Name: Murine Hautfibroblasten-Isolation durch FACS (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-07T10:00:01.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: Erfahren Sie die FACS-basierte Isolierung muriner Hautfibroblasten ohne In-vitro-Kultur zur Erhaltung des nativen Phänotyps. Diese Methode ermöglicht präzise Einblicke in Fibroblastenheterogenität und deren Rolle bei Narbenbildung und Fibrose.

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Diese Arbeit wurde zum Teil durch einen Zuschuss aus NIH R01 GM087609 (HPL), ein Geschenk von Ingrid Lai und Bill Shu zu Ehren von Anthony Shu (HPL), NIH Zuschusses U01 HL099776 (MTL), der Hagey Laboratory for unterstützt Pediatric Regenerative Medizin und der Oak Foundation (bis MTL, GCG und HPL). GGW wurde von der Stanford School of Medicine, der Stanford Medical Scientist Training Program unterstützt und NIGMS Ausbildungsförderung GM07365. ZNM wurde von der Plastic Surgery Foundation Research Fellowship Grant und der Hagey Family Fund unterstützt. MSH wurde vom California Institute für Regenerative Medizin (CIRM) Clinical Fellow Ausbildungsförderung TG2-01159, der American Society of Kiefer-Gesichtschirurgen (ASMS) / MKG-Chirurgen Foundation (MSF) Research Grant Award und dem Transplant und Tissue Engineering Fellowship Award unterstützt.

Dieses Protokoll folgt von der Stanford University Administrative Panel on Laboratory Animal Care anerkannten Methoden. 1. Die Verdauung von Murine Dermis <ol><li> Euthanize Mäuse durch zervikale Dislokation nach der Anästhesie mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin 100 mg / kg + Xylazin 20 mg / kg Acepromazin + 3 mg / kg. Hinweis: Verschiedene Altersgruppen und können verwendet werden. </li><li> Rasieren und enthaaren die Rückenhaut. Etwa 100.000 Zellen können aus einem Stück Rückenhaut 60 mm x 100 mm getrennt werden. </li><li> Tauchen Sie die Maus in 70% Ethanol und auf eine saubere, sterile Oberfläche zu trocknen. </li><li> Unmittelbar ernten dorsalen Haut von Mäusen unter Verwendung von sterilen Präparierscheren. Bei weiblichen Mäusen, zu vermeiden, einschließlich der Brustgewebe. </li><li> Ab der Basis des Schwanzes, verwenden Pinzette Zelt die Haut und machen eine Querschnitt vor dem Sezieren entlang der supra Faszienebene. </li><li> Sorgfältig zu vermeiden einschließlich subkutanem Fett, während der Erntedie Haut. Untersuchen Sie die Haut geerntet für jede Unterhautfett und vorsichtig abkratzen mit der stumpfen Seite eines Skalpells. </li><li> Spülen Sie die Haut geerntet in betadine gefolgt von 5x PBS Waschungen auf Eis. Anmerkung: Es ist wichtig, die Haut so nahe wie möglich steril zur Vermeidung von Verunreinigungen zu halten. </li><li> Blatt vor den Mund, die Haut mit Rasierklingen und Präparierscheren in einem sterilen Teller, bis die Probe eine einheitliche Konsistenz mit 2-3 mm große Stücke. </li><li> Vorbereitung 50 ml konischen Röhrchen mit 20 ml Kollagenase IV in einer Konzentration von 1 mg / ml in DMEM. Teilen die Dermis in die Rohre auf der Basis von fünf Mäusen pro Röhrchen. </li><li> Man schüttelt kräftig Proben während der Inkubation bei 37 ° C für 1 h entweder in einem Wasserbad oder Ofen. </li><li> Proben zu entfernen aus dem Inkubator und durch ein 10-ml-Spritze ohne Nadel 3-5x in einer sterilen Haube. </li><li> Legen Sie die Proben wieder in den Brutschrank bei 37 ° C und kräftig schütteln für weitere 30 min. </li><li> In einer sterilen Haube, Pipette die Proben auf und ab 3-5x mit einer 10 ml Pipette. Pipettieren der Probe durch einen 100 um-Filter in ein neues 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> Verlaufen in 20 ml 10% FBS DMEM über das gleiche Filter, um die Zellausbeute zu maximieren und bringt das Gesamtvolumen auf 40 ml. Zentrifuge bei 300 g für 8 min bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie den Überstand mit einer sterilen Glaspipette, wobei große Sorgfalt, um zuerst die obere Fettschicht vor der verbleibende Überstand zu entfernen. Anmerkung: Dieser Schritt ist entscheidend, um Adipozyten Kontaminierung. </li><li> Resuspendieren des Pellets in 20 ml 10% FBS DMEM. </li><li> Übergeben Sie die Zelle / DMEM Suspension durch ein 70 &amp; mgr; m-Filter. </li><li> Spülen der Filter mit 10 ml 10% FBS DMEM und zentrifugieren die gefilterte Suspension wird bei 300 g für 8 min bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie den Überstand mit einer sterilen Glaspipette, wieder darauf achten, dass zuerst alle verbleibenden Fettschicht zu entfernen. </li><li> Wenn es signifikante RBC Verschmutzung (das Pellet ist sichtlich rot), re-suspendieren die Pelletsin 20 ml ACK-Lysepuffer und Inkubation für 5 min bei RT. Andernfalls fahren Sie mit Schritt 24. </li><li> In das gleiche Volumen (20 ml) FACS-Puffer (PBS, 10% FBS, 0,1% Natriumazid), dann mischen und beiseite stellen eine 5-ml-Aliquot als ungefärbte Kontrolle. Zentrifugieren Sie die verbleibende Probe bei 300 g für 8 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Überstand entfernen und legte Pellets auf Eis. Die Zellen können sich an dieser Stelle eingefroren werden, wenn FACS Zeit nicht verfügbar ist. </li></ol> 2. Isolierung von Fibroblasten durch FACS <ol><li> Stellen Sie 500 ul Linie Antikörperinkubation Mix für jedes Pellet. Tun dies, indem zuerst 475 ul FACS-Puffer, enthaltend DNase (10 ug / ml) mit einem Rohr und dann Zugabe fluorophorkonjugierten CD31 (1: 100), CD45 (1: 200), Tie2 (1:50), Ter -119 (1: 200) und EpCAM (1: 100), Antikörper gegen die jeweilige Verdünnung für jeden Antikörper zu erzielen. </li><li> Re-suspend jedes Pellet in 500 ul Linie Antikörperinkubation Mischung und Inkubation dieser Suspension auf Eis für 20 min. </li><li> In 5ml FACS-Puffer, enthaltend DNase (10 ug / ml) zu der Probe und vorsichtig mischen. Zentrifuge bei 300 g für 8 min bei 4 ° C. </li><li> Den Überstand und wasche das Zellpellet mit 5 ml FACS-Puffer, enthaltend DNase (10 ug / ml) und zentrifugiert unter den gleichen Bedingungen wie in Schritt 26. </li><li> Das Pellet in 500 ul FACS-Puffer mit DNase (10 ug / ml) und zur Seite legen ein 50 ul Aliquot als Lebensfähigkeit Farbstoff Kontrolle. </li><li> Hinzufügen Lebensfähigkeit Farbstoff der Wahl, um die verbleibende Probe in dem für den gewählten Farbstoff angegebenen Konzentration. </li><li> Führen FACS-Analyse 31 und Sortierung für die Lebensfähigkeit Dye- / CD31- / CD45- / Tie2- / Ter-119- / EpCAM- Zellen (siehe Abbildung 2A). Sortierung direkt in FACS-Puffer. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die in dieser Handschrift beschriebenen Protokoll bietet ein Mittel, um Fibroblasten durch FACS-basierte Sortierung zu isolieren, im Vergleich zu bestehenden Verfahren, die entweder wählen Sie für eine Teilgesamtheit oder erfordern Zeit in der Zellkultur vor der nachfolgenden Analysen. Die von der Ernte der Haut, um das Sortieren von Fibroblasten benötigte Zeit beträgt ca. 6 Stunden; jedoch wird die Anzahl der Mäuse in der Ernte verwendet diese Abschätzung beeinflussen. Einige Punkte im Prot...

Fibroblasten werden oft morphologisch spindelförmigen Zellen, die auf Kunststoffsubstraten haften definiert. Fibroblasten sind das Prinzip Zelltyp für die Synthese und den Umbau der extrazellulären Matrix in embryonalen und adulten Organen 1 verantwortlich. Fibroblasten sind daher entscheidend für die Entwicklung von Säugetieren und tragen wesentlich zur extrazelluläre Milieu, das das Verhalten von benachbarten in jedem Gewebe und Organ vorliegenden Zelltypen beeinflußt. Fibroblasten sind auch der Hauptzelltyp hinter eine vielfältige Reihe von medizinischen Bedingungen, die enorme klinische Belastung verursachen. Pathologische Fibroblastenaktivität beeinträchtigt die normale Gewebefunktion und umfasst Gewebe und Organfibrose (wie der Lunge und Leber), Narben nach kutaner Wundheilung, Atherosklerose, Sklerodermie und Bildung Atheromatoseplaques nach der Blutgefäßverletzung 2-5. Wundheilung insbesondere akut und chronisch sowohl beinhaltet deposition von Narbengewebe, die weder ähnelt auch Aufgaben wie das normale Gewebe umgibt, und führt zu einer signifikanten Morbidität über verschiedene pathologische Zustände. Nach Verletzung, gibt es einen Übergang von Fibroblasten zu Myofibroblasten, die dann sezerStruktur ECM Komponenten auszuüben parakrine Wirkungen auf benachbarten Zelltypen und Wiederherstellen mechanische Stabilität durch Abscheiden Narbengewebe 6. In Hautgewebe besteht signifikante Abweichung in der Qualität der Wundreparatur in Entwicklungszeit zwischen anatomischen Stellen. In den ersten beiden Trimester des Lebens heilt der Fötus ohne Narbenbildung; jedoch von dem dritten Trimester auf und im Erwachsenenalter, Menschen heilen mit einer Narbe. Ortspezifische neben altersspezifische Unterschiede in der Wundheilung gibt. Wunden im Mundraum umzu mit minimaler Narbenbildung 7,8, während Narbengewebeablagerung innerhalb kutanen Wunden signifikant 9. Kontroverse besteht concerning den relativen Einfluss der Umwelt im Vergleich zu den intrinsischen Eigenschaften der lokalen Fibroblasten auf das Ergebnis der Wundheilung in Bezug auf sowohl Alter und Standort 10,11. Anbetracht der bedeutenden Unterschiede bei der Heilung von Maus oral vs. kutanen Dermis und früher embryonaler (E15) gegenüber späteren embryonalen (E18) Dermis, ist es wahrscheinlich, dass die intrinsische Unterschiede in den Populationen von Fibroblasten bei bestimmten Entwicklungs Alters und unter verschiedenen anatomischen Stellen existieren . Im Jahr 1986, Harold F. Dvorak gesetzten Tumoren sind Wunden, die nicht heilen 12. Dvorak geschlossen, dass Tumoren verhalten sich wie Wunden im Körper und induzieren ihre Stroma durch Aktivieren der Wundheilungsreaktion des Wirts. Zahlreiche Studien haben seit sucht den Beitrag von Fibroblasten zur Progression von Karzinomen 13-15, aber wie im Falle der Wundheilung, die Identität und die embryonalen Ursprungs der Fibroblasten, die mit dem Stroma der kutanen ca beitragenrcinomas nicht ausreichend definiert. Die Antwort auf diese Frage trägt medizinische Relevanz angesichts der jüngsten Studien Aussetzen des Tumor-assoziierten Fibroblasten als potenziell wirksame Ziel für Anti-Krebs-Therapie 16. Identifizierung und prospektiv Isolierung der Fibroblasten-Linien mit fibrogene Potenzial in vivo dotiert ist ein wesentlicher Schritt in Richtung ihrer Reaktion auf eine Verletzung in einem breiten Spektrum von akuten und chronischen Krankheitszuständen wirksam manipulieren. Im Jahr 1987 zeigte Cormack zwei Subpopulationen von Fibroblasten, einer mit Wohnsitz innerhalb der papillären und ein innerhalb der retikulären Dermis 17,18. Eine dritte Subpopulation gefunden wurde mit Haarfollikeln in der dermalen Papille Bereich des Follikels 19,20 verbunden. Wenn sie kultiviert werden, diese Fibroblasten-Subtypen zeigen Unterschiede in den Wachstumspotential, Morphologie und Wachstumsfaktor / Cytokine Profile 21-24. Bisher Studien, Fibroblasten-erterogeneity weitgehend versäumt, angemessen zu Entwicklungs- und Funktionsvielfalt bei Fibroblasten in vivo. Dies ist teilweise ein Ergebnis einer Abhängigkeit von kultivierten Fibroblastenpopulationen und das homogenisierende Wirkung Zellkultur oder eine positive Selektion auf der Grundlage eines selbst-Oberflächenrezeptor nicht von allen Fibroblasten 25 ausgedrückt. Eine aktuelle Studie aus unserem Labor zeigten eine tiefgreifende Oberflächenmarker und Transkriptions-Verschiebung in kultivierten vs. uncultured Fibroblasten durch die FACS-basierte Isolierung Methodik in diesem Manuskript 26 präsentiert isoliert. Anschließend identifizierten wir eine spezifische Fibroblastenlinie innerhalb der murine dorsal Dermis und bestimmt, dass diese Linie von embryonalen Expression des Engrailed-1 definiert ist, ist in erster Linie für Bindegewebsablagerung in die Rückenhaut verantwortlich. Die Linie Funktionen während der akuten und chronischen Formen der Fibrose einschließlich Wundheilung, Krebs Stromabildung undstrahleninduzierten Fibrose 27. Die Charakterisierung der verschiedenen Fibroblasten-Linien hat kritische Auswirkungen für Therapien, die auf die Modulation fibrogene Verhalten ausgerichtet. Anstatt in einem der vorhandenen Protokolle, die auf In-vitro-Manipulation verlassen, um Zellisolierung 28,29 zu erreichen, wird die Ernte-Protokoll (Abbildung 1) detailliert hier Ausbeute informative Analysen von Fibroblasten, die mehr genau zu erfassen Phänotyp und Verhalten in vivo zu helfen.

<table><tbody><tr><td>Chirurgische Zange</td><td>Kent Scientific</td><td>INS650916</td><td></td></tr><tr><td>Mikroschere</td><td>Kent Scientific</td><td>INS600127</td><td></td></tr><tr><td>Povidon Jod Prep Solution</td><td>Dynarex</td><td>1415</td><td></td></tr><tr><td>Nair (Enthaarungscreme)</td><td>Church and Dwight Co.</td><td></td><td></td>22600267058</tr><tr><td>Kollagenase IV</td><td>Gibco</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Elastase</td><td>Abcam</td><td>ab95133</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>A14430-01</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumchlorid-Kalium (ACK) Lysingpuffer</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m Filter</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m Filter</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu; m Filter</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>CD31</td><td>BioLegend</td><td>102421</td><td></td></tr><tr><td>CD45</td><td>BioLegend</td><td>103125</td><td></td></tr><tr><td>Tie2</td><td>BioLegend</td><td>124005</td><td></td></tr><tr><td>Ter-119</td><td>BioLegend</td><td>116233</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM (CD326)</td><td>eBioscience</td><td>48-5791</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Propidiumiodid (PI-Viabilitäts-Färbung)</td><td>BioLegend</td><td>421301</td><td></td></tr></tbody></table>

murine hautfibroblasten-isolation durch facs

 Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

Fibroblasten sind die Hauptzelltyp für die Sekretion der extrazellulären Matrix verantwortlich sind und eine wichtige Komponente vieler Organe und Gewebe. Fibroblast Physiologie und Pathologie zugrunde ein Spektrum von klinischen Einrichtungen, einschließlich Fibrosen in mehreren Organen, hypertrophe Narben nach Verbrennungen, Verlust der Herzfunktion nach Ischämie und der Krebsentstehung ein Stroma. Allerdings bleiben Fibroblasten ein schlecht charakterisierte Zelltyp, vor allem wegen ihrer inhärenten Heterogenität. Bestehenden Verfahren für die Isolierung von Fibroblasten erfordern Zeit in Zellkultur, die grundlegend beeinflusst Zellphänotyps und Verhalten. Folglich sind viele Studien, die Fibroblasten biology beruhen auf in-vitro-Manipulation und nicht genau Fibroblasten Verhalten in vivo zu erfassen. Um dieses Problem zu überwinden, haben wir eine FACS-basiertes Protokoll entwickelt für die Isolierung von Fibroblasten aus der Rückenhaut von erwachsenen Mäusen, die Zellkultur nicht erfordert, wodurch preserving die physiologische Transkriptions-und Proteom-Profil jeder Zelle. Unsere Strategie ermöglicht Ausschluss nicht mesenchymale Linien über eine Linie negative Gate (Lin -) statt eines positiven Selektionsstrategie zur Vorauswahl oder Anreicherung von einer Subpopulation von Fibroblasten zu vermeiden Expression spezifischer Oberflächenmarker und werden so umfassend wie möglich über diese heterogenen Zelltyp.

Die Gültigkeit dieses Ansatzes (Abbildung 1) wurde in einer Reihe von Möglichkeiten, die im Detail in unserer jüngsten Veröffentlichung 27 geprüft werden kann verifiziert. Dazu gehören Immunzytochemie von sortierten Zellen und Stoffzelle und Einzelzelltranskriptionsanalyse von frisch sortierten Zellen. Sortieren von Fibroblasten direkt anstatt sich auf Kultur genauer erfasst ihre in vivo Phänotyp. Unter Verwendung einer Linie negativen Verarmungs Ansatz (2A) und nicht als positive Selekt...

Das Verhalten von Fibroblasten liegt einem Spektrum klinischer Entitäten zugrunde, aber sie bleiben schlecht charakterisiert, hauptsächlich aufgrund ihrer inhärenten Heterogenität. Die traditionelle Fibroblastenforschung beruht auf In-vitro-Manipulation, um das Verhalten von Fibroblasten in vivo zu maskieren. Wir beschreiben ein FACS-basiertes Protokoll für die Isolierung von Hautfibroblasten der Maus, das keine Zellkultur erfordert.

Murine Hautfibroblasten-Isolation durch FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Fibroblasten mittels FACS zu isolieren und dabei die In-vitro-Kultur zu umgehen, die bereits nachweislich zu einer phänotypischen Veränderung dieser Zellen führt. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Entwicklungsbiologie und der Wundheilung zu beantworten, beispielsweise wie Fibroblastensubtypen identifiziert werden können, die an Narbenbildung und Fibrose beteiligt sind. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass In-vitro-Experimente vermieden werden, da die Anheftung an Kunststoff den Phänotyp der Fibroblasten verändert.Diese Methode kann nicht nur Erkenntnisse über dermale Fibroblasten liefern, sondern auch auf andere Systeme angewendet werden, wie beispielsweise peritoneale Fibroblasten und abdominelle Adhäsionen. Beginnen Sie damit, die dorsale Haut der betreffenden Maus zu rasieren und zu enthaaren. Tauchen Sie anschließend die enthaarte Maus in 70 % Ethanol ein und legen Sie das Tier auf eine saubere, sterile Oberfläche, um es trocknen zu lassen.Danach beginnend an der Basis des Schwanzes die Haut mit einer Pinzette anheben und mit einer Schere einen Querschnitt durchführen. Anschließend entlang der suprafaszialen Ebene dissezieren, um das dorsale Gewebe zu gewinnen. Sobald ein Hautstück von 60 mal 100 Millimeter entfernt wurde, mit der stumpfen Kante eines Skalpells vorsichtig überschüssiges subkutanes Fett entfernen.Anschließend die gewonnene Haut in Betadine spülen, gefolgt von fünf Waschschritten mit PBS auf Eis. Mit Rasierklingen und Präzisions-Scheren wird das Dermisgewebe in einer sterilen Schale solange zerkleinert, bis die Proben einheitlich eine Größe von etwa zwei bis drei Millimetern aufweisen. Danach werden Gewebefragmente von bis zu fünf Mäusen in die entsprechende Anzahl einzelner 50-Milliliter-Konischflaschen überführt, die jeweils 20 Milliliter Kollagenase 4 in DMEM enthalten.Schütteln Sie die Proben kräftig bei 37 Grad Celsius. Nach einer Stunde überführen Sie die Röhrchen in eine sterile Werkbank und geben Sie die Gewebeflocken dreimal bis fünfmal durch eine nadelfreie 10-Milliliter-Spritze. Stellen Sie die Proben anschließend weitere 30 Minuten auf den Schüttler und pipettieren Sie danach erneut dreimal bis fünfmal mit einer 10-Milliliter-Spritze.Filtern Sie die Proben anschließend durch einen 100-Mikron-Sieb in ein neues 50-Milliliter-Gefäß und waschen Sie das Siebgewebe mit 20 Milliliter DMEM, das mit FBS ergänzt wird, um das Gesamtvolumen auf 40 Milliliter aufzufüllen. Zentrifugieren Sie danach die Zellen und aspirieren Sie mit einer sterilen Glaspipette die obere Fettschicht. Nachdem die kontaminierenden Fettanteile entfernt wurden, entfernen Sie mit einer neuen Glaspipette den Rest des Überstandes und resuspendieren die Pellets in 20 Milliliter DMEM mit FBS.Nun filtrieren Sie die Zellen durch einen 75-Mikron-Filter und spülen Sie das Sieb mit 10 Milliliter DMEM plus FBS ab. Anschließend zentrifugieren Sie die Zellen erneut und entfernen Sie das Fett und das Überstandsvolumen, wie zuvor gezeigt. Resuspendieren Sie das Pellet in 20 Milliliter FACS-Puffer und stellen Sie einen Aliquot von fünf Milliliter für die unbehandelte Kontrolle beiseite.Anschießend das verbleibende Probenmaterial zentrifugieren, den Überstand verwerfen und das Pellet auf Eis stellen. Zur Isolierung der Fibroblasten mittels FACS das Pellet in 500 Mikroliter Inkubationsmix mit Linien-Antikörpern auf Eis resuspendieren. Nach 20 Minuten vorsichtig fünf Milliliter FACS-Puffer, ergänzt mit DNase, mit den Zellen vermischen und diese zentrifugieren.Waschen Sie das Pellet in einem zweiten Ansatz von fünf Millilitern DNase. Anschließend resuspendieren Sie die Zellen in 500 µL FACS-Puffer und DNase und heben einen Aliquot von 50 µL Zellen für die Lebendtot-Färbekontrolle zurück. Schließlich geben Sie Lebendtot-Färbemittel zur verbleibenden Probe hinzu und sortieren die Zellen gemäß dem Diagramm.Die Verwendung eines Ansatzes zur Ausschöpfung von linienegativen Zellen anstelle eines Ansatzes zur positiven Selektion verhindert eine Vorauswahl bestimmter Teilpopulationen. Die Transkriptom-Mikroarray-Analyse zeigt, dass kultivierte Fibroblasten, die mittels Live-Harvest- und Gewebe-Explant-Methoden isoliert wurden, auf transkriptomweiter Ebene einen hohen Grad an Ähnlichkeit aufweisen, mit einem Pearson-Korrelationskoeffizienten von 0,92. Im Vergleich dazu unterschieden sich kultivierte Fibroblasten signifikant von einem live geernteten, nicht kultivierten Fibroblasten, was die Bedeutung der Analyse von live geernteten gegenüber kultivierten Fibroblasten unterstreicht.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Entwicklungsbiologie und der Wundheilung den Weg, um die Heterogenität von Fibroblasten zu bestätigen und Subpopulationen zu identifizieren, die für Narbenbildung und andere Formen der Fibrose verantwortlich sind.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Krebs Fibroblasten (CAF) zu erleichtern Tumorinitiation, Wachstum und die Progression durch signalisiert, dass es fördert die Proliferation, Angiogenese und Entzündung. Hier beschreiben wir ein Verfahren, um reine Populationen normalen Fibroblasten und CAF aus frischen Maus und menschlichen Geweben isolieren durch Zellsortierung unter Verwendung PDGFRα als Oberflächen-Marker.

Isolation von Normal und Krebs-assoziierte Fibroblasten von Fresh Gewebe durch Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Dieses Video beschreibt die schnelle Methode, die Melanozyten und Fibroblasten gleichzeitig aus der Haut des postnatalen Mauswelpen zu isolieren und zu kultivieren. Diese Zellen können in vitro erhalten und manipuliert werden, um die Zellbiologie der Haut, die Wundheilung und das Melanom zu untersuchen.

Schnelle Kultivierung primärer melanischer Melanozyten und Fibroblasten: Isolierung von Melanozyten und Fibroblasten aus einer ganzen Maushautprobe

Ein ideales Modell für das Studium der adulten Stammzellbiologie ist der Haarfollikel der Maus. Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung verschiedener Populationen von Haarfollikeln, Stammzellen und epidermalen Keratinozyten vor, wobei die enzymatische Verdauung der Rückenhaut von Mäusen mit anschließender FACS-Analyse zum Einsatz kommt.

Isolieren von Haarfollikelstammzellen und epidermalen Keratinozyten von Dorsal Mäusehaut

Dieses Manuskript beschreibt ein FACS-basiertes Protokoll zur Isolierung von papillären und Netzfibroblasten von der menschlichen Haut. Sie umgeht in der vitro-Kultur, die mit dem häufig verwendeten Isolationsprotokoll über Explantationskulturen unvermeidlich war. Die ausstrahlenden fibroblasten Untersätze sind funktional unterscheidbar und zeigen eine differenzierte Genexpression und Lokalisierung innerhalb der Dermis.

Isolierung von papillären und retikulären Fibroblasten aus der menschlichen Haut durch Fluoreszone-aktivierte Zellsortierung

Dieses Protokoll skizziert eine schnelle Methode, um gleichzeitig Melanozyten- und Fibroblastenkulturen aus der Haut von 0-4 Tage alten Mäusen zu erzeugen. Diese Primärkulturen können in vitro gepflegt und manipuliert werden, um eine Vielzahl physiologisch relevanter Prozesse zu untersuchen, einschließlich Hautzellbiologie, Pigmentierung, Wundheilung und Melanom.

Schnelle Generierung von primären Melanozyten- und Fibroblastenkulturen

Wir präsentieren ein Protokoll, um primäre erwachsene Fibroblasten auf einfache, schnelle und zuverlässige Weise zu isolieren, die von Anfängern (z. B. Studenten) durchgeführt werden können. Das Verfahren kombiniert enzymatische Gewebeverdauung und mechanische Agitation mit Ultraschallwellen, um primäre Fibroblasten zu erhalten. Das Protokoll kann leicht an spezifische experimentelle Anforderungen (z.B. menschliches Gewebe) angepasst werden.

Ultraschall-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

Die Zellumprogrammierung erfordert die Einführung von Schlüsselgenen, die den pluripotenten Zellzustand regulieren und aufrechterhalten. Das beschriebene Protokoll ermöglicht die Bildung induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSCs) aus menschlichen dermalen Fibroblasten ohne virale/integrierende Methoden, aber unter Verwendung nicht modifizierter RNAs (NM-RNAs) in Kombination mit Immunumgehungsfaktoren, die die zellulären Abwehrmechanismen reduzieren.

Isolierung von adulten menschlichen Dermal-Fibroblasten aus der Bauchhaut und Generierung induzierter pluripotenter Stammzellen mit einer nicht-integrierenden Methode

Die Gewinnung einer reinen Population von Fibroblasten ist entscheidend für die Untersuchung ihrer Rolle bei der Wundreparatur und Fibrose. Beschrieben ist eine detaillierte Methode, um Fibroblasten und Myofibroblasten von unverletzten und verletzten Mausherzen zu isolieren, gefolgt von der Charakterisierung ihrer Reinheit und Funktionalität durch Immunfluoreszenz, RTPCR, Fluoreszenz-unterstützte Zellsortierung und Kollagen-Gel-Kontraktion.

Isolierung und Charakterisierung von adulten Herz-Fibroblasten und Myofibroblasten

Dieser Beitrag beschreibt eine explantationskulturbasierte Methode zur Isolierung und Kultivierung primärer, patientenspezifischer humaner Aortenglattmuskelzellen und dermaler Fibroblasten. Weiterhin wird eine neuartige Methode zur Messung der Zellkontraktion und anschließenden Analyse vorgestellt, mit der patientenspezifische Unterschiede in diesen Zellen untersucht werden können.

Isolierung primärer patientenspezifischer glatter Aortenmuskelzellen und semiquantitative Echtzeit-Kontraktionsmessungen in vitro

In dieser Arbeit wird ein Verfahren zur magnetischen Bead-basierten Isolierung von murinen Endothelzellen aus dermalen lymphatischen Kapillaren beschrieben. Die isolierten lymphatischen Endothelzellen können für nachgelagerte In-vitro-Experimente und Proteinexpressionsanalysen verwendet werden.

Isolierung von dermalen lymphatischen Endothelzellen der Maus

Dieses Protokoll beschreibt eine optimierte Methode zur Dissoziation alter Maus-Tränendrüsen, um lebensfähige Einzelzellen für die Sequenzierung einzelner RNA zu erhalten. Sequentielle enzymatische Verdauung und sanfte Handhabung erhalten die Zellintegrität und liefern hochwertige Suspensionen, die für zelltypspezifische Isolation und transkriptomische Analyse altersassoziierter Veränderungen in Tränendrüsenpopulationen geeignet sind.

Protokoll für Einzelzell-Dissoziation, RNA-Sequenzierung und Isolierung von Myoepithelzellen und Fibroblasten aus den gealterten Lacrimal- und Speicheldrüsen

Erfahren Sie die FACS-basierte Isolierung muriner Hautfibroblasten ohne In-vitro-Kultur zur Erhaltung des nativen Phänotyps. Diese Methode ermöglicht präzise Einblicke in Fibroblastenheterogenität und deren Rolle bei Narbenbildung und Fibrose.

Murine Hautfibroblasten-Isolation durch FACS

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