Computertomographie und Optical Imaging von Osteogenesis-Angiogenese-Kopplung an Integration von Schädelknochen Autografts und Allografts Beurteilen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Integration von Schädelknochentransplantaten in Bezug auf Knochenregeneration und Neovaskularisation mit multimodalen bildgebenden Ansätzen zu überwachen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der regenerativen Medizin zu beantworten, wie z.B. die Osteogenese-Angiogenese-Kopplung. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine hochauflösende 3D-Bestimmung der Gefäße ermöglicht und die Untersuchung des gesamten Organs ermöglicht, was zeigt, dass das Verfahren von Doron Vic, einem Doktoranden in meinem Labor, nach der Einschläferung der sieben bis acht Wochen alten Bab-Seemaus sein wird.

Verwenden Sie laut Textprotokoll einen Haarschneider, um den Schädelbereich entgegen der Haarwuchsrichtung zu rasieren. Tragen Sie 70% Isopropanol auf den Schlachtkörper auf und desinfizieren Sie den Kopf. Verwenden Sie dann ein Skalpell mit der Nummer 11, um die Haut der Kopfhaut zu durchtrennen und das Periost mit einem Zahnbohrer und einem Zinken mit einem Innendurchmesser von 4,5 Millimetern zu entfernen.

Lösen Sie ein kreisförmiges Fragment des Schädeldachknochens. Übertragen Sie das Knochenfragment in eine 100 Millimeter große Kunststoffschale mit steriler Kochsalzlösung. Beobachten Sie an dieser Stelle Blut und Weichgewebe, die mit einer gebogenen Pinzette am Knochenfragment befestigt sind.

Halten Sie jeweils ein Knochenfragment und tupfen Sie es mit einem Applikator mit Wattespitze gründlich ab. Entfernen von Hirngewebe, Weichgewebe und Blut. Schneiden Sie mit einer feinen Schere vorsichtig alle Knochenspäne ab, die am Transplantat haften geblieben sind, damit das Transplantat eine perfekt abgerundete Form hat.

Tauchen Sie jedes Transplantat einmal in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit 70 % Ethanol und zweimal in 15-Milliliter-Röhrchen mit PBS, um das Ethanol abzuwaschen. Frieren Sie das Allotransplantat nach dem Einfrieren mindestens eine Woche lang in einem Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius in Kryoröhrchen ein. Stellen Sie sicher, dass das Allotransplantat transparent erscheint, wenn Sie mit transgenen Empfängermäusen arbeiten, die unter der Kontrolle des Osteocalcin-Promotors Luciferase exprimieren.

Nach der Betäubung einer sieben bis acht Wochen alten weiblichen Maus mit injizierbaren Anästhetika und der Überprüfung der Sedierung. Verwenden Sie einen Haarschneider entgegen der Haarwuchsrichtung, um den Schädeldachbereich zu rasieren. Tragen Sie ein Enthaarungsmittel auf, um alle Fellreste zu entfernen, und wischen Sie sie nach nicht länger als zwei Minuten mit trockener Gaze ab.

Verwenden Sie dann in Kochsalzlösung getränkte Gaze, um den Bereich abzuwischen. Desinfizieren Sie die Kopfhaut, indem Sie 5% Chlorhexidin subkutan auftragen. Injizieren Sie fünf Milligramm Carprofen pro Kilogramm, verdünnt in 200 Mikrolitern Kochsalzlösung.

Tragen Sie Augensalbe auf, um Trockenheit zu verhindern, und halten Sie das Tier immer auf einem Wärmekissen. Positionieren Sie dann das Tier unter dem Operationsfernglas. Machen Sie anschließend mit einer feinen Schere und einer Pinzette einen einen Zentimeter langen ovalen Schnitt in die Kopfhaut.

Halten Sie das Periost fest und schneiden Sie es mit einer feinen Schere mit einem Zahnbohrer und einem Außendurchmesser von fünf Millimetern tr ab, bohren Sie den Schädelbaddefekt zwei Millimeter vor der Lambdoidnaht, um ein Eindringen der Dura mater zu vermeiden. Bohren Sie drei Viertel des Weges in den Knochen und lösen Sie das Knochenfragment mit einem Spatel. Ein kritischer Schritt im Protokoll ist die Beendigung der Fehlerstelle.

Eine Verletzung der Labo-Naht führt zu massiven Blutungen. Daher sollte darauf geachtet werden, dass das darunterliegende Durometer und das obere Sagittal nicht gestört werden. Um ein Autotransplantat zu implantieren.

Verwenden Sie 10 Milliliter sterile Kochsalzlösung in einer 10 Millimeter großen Kunststoffplatte, um das Knochenfragment zu waschen. Entfernen Sie Blutgerinnsel, ohne Weichgewebe zu entfernen, um ein Allotransplantat zu implantieren, tauen Sie im Voraus auf und normalisieren Sie die Probe auf Raumtemperatur. Waschen Sie dann das Knochenfragment mit einer gebogenen Pinzette.

Platzieren Sie das Knochentransplantat so in den Defekt, dass es die Defektränder nicht berührt. Kleben Sie dann das Transplantat mit Fibringel auf den Wirtsknochen. Vernähen Sie die Haut mit vier oh Vicryl-Nähten und tragen Sie Povidon-Jod auf den chirurgischen Schnitt auf.

Markieren Sie das Mausohr und injizieren Sie 0,25 Milligramm pro Kilogramm Anti-Limousine. Um die anästhetische Wirkung des Meto umzukehren. Führen Sie die postoperative Versorgung gemäß dem Textprotokoll durch.

Bereiten Sie heparinisierte Kochsalzlösung vor, indem Sie 2000 Einheiten Natriumheparin wiegen und in ein 50-Milliliter-Röhrchen umfüllen. Geben Sie 20 Milliliter sterile Kochsalzlösung in das Röhrchen und schütteln Sie. Füllen Sie eine 20-Milliliter-Lockspritze mit 15 Millilitern erwärmter heparinisierter Kochsalzlösung und verbinden Sie die Spritze mit einem 23-Gauge-Kopfhautvenen-Set.

Befestigen Sie die Spritze an einer Spritzenpumpe und stellen Sie die Pumpe auf 10 Milliliter auf einen Milliliter pro Minute ein. Nach der Betäubung einer Maus gemäß dem Textprotokoll bestätigen Sie die Sedierung mit einem Zehenkneifen und befestigen Sie die Maus. Es ist zurück zu einem Fixierbrett, das mit einer saugfähigen Oberflächenfolie umwickelt ist.

Schneiden Sie anschließend die Haut vom Bauch bis zum Hals ab. Schneide die Bauchdecke bis zum Xiphoid-Prozess durch. Schneiden Sie dann den Brustkorb entlang seiner seitlichen Seite auf und stellen Sie sicher, dass das Herz vollständig freiliegt und Herz und Lunge unbeschädigt sind.

Verwenden Sie ein Blutstillungsmittel, um das Brustbein zurückzuziehen. Führen Sie die Schmetterlingsnadel drei Millimeter in die linke Herzkammer ein. Kleben Sie dann die Nadel mit drei Sekunden Kleber an die Herz- und Brustwand Das Einführen der Schmetterlingsnadel in den linken Ventrikel ist ein heikler Eingriff.

Versuchen Sie, das Einführen in den rechten Ventrikel oder zu tief in den linken Ventrikel zu vermeiden, da es die hintere Herzwand durchdringt. Aktivieren Sie anschließend sofort die Pumpe. Nach einer Minute präparieren Sie die untere Vena cva, um das Gefäßsystem drucklos zu machen.

Kippen Sie das Brett so, dass die Flüssigkeiten vom Kopf wegfließen. Eine erfolgreiche Durchblutung führt zu einer Reinigung der Leber und der Blutgefäße. Nun werden 10 Milliliter 4%iges Formaldehyd perfundiert.

Vermeidung des Eindringens von Luftblasen in das Gefäßsystem. Wenn die Durchblutung abgeschlossen ist, was durch eine Versteifung des Schwanzes angezeigt wird, verwenden Sie 10 Milliliter heparinisierte Kochsalzlösung, um das Formaldehyd auszuspülen. Bereiten Sie das röntgenundurchlässige Kontrastmittel gemäß den Herstellerangaben vor.

Durch Mischen der Verbindung, des Verdünnungsmittels und des Härtungsmittels in einem Kunststoffröhrchen wird das Tier mit dem Kontrastmittel mit einer Geschwindigkeit von einem Milliliter pro Minute durchblutet. Die Koronararterien und Leberarterien sollten gelb werden, wenn die Durchblutung abgeschlossen ist. Schneiden Sie den Schlauch bis zur Schmetterlingsnadel ab und wickeln Sie den Kadaver in Papier ein, um ein Auslaufen der Lösung in den Schädeldachbereich zu verhindern.

Setzen Sie das Tier über Nacht bei vier Grad Celsius ein, um die Polymerisation am nächsten Tag zu ermöglichen. Um die Schädelregion zu präparieren, schneiden Sie die Haut mit einem Skalpell so seitlich wie möglich ab, um eine Beschädigung der interessierenden Schädelregion zu vermeiden. Suchen Sie das Knochentransplantat und schneiden Sie dann mit einer feinen Schere den Schädelknochen 10 Millimeter vom Transplantat entfernt ab.

Mit einem Mikro-CT-Scanner. Stellen Sie das Sichtfeld auf 20,5 Millimeter, die Röntgenenergie auf 55 KVP, die Intensität auf 145 Mikroampere, tausend Projektionen pro 360 Grad und eine Integrationszeit von 200 Millisekunden ein. Scannen Sie die isolierte Schädeldachknochenprobe.

Betrachten Sie die 2D-rekonstruierten Schnitte, die von der Mikro-CT-Software generiert wurden. Stellen Sie sicher, dass Sie den interessierenden Bereich richtig scannen und dann den Schädelbahndefekt lokalisieren. Wenn die durchbluteten Gefäße leicht erkennbar sind, verwenden Sie 6%ige Trichloressigsäure, verdünnt in doppelt destilliertem Wasser.

Um die Probe zu entkalken, scannen Sie die Probe erneut mit den gleichen Parametern wie gerade beschrieben. Lokalisieren Sie die Lambdoid-Naht in den rekonstruierten 2D-Schnitten. Definieren Sie ein zylindrisches Volumen von Interesse oder VOI mit einer Höhe von zwei Millimetern und einem Durchmesser von acht Millimetern, das tangential zur Naht ist.

Dies ist die anatomische Stelle des Defekts. Als nächstes segmentieren Sie den Knochen vom Weichgewebe. Legen Sie den unteren Schwellenwert auf 130 fest, und wenden Sie einen eingeschränkten 3D-Gaußschen Filter an, um das Rauschen in der Lautstärke teilweise zu unterdrücken.

Generieren Sie eine 3D-Rekonstruktion. Stellen Sie sicher, dass der VOI mithilfe der IPL-Software und des DT-Objekts richtig positioniert ist. Peram-Funktion generiert eine Dickenkarte.

Diese Funktion beschreibt das Gefäßvolumen für jeden Gefäßdurchmesser, führen Bildgebung und Mikrocomputertomographie durch. Gemäß dem Textprotokoll, wie hier gezeigt, zeigte die CT-Untersuchung sieben Tage nach der Operation ein signifikant höheres Volumen an Blutgefäßen mit kleinem und mittlerem Durchmesser, die den gesamten Transplantatbereich bei Mäusen ernährten, die Autogramme erhalten hatten, im Gegensatz zu Mäusen, die Allotransplantate erhielten, bei denen die Gefäße von außen einzudringen schienen. Darüber hinaus zeigte die Fluoreszenzbildgebung eine signifikant höhere Blutdurchblutung bei autograph behandelten Tieren.

Am 14. Tag erreicht der Gefäßbaum im Allotransplantat die Nähe aller Transplantate. Dennoch war das Gefäßvolumen im Vergleich zur Autographt-Gruppe deutlich geringer. Dieser Unterschied war am deutlichsten, wenn Gefäße mit einem Durchmesser von 0,08 bis 0,1 Millimetern verglichen wurden, wie hier 28 Tage nach der Operation, das Gefäßvolumen sieben Tage nach der Operation wieder auf den Ausgangswert zurückkehrte.

Die Autotransplantatgruppe zeigte eine signifikant größere Knochenmineralisierung, wie durch Fluoreszenzbildgebung mit einer Hydroxylapatit-gerichteten Sonde zu sehen war. Während sich in dieser Gruppe nur an den Defekträndern in der Allotransplantatgruppe Knochen bildete, wie durch eine Ringform gekennzeichnet, war das Knochenvolumen 56 Tage nach der Operation signifikant höher und die Transplantatdicke signifikant größer bei Tieren, die Autogramme erhielten, im Vergleich zu Allotransplantaten. Einmal gemeistert, kann diese Operationstechnik in etwa 25 Minuten durchgeführt werden. Im Anschluss an dieses Verfahren kann eine Fluoreszenzbildgebung mit anderen Probanden durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. zur Osteoklastenaktivität und zur Beteiligung der Immunantwort.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Knochenregeneration in der zugrunde liegenden Angiogenese abbilden können.