Computertomographie und Optical Imaging von Osteogenesis-Angiogenese-Kopplung an Integration von Schädelknochen Autografts und Allografts Beurteilen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Integration von Schädelknochen-Transplantaten hinsichtlich Knochenregeneration und Neovaskularisierung mittels multimodaler Bildgebungsverfahren zu überwachen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der regenerativen Medizin zu beantworten, beispielsweise die Kopplung von Osteogenese und Angiogenese. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine hochauflösende 3D-Bestimmung des Gefäßbaums ermöglicht und die Untersuchung des gesamten Organs erlaubt. Die Demonstration des Verfahrens erfolgt durch Doron Vic, einen Doktoranden in meinem Labor, nach der Tötung eines sieben bis acht Wochen alten Bab-See-Maus.

Gemäß dem Textprotokoll verwenden Sie einen Haarschneider, um die kraniale Region entgegen der Haarwuchsrichtung zu rasieren. Tragen Sie 70 % Isopropanol auf den Kadaver, Kopf auf, um ihn zu desinfizieren. Anschließend schneiden Sie mit einem Skalpell der Größe 11 die Kopfhaut ein und entfernen das Periost mithilfe eines Zahnbohrers und einer Zahnfräse mit einem inneren Durchmesser von 4,5 Millimetern.

Lösen Sie ein kreisförmiges Fragment des Schädeldaches ab. Überführen Sie das Knochenstück in eine 100 Millimeter Kunststoffschale, die sterile Kochsalzlösung enthält. Untersuchen Sie zu diesem Zeitpunkt mit einer gebogenen Pinzette das am Knochenstück anhaftende Blut und Weichgewebe.

Halten Sie jeweils ein Knochenfragment und verwenden Sie einen Wattestäbchen, um es gründlich abzutupfen. Entfernen Sie dabei jegliches Gehirngewebe, Weichgewebe und Blut. Schneiden Sie vorsichtig mit einer feinen Schere alle am Transplantat verbliebenen Knochensplitter ab, damit das Transplantat eine vollständig runde Form erhält.

Tauchen Sie jeden Transplantat einmal in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit 70 % Ethanol und zweimal in 15-Milliliter-Röhrchen mit PBS ein, um das Ethanol abzuwaschen. Gefrieren Sie das Allograft nach dem Einfrieren mindestens eine Woche lang in einem Minus-80-Grad-Celsius-Gefrierschrank in Kryoröhrchen. Stellen Sie sicher, dass das Allograft transparent erscheint, wenn Sie mit empfängertransgenen Mäusen arbeiten, die Luciferase unter der Kontrolle des Osteocalcin-Promotors exprimieren.

Nach der Anästhesie einer sieben bis acht Wochen alten weiblichen Maus mit injizierbaren Anästhetika und der Überprüfung der Sedierung verwenden Sie einen Haarschneider, um entgegen der Haarwuchsrichtung den kallottenartigen Bereich zu rasieren. Tragen Sie ein Enthaarungsmittel auf, um eventuelle Haarreste zu entfernen, und wischen Sie es nach spätestens zwei Minuten mit trockenem Mull ab.

Verwenden Sie dann ein in Kochsalzlösung getränktes Mulltuch, um die Stelle abzuwischen. Desinfizieren Sie die Kopfhaut durch subkutane Applikation von 5 % Chlorhexidin. Injizieren Sie fünf Milligramm pro Kilogramm Carprofen, verdünnt in 200 Mikrolitern Kochsalzlösung.

Augensalbe auftragen, um Austrocknung zu verhindern, und das Tier stets auf einer Wärmematte lagern. Danach das Tier unter dem Operationsmikroskop positionieren. Anschließend mit feinen Scheren und Pinzetten einen etwa einen Zentimeter langen ovalen Schnitt in die Kopfhaut mit Hilfe der Pinzette durchführen.

Halten Sie das Periost fest und schneiden Sie es mit einer Feinschere unter Verwendung eines Zahnbohrers und eines Feinbohrers mit fünf Millimetern Außendurchmesser ab. Bohren Sie den Schädelfehlbereich zwei Millimeter anterior zur Lambdasnaht, um eine Durchtrennung des Duramaters zu vermeiden. Bohren Sie bis zu drei Viertel der Knochen Tiefe hinein und lösen Sie das Knochenfragment mit einem Spatel ab. Ein kritischer Schritt im Protokoll ist die endgültige Bestimmung der Defektlokalisation.

Verletzungen der Sagittalfuge führen zu massiven Blutungen. Daher sollte darauf geachtet werden, den darunterliegenden Dura mater und den Sinus sagittalis superior nicht zu verletzen. Zum Einsetzen einer Autotransplantation.

Verwenden Sie 10 Milliliter sterile Kochsalzlösung in einer 10 Millimeter Kunststoffplatte, um das Knochenfragment zu waschen. Entfernen Sie Blutgerinnsel, ohne das Weichgewebe zu entfernen, um eine Allograft vor dem Einpflanzen im Voraus aufzutauen und die Probe auf Raumtemperatur zu normalisieren. Anschließend waschen Sie das Knochenfragment mit gebogenen Pinzetten.

Platzieren Sie die Knochentransplantat so in den Defekt, dass es die Defektränder nicht berührt. Befestigen Sie das Transplantat anschließend mit Fibringel an dem Wirtsknochen. Nähen Sie die Haut mit einer 4-0-Vicryl-Naht und tragen Sie Povidon-Iod auf den chirurgischen Einschnitt auf.

Markieren Sie das Mausohr und injizieren Sie 0,25 Milligramm pro Kilogramm Anti-Sedan, um die anästhetische Wirkung des Meato aufzuheben. Führen Sie die postoperative Versorgung gemäß dem Textprotokoll durch.

Bereiten Sie heparinhaltiges Kochsalzlösung vor, indem Sie 2000 Einheiten Natriumheparin abwiegen und in ein 50-Milliliter-Gefäß umfüllen. Geben Sie 20 Milliliter sterile Kochsalzlösung hinzu und schütteln Sie das Gefäß. Füllen Sie eine 20-Milliliter-Luer-Lock-Spritze vollständig mit 15 Milliliter erwärmter heparinhaltiger Kochsalzlösung und verbinden Sie die Spritze mit einem 23-Gauge-Skalpvenenset.

Befestigen Sie die Spritze an einer Spritzenpumpe und stellen Sie die Pumpe auf 10 Milliliter bei einem Milliliter pro Minute ein. Nach der Anästhesie eines Mäuses gemäß dem Textprotokoll bestätigen Sie die Sedierung durch einen Zehenquetschtest und sichern Sie die Maus mit dem Rücken nach unten auf einem Fixierbrett, das mit einer saugfähigen Oberflächenauflage umhüllt ist.

Schneiden Sie anschließend die Haut vom Abdomen bis zum Hals auf. Schneiden Sie die Bauchdecke bis zum Processus xiphoideus auf. Durchtrennen Sie dann den Rippenbogen an seiner Seitenfläche, wobei sichergestellt werden muss, dass das Herz vollständig freigelegt ist und Herz sowie Lunge unverletzt bleiben.

Verwenden Sie eine Hämoklippe, um das Brustbein zurückzuhalten. Führen Sie die Butterfly-Nadel drei Millimeter in den linken Ventrikel ein. Befestigen Sie die Nadel dann mit einem Drei-Sekunden-Kleber am Herzen und an der Brustwand. Die Einführung der Butterfly-Nadel in den linken Ventrikel ist ein empfindlicher Vorgang.

Versuchen Sie, eine Injektion in den rechten Ventrikel oder zu tief in den linken Ventrikel zu vermeiden, da dies zur Durchtrennung der hinteren Herzwand führen kann. Aktivieren Sie anschließend sofort die Pumpe. Nach einer Minute dissezieren Sie die Vena cava inferior, um die Gefäße zu entlasten.

Neigen Sie das Brett so, dass die Flüssigkeiten vom Kopf wegfließen. Ein erfolgreicher Perfusionsvorgang führt zu einer Entleerung der Leber und der Blutgefäße. Perfundieren Sie nun 10 Milliliter 4 % Formaldehyd.

Vermeidung des Eindringens von Luftblasen in das Gefäßsystem. Wenn die Perfusion abgeschlossen ist, was durch eine Versteifung des Schwanzes angezeigt wird, spülen Sie das Formaldehyd mit 10 Milliliter heparinisiertem Kochsalzlösung aus. Bereiten Sie das röntgendichte Kontrastmittel gemäß den Herstelleranweisungen vor.

Durch Mischen des Verdünnungsmittels der Verbindung und des Härteagents in einem Plastikröhrchen wird das Tier mit dem Kontrastmittel mit einer Geschwindigkeit von einem Milliliter pro Minute perfundiert. Die koronare, intestinale und hepatische Arterie sollten gelb werden, wenn die Perfusion abgeschlossen ist. Das Schlauchstück bis zur Butterfly-Kanüle abschneiden und die Leiche in Papier einwickeln, um ein Austreten der Lösung in den kallottennahen Bereich zu verhindern.

Stellen Sie das Tier über Nacht bei vier Grad Celsius, um am folgenden Tag die Polymerisation zu ermöglichen. Um die kalvariale Region zu präparieren, schneiden Sie mit einem Skalpell die Haut so lateral wie möglich, wobei Sie vermeiden sollten, die interessierende kraniale Region zu beschädigen. Lokalisieren Sie die Knochentransplantat und schneiden Sie dann mit feiner Schere den Schädelknochen zehn Millimeter entfernt vom Transplantat ab.

Mithilfe eines Mikro-CT-Scanners. Stellen Sie das Sichtfeld auf 20,5 Millimeter, die Röntgenenergie auf 55 kVp, die Intensität auf 145 Mikroampere, tausend Projektionen pro 360 Grad und eine Integrationszeit von 200 Millisekunden ein. Scannen Sie die isolierte kalvarielle Knochenprobe.

Untersuchen Sie die von der Mikro-CT-Software generierten 2D-rekonstruierten Schnittbilder. Stellen Sie sicher, dass der interessierende Bereich ordnungsgemäß gescannt wurde, und lokalisieren Sie anschließend den kalvarialen Defekt. Falls die perfundierten Gefäße leicht identifizierbar sind, verwenden Sie 6 % Trichloressigsäure, die in doppelt destilliertem Wasser verdünnt wurde.

Um die Probe zu entkalken, scannen Sie die Probe erneut mit denselben Parametern wie zuvor beschrieben. Lokalisieren Sie die lambdoide Naht in den rekonstruierten zweidimensionalen Schnittbildern. Definieren Sie ein zylindrisches Untersuchungsvolumen (VOI) mit einer Höhe von zwei Millimetern und einem Durchmesser von acht Millimetern, das tangential zur Naht liegt.

Dies ist die anatomische Stelle des Defekts. Danach das Knochenmaterial von dem Weichgewebe segmentieren. Setzen Sie die untere Schwelle auf 130 und wenden Sie einen begrenzten 3D-Gauß-Filter an, um das Rauschen in den Volumen teilweise zu unterdrücken.

Erzeugen Sie eine 3D-Rekonstruktion. Stellen Sie mithilfe der IPL-Software und des DT-Objekts sicher, dass das VOI korrekt positioniert ist. Erzeugen Sie mit der Funktion Peram eine Dickenkarte.

Diese Funktion beschreibt das Gefäßvolumen für jeden Gefäßdurchmesser, um Bildgebung und Mikrocomputertomographie durchzuführen. Gemäß dem Textprotokoll zeigte die CT-Aufnahme sieben Tage nach der Operation, wie hier dargestellt, ein signifikant höheres Volumen an Blutgefäßen mit kleinem und mittlerem Durchmesser, die den gesamten Transplantatbereich bei Mäusen versorgten, die Autotransplantate erhalten hatten, im Vergleich zu Mäusen mit Allografts, bei denen die Gefäße von außen einzudringen schienen. Zusätzlich zeigte die Fluoreszenzbildgebung eine signifikant höhere Durchblutung bei Tieren, die mit Autotransplantaten behandelt wurden.

Am Tag 14 erreicht der Gefäßbaum im Allograft die gesamte Nähe des Transplantats. Dennoch war das Gefäßvolumen im Vergleich zur Autograft-Gruppe signifikant niedriger. Dieser Unterschied zeigte sich am deutlichsten, wenn Gefäße mit Durchmessern von 0,08 bis 0,1 Millimeter verglichen wurden; wie hier 28 Tage nach der Operation zu sehen, kehrte das Gefäßvolumen sieben Tage nach der Operation auf den Ausgangswert zurück.

Die Autograft-Gruppe zeigte eine signifikant stärkere Knochenmineralisierung, wie durch Fluoreszenzbildgebung mit einem auf Hydroxylapatit gerichteten Probe sichtbar wurde. In dieser Gruppe bildete sich Knochengewebe im gesamten Bereich um das Transplantat herum, während es in der Allograft-Gruppe nur an den Defekträndern gebildet wurde, was sich 56 Tage nach der Operation als ringförmige Struktur zeigte. Das Knochenvolumen war signifikant höher und die Dicke des Transplantats signifikant größer bei Tieren, die Autografts erhielten, im Vergleich zu Allografts. Sobald die chirurgische Technik beherrscht ist, kann sie in etwa 25 Minuten durchgeführt werden. Im Anschluss an dieses Verfahren kann eine Fluoreszenzbildgebung unter Verwendung anderer Proben durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten, beispielsweise zur Aktivität von Osteoklasten und zur Beteiligung der Immunantwort.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Knochenregeneration in der zugrunde liegenden Angiogenese bildlich darstellt.