Name: Synthese von Keratin-basierten Nanofaser für Biomedizinische Technik (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 43 s
Description: Erfahren Sie die Synthese von Keratin/PCL-Nanofasern mittels Elektrospinnen für biomedizinische Anwendungen. Diese Methode ermöglicht die Herstellung biokompatibler Materialien für Gewebeengineering und Wundheilung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autoren möchten National Science Foundation durch Engineering Research Center für die Revolutionierung Metallic Biomaterialien (ERC-0.812.348) und Nanotechnologie Undergraduate Education (EWG 1.242.139) für die Förderung Unterstützung danken.

Alle Protokoll folgt den Richtlinien der North Carolina A &amp; T State University Office of Research Compliance und Ethik. 1. Chemische Zubereitung für Keratin Extraction 4 <ol><li> Zur Herstellung von 1.000 ml von 2% w / v Peressigsäurelösung (PAS), unter einer Abzugshaube 20 ml Peressigsäure bis 980 ml VE-Wasser (DI). </li><li> Zur Herstellung von 1.000 ml 100 mM Tris-Base-Lösung (TBS), fügen 12,2 g Tris-Base auf 1000 ml VE-Wasser und rühren, bis vollständig gelöst. </li><li> Bereiten verdünnter Chlorwasserstoffsäure-Lösung (DHAS) in einem Abzug von 4 ml konzentrierter Salzsäure in 30 ml DI-Wasser zu gießen. </li><li> Beschaffen ca. 20 g des menschlichen Haarabschnitten, die nicht chemisch behandelt oder verändert wurden. Haare können beliebig lang sein. </li><li> Waschen Sie die Haare gründlich per Hand mit warmem Wasser und Seife. Verwenden deionisiertem (DI) Wasser für die Schlussspülung. </li><li> Legen Sie das Haar in zwei 600 ml-Becher und in einen 80 ° C oven für 1 Stunde. </li><li> Lassen Sie die Flüssigkeit aus dem Boden des Bechers und legen Sie in den Ofen zurück, bis das Haar vollständig trocken ist. </li><li> Dividieren trockene Haar gleichmäßig zwischen den 600-ml-Becher, legen 10 g Haar in jedem Becher. Nicht in den Haaren mehr als 500 ml zu füllen. </li><li> Gießen Sie 500 ml PAS in jedem Becher dafür, dass alle Haare zu bedecken. Decke das Becherglas mit Parafilm und Speicher für 12 Stunden. </li></ol> 2. Herstellung von Keratin Extraktlösung <ol><li> Trennen Sie die Haare aus dem PAS ein 500 um Sieb verwenden. Sammeln Sie die Abfall PAS in einem separaten Behälter. Spülen Sie das Haar gründlich mit VE-Wasser auf, übrig gebliebene PAS entfernen. </li><li> Setzen Sie den gespült Haar in einem 500 ml Kolben. Gießen Sie 400 ml TBS in den Kolben, um sicherzustellen, dass das Haar bedeckt ist. Danach wird der Kolben in einem Schüttelbad auf 38 ° C, 65 min-1 Std. </li><li> Nach 1 Stunde entfernen Bad Schütteln und gießen Sie die Flüssigkeit, ca. 400 ml aus Keratin Extraktionslösung (KES), into einem 1000-ml-Becher. </li><li> Gießen Sie 400 ml DI-Wasser in den Kolben die Haare enthalten, um sicherzustellen, dass das Haar bedeckt ist und legen Sie wieder in den Schüttelbad für 1 Stunde. Entfernen Sie den Kolben aus dem Schüttelbad und gießen Sie die restlichen 400 ml der KES in den 1000-ml-Becher mit dem zuvor erfassten KES. Das Haar wird nicht mehr benötigt und kann in den nächsten Papierkorb Behälter aus dem Kolben und entsorgt werden entsorgt. </li></ol> 3. Konzentration von Keratin Extraktlösung <ol><li> Füllen rotodistiller Bad in die oberste Zeile mit destilliertem Wasser und auf 90 ° C. Stellen Rotationsgeschwindigkeit auf 200 Umdrehungen pro Minute. Schalten Sie den Kühlmittelkühler-Pumpe und auf -10 ºC. </li><li> ein pH-Meter unter Verwendung der pH-Wert der KES Verwenden einer Pipette zu überwachen langsam 1 mM DHAS bis zum Erreichen eines pH 7,0 bis der KES hinzuzufügen. Rühre langsam, während die Lösung zugegeben wird. </li><li> Gießen Sie die neutralisiert KES in die 500 ml-Rundkolben bis etwa Viertel voll. Führen Sie den Brenner nach HerstellerProtokoll für 1,25 Std. <ol><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.3 bis alle der KES destilliert worden. Stellen Sie sicher, dass der Kolben fest verbunden ist. </li></ol></li></ol> 4. Dialyse von Keratin Extraktlösung <ol><li> Gießen KES Lösung gleichmäßig in 12 separaten 14 ml konischen Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 1050 × g für 10 min. </li><li> Gießen Sie die zentrifugiert KES in ein sauberes Becherglas, um sicherzustellen, aus den gesammelten Schmutz zu abgießen. Wiederholen, bis alle der KES wurde zentrifugiert wurde. </li><li> Füllen Sie einen 2000-ml-Messzylinder mit DI-Wasser. </li><li> Schneiden Sie Dialyseschlauch Cellulosemembran bis 24 Zoll, und ein Ende der Schlauchklemme zu halten sie zu. </li><li> Tauchen Sie die Länge des Rohres in den Zylinder DI-Wasser, um es flexibler und leichter zu öffnen. </li><li> Öffnen der nicht-begrenzten Ende der Dialyseschlauch Cellulosemembran und gießt langsam 60 ml zentrifugiert KES-Lösung in den Schlauch. Verwenden Sie einen anderen Clip dieses Ende der Rohrleitung zu schließen. </li><li> Legen Sie die dialysis Rohr in der 2000 ml Zylinder DI-Wasser und lassen für 24 Stunden zu sitzen. Ändern Sie den DI-Wasser in den Zylinder alle 3 bis 4 Stunden. </li><li> Nach dem 24-Stunden-Zeitraum, leeren Sie den dialysiert KES Lösung in bedeckten Gläser, sicher zu sein, für 24 Stunden bei -20 ° C Platz an der Spitze und in der Tiefkühltruhe zu verlassen. </li></ol> 5. Die Gefriertrocknung von Extraktlösung Keratin <ol><li> Stellen Sie die Gefriertrocknungsanlage bis -86 ºC. </li><li> Entfernen Sie die Gläser eingefroren KES aus der Tiefkühltruhe enthält, nehmen Sie die Kappen aus der Gläser, und legen Sie sie in Gefriertrockner Ampullen. Legen Sie die Dichtungen an den Ampullen und den Drehknopf einen Unterdruck von 0,133 mbar bis erstellen. Lyophilisieren die Proben für etwa 48 Stunden, bis die gesamte Feuchtigkeit verschwunden ist. </li></ol> 6. Herstellung von Elektrospinnen Solutions (10 Gew% Keratin Solution) <ol><li> Entfernen Sie die Keratin-Pulver aus der Gefriertrocknungsanlage und gewogen. </li><li> In DI-Wasser auf die Keratin-Pulver mit einer 10% Gewicht / Gewicht zu schaffenKeratin Lösung. </li></ol> 7. Herstellung von 10% Gew PCL-Lösung <ol><li> Erhalten PCL (ε-Caprolacton-Polymer, Mn 70-90 kDa) und Trifluorethanol (TFE). Vorbereiten eines 10 Gewichts-% PCL in TFE durch Rühren O / N und eine homogene Mischung erhalten. </li></ol> 8. Herstellung von Keratin / PCL-Lösung <ol><li> Besorgen Sie sich die 10 Gew% PCL-Lösung vorher vorbereitet und 10 Gew% Keratin Lösung. In Keratin in den PCL-Lösung tropfenweise um 10 ml PCL / Keratin Lösungen von 90:10 zu schaffen, 80:20, 70:30 und 60:40 Verhältnisse. </li><li> Verwenden Sie einen Vortexer eine homogene Mischung aus PCL / Keratin-Lösung zu erhalten, bevor das Elektrospinnen. </li></ol> 9. Produktion von elektro PCL / Keratinfaser <ol><li> Es werden ca. 8 ml des PCL / Keratinlösung in einem 10 ml Einwegspritze, ausgestattet mit einer 0,5-mm Durchmesser Kunststoffrohr. Legen Sie die Spritze in eine Spritzenpumpe, wo die Durchflussmenge eingestellt ist 2,5 ml / h. </li><li&gt; Spannung an die Spitze der Nadel Nehmen mit dem Rohr verbunden (~ 23 cm von der Fasersammel Trommel positioniert und ~ 30 Grad von der Horizontalen). Tragen Sie eine 19 - auf das Rohr 22 kV Spannung und drehen Sie den Sammeltrommel bei etwa 200 Umdrehungen pro Minute. <ol><li> Wickeln Sie die Sammeltrommel mit Aluminiumfolie vor der Ausführung des Beispiels. Sicherzustellen, dass die Aluminiumfolie des Etikettenbands durch Anlegen an beiden Enden stabil ist. Hinweis: Die Fasern auf der Aluminiumfolie bilden wird (siehe Abbildung 2), speichern Sie die Faser bedeckt Folie bei RT. </li></ol></li></ol> 10. Mechanische Analyse von PCL / Keratin Nanofasern <ol><li> Schneiden Sie die Probe in 60 mm x 8 mm. Achten Sie darauf, die Dicke durch Verwendung von digitalen Mikrometer zu erfassen. Für jede Zusammensetzung bereit, verwenden fünf Proben. </li><li> Bringen Sie die 60 x 8 mm Probe in der Zugprüfmaschine. Verwenden Sie eine kundenspezifische Probenhalter auf die Probe befestigen. Sandwich die Probe zwischen Probenhaltern, die sich von einer Karteikarte hergestellt wird unter Verwendung von Doppel-seitiges Klebeband. Übernehmen Sie die 10 N Kraftmessdose mit einem Hubraum von 10 mm / min. Hinweis: Der Probenhalter wurde entwickelt, 62 mm sein, um 40 mm mit einem inneren Fenster von 50 mm um 38 mm. </li><li> Satzerweiterung und Belastungswerte durch Software nach Software-Protokoll. </li><li> Berechnen Belastung durch die Kraft der Fläche der getesteten Probe dividiert wird. Als nächstes berechnen Stamm durch die Änderung in der Länge um Ausgangslänge dividiert wird. </li><li> Generieren Sie die Spannungs-Dehnungs-Kurve, die durch Stress in der y-Achse aufgetragen Dehnungswert in der x-Achse für entspricht. </li><li> Berechnen der Elastizitätsmodul aus dem linearen Bereich, in dem Hang zu Elastizitätsmodul entspricht. Bestimmen Zugfestigkeit von der Spannungs-Dehnungs-Grundstück von 0,2% im Stamm versetzt zu nehmen und eine parallele Linie zu dem linearen Bereich Kurve zeichnen. </li><li> Führen Sie die statistische Analyse der mechanischen in dreifacher Ausfertigung erhalten Daten, die zuvor unter Verwendung von Einweg-Varianzanalyse mit Analysesoftware 8. P-Werte &lt;0,05 wirsind statistisch signifikant angesehen. </li></ol> 11. Oberflächenmorphologie und strukturelle Charakterisierung <ol><li> Verwenden Rasterelektronenmikroskop (SEM) mit Parametern von 15 kV und einem Strom von 5 &amp; mgr; A Beschleunigungsspannung die Morphologie der elektrogesponnenen Fasern zu beobachten. <ol><li> Vor mit SEM Abbilden, schnitt ein 2 cm 2 Schnitt der Faser und verbinden Sie es mit einem SEM Bühne Kupferband. Legen Sie die Bühne in der Sputter-Beschichtungsvorrichtung und Mantel mit Gold bei 15 mA für 1 Minute und 30 Sekunden mit einer Goldschicht etwa 11 nm Dicke zu schaffen. Legen Sie die Probe in der Kammer des SEM. Beachten Sie die Faserproben. </li></ol></li><li> Verwenden Fourier-Transformations-Infrarot-Spektroskopie (FTIR), die chemische Bindung zwischen den PCL und Keratin zu charakterisieren. Legen Sie die 2 cm 2 Abschnitt der elektroNanoFaserMembran in einem Magnethalter und spülen Sie das System mit trockener Luft vor dem Test. Erhalten Spektren für 200 Scans und Analyse der Spektren sta mitndard Software nach Software-Protokoll. </li><li> Führen Spektralanalyse Standardsoftware und nutzen dreifacher Ausführung jedes Verhältnis von Nanofaser nach dem Protokoll des Herstellers. </li></ol> 12. Untersuchung von Zellfaser-Interaktion <ol><li> Schnittfasern in 16 mm 2 Proben. Verwenden Sie einen biokompatiblen Silikonbasis Leim jede Probe auf Deckgläser mit einem Durchmesser von 12 mm zu befestigen. </li><li> Kleben Sie ein Ende des Faserprobe auf der Rückseite des Deckglases, wickeln Sie die Probe um das Deckglas, kleben Sie dann das freie Ende der Probe auf der Rückseite des Deckglases als auch, so dass das obere Ende der Rutsch bedeckt nur mit der Faserprobe. </li><li> Legen Sie die Faserproben in einer 24-Well-Platte. Sterilisieren der Proben nach 1 Stunde in 80% Ethanol eingetaucht. </li><li> Spülen Sie das Ethanol aus den Proben DI Wasser. Dann Pipette 2 ml Basismedium auf den Proben, um sicherzustellen, die gesamte Probe zu bedecken. Entfernen Sie das Medium nach 5 min. </li><li> Verwenden Fibroblasten 3T3 Zellen, die die Faserproben zu säen. Die Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit Antibiotika und 10% fötalem Rinderserum (FBS), so dass es etwa 62.000 Zellen / cm 2 pro 1 ml DMEM. </li><li> Schau mal 1 ml der 3T3-Zellen enthaltende DMEM-Lösung in jedes Well Platte sicherzustellen, dass jeder Faserprobe mit etwa 62.000 Zellen / cm 2 bedeckt ist. Inkubieren der Well-Platten für 24 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2. Hinweis: Verwenden Sie 5% CO 2, weil das Niveau in der Regel den pH-Wert des Zellmedien in physiologischen Bereich für Tage aufrechterhalten kann. </li></ol> 13. Abbau von Nanofaser-Matrix <ol><li> Cut getrocknet PCL / Keratin Nanofasermembranen in quadratische ca. 30 mm x 30 mm. </li><li> Sterilisieren Sie die 900 mm 2 Proben mit 80% Alkohol für 10 Minuten Inkubationszeit und gründlich mit VE-Wasser. Inkubieren der Proben in 15 ml PBS, pH 7,5, bei 37 ºC. Ersetzen Sie den bufalle 3 Tage fer. </li><li> Nehmen die Membranen aus der Lösung in bestimmten Abständen, 1 Woche und 7 Wochen, und Spülen mit DI-Wasser. </li><li> Legen Sie die Membranproben in Gefriertrockner Ampullen. Legen Sie die Dichtungen an den Ampullen und den Drehknopf ein Vakuum zu erzeugen. Lyophilisieren für 24 Stunden, vollständig trocken bis. </li><li> Bringen Sie die getrocknete Probe an einen SEM Bühne Kupferband. Legen Sie die Bühne in der Sputter-Beschichtungsvorrichtung und Mantel mit Gold bei 15 mA für 1 Minute und 30 Sekunden. </li><li> Legen Sie die Probe in der Kammer des SEM. Beachten Sie die Faserproben bei einer Beschleunigungsspannung von 1,5 kV und 5 &amp; mgr; A Strom. </li></ol>

<ol><li>Huang, Z. -M., Zhang, Y. Z., Kotaki, M., Ramakrishna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+on+polymer+nanofibers+by+electrospinning+and+their+applications+in+nanocomposites%5BTitle%5D)+AND+%22Compos+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">A review on polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites.</a> Compos Sci Technol. 63, (2003).</li>
<li>Li, W. J., Laurencin, C. T., Caterson, E. J., Tuan, R. S., Ko, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+nanofibrous+structure%3A+a+novel+scaffold+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res%22%5BJournal%5D)">Electrospun nanofibrous structure: a novel scaffold for tissue engineering.</a> J Biomed Mater Res. 60, 613-621 (2002).</li>
<li>Liu, W., Thomopoulos, S., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+nanofibers+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthc+Mater%22%5BJournal%5D)">Electrospun nanofibers for regenerative medicine.</a> Adv Healthc Mater. 1, 10-25 (2012).</li>
<li>Edwards, A., Jarvis, D., Hopkins, T., Pixley, S., Bhattarai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28-caprolactone%29%2Fkeratin-based+composite+nanofibers+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+B%22%5BJournal%5D)">Poly(-caprolactone)/keratin-based composite nanofibers for biomedical applications.</a> J Biomed Mater Res B. 103, 21-30 (2015).</li>
<li>Dowling, L. M., Crewther, W. G., Parry, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+structure+of+component+8c-1+of+alpha-keratin.+An+analysis+of+the+amino+acid+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Secondary structure of component 8c-1 of alpha-keratin. An analysis of the amino acid sequence.</a> Biochem J. 236, 705-712 (1986).</li>
<li>Yamauchi, K., Maniwa, M., Mori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+fibroblast+cells+on+keratin-coated+substrata%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomat+Sci-Polymer%22%5BJournal%5D)">Cultivation of fibroblast cells on keratin-coated substrata.</a> J Biomat Sci-Polymer. 9, 259-270 (1998).</li>
<li>Shea, L. D., Wang, D., Franceschi, R. T., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+Bone+Development+from+a+Pre-Osteoblast+Cell+Line+on+Three-Dimensional+Scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+E%22%5BJournal%5D)">Engineered Bone Development from a Pre-Osteoblast Cell Line on Three-Dimensional Scaffolds.</a> Tissue E. 6, 605-617 (2000).</li>
<li>Fortin, M. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Biological+Software%5BTitle%5D)+AND+%22Q+Rev+Biol%22%5BJournal%5D)">New Biological Software.</a> Q Rev Biol. 71, 169-170 (1996).</li>
<li>Bhattarai, N., Edmondson, D., Veiseh, O., Matsen, F. A., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+chitosan-based+nanofibers+and+their+cellular+compatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Electrospun chitosan-based nanofibers and their cellular compatibility.</a> Biomaterials. 26, 6176-6184 (2005).</li>
<li>Yang, S., Leong, K. F., Du, Z., Chua, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+of+scaffolds+for+use+in+tissue+engineering.+Part+I.+Traditional+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+E%22%5BJournal%5D)">The design of scaffolds for use in tissue engineering. Part I. Traditional factors.</a> Tissue E. 7, 679-689 (2001).</li>
<li>Bhattarai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural-Synthetic+Polyblend+Nanofibers+for+Biomedical+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">Natural-Synthetic Polyblend Nanofibers for Biomedical Applications.</a> Adv Mater. 21, 2792-2797 (2009).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Extraktion von Keratin aus Menschenhaar wurde erfolgreich erreicht. Die Peressigsäure fungierte als Oxidationsmittel auf das menschliche Haar, so dass das Keratin von der Tris-Base extrahiert werden. Die Produktion von Keratin Pulver wurde in kleinem Maßstab aufgrund der Tatsache, dass es nur für Forschungszwecke durchgeführt wurde. Diese Vorgehensweise hat sich in der Industrie etabliert für die Großproduktion bereits. Der Zweck der Klein Keratin Extrahieren war Kontamination zu kontrollieren, Batch-Variabilität und Wi...

Elektrospinnen ist als vorherrschende Methode zur Erreichung Polymer-Nanofasern anerkannt. Die Fasern können auf einer Nanometerbereich erzeugt werden und die Fasereigenschaften sind kundengerecht ein. Diese Entwicklungen und die Eigenschaften der elektrogesponnenen Nanofasern wurden für ihre Anwendungen in der biomedizinischen Technik vor allem im Tissue Engineering besonders interessant. Die elektrogesponnenen Nanofasern besitzen Ähnlichkeiten mit der extrazellulären Matrix und somit Zelladhäsion, Migration und Proliferation 2 zu fördern. Aufgrund dieser Ähnlichkeit mit der extrazellulären Matrix (ECM), elektrogesponnenen Fasern können als Materialien verwendet werden, in Wundverband, Arzneimittelabgabe zu unterstützen, und für technische Gewebe, wie Leber, Knochen, Herz und Muskel 3. Eine Vielzahl von verschiedenen Polymeren aus synthetischen und natürlichen Ursprungs verwendet wurden elektrogesponnenen Fasern für verschiedene biomedizinische Anwendungen Engineering 4 zu schaffen. In jüngster Zeit gewachsen ist inInteresse an der Entwicklung von Verbundnanofasern von 4 synthetischen und natürlichen Polymeren gemischt werden. In diesen Zusammensetzungen erben die Endprodukte der Regel die mechanische Festigkeit mit dem synthetischen Polymer verbunden, während auch biologische Signale und Eigenschaften aus dem natürlichen Polymer übernehmen. In diesem Experiment PCL und Keratin vorgestellt, wie die synthetischen und natürlichen Polymeren für die Synthese eines Verbundnanofaser verwendet zu werden. Keratin ist ein natürliches Polymer, das im Haar, Wolle und Nägel gefunden wird. Es enthält viele Aminosäurereste; von besonderem Interesse ist Cystein 4,5. Idealerweise würde ein natürlich vorkommendes Polymer nachwachsender, biokompatibel und biologisch abbaubar sein. Keratin besitzt alle drei dieser Eigenschaften gleichzeitig Zellproliferation und Befestigung an den Biomaterialien verbessert es in 6 eingearbeitet worden ist. Polycaprolacton (PCL) ist ein resorbierbares, synthetisches Polymer, das in signifikant istTissue Engineering 4. Dieses Polymer hat für seine strukturelle und mechanische Stabilität gelobt, aber bisher fehlt es an Zell Affinität und weist eine lange Abbaurate. Die hydrophobe Natur von PCL ist wahrscheinlich verantwortlich für die fehlende Zellaffinität 7. Allerdings macht PCL für ihre Grenzen, indem mit anderen Polymeren sehr gut mischbar sind. Eine PCL / Keratin Verbund sollten die mechanischen Eigenschaften von PCL demonstrieren und die biologischen Eigenschaften von Keratin übernehmen, es zu einer idealen Wahl für verschiedene biomedizinische Anwendungen.

<table><tbody><tr><td>Menschliches Haar&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Gewonnen von einem örtlichen Friseursalon in Greensboro</td></tr><tr><td>Peressigsäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCL (e-Caprolacton-Polymer)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>502-44-3</td><td>Mn 70-90 kDa</td></tr><tr><td>Trifluorethanol (TFE)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75-89-8</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base (TrizmaTM Base Powder)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>>99,9% kristallin</td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>Fischer Scientific</td><td>A144C-212 Los 093601</td><td>Waltham, MA</td></tr><tr><td>Kwik-Sil</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td>Sarasota, FL</td></tr><tr><td>Zellulosemembran</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>12 - 14 kDa molekulares</td></tr><tr><td>Trennlichtmikroskop</td><td>Olympus BX51M</td><td>BX51M Japan</td><td></td></tr><tr><td>Rasterelektronenmikroskop</td><td>Hitachi SU8000</td><td>SU8000</td><td>Japan</td></tr><tr><td>Tischgerät Shimadzu Maschine</td><td>Nordamerika Analyse- und Messgeräte AGS-X Serie</td><td>AGS-X Serie&nbsp;</td><td>Kolumbien, MD</td></tr><tr><td>Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie</td><td>Bruker Tensor 2 Instrument&nbsp;</td><td></td><td>Billerica, MA</td></tr><tr><td>Microcal Origin Software</td><td></td><td></td><td>Northampton, MA</td></tr><tr><td>Röntgenbeugung (XRD)</td><td>Bruker AXS D8 Advance Röntgendiffraktometer</td><td></td><td>Madison, WI</td></tr><tr><td>Fibroblast 3T3&nbsp; Zelle</td><td>American Tissue Type Culture Collection</td><td></td><td>Manassas, VA</td></tr><tr><td>Dulbeccos modifiziertes Eagle's Medium (DMEM</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Grand Island, NY</td></tr><tr><td>Spectra max Gemini XPS Mikroplatten-Reader</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Sunnyvale, CA</td></tr><tr><td>Student- Newman-Keuls Post-hoc-Test</td><td>SigmaPlot 12 Software</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

synthese von keratin-basierten nanofaser für biomedizinische technik

Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering

Elektrospinnen aufgrund seiner Vielseitigkeit und Potential für Anwendungen in verschiedenen Bereichen wird häufig zur Herstellung von Nanofasern verwendet wird. Die Herstellung dieser porösen Nanofasern ist von großem Interesse aufgrund ihrer einzigartigen physikochemischen Eigenschaften. Hier erarbeiten wir auf die Herstellung von Keratin enthaltenden Poly (ε-caprolacton) (PCL) Nanofasern (dh PCL / Keratin Verbundfaser). Wasserlösliche Keratin wurde zuerst aus Menschenhaar und gemischt mit PCL in unterschiedlichen Verhältnissen extrahiert. Die gemischte Lösung von PCL / Keratin wurde in Nanofasermembranen umgewandelt ein Labor entwickelt Elektro mit aufgebaut. Verwendung von Rasterelektronenmikroskopie und Zugprüfmaschine Fasermorphologie und mechanischen Eigenschaften der erhaltenen Nanofaser wurden beobachtet und gemessen. Weiterhin Abbaubarkeit und chemischen Eigenschaften der Nanofaser wurden durch FTIR sucht. SEM-Bilder zeigten, gleichmäßige Oberflächenmorphologie für PCL / Keratinfasern unterschiedlicher Zusammensetzung. Diese PCL / Keratin Fasern zeigte auch hervorragende mechanische Eigenschaften wie Elastizitätsmodul und Fehlerpunkt. Fibroblasten-Zellen waren in der Lage zu befestigen und somit beweisen gute Lebensfähigkeit der Zellen vermehren. Basierend auf den Eigenschaften, die oben diskutiert, kann man argumentieren, dass die stark vermischten Nanofasern aus natürlichen und synthetischen Polymeren eine ausgezeichnete Entwicklung von Verbundwerkstoffen darstellen, die für verschiedene biomedizinische Anwendungen verwendet werden kann.

Fasermorphologie REM-Aufnahmen der Fasern wurden für alle Faserzusammensetzungen erhalten. Siehe Abbildung 3. Fiber Bild bestätigt, dass die Fasern zufällig orientiert sind. mechanische Prüfung Mechanisch feste Fasern für verschiedene Tissue Engineering-Anwendungen benötigt. Diese Fasern sollten eine ausreichende Festigkeit und Flexibilität unter bestimm...

Elektronanofasern weisen eine hohe Oberflächenverhältnis, ausgezeichnete mechanische Integrität zu gewichten, und das Zellwachstum und Proliferation unterstützen. Diese Nanofasern haben eine breite Palette von biomedizinischen Anwendungen. Hier fertigen wir Keratin / PCL-Nanofasern, die Elektrospinntechnik, und zu charakterisieren, die Fasern für mögliche Anwendungen im Tissue Engineering.

Synthese von Keratin-basierten Nanofaser für Biomedizinische Technik

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, keratinbasierte Nanofasern für biomedizinische Anwendungen herzustellen und zu charakterisieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der biomedizinischen Technik zu beantworten, beispielsweise im Zusammenhang mit Wundheilung, Arzneimittelfreisetzung und der Herstellung von funktionellem Gewebe wie Leber, Knochen und Muskel. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie kostengünstig und effizient ist und sich zudem auf eine großtechnische Produktion hochskalieren lässt.Die Implikationen dieser Technik reichen bis zur Behandlung von Wunden und der gezielten Abgabe von Wirkstoffen für die Geweberegeneration. Obwohl diese Methode Einblicke in die Vorteile der Verwendung elektrogesponnener Nanofasern ermöglicht, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, beispielsweise auf die Geweberegeneration. In der Regel haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da es anspruchsvoll ist, eine polymere Substanz herzustellen, die Nanofasern erzeugen kann.Beschaffen Sie etwa 20 Gramm menschlicher Haarabschnitte, die nicht chemisch behandelt oder verändert wurden. Die Haarlänge kann beliebig sein. Waschen Sie das Haar gründlich von Hand mit warmem Wasser und Seife.Verwenden Sie deionisiertes Wasser für die letzte Spülung. Geben Sie das Haar in zwei 600-Milliliter-Bechergläser und stellen Sie sie eine Stunde lang in einen 80 °C heißen Ofen. Sobald das Haar trocken ist, teilen Sie es gleichmäßig auf die beiden 600-Milliliter-Bechergläser auf, wobei jeweils 10 Gramm Haar in jedes Becherglas gegeben werden. Lassen Sie das Haar nicht mehr als 500 Milliliter füllen. Gießen Sie anschließend 500 Milliliter Peressigsäurelösung oder PAS in jedes Becherglas, wobei sichergestellt werden muss, dass das gesamte Haar bedeckt ist. Bedecken Sie die Bechergläser mit Parafilm und lagern Sie sie 12 Stunden lang. Trennen Sie das Haar mithilfe eines 500-Mikron-Siebs vom PAS und sammeln Sie das abgetrennte PAS in einem separaten Behälter. Spülen Sie das Haar gründlich mit entionisiertem Wasser, um restliches PAS zu entfernen. Geben Sie nach dem Einbringen des gespülten Haares in einen 500-Milliliter-Kolben 400 Milliliter einer 100-Millimolar-Tris-Basen-Lösung (TBS) in den Kolben, und stellen Sie sicher, dass das Haar vollständig bedeckt ist.Danach den Kolben in ein Schüttelbad stellen, das auf 38 Grad Celsius und 65 U/min eingestellt ist, und eine Stunde lang inkubieren. Nach einer Stunde den Kolben aus dem Schüttelbad nehmen. Die Flüssigkeit, etwa 400 Milliliter Keratin-Extraktionslösung (KES), in einen 1000-Milliliter-Becher umgießen.Geben Sie 400 Milliliter deionisiertes Wasser in den Kolben mit dem Haar, wobei sichergestellt werden muss, dass das Haar bedeckt ist, bevor der Kolben für eine Stunde wieder in das Schüttbad gestellt wird. Entnehmen Sie den Kolben aus dem Schüttbad und gießen Sie die restlichen 400 Milliliter des KES in den 1000-Milliliter-Becher mit dem zuvor gesammelten KES. Das Haar wird nicht mehr benötigt und kann in der nächstgelegenen Abfalltonne entsorgt werden.Nach der Neutralisierung des gesammelten KES gemäß dem schriftlichen Protokoll die Lösung in den 500-Milliliter-Rundkolben füllen, bis dieser etwa zu einem Viertel gefüllt ist. Den Destillierapparat gemäß den Anweisungen des Herstellers für 1,25 Stunden betreiben und sicherstellen, dass der Kolben fest verbunden ist. Diesen Vorgang wiederholen, bis der gesamte KES destilliert wurde.Geben Sie die destillierte KES-Lösung gleichmäßig auf 12 separate kegelförmige Röhrchen mit 14 Milliliter auf. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 1.050 × g für 10 Minuten. Gießen Sie das zentrifugierte KES in ein sauberes Becherglas, wobei Sie darauf achten sollten, vom gesammelten Zelltrümmermaterial wegzugießen.Wiederholen Sie den Vorgang, bis die gesamte KES-Zentrifugation abgeschlossen ist. Schneiden Sie als Nächstes eine Dialyse-Schlauch-Cellulosemembran auf 24 Zoll Länge zu und befestigen Sie eine Ende des Schlauchs mit einer Klammer, um es verschlossen zu halten. Öffnen Sie das nicht geklammerte Ende der Dialyse-Schlauch-Cellulosemembran und gießen Sie langsam 60 Milliliter der zentrifugierten KES-Lösung in den Schlauch.Verwenden Sie einen weiteren Clip, um dieses Ende des Schlauchs zu verschließen. Geben Sie das Dialyse-Röhrchen in einen 2.000-Milliliter-Zylinder mit entionisiertem Wasser und lassen Sie es 24 Stunden lang stehen, wobei das entionisierte Wasser im Zylinder alle drei bis vier Stunden gewechselt wird. Danach gießen Sie die dialysierte KES-Lösung in verschließbare Gläser, wobei darauf geachtet werden sollte, oben etwas Freiraum zu lassen.Stellen Sie die verschlossenen Gläser 24 Stunden lang in einen Gefrierschrank bei minus 20 Grad Celsius. Nach der 24-stündigen Gefrierphase nehmen Sie die Deckel von den Gläsern ab und füllen Sie in Gefriertrocknungsampullen. Setzen Sie die Verschlüsse auf die Ampullen und drehen Sie den Knopf, um einen Vakuumdruck von 0,133 Millibar zu erzeugen.Lyophilisieren Sie die Proben für etwa 48 Stunden, bis die gesamte Feuchtigkeit entfernt ist. Bereiten Sie eine PCL-Keratin-Lösung vor, indem Sie eine 10 Gewichtsprozent-Keratin-Lösung tropfenweise zu einer 10 Gewichtsprozent-PCL-Lösung hinzufügen, um 10 Milliliter-Lösungen mit PCL-zu-Keratin-Verhältnissen von 90 zu 10, 80 zu 20, 70 zu 30 und 60 zu 40 herzustellen. Geben Sie etwa acht Milliliter der verwirbelten PCL/Keratin-Lösung in eine 10-Milliliter-Wegwerfspritze, die mit einem Kunststoffrohr mit einem Durchmesser von 0,5 Millimetern ausgestattet ist.Platzieren Sie die Spritze in einer Spritzenpumpe, bei der die Flussrate auf 2,5 Milliliter pro Stunde eingestellt ist. Leiten Sie eine Spannung an die Nadelspitze, die mit dem Schlauch verbunden ist. Legen Sie eine Spannung von 19 bis 22 Kilovolt an den Schlauch an und drehen Sie die Sammeltrommel mit etwa 200 U/min.Schneiden Sie die Fasern in Proben mit einer Fläche von 16 Quadratmillimetern. Verwenden Sie einen biokompatiblen, silikonbasierten Klebstoff, um jede Probe auf Deckgläsern mit einem Durchmesser von 12 Millimetern zu befestigen. Kleben Sie ein Ende der Faserprobe auf die Rückseite des Deckgläschens und wickeln Sie die Probe um das Deckgläschen herum.Danach das freie Ende der Probe ebenfalls auf die Unterseite des Deckgläschens kleben, sodass die Oberseite des Deckgläschens nur mit der Faserprobe bedeckt ist. Die Faserproben in eine 24-Loch-Platte geben. Die Proben durch Einlegen in 80 % Ethanol für eine Stunde sterilisieren.Spülen Sie das Ethanol von den Proben mit entionisiertem Wasser ab. Geben Sie anschließend 2 Milliliter Basalmedium mittels Pipette auf die Proben, wobei sichergestellt werden muss, dass die gesamte Probe fünf Minuten lang bedeckt ist. Verwenden Sie Fibroblasten-3T3-Zellen, um die Faserproben zu besiedeln.Suspendieren Sie die Zellen in DMEM, ergänzt mit Antibiotika und 10 % fetalem Kälberserum, sodass etwa 62.000 Zellen pro Quadratzentimeter pro einem Milliliter DMEM vorliegen. Geben Sie je einen Milliliter der 3T3-Zellen enthaltenden DMEM-Lösung in jede Vertiefung der Mikrotiterplatte, wobei sichergestellt werden muss, dass jede Faserprobe mit etwa 62.000 Zellen pro Quadratzentimeter bedeckt ist. Inkubieren Sie die Mikrotiterplatten 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.Nach dem Schneiden der getrockneten PCL/Keratin-Nanofasermembranen die 900 Quadratmillimeter großen Proben mit 80 % Alkohol über einen Inkubationszeitraum von 10 Minuten sterilisieren. Anschließend die Membranen gründlich mit entionisiertem Wasser waschen. Danach die Proben in 15 Milliliter PBS, pH 7,5, bei 37 Grad Celsius inkubieren und den Puffer alle drei Tage erneuern.Entnehmen Sie die Membranen nach vorgegebenen Intervallen von einer Woche und sieben Wochen der Lösung. Spülen Sie sie mit entionisiertem Wasser ab. Geben Sie die Membranproben in Ampullen für den Gefriertrockner.Bringen Sie die Verschlüsse auf die Ampullen auf und erzeugen Sie ein Vakuum, um die Proben 24 Stunden lang bis zur vollständigen Trocknung lyophilisieren. Befestigen Sie danach die getrocknete Probe mit Kupfertape auf dem Probenträger eines Rasterelektronenmikroskops (REM). Platzieren Sie den Träger in der Sputter-Bedampfungsanlage und bedampfen Sie ihn eine Minute und 30 Sekunden lang bei 15 Milliampere mit Gold.Geben Sie die Probe in die Kammer des REM. Untersuchen Sie die Faserproben bei einer Beschleunigungsspannung von 1,5 Kilovolt und einem Strom von fünf Mikroampere. Hier sind repräsentative Bilder von PCL/Keratin-basierten Nanofasern, die erfolgreich aus Lösungen mit PCL/Keratin-Verhältnissen von 70 zu 30, 80 zu 20 und 90 zu 10 elektrogesponnen wurden.Es wurde festgestellt, dass die elektrogesponnenen Fasern Youngsche Module aufweisen, die denen des nativen Gewebes nahekommen. Die Youngschen Module nahmen mit steigendem Keratinanteil ab. Die Abbildung zeigt den grafischen Trend der Variation des Youngschen Moduls in Abhängigkeit vom PCL/Keratin-Verhältnis.Die hier dargestellten Spektren der Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie bestätigen die Bindung von PCL an Keratin. Die Hauptspitze bei 1.722 cm⁻¹ stimmt mit den Standardgrundmessungen des PCL-Absorptionsbands überein und ist in allen Spektren sichtbar. Die Zelladhäsion und -proliferation auf den PCL-Keratinfasern bestätigt, dass die Fasern nicht toxisch sind und eine Unterstützung für das Zellwachstum bieten. Das Wachstum der Filopodien entlang der Nanofasern weist auf eine günstige Wechselwirkung zwischen den Fibroblasten und den PCL/Keratin-Fasern hin. Sobald die Nanofasersynthese-Technik beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von 24 Stunden durchgeführt werden. Bei der Durchführung des Elektrospinnverfahrens ist es wichtig, die Viskosität der Polymerslösung, die Flussrate der Lösung, die angelegte Spannung, die Drehgeschwindigkeit der Trommel sowie die Schritte für die Kultivierung von Fibroblastenzellen zu beachten.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man PCL/Keratin-basierte Nanofasern synthetisiert und welche Bedeutung dies im Bereich des biomedizinischen Ingenieurwesens hat. Mit dieser Methode können weitere Verfahren wie Zellviabilitäts- und In-vivo-Abbautechniken durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen hinsichtlich der Toxizitätsreaktion auf Gewebe, des Gewebewachstums und des Abbaus der Fasern zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg dafür, dass Forscher im Bereich des regenerativen Ingenieurwesens Gebiete wie die Hautregeneration, die Wundheilung und die Arzneimittelabgabe erforschen konnten.Es sollte nicht vergessen werden, dass das Arbeiten mit organischen Lösungsmitteln wie TFE und mit hohen Spannungen äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Schutzbrille, Laborkittel und Handschuhen sowie die ordnungsgemäße Entsorgung von Lösungsmitteln sollten stets beachtet werden, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.

synthesis-of-keratin-based-nanofiber-for-biomedical-engineering

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Ein effizientes Konzept zur Herstellung von Nanofasern mit funktionellen Gruppen, die spezifisch mit Proteinen dekoriert wird beschrieben. Der Ansatz erfordert zunächst die Herstellung eines Polymers mit der entsprechenden funktionellen Gruppe funktionalisiert. Die funktionelle Polymer in Nanofasern durch Elektrospinnen hergestellt. Die Effektivität der Bindung der Nanofasern mit einem Protein durch konfokale Mikroskopie untersucht.

Verfahren zur Herstellung Biofunktionelle Nanofasern

Elektrogesponnene Gerüste können Post-Production für das Tissue Engineering-Anwendungen verarbeitet werden. Hier beschreiben wir Methoden für die Spinnerei komplexe Gerüste (durch aufeinander folgende Spinning), für die Herstellung dicker Gerüste (durch Multi-Schichtung mit Hitze und Dunst Glühen), für das Erreichen Sterilität (aseptische Produktion oder Postproduktion Sterilisation) und für die Erreichung entsprechenden biomechanischen Eigenschaften.

Postproduction Verarbeitung von Elektrogesponnene Fasern für Tissue Engineering

Eine Methode, um komplexe Nanofasern und Nanostrukturen aus einzelnen oder mehreren extrazellulären Matrixproteinen zu erhalten, wird beschrieben. Diese Methode verwendet Protein-Oberflächen-Wechselwirkungen zu frei stehenden Materialien auf Proteinbasis mit abstimmbaren Zusammensetzung und Architektur für den Einsatz in einer Vielzahl von Gewebe-und Biotechnologie-Anwendungen zu erstellen.

ECM-Protein-Nanofasern und Nanostrukturen Engineered Mit Oberflächen initiierte Versammlung

Synthese und Herstellung von elektro langen Fasern sich über eine größere Ablagefläche über einen neu gestalteten Sammler aus einem neuartigen biologisch abbaubaren Polymer namens Poly (Glycerin-Dodecanoat) (PGD) wurde berichtet. Die Fasern waren in der Lage, das Wachstum von pluripotenten Zellen aus Maus-Stammzellen zu unterstützen.

Elektro Faser-Gerüste von Poly (Glycerin-dodecandioat) für Ingenieurnervengewebe aus embryonalen Stammzellen der Maus

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur elektroNanoFaserGerüste mit abgestuften Organisation der Fasern herzustellen und zu erforschen ihre Anwendungen bei der Regulierung der Zellmorphologie / Ausrichtung. Farbverläufe in Bezug auf physikalische und chemische Eigenschaften der Nanofasergerüste bieten eine Vielzahl von Anwendungen im Bereich der Biomedizin.

Elektronanofasergerüste mit Abstufungen in Fiber-Organisation

Zwei- und dreidimensionale superhydrophobe Polymermaterialien werden durch Elektrospinnen oder Elektrospritzen biologisch abbaubarer Polymere hergestellt, die mit einem Polymer mit niedrigerer Oberflächenenergie ähnlicher Zusammensetzung gemischt werden.

Herstellung Superhydrophobe Polymere Materialien für biomedizinische Anwendungen

Dieses Manuskript beschreibt das Verfahren zu fabrizieren und zu charakterisieren Griffithsin veränderten Poly (Milchsäure-co-Glykol Säure) Electrospun Fasern, die starke Klebe- und antivirale Aktivität gegen humane Immundefizienz-Virus Typ 1-Infektion nachweisen in Vitro. Methoden zur Synthese, Fläche zu ändern, und die daraus resultierende Morphologie, Konjugation, prägen und Desorption des Griffithsin von oberflächenmodifizierten Fasern werden beschrieben.

Herstellung und Charakterisierung von Griffithsin-modifizierte Faser Gerüste für die Prävention von sexuell übertragbare Infektionen

Ziel dieses Protokolls ist es, die Montage einer biomimetischen Nanomatrix (NM) mit Janus-Basis-Nanoröhren (JBNTs) und Fibronectin (FN) zu zeigen. Bei der Kokultur mit humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSCs) weisen die NMs eine ausgezeichnete Bioaktivität bei der Förderung der hMSCs Adhäsion auf.

Herstellung einer biomimetischen Nano-Matrix mit Janus Base Nanotubes und Fibronectin zur Stammzellhaftung

Gewebekultureinsätze mit Kunststoffmembranen sind der goldene Standard in Zellkulturlaboren als durchlässige Stützen zur Etablierung von Zellschichten und Modellen von Barrieregeweben. Hier stellen wir eine einfache Methode vor, um die Kunststoffmembran durch eine biologisch relevantere Membran zu ersetzen, die aus einem rekombinanten funktionalisierten Spinnenseidenprotein besteht.

Nanofibrilläre Basalmembran-Imitation aus rekombinant funktionalisierter Spinnenseide in maßgefertigten Gewebekultureinsätzen

Das folgende Protokoll stellt ein scherbasiertes Extrusionsverfahren zur Herstellung von Kollagen-Hydrogelen mit nanoskaligen strukturierten Fibrillen vor, das auf eine breite Palette von Tissue-Engineering-Anwendungen angewendet werden kann.

Herstellung von nanofibrillär strukturiertem Kollagen für das Tissue Engineering

Erfahren Sie die Synthese von Keratin/PCL-Nanofasern mittels Elektrospinnen für biomedizinische Anwendungen. Diese Methode ermöglicht die Herstellung biokompatibler Materialien für Gewebeengineering und Wundheilung.

Synthese von Keratin-basierten Nanofaser für Biomedizinische Technik

Weitere Videos entdecken