RNAi-vermittelten Kontrolle der Aflatoxine in Peanut: Methode, um Mykotoxinproduktion und Transgenexpression in der Erdnuss-Analyse / Aspergillus Pathosystem

Das übergeordnete Ziel dieser Arbeit ist es, eine zuverlässige, genaue, kostengünstige und schnelle Methode zum Testen der Wirksamkeit der RNAi-vermittelten Stilllegung von Aflatoxinsynthese-Genen von Aspergillus in transgenen Erdnüssen unter Verwendung einer minimalen Anzahl von Samen bereitzustellen, in der Regel sind Hunderte von Gramm Samen erforderlich, um Aflatoxine in Proben effektiv zu quantifizieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass weniger als fünf Samen verwendet werden, um eine bestimmte Behandlung 10 Tage vor der Vorbereitung der Samen zu testen, eine Kultur von Aflatoxin-positivem Aspergillus flavus NR RL 3 3 3 5 7 in ZAP Pex Schneckenmedium einzurichten. Bauen Sie diese Kultur bei 25 Grad Celsius an.

Es wird für die Saatgutimpfung verwendet. Nach der Vorbereitung der transgenen Pflanzen, die die RNAI exprimieren, die im Textprotokoll beschrieben ist, fahren Sie mit der Ernte ihrer Samen fort. Entfernen Sie zuerst den Peric-Karpfen mit Abrieb aus einem auf niedrige Stufe eingestellten Hochdruckreiniger oder kratzen Sie den Peric-Karpfen mit der Hand ab.

Sobald der Perikarpfen entfernt ist, bestimmen Sie die Farbe des Mesokarpfens, indem Sie die Schoten auf einem Reifebrett in die richtigen Gruppen einteilen. Entferne nun die Löcher und verarbeite die gelben und braunen Kerne getrennt. Berechnen Sie die Anzahl der für das Experiment benötigten Samen: Mindestens drei Samenstücke, d. h. drei Co-Leadin-Hälften werden pro zu beprobender Erdnusslinie benötigt.

Bedecken Sie den Boden eines sterilen Becherglases mit einer Schicht Samen und bedecken Sie die Samen dann einfach mit einem abgemessenen Volumen von 75% Ethanol. Verdoppeln Sie dann diese Lautstärke. Lassen Sie die Samen 30 Sekunden lang in Lösung inkubieren und spülen Sie sie dann in sterilisiertem destilliertem Wasser ab.

Behandeln Sie anschließend die Samen mit einem Volumen von 2% Hypochlorit, wie es mit dem F-Ethanol gemacht wird. Lassen Sie diese Inkubation fünf Minuten lang ablaufen. Verwenden Sie dann drei Spülgänge in fünffachem Volumen sterilisiertem destilliertem Wasser.

Um das Hypochlorit zu entfernen, ist es entscheidend, dass die gesamte Hypochloritlösung in diesem Schritt abgewaschen wird. Die Samen werden nun oberflächensterilisiert. Als nächstes hydratisieren Sie die Samen, indem Sie sie zwei Stunden lang in sterilisiertes destilliertes Wasser tauchen, um die hydratisierten Samen auf eine sterile Petrischale zu legen.

Zu diesem Zeitpunkt sollten alle Materialien sterilisiert werden. Entferne die Samenschalen mit einer Pinzette und trenne dann die Cohain. Zum Schluss entnehmen Sie die Embryonen mit einem Skalpell.

Die Embryonen können verworfen oder zur Regeneration neuer Pflanzen verwendet werden. Schneiden Sie dann das Olein mit einem Skalpell in zwei Hälften und tauchen Sie die Hälften und das sterilisierte destillierte Wasser ein, bis sie für die Impfung bereit sind. Tupfen Sie dann überschüssiges Wasser von der Hälfte des Co-Leadins auf sterile Papiertücher und legen Sie die Samenstücke in separate 1,5%-Schneckenplatten mit Samengrößen-Divots und stecken Sie die Samen mit der Schnittseite nach oben hinein, um die Co-Leadin-Hälften zu beimpfen.

Geben Sie zwei Mikroliter von 10.000 Aspergillus-Sporen pro Mikroliter Suspension auf die Schnittflächen. Lassen Sie die Suspension nicht an den Seiten der Samenhälfte herunterlaufen. Zum Schluss stellen Sie die Gerichte für ein bis vier Tage in einen dunklen Brutkasten bei 30 Grad Celsius, bis sie getestet werden.

Nach einem Tag, nach zwei Tagen und nach drei oder vier Tagen nehmen Sie Proben aus den Samen, je nach Bedarf vorsichtig zufällig ausgewählte geimpfte Hälften. Wischen Sie überschüssige Sporen und Schnecken mit einem Taschentuch ab und geben Sie die Probe in ein Glasfläschchen mit Schraubverschluss. Übertragen Sie nicht beimpfte Proben in zwei Milliliter-Röhrchen für die R-T-P-C-R-Analyse.

Geben Sie Proben in flüssigem Stickstoff frei und lagern Sie gefrorene Proben in einem Gefrierschrank, bis sie verarbeitet werden. Für die Aflatoxin-Analyse besorgen Sie sich bei Bedarf das geimpfte halbe Fläschchen Leadin in einem Vier-Milliliter-Glasfläschchen mit Schraubverschluss. Die Probe wird über viele Monate bei minus 80 Grad Celsius stabil sein.

Wenn die Samen Raumtemperatur haben, extrahieren Sie die Probe, indem Sie vier Volumen Methanol hinzufügen und die Röhrchen über Nacht im Dunkeln bei Raumtemperatur ohne Rühren inkubieren lassen. Führen Sie am nächsten Tag zuerst die UPLC durch und bereiten Sie eine 1,5 Milliliter Propylen-Minisäule mit einer passenden Fritte vor. Fügen Sie dann 200 Milligramm Aluminiumoxid hinzu.

Und als nächstes fügst du eine weitere Fritte ein. In der nächsten Position positioniert sich das A-U-P-L-C Probenehmerfläschchen automatisch unter und in Kontakt mit der Minisäule, um die Verdunstung zu minimieren. Geben Sie nun 0,5 Milliliter Methanolextrakt aus der Probe in ein Einwegglas, das nicht aus Plastik besteht.

Geben Sie dann 0,5 Milliliter Acetonitril in das Röhrchen und mischen Sie die Lösungen mit einer Pipette. Geben Sie nun 0,5 Milliliter der Mischung auf die vorbereitete Mini-Säule und sammeln Sie das EIT nur mit Hilfe der Schwerkraft. Sobald das EIT gesammelt ist, befestigen Sie schnell eine Septikkappe an der Sammelfläschchen, um sie auf dem UPLC zu verwenden.

Platzieren Sie die Fläschchen in A-U-P-L-C, das bereits mit einer mobilen Phase mit Wasser, Methanol und Acedonit vorbereitet wurde. Quantifizieren Sie dann den Aflatoxingehalt in den EITs. Weitere Informationen zur UPLC-Analyse finden Sie im Textprotokoll.

Setzen Sie die für die Extraktion verwendeten Samenstücke in einzelne Glasfläschchen ein. Anschließend werden die Fläschchen über Nacht lyophilisiert und das Trockengewicht der Gewebeprobe am Morgen gemessen, damit die Aflatoxinkonzentrationen in Nanogramm pro Gramm Probe ausgedrückt werden können. Nehmen Sie dann die Proben aus dem Gefrierschrank und fügen Sie Triol hinzu und mahlen Sie das gefrorene Gewebe mit einem Perlmühlen-Homogenisator bei 3.100 U/min für 40 Sekunden und fahren Sie mit der RNA-Extraktion fort. Ein RNAI-Vektor, der kleine Fragmente von fünf Aflatoxinsynthese-Genen aus einem Flavis trägt, wurde verwendet, um Erdnusspflanzen zu transformieren.

Die Identifikationsnummern entsprechen den Genom-Annotationsnummern des Instituts von 99 regenerierten TRANSFORMANTS, sieben PCR-positive Linien wurden wie beschrieben kloniert und getestet. Alle sieben zeigten eine um 60 bis 100 % geringere Aflatoxinakkumulation im Vergleich zu Kontrolllinien. Die Ergebnisse von zwei der sieben Linien werden vorgestellt.

Diese beiden RN AI-Linien zeigten das Vorhandensein der NPT zwei wählbaren Markierungen. Gemäß den S-T-N-P-C-R-Ergebnissen war die verwendete Negativkontrolle eine PCR-negative Linie, die den Transformationsprozess durchlief, um die RNAi-Linien auf ihre Fähigkeit zu testen, Aflatoxinen zu widerstehen, frisch geerntete Kedia eines Aflatoxin-Positiven. Eine Flavis-Linie NRRL 3, 3, 5, 7 wurde nach einer Inkubation von bis zu 96 Stunden auf Leadin im halben Kindbett ohne Embryo und Testa angewendet.

Die inokulierten Gewebe wurden mit UPLC aufbereitet, um ihre Aflatoxinspiegel wie beschrieben zu messen. Diese Ergebnisse wurden durch die Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie weiter bestätigt. Insgesamt zeigte RNAi 2 88 72 eine Reduktion von 94 bis 100 % von Aflatoxin B zwei und eine Reduktion von 90 bis 100 % von Aflatoxin B 1 im Vergleich zur Kontrolle.

Während RNAi 2, 88, 74 eine 60- bis 100%ige Reduktion beider Aflatoxine zeigte. Nach diesem Verfahren können die gleichen Samenextrakte zur Analyse von Phyto Xin verwendet werden, um die Reaktion des Samens auf Pilzbefall besser zu verstehen. Diese Methode wird auch ein einzigartiges Werkzeug zur Entwicklung der RNAI-Technologie zur Kontrolle von Mykotoxinen bieten.Oxon.