können die Virulenz Effektoren Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK) Phosphorylierungskaskaden MTI zu inaktivieren, um die Entwicklung der Erkrankung in dem infizierten Gewebe 14-16 induzieren. Während der dynamischen Koevolution zwischen Hosts und Krankheitserreger, Pflanzen entwickelte auch die Gegenstrategie, die Effektor-Proteine ​​erkennen und dämpfen das Pathogen Virulenz Moleküle 17. Diese direkte oder indirekte Effektor Erkennung durch Krankheitsresistenz (R) 18-Proteine ​​vermittelt wird. Meiste tSaum sind Mitglieder der NB-LRR (Nukleotid-Bindungs ​​und Leucin-reichen Wiederholungen) Familie 19. Die Wahrnehmung eines avirulenten Effektorzellen durch ein R-Protein löst eine stärkere und breitere Immunantwort charakterisiert als Effektor-Triggered Immunity (ETI) 20. Neben der Induktion der Expression von Abwehrgene 21 und die Produktion von Verteidigungsmetaboliten 22, ETI führt oft zu einer raschen lokalisierten programmierten Zelltod als hypersensible Reaktion (HR) bekannt, die Pathogen-Ausbreitung in das benachbarte Gewebe 3 zu beschränken. Neben der lokalisierten programmierten Zelltods 23, sind Pflanzen der Lage, eine langfristige und systemweiten Immunantwort bezeichnet Systemische Akquirierte Resistenz (SAR) 4. Bei Provokation mit einem biotrophe Erreger, Pflanzenzellen auszulösen, die Biosynthese und Akkumulation eines endogenen Phytohormon Salicylsäure (SA) und PR-Proteinen sowohl in lokalen und systemischen Geweben 24. Durch tsein Verfahren ein gesteigertes Zustand der Bereitschaft in den nicht-infizierten Blättern, die für die Montage schneller Abwehrreaktionen bei einer nachfolgenden Infektion durch ein breites Spektrum von Erregern 24 ermöglicht erreicht. SA und ihre synthetischen Analoga, wie Benzo (1,2,3) thiadiazol-7-thiocarbonsäure-S-methyl ester (BTH) und 2,6-Dichlorisonicotinsäure (INA) in der Lage sind, chemisch zu induzieren Salicylsäure (SA) -Triggered Immunity (STI) bei der externen Anwendung 24. Nonexpressor der Pathogenese-Assoziierte Gene 1 (NPR1) wird vorgeschlagen, einer der SA-Rezeptoren und wirkt als Haupttranskriptionsregulator während SA-vermittelte Abwehrreaktion sowohl in lokalen und systemischen Geweben 21,25,26 sein. Es hat sich eindeutig gezeigt, dass NPR1 für SAR Einrichtung erforderlich ist, und der Verlust von NPR1 führt zu dramatischen Anfälligkeit gegenüber Pseudomonas syringae 25. Um umfassend charakterisieren die molekularen Beitrag der PflanzenKomponenten in den Pflanzen-Pathogen-Interaktionen, mehrere Biotests wurden entwickelt, um spezifische Abwehr Veranstaltungen zu messen, einschließlich ROS Burst 27, Kallose-Abscheidung 28, Verteidigung Gene Expression und Anhäufung von ihrer Proteinprodukte 21. Während diese Einzeltests können Einblicke in eine spezifische Form der Pflanze Immunantwort bereitzustellen, keiner von ihnen ist jedoch in der Lage sind, das komplette Abwehrreaktion an der gesamten Pflanze Ebene darstellen. Umgekehrt ist die Quantifizierung der Pathogen Wachstum nach der Infektion bietet eine Gesamtschätzung der Immunantwort auf der organismischen Ebene. Daher ist die Entwicklung und Optimierung von einem präzisen und hoch standardisierte Erreger Inokulation Assay kritischen Kraftstoff den Forschungen und Entdeckungen auf den Arabidopsis Immunantworten. Pseudomonas syringae, ein Gram-negatives Bakterium, wurde als Phytopathogen Lage verursacht Krankheit in einem Bereich von Wirten, einschließlich Pflanzen Arabidops identifiziertenist 29. Als Modellpflanze-Pathogen-System, das Arabidopsis - P. syringae Interaktion wurde in großem Umfang angewendet, um die molekularen Mechanismen zugrunde liegenden Pflanzenabwehrreaktionen 29 zu verstehen. Bisher über 50 P. syringae Pathovare wurden basierend auf ihrer Fähigkeit, verschiedene Pflanzenarten infizieren 30 identifizierten . P. syringae pv. tomato DC3000 (Pst DC3000) 31 und P. syringae pv. maculicola ES4326 (PSM ES4326) 32 sind die beiden am weitesten verbreitete und umfassend charakterisiert virulenten Stämmen. Abgesehen davon, dass durch die Pflanze erkannt und Auslösen des MTI Reaktion Pst DC3000 und PSM ES4326 sind zur Sekretion virulenten Effektorproteine ​​MTI drücken und lösen ETS, das Wachstum des Pathogens 31,33 begünstigen. Funktionell sezieren die Interaktion zwischen Arabidopsis und P. syringae, multiple0; Pathogeninfektion Methoden wurden auf der Grundlage des Erregers Liefer Ansatz entwickelt. Für Bodenkultur Pflanzen, können Krankheitserreger mit einer Spritze Infiltration, Vakuuminfiltration, Tauch Inokulation und Sprühinokulation 29,34 geliefert werden. Vor kurzem wurde Sämling Flut Inokulation Assay entwickelt, um große Bildschirme auf Gewebekulturplatten durchführen wachsenen jungen Arabidopsis-Pflanzen 35. Syringe Infiltration, als einer der am häufigsten verwendeten Ansatz, manuell liefert die Erreger in den Apoplasten durch die natürlichen Blattöffnungen bezeichnet Spaltöffnungen 29. Durch diesen Ansatz, gleiche Mengen von P. syringae in die befallenen Blatt infiltriert werden und die Stärke der pflanzlichen Immunantwort ist umgekehrt an die das Wachstum des Pathogens Niveaus korreliert. Daher dient die Quantifizierung der Pathogen Wachstum als eine optimale Vorgehensweise, um die Immunfunktion im gesamten Werksebene zu bewerten. Darüber hinaus können Spritzen Infiltration der lokalen und systemischen Gewebe zu unterscheiden, worin B kanne in der Charakterisierung der molekularen Mechanismen SAR 36 erhoben. In dem folgenden Protokoll beschreiben wir eine optimierte Spritze Infiltration Assay mit Psm ES4326 um Arabidopsis-Mutanten für erhöhte Krankheitsanfälligkeit (EDS) zu screenen. Dieses Protokoll wird zwei Arabidopsis-Genotypen zu beschäftigen: ein Wildtyp-Ökotyp Columbia-0 (Col-0), Pflanzen (Kontrolle) und npr1-1 loss-of-function-Mutanten (hypersusceptible) das wird mit virulenten Bakterienstamm Psm ES4326 37 infiziert werden. Die npr1-1 Mutante trägt eine Punktmutation in der Ankyrin-Repeat-Consensussequenz des NPR1 Molekül, das die hoch konservierten Histidin zu Tyrosin verändert und macht das Protein nicht-funktionellen 25. Darüber hinaus ist eine Anzahl von Modifikationen der Spritze Infiltration Assay beschrieben, die die Quantifizierung von Fehlern in den spezifischen Schichten aus Immunantwort, einschließlich MTI und STI ermöglichen.

<table><tbody><tr><td>MetroMix 360&nbsp;</td><td>Grosouth</td><td>SNGMM360</td><td></td></tr><tr><td>Große Töpfe</td><td>Grosouth</td><td>TEKUVCC10TC</td><td></td></tr><tr><td>12 x 6 Einsätze</td><td>Grosouth</td><td>LM1206</td><td></td></tr><tr><td>11x 21 Flats ohne Löcher</td><td>Grosouth</td><td>LM1020</td><td></td></tr><tr><td>11x 21 Flats mit Löchern</td><td>Grosouth</td><td>LM1020H</td><td></td></tr><tr><td>Vinyl-Anzuchtkuppeln</td><td>Grosouth</td><td>CW-221</td><td></td></tr><tr><td>Proteose Pepton</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0122-17-4</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat Dibasisches Trihydrat&nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>151946</td><td></td></tr><tr><td>Agar&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A360-500</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycinsulfat</td><td>Bio Basic Inc</td><td>SB0494</td><td></td></tr><tr><td>100 x 15 mm Petrischalen</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>150 x 15 mm Petrischalen</td><td>Fisher Scientific</td><td>R80150</td><td></td></tr><tr><td>Rechteckige Platte</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-450&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 Hexahydrat</td><td>Bio Basic Inc</td><td>MB0328</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Bio Basic Inc</td><td>GB0232</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&nbsp; </td><td>Bio Basic Inc</td><td>MN1988</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Spritze</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9992493&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-A</td><td></td></tr><tr><td>Mahlrohre&nbsp;</td><td>Denville Scientific</td><td>B1257</td><td></td></tr><tr><td>Kappen zum Schleifen von Röhrchen</td><td>Denville Scientific</td><td>B1254</td><td></td></tr><tr><td>Edelstahl-Schleifkugel</td><td>Fisher Scientific</td><td>2150</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platte&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-556-008</td><td></td></tr><tr><td>Natriumsalicylat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>s3007-1kg</td><td></td></tr><tr><td>flg22 (QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA)</td><td>Genescript</td><td>Auf Bestellung</td><td></td></tr><tr><td>elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)</td><td>Genescript</td><td>Auf Bestellung</td><td></td></tr><tr><td>Locher</td><td>Klammern</td><td>146308</td><td></td></tr><tr><td>Biophotometer plus</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td>952000006</tr><tr><td>PowerGen Hochdurchsatz-Homogenisator</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-503</td><td></td></tr><tr><td>Akku-Spin-Mikrozentrifuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-675</td><td></td></tr><tr><td>Mehrkanalpipette (10-100 & Mikro; l)</td><td>Eppendorf</td><td>3122 000.043</td><td></td></tr><tr><td>Mehrkanalpipette (30-300 & Mikro; l)</td><td>Eppendorf</td><td>3122 000.060</td><td></td></tr><tr><td>Pipette (20&Mikro; l)</td><td>Eppendorf</td><td>3120 000.038</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen</td><td>Fisher Scientific</td><td>3552-HR</td><td></td></tr><tr><td>Sharpie Permanent</td><td>Marker Staples</td><td>507130</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Tube</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-890</td><td></td></tr></tbody></table>

bakterielle blatt infiltration assay für bildende charakterisierung pflanzlicher abwehrreaktionen mit hilfe der<em&gt; arabidopsis thaliana-pseudomonas syringae</em&gt; pathosystem

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

In Abwesenheit von spezialisierten mobilen Immunzellen, Pflanzen nutzen ihre lokalisierten programmierten Zelltod und Systemische Akquirierte Resistenz, sich gegen Pathogenbefall verteidigen. Der Beitrag einer speziellen Arabidopsis Gens an der Gesamtanlage Immunantwort spezifisch und quantitativ durch Bestimmung des Wachstum des Pathogens im infizierten Gewebe bewertet. Seit über drei Jahrzehnten, die hemibiotrophe Bakterium Pseudomonas syringae pv. Maculicola ES4326 (PSM ES4326) wurde weithin als Modell Erreger, die molekularen Mechanismen der Arabidopsis Immunantwort zugrunde liegenden Untersuchung angewendet. Um Krankheitserreger in das Blattgewebe zu liefern, haben mehrfache Impfung Verfahren festgelegt, beispielsweise Spritzen Infiltration, dip Inokulation, Spray, Vakuuminfiltration, und Hochwasser Inokulation. Das folgende Protokoll beschreibt eine optimierte Spritze Infiltrationsverfahren zu virulenten Psm ES4326 in Blätter von erwachsenen liefernBodenkultur Arabidopsis-Pflanzen und genau Bildschirm für erhöhte Krankheitsanfälligkeit (EDS) gegenüber diesem Erreger. Zusätzlich kann dieses Protokoll mit mehreren Vorbehandlungen, ergänzt werden, um spezifische Immundefekten weiter zerlegen innerhalb unterschiedlicher Schichten des pflanzlichen Abwehr einschließlich Salicylsäure (SA) -Triggered Immunity (STI) und MAMP-Triggered Immunity (MTI).

Das Protokoll beschreiben wir hier stellt eine optimierte P. syringae Spritze Infiltration Assay eine quantitative Bewertung der Immunantwort in Arabidopsis-Pflanzen. Wie in Figur 1 dargestellt ist, ist die Spritze Infiltration Psm ES4326 von Pathogen-Extraktion und Quantifizierung über serielle Verdünnungen und Kolonien Aufzählung folgt. Wie in Schritt 3 im Protokolltext beschrieben, kann Verbesserte Krankheitsanfälligkeit (EDS) gegen Psm...

Die Quantifizierung des Erregerwachstums ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Charakterisierung verschiedener Immunantworten von Arabidopsis thaliana (im Folgenden: Arabidopsis). Das hier beschriebene Verfahren stellt einen optimierten Spritzeninfiltrationsassay zur Quantifizierung der Pseudomonas syringae pv dar. Maculicola ES4326-Wachstum in adulten Arabidopsis-Blättern.

Bakterielle Blatt Infiltration Assay für Bildende Charakterisierung pflanzlicher Abwehrreaktionen mit Hilfe der<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Immunantwort von Arabidopsis diliana quantitativ mittels eines optimierten Spritzeninfiltrationsassays zu charakterisieren. Dies wird zunächst erreicht, indem Bakterien mithilfe der Spritzeninfiltration manuell über die natürlichen Öffnungen, sogenannte Sada, in das Blatt eingeleitet werden. Der zweite Schritt besteht darin, nach Auftreten von Krankheitssymptomen Scheiben des infizierten Blattgewebes zu gewinnen. Anschließend werden die Bakterien durch Hochdurchsatz-Homogenisierung aus den Blattscheiben extrahiert. Der letzte Schritt besteht in der seriellen Verdünnung und Auftragung auf bakterielle Auszählplatten, um die Kolonien zu zählen. Letztendlich kann das bakterielle Wachstum in jeder Blattscheibe mit der relativen Stärke der pflanzlichen Immunantwort korreliert werden.Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der pflanzlichen Immunität zu beantworten, beispielsweise die Identifizierung von Genen, die zur Abwehrreaktion gegen biotischen Stress beitragen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass sie eine präzise Quantifizierung des Pathogenwachstums im infizierten Pflanzengewebe ermöglicht und hilft, experimentelle Fehler zu vermeiden, die durch die Entnahme von Blättern mit unterschiedlichem Entwicklungsstand verursacht werden. Diese Methode kann Erkenntnisse über die pflanzliche Immunantwort auf eine Infektion mit einem virulenten bakteriellen Pathogen liefern und kann auch auf andere Systeme angewendet werden, beispielsweise auf immunologische Reaktionen, die durch Salicylsäure oder mikrobenassoziierte molekulare Muster ausgelöst werden.Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, die Bakterien in das Blatt zu bringen, ohne das Gewebe zu beschädigen. Die folgende Prozedur wird von dem Postdoktoranden Hindu sowie den Doktorandinnen Shalu und Yali demonstriert. Bald aus meinem Labor wird in diesem Video der Assay zur Untersuchung der erhöhten Krankheitsanfälligkeit gezeigt.Vor dem Experiment bereiten Sie King's B- oder KB-Agarplatten vor, indem Sie einen Liter KB-Festmedium gemäß der Beschreibung im Protokolltext herstellen und auf einem magnetischen Rührer abkühlen lassen. Wenn das Medium handwarm abgekühlt ist, geben Sie 80 % Glycerin, eine molare Magnesiumsulfatlösung und Streptomycin hinzu, mischen die Lösung gut durch und gießen zwei Größen von KB-Agarplatten. Die kleinere Petrischale dient als primäre Bakterienkulturplatte, die größere Petrischale als Bakterienzählplatte.Lagern Sie die Platten zwei Tage vor der Assay-Bestreichung bei vier Grad Celsius. PSM ES 43 26. Entnehmen Sie Bakterien aus einer Glycerinlagerkultur bei minus 80 Grad Celsius auf eine KB-Strep-Bakterienkulturplatte und inkubieren Sie diese am folgenden Tag bei 28 Grad Celsius für 24 bis 48 Stunden.Beginnen Sie die Flüssigkultur in einem sterilen Reagenzglas mit vier Millilitern flüssigem KB-Medium, das 50 Mikrogramm pro Milliliter Streptomycin enthält. Schütteln Sie über Nacht bei 250 U/min bei 28 Grad Celsius. Die Arabidopsis-Pflanzen für das Experiment werden am selben Tag, an dem die bakterielle Flüssigkultur angesetzt wird, unter den im Protokolltext beschriebenen Bedingungen kultiviert.Kennzeichnen Sie die Blütenblätter der Blätter Nummer fünf und sechs mit einem stumpfen, wasserfesten Stift, um eine einfache Identifizierung des infizierten Gewebes bei der Probenahme zu ermöglichen. Um das Öffnen der STA zu verbessern und den Eintritt der Pathogenlösung in das Blattwasser zu erleichtern, gießen Sie die Pflanzen gründlich, indem Sie das Pflanzgefäß von unten 20 Minuten lang einweichen.Nach 20 Minuten das überschüssige Wasser abgießen. Die Infektion der Arabidopsis-Pflanzen wird am Tag nach der Inokulation der Flüssigkultur durchgeführt.Überführen Sie die Bakterienkultur in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie sie zwei Minuten lang mit 9.600 G. Entsorgen Sie bei Raumtemperatur den Überstand und resuspendieren Sie das Bakterienpellet in einem Milliliter sterilem 10-Millimolar-Magnesiumchlorid. Verdünnen Sie die Bakteriensuspension mit neun Millilitern 10-Millimolar-Magnesiumchlorid in einem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Nach der Messung der optischen Dichte der Bakterien verdünnen Sie die Bakterien mit 10-Millimolar-Magnesiumchlorid auf eine endgültige OD 600 von 0,0002.Für den EDS-Infektionsassay. Eine einteilige Einmalspritze mit stumpfem Ende mit einem Fassungsvermögen von einem Milliliter, allgemein als Insulinspritze bekannt, wird zur Infiltration verwendet. Füllen Sie die Spritze mit 0,5 bis 0,6 Milliliter der verdünnten Bakterienlösung, um eine deutlich bessere Kontrolle während des Infiltrationsvorgangs zu erzielen; füllen Sie die Spritze nicht bis zur maximalen Kapazität.Legen Sie die Unterseite des Blattes auf der Oberseite des Zeigefingers frei und justieren Sie mit Hilfe des Daumens vorsichtig die Position des Blattes. Positionieren Sie die Spritze senkrecht zur Blattoberfläche, um eine gleichmäßige Druckverteilung zu gewährleisten und so Schäden am Blatt zu minimieren. Vermeiden Sie während der Infiltration den Bereich der Mittelrippe.Drücken Sie den Kolben langsam, um die Bakterienlösung einzubringen. Das Eindringen der Flüssigkeit in das Blattmesophyll wird durch eine dunklere Blattfärbung sichtbar. Infiltrieren Sie die gesamte Blattoberfläche, auch wenn mehrere Versuche erforderlich sind. Nach Abschluss der Infiltration wird das Blatt vorsichtig mit saugfähigem Papier abgetupft, um die überschüssige Pathogenlösung zu entfernen.Untersuchen Sie das infizierte Blattgewebe visuell auf Schäden. Lassen Sie die infiltrierten Pflanzen eine bis zwei Stunden trocknen und stellen Sie die Pflanzen danach wieder an ihre ursprünglichen Wachstumsbedingungen zurück. Sprühen Sie eine klare Haube mit Wasser und bedecken Sie die infizierten Pflanzen dafür zwei Stunden lang.Danach die Haube anbrechen, um eine Öffnung von zwei bis drei Zoll zu erzeugen, und sie während des restlichen Infektionsversuchs, der gewöhnlich drei Tage dauert, geöffnet lassen. Einen Tag vor der Quantifizierung des Pathogenwachstums die KB-Medienplatten mit 150 Millimeter mal 15 Millimeter im Voraus austrocknen.Trocknen Sie die Platten, indem Sie sie etwa 24 Stunden bei Raumtemperatur belassen. Verarbeiten Sie das infizierte Gewebe nach dem Auftreten von Sklerose, die durch Vergilbung des infizierten Gewebes in den empfänglichen Genotypen angezeigt wird, jedoch vor der Ausbildung nekrotischer Läsionen. Bereiten Sie für jeden Genotyp sechs Mahröhren vor.Legen Sie eine Edelstahlkugel und fügen Sie 500 µL sterilem, 10 mmolarem Magnesiumchlorid zu jedem Gefäß hinzu. Trennen Sie danach das infizierte Blatt von der Pflanze ab und stanzen Sie mit einer Lochpapierzange unter Zuhilfenahme einer Pinzette zufällig eine Blattscheibe aus, geben Sie zwei Blattscheiben von zwei verschiedenen Pflanzen in jedes Zerkleinerungsgefäß. Verschließen Sie die Gefäße und homogenisieren Sie das Gewebe mit einem Hochdurchsatz-Homogenisator für 10 Minuten auf maximaler Drehzahl.Wiederholen Sie diesen Vorgang gegebenenfalls, bis das Gewebe gut homogenisiert ist und die Lösungen aufgrund der Freisetzung von Chlorophyll aus den infizierten Blättern grün färben, während Sie warten. Füllen Sie zur Homogenisierung jedes Loch in den ersten sechs Reihen einer 96-Loch-Kulturplatte mit 180 µL 10 mM Magnesiumchlorid. Geben Sie 20 µL der zerkleinerten Gewebesuspension in jedes Loch der ersten Reihe der 96-Loch-Platte und mischen Sie durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren der Flüssigkeit.Wenn kleine Gewebefragmente die Spitze verstopfen, schneiden Sie diese um zwei bis drei Millimeter ab, um die korrekte Volumenaufnahme der Lösung zu ermöglichen, und schaffen Sie ausreichend Platz für den Tropfen oben auf der Platte. Platzieren Sie Gewebe unterschiedlicher Genotypen in abwechselnden Reihen. Um eine Verdünnungsreihe im Verhältnis 1:10 vorzubereiten, übertragen Sie 20 Mikroliter der Gewebeaufschlämmung in die zweite Reihe und wiederholen Sie diesen Vorgang bis zur sechsten Verdünnung. Übertragen Sie mithilfe geteilter Pipettenspitzen 20 Mikroliter der Lösung von der 96-Loch-Platte auf die KB-Platte mit den Maßen 150 Millimeter mal 15 Millimeter.Arbeiten Sie von der verdünntesten Suspension zur konzentriertesten, sodass es nicht notwendig ist, die Pipettenspitzen zwischen den Verdünnungen zu wechseln. Trocknen Sie die Platte bei Raumtemperatur mit leicht geöffnetem Deckel. Sobald keine Flüssigkeit mehr auf der Oberfläche der Platte sichtbar ist, schließen Sie den Deckel, drehen die Platte um und inkubieren sie bei Raumtemperatur.Die Platten 40 bis 60 Stunden inkubieren, bis die Kolonien sichtbar werden. Bestätigen Sie, dass die Bakterien auf den Platten den vorhersehbaren zehnfachen Rückgang an koloniebildenden Einheiten widerspiegeln.Zählen Sie die Bakterien, bevor sie überwachsen und die Kolonien miteinander verschmelzen. Bestimmen Sie die Anzahl der Bakterien in der niedrigsten Verdünnung, die keine überlappenden Kolonien aufweist. Üblicherweise enthält die bevorzugte Verdünnung, die gezählt werden soll, zwischen 10 und 50 Kolonien und kann zwischen technischen Wiederholungen variieren.Um die Stufen der bakteriellen Proliferation zu berechnen, ermitteln Sie die Anzahl der koloniebildenden Einheiten pro Blattscheibe mithilfe dieser Formel, wobei R die Anzahl der Reihen und T die Anzahl der Bakterien in jedem technischen Replikat ist. Die Daten werden anschließend verwendet, um einen Graphen zu erstellen. Jeder Datenpunkt wird als Mittelwert aus sechs technischen Replikaten auf einer logarithmischen Skala dargestellt.Aerobars stellen das 95 %-Konfidenzintervall des Mittelwerts der verstärkten Krankheit dar. Die Anfälligkeit gegenüber P-S-M-E-S 43 26 wurde durch Infektion mit einem Inokulum mit einem OD 600 von 0,0002 bewertet. Die Ergebnisse zeigen, dass die hochanfälligen NPR-eins-Bindestrich-eins-Mutanten ungefähr 2,5 log oder 300-mal mehr Pathogenwachstum aufweisen als die Wildtyp-Pflanzen Columbia null.Mit dem Spritzeninfiltrationsassay können verschiedene Schichten der Immunantwort untersucht werden. Um die durch Salicylsäure ausgelöste Immunität zu bewerten, wird die äußere Applikation von Natriumsalicylat verwendet, um die Immunantwort auszulösen, die anschließend durch das Wachstum von Pathogenen quantifiziert wird. Der Verlust von NPR1, das als Rezeptor für Salicylsäure und als wichtiger transkriptioneller Koregulator für salicylsäureabhängige Zielgene fungiert, führt zu einer Unempfindlichkeit gegenüber der exogenen Anwendung des Salicylsäurederivats.Um die durch mikrobenassoziierte molekulare Muster ausgelöste Immunität zu charakterisieren, wurden Pflanzen mit zwei bekannten Auslösern vorbehandelt. Die mit FLAG 22 behandelten Wildtyp-Pflanzen der Linie Columbia-0 wiesen eine um eine dekadische Logarithmenstufe – also zehnfache – Verringerung der bakteriellen Population auf, während die FLS2-Mutantenpflanzen keinen hemmenden Effekt auf das bakterielle Wachstum zeigten. Ebenso reagierten die EFR-Mutantenpflanzen nicht auf die Vorbehandlung mit L 18.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die arabische Opsys-Immunantwort mittels des Spritzeninfiltrationsassays quantifiziert. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Krankheitsentwicklung zu überwachen und das Gewebe nach dem Auftreten von Corsis zu entnehmen. Der Pseudomona-Pather-Cul-Cola S phos 3, 2 6 ist ein hemiatropher Pathogen.Daher sollte die Probenahme vor dem Übergang in die neurotrope Phase durchgeführt werden. Nach dieser Vorgehensweise können weitere Methoden wie die quantitative Echtzeit-PCR und die Western-Blot-Analyse durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise, welcher spezifische Immunsignalkaskade gestört ist. Vergessen Sie nicht, dass Sie mit lebenden Bakterien arbeiten.Obwohl Pseudomona Senge beim Menschen nicht pathogen ist, denken Sie daran, kontaminierte Verbrauchsmaterialien und infizierte Pflanzen während dieses Verfahrens ordnungsgemäß zu entsorgen.

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Research

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Bakterielle Blatt Infiltration Assay für Bildende Charakterisierung pflanzlicher Abwehrreaktionen mit Hilfe der Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem (Video) | JoVE Journal

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