Name: Herstellung von Thermoresponsive nanostrukturierte Oberflächen für Tissue Engineering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung thermoresponsiver nanostrukturierter Oberflächen mittels Langmuir-Schaefer-Methode für Tissue Engineering. Diese Technik ermöglicht die kontrollierte Zelladhäsion und den Zell-Sheet-Transfer.

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Diese Studie wurde finanziell unterstützt durch das Projekt "Cell Sheet Tissue Engineering Center (CSTEC)" des Ministeriums für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (MEXT), Japan.

1. Synthese von Polystyrol- Block -Poly (N Isopropylacrylamid) durch die zwei-Stufen - Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer (RAFT) radikalische Polymerisation <ol><li> Auflösen Styrol (153,6 mmol), 4-cyano-4- (ethylsulfanylthiocarbonyl) sulfanylpentanoic Säure (ECT; 0,2 mmol) und 4,4&#39;-Azobis (4-cyanovaleriansäure) (ACVA; 0,04 mmol) in 40 ml 1, 4-Dioxan. Frieren Sie die Lösung in flüssigem Stickstoff unter Vakuum für 15-20 min, die reaktiven Spezies zu entfernen und allmählich auftauen bei RT. Stellen Sie sicher, dass die Lösung vollständig aufgetaut ist und wiederholen Sie diese Gefrier-Pump-Auftau-Entgasung Zyklus dreimal. </li><li> Erhalten, die Polystyrol (PSt) (Mw: 13.500) als Makro RAFT Mittel durch Polymerisation bei 70 ° C für 15 Stunden in einem Ölbad. </li><li> Precipitate PSt Makro RAFT Mittel mit 800 ml Ether und im Vakuum getrocknet. </li><li> Auflösen IPAAm Monomer (4,32 mmol), PSt Makro RAFT Mittel (0,022 mmol) und ACVA (0,004 mmol) in 4 ml 1,4-Dioxan. </li><li> Entfernender Sauerstoff in der Lösung durch die Gefrier-Pump-Auftau-Zyklen Entgasung wie in Schritt 1.1 erwähnt. </li><li> Durchführen einer Polymerisation bei 70 ° C für 15 Stunden in einem Ölbad nach dem Entgasen. Erhalten Sie synthetisierten St-IPAAm Molekül (Mw: 32,800) auf die gleiche Weise wie bei der PSt Makro RAFT Mittel. </li></ol> 2. Herstellung von Silanized Hydrophobe Modified Glassubstrate <ol><li> Waschglassubstrate (24 mm x 50 mm) mit einem Überschuß an Aceton und Ethanol und mit Ultraschall 5 min Oberflächenverunreinigungen zu entfernen. </li><li> Trocknen der Substrate in einem Ofen bei 65 ° C für 30 min. Dann Sauerstoffplasma verwenden (400 W, 3 min), um die Oberflächen der Substrate bei RT zu aktivieren. </li><li> Tauchen der Substrate in Toluol, das 1% Hexyltrimethoxysilan über Nacht bei RT, das Substrat zu silanisieren. </li><li> Waschen Sie die silanisierte Substrate in Toluol und tauchen für 30 min in Aceton nicht umgesetztes Mittel zu entfernen. </li><li> Anneal Substrate für 2 Stunden bei 110 ° C, um gründlich die s immobilisierenDein Gesicht. </li><li> Schneiden Sie die silanisierte Substrate durch ein Glasschneider bis 25 mm x 24 mm, die Zellkulturschalen (Schale Größe: φ35 mm) passen. </li></ol> 3. Herstellung von Langmuir-Filme und Film-Oberfläche übertragen <ol><li> Legen Sie das Langmuir-Film Instrument in einem Schrank die Ansammlung von Staub zu verhindern. </li><li> Waschen Sie die Langmuir-Trog (Größe: 580 mm x 145 mm) und Barrieren mit destilliertem Wasser und Ethanol zu entfernen Verunreinigungen. </li><li> Trocknen Sie die Wanne und Barrieren, die durch mit einem fusselfreien Tuch abwischen. Dann füllen die Wanne mit etwa 110 ml destilliertem Wasser, und stellen Sie die Hindernisse auf beiden Seiten der Mulde. Man beachte, dass destilliertes Wasser sollte ohne Verschütten in den folgenden Schritten von 3,5 bis 3,13 zugegeben werden. </li><li> Erhitzen Sie eine Platin Wilhelmy-Platte (Umfang: 39,24 mm) zur Überwachung der Oberflächenspannung mit einem Gasbrenner, bis die Platte rot wird und dann mit destilliertem Wasser waschen Verunreinigungen zu entfernen. Hängen Sie die Wilhelmy-Platte auf einem Draht befestigtdie Oberflächendruck-Messinstrument. </li><li> Null, um die Oberflächendruck-Messgerät nach dem Protokoll des Herstellers. Komprimieren der Luft-Wasser - Grenzfläche auf dem Trog durch die Barrieren an den beiden Seiten der Rinne , bis die Schnittstelle ohne Tropfen Polymer etwa 50 cm 2 erreicht. </li><li> Aspirat kleine Verunreinigungen, bis der Oberflächendruck ist nahezu 0 mN / m. </li><li> Positionieren Sie die Hindernisse auf beiden Seiten, und destilliertes Wasser für die Abnahme von destilliertem Wasser aus Schritt 3.6 zu kompensieren. </li><li> Man löst 5 mg des synthetisierten St-IPAAm Molekül in 5 ml einer Entwicklungslösung aus Chloroform. Hinweis: Dichlormethan oder Toluol, können auch als Lösungsmittel verwendet werden. </li><li> fallen sanft 27 &amp; mgr; l von St-IPAAm in Chloroform auf den Trog gelöst, um eine Mikrospritze oder Mikropipette. </li><li> Nach einer Wartezeit für 5 Minuten eine vollständige Verdampfung von Chloroform zu ermöglichen, beide Barrieren bewegen horizontal, um die St-IPAAm Moleku zu komprimierenle an der Grenzfläche. Aufrechterhaltung Komprimierungsrate der Barrieren bei 0,5 mm / sec , bis der Zielfläche von 50 cm 2 erreicht ist. Hinweis: Eine schnelle Kompressionsrate Defekte in der Langmuir-Film verursacht. </li><li> Messen der Oberflächendruck (π) -A m Isothermen mit dem Platin Wilhelmy - Platte an der Oberfläche Druck-Messinstrument während der Kompression nach dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Nachdem das Zielgebiet Größe erreichen, halten die Oberfläche für 5 min die St-IPAAm Moleküle zu ermöglichen, sich zu entspannen; die Moleküle Gleichgewicht nicht unmittelbar nach der Kompression erreichen. </li><li> Übertragen Sie die Langmuir-Film auf eine hydrophob modifizierte Glassubstrat mit einer Transfervorrichtung für 5 Minuten unter Verwendung zu robust den Film adsorbieren. Befestigen Sie das hydrophobe Glassubstrat parallel auf dem Gerät. Schließen Sie das Gerät an eine Ausrichtungsstufe und senkrecht bewegen. </li><li> Heben Sie das Substrat horizontal mit der Transfervorrichtung und trocken für 1 Tag in einem desiccator. </li></ol> 4. Kultivierung von Zellen und Optimierung von Zelladhäsion und Detachment auf dem Langmuir Film übertragen Oberflächen <ol><li> Zur Herstellung von Zellsuspensionen, die Kultur bovine Arteria carotis Endothelzellen (BAECs) zu einem Drittel Konfluenz bei 37 ° C in 5% CO 2 und 95% Luft auf Gewebekultur - Polystyrol (TCPS) mit Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) , das 10% fötales Rinderserum (FBS) und 100 U / ml Penicillin. </li><li> Nach Erreichen der Konfluenz, behandeln BAECs mit 3 ml 0,25% Trypsin-EDTA 3 min bei 37 ° C in 5% CO 2 und 95% Luft. </li><li> Deaktivieren des Trypsin-EDTA durch Zugabe von 10 ml DMEM-10% FBS enthält, und sammeln zu einer 50 ml konischen Röhrchen die Zellsuspension. </li><li> Zentrifuge bei 120 xg für 5 min, und den Überstand aspirieren. Re-suspend die Zellen mit 10 ml DMEM. </li><li> Legen Sie die St-IPAAm Oberflächen unter UV-Licht auf eine saubere Bank für 5 min zu sterilisieren. </li><li> Samen des wiedergewonnenen cells auf der St-IPAAm Flächen in einer Konzentration von 1,0 x 10 4 Zellen / cm 2 durch eine Einweg - Hämozytometer gezählt und die Zellen auf den Oberflächen mit einem Mikroskop mit einem Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO 2 und 95% ausgestattet beobachten Luft. Hinweis: Sterilisieren Sie die St-IPAAm Oberflächen durch UV-Licht auf eine saubere Bank ausgestattet. </li><li> Nehmen Sie Zeitrafferbilder von adhärenten BAECs für etwa 24,5 Stunden bei 37 ° C mit einem Phasenkontrast-Mikroskop mit 10-facher Vergrößerung. Nach BAEC- Haftung, Rekord Ablösung der BAECs von der St-IPAAm Oberfläche bei 20 ° C für etwa 3,5 Stunden. </li></ol> 5. Zellrasen Herstellung auf den Langmuir Film-Oberflächen übertragen <ol><li> Kultur BAECs in der gleichen Weise verwendet, in Abschnitt 4 beschrieben. </li><li> Seed insgesamt 1,0 x 10 5 Zellen / cm 2 auf St-IPAAm Oberflächen und Inkubation für 3 Tage bei 37 ° C in 5% CO 2. Confluent BAECs spontan bei 20 ° C abgelöst.</li>
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Alle Autorinnen und Autoren haben zu gleichen Teilen an der Erstellung des Manuskripts mitgewirkt und die endgültige Fassung freigegeben. Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Eine temperaturempfindliche Oberfläche wurde durch das Langmuir-Schäfer-Methode hergestellt, und die Oberflächeneigenschaften für die Zelladhäsion / Ablösung und Zellrasen Rückgewinnung optimiert. Wenn für die Herstellung von Oberflächen unter Verwendung dieses Verfahrens sind mehrere Schritte kritisch. Die molekulare Zusammensetzung der St-IPAAm Moleküle hat eine große Wirkung auf die Oberflächenstruktur und die Stabilität der Oberfläche und durch die Erweiterung, auf die Zelladhäsion und Ablösung. Insbesondere sollten...

Nanostrukturierte Oberflächen haben in jüngster Zeit erhebliche Aufmerksamkeit aufgrund ihrer verschiedenen Anwendungsmöglichkeiten, einschließlich Strukturierung, Zellkultur, Reinigung und Oberflächenumschaltung. Zum Beispiel superhydrophoben Oberflächen , die durch die Nanostruktur des Lotusblattes inspiriert und andere ansprechende Oberflächen sind in der Lage 1-4 auf äußere Reize reagieren. Die Langmuir-Film ist eine der am häufigsten untersuchten Polymerbeschichtungen. Ein Langmuir - Film wird durch Eintropfen amphiphilen Molekülen auf einem Luft-Wasser - Grenzfläche 5-8 gebildet. Der Film kann dann durch physikalische oder chemische Adsorption und die molekulare Konformation auf einer festen Oberfläche auf einer festen Oberfläche übertragen werden kann unter Verwendung von vertikalen und horizontalen Übertragungsmethoden 9-12 gesteuert werden. Die Dichte des Langmuir-Film kann präzise durch Komprimieren der Luft-Wasser-Grenzfläche zu regeln. In jüngster Zeit hat dieses Verfahren auch zur Herstellung von nanoskaligen sea-island Structur bewährtes durch amphiphile Blockcopolymere verwendet. Die Nanostrukturen angenommen eines Kerns aus hydrophoben Segmenten bestehen und eine Schale aus hydrophilen Segmente 13-17. Darüber hinaus wird die Anzahl von Nanostrukturen auf einer Oberfläche durch Steuern der Fläche pro Molekül (A m) des Blockcopolymers an der Grenzfläche geregelt. Wir haben auf einem ursprünglichen, einzigartigen, gerüstfreie Gewebe-Engineering-Ansatz, Zellrasen Technik fokussiert, eine temperaturempfindliche Kulturoberfläche verwenden. Die entwickelte Technologie wurde für verschiedene Organe 18 auf regenerative Therapien angewandt. Eine temperaturempfindliche Kulturoberfläche wurde durch Pfropfen von Poly (N Isopropylacrylamid) (PIPAAm), eine temperaturempfindliche Molekül, auf eine Oberfläche 19-27 hergestellt. PIPAAm und seine Copolymere weisen eine untere kritische Lösungstemperatur (LCST) in wässrigem Medium bei Temperaturen nahe 32 ° C. Die Kulturfläche zeigte auch eine temperaturempfindliche Alterna<html> auf zwischen Hydrophobie und Hydrophilie. Bei 37 ° C, die PIPAAm gepfropfte Oberfläche wurde hydrophob, und die Zellen leicht angebracht und proliferierten auf der Oberfläche als auch auf konventionelle Gewebskultur-Polystyrol. Wenn die Temperatur auf 20 ° C gesenkt wurde, wurde die Oberfläche hydrophil, und die Zellen von der Oberfläche spontan löst. Daher kultiviert konfluenten Zellen auf der Oberfläche konnte durch Änderung der Temperatur als intaktes Blatt geerntet werden. Diese Zell - Adhäsion und Ablösung Eigenschaften wurden auch von einer Oberfläche hergestellt durch Langmuir Filmbeschichtung für Labordemonstration 26 angezeigt, 27. Ein Langmuir - Film von Blockcopolymeren , bestehend aus Polystyrol (P (St)) und PIPAAm (St-IPAAm) wurde hergestellt. Die Langmuir - Film mit einem spezifischen A m könnte horizontal zu einer hydrophob modifizierten Glassubstrat übertragen werden. Zusätzlich Zelladhäsion auf und Ablösung von der vorbereiteten Oberfläche in Reaktion auf Temperatur wurden bewertet. _content &quot;&gt; Hier beschreiben wir Protokolle für die Herstellung eines Films aus thermo-responsive amphiphile Blockcopolymere auf einem Glassubstrat besteht Langmuir nanostrukturiert. Unser Verfahren in verschiedenen Bereichen der Oberflächenwissenschaft eine effektive Herstellungstechnik für organische Nanofilme bereitstellen kann und erleichtern eine wirksame Kontrolle der Zelladhäsion auf und spontane Ablösung von einer Oberfläche.

<table><tbody><tr><td>N-isopropylacrylamid</td><td>Kohjin</td><td></td><td>Keine Katalognummer</td></tr><tr><td>Azobis(4-cyanovaleriansäure)</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>016-19332</td><td></td></tr><tr><td>Styrol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4972</td><td></td></tr><tr><td>1,3,5-Trioxan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T81108</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Dioxan</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>045-24491</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Nakarai</td><td>11482-15</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>GIBCO BRL</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin</td><td>GIBCO BRL</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td></td><td>Sigma T4174</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Japan Bioserum</td><td>JBS-11501</td><td></td></tr><tr><td>BAECs</td><td>Health Science Research Resources Bank</td><td>JCRB0099</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>Matsunami Glass Industry</td><td>C024501</td><td></td></tr><tr><td>AFM NanoScope V</td><td>Veeco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1H NMR INOVA 400</td><td>Varian, Palo Alto</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATR/FT-IR NICOLET 6700</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GPC HLC-8320GPC</td><td>Tosoh</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TSKgel Super AW2500, AW3000, AW4000</td><td>Tosoh</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Langmuir-Blodgett Ablagerungsmulden&nbsp;</td><td>KSV Instruments</td><td>KN 2002</td><td>KSV NIWA Midium durch</td></tr><tr><td>Nikon ECLIPSE TE2000-U</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

herstellung von thermoresponsive nanostrukturierte oberflächen für tissue engineering

Preparation of Thermoresponsive Nanostructured Surfaces for Tissue Engineering

Thermoresponsives Poly(N-isopropylacrylamid) (PIPAAm)-immobilisierte Oberflächen zur Kontrolle der Zelladhäsion und -ablösung wurden mit der Langmuir-Schaefer-Methode hergestellt. Amphiphile Blockcopolymere, bestehend aus Polystyrol und PIPAAm (St-IPAAms), wurden durch reversible Additions-Fragmentationskettentransfer-Radikalpolymerisation (RAFT) synthetisiert. Eine Chloroformlösung von St-IPAAm-Molekülen wurde vorsichtig in eine Langmuir-Trog-Vorrichtung fallen gelassen, und beide Barrieren der Vorrichtung wurden horizontal bewegt, um den Film zu komprimieren und seine Dichte zu regulieren. Anschließend wurde die St-IPAAm Langmuir-Folie mit einer oberflächenfixierten Vorrichtung horizontal auf ein hydrophobisch modifiziertes Glassubstrat übertragen. Rasterkraftmikroskopische Aufnahmen zeigten deutlich nanoskalige Meeresinselstrukturen auf der Oberfläche. Die Stärke, Geschwindigkeit und Qualität der Zelladhäsion und -ablösung auf der präparierten Oberfläche wurden durch Temperaturänderungen über den unteren kritischen Lösungstemperaturbereich von PIPAAm-Molekülen moduliert. Darüber hinaus gelang es, eine zweidimensionale Zellstruktur (Zellblatt) auf den optimierten Oberflächen wiederherzustellen. Diese einzigartigen PIPAAm-Oberflächen können nützlich sein, um die Stärke der Zelladhäsion und -ablösung zu kontrollieren.

Blockcopolymere , bestehend aus Polystyrol und Poly (N Isopropylacrylamid) (St-IPAAms) mit spezifischen Molekulargewichten wurden durch RAFT Radikalpolymerisation synthetisiert. ECT wurde als Kettenübertragungsmittel hergestellt , wie es in Moad et al. 28. Zwei St-IPAAm Molekülen verschiedener PIPAAm Kettenlängen synthetisiert wurden, und die erhaltenen Blockpolymere wurden durch 1 H - kernmagnetische Resonanz (NMR) und Gelpermeationschromatographi...

Nanoskalige Meeresinseloberflächen, die aus thermoresponsiven Blockcopolymeren bestehen, wurden mit der Langmuir-Schaefer-Methode hergestellt, um die spontane Zelladhäsion und -ablösung zu kontrollieren. Sowohl die Präparation der Oberfläche als auch die Adhäsion und Ablösung von Zellen auf der Oberfläche wurden visualisiert.

Herstellung von Thermoresponsive nanostrukturierte Oberflächen für Tissue Engineering

Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the ...

Das übergeordnete Ziel dieser Langmuir-Schaefer-Methode mit Blockcopolymeren besteht darin, Zellschichten unter verschiedenen Bedingungen auf temperatursensitiven Oberflächen herzustellen, indem die Stärke der Zelladhäsion und -anheftung gesteuert wird. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Biomaterialien zu beantworten, beispielsweise hinsichtlich biokompatibler Materialien, Zellkulturoberflächen und Bioabtrennung. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Wechselwirkung zwischen der temperatursensitiven Oberfläche und den Zellen kontrolliert werden kann und die Modifikationsbedingungen zur Gewinnung von Zellschichten optimiert werden können.Obwohl diese Methode Einblicke in die Wechselwirkung zwischen Zelle und Oberfläche ermöglichen kann, ist sie auch auf andere Systeme wie die Bioabtrennung und Biofilme anwendbar. Lösen Sie zunächst Styrol, ECT und ACVA in 40 Milliliter 1,4-Dioxan. Frosten Sie die Lösung unter Vakuum 15 bis 20 Minuten lang in flüssigem Stickstoff ein, um die reaktiven Spezies zu entfernen.Nachdem die Lösung langsam bei Raumtemperatur aufgetaut wurde, diesen Gefrier-, Pump-, Auftau-, Entgasungszyklus dreimal wiederholen. Das Polystyrol als makroskopisches RAFT-Agens durch Polymerisation bei 70 Grad Celsius für 15 Stunden in einem Ölbad gewinnen. Das makroskopische RAFT-Polystyrol mit 800 Millilitern Ether ausfällen und im Vakuum trocknen.Lösen Sie als Nächstes das IPAAm-Monomer, das Polystyrol-Makro-RAFT-Agens und ACVA in vier Millilitern 1,4-Dioxan auf. Entfernen Sie den Sauerstoff in der Lösung durch Gefriertrocknung, Pumpen und Auftauen zur Entgasung, wie zuvor beschrieben. Führen Sie eine Polymerisation bei 70 Grad Celsius für 15 Stunden in einem Ölbad nach der Entgasung durch.Erhalten Sie schließlich das synthetisierte St-IPAAm-Molekül auf die gleiche Weise wie das Polystyrol-Makro-RAFT-Agens. Waschen Sie die Glassubstrate mit überschüssigem Aceton und Ethanol und behandeln Sie sie fünf Minuten lang im Ultraschallbad, um Oberflächenverunreinigungen zu entfernen. Trocknen Sie die Substrate im Ofen bei 65 Grad Celsius für 30 Minuten.Verwenden Sie anschließend Sauerstoffplasma, um die Oberflächen der Substrate bei Raumtemperatur zu aktivieren. Tauchen Sie die Substrate über Nacht bei Raumtemperatur in Toluol, das 1 % Hexatrimethoxysilan enthält, ein, um die Substrate zu silylisieren. Waschen Sie die silylisierten Substrate danach in Toluol und tauchen Sie sie 30 Minuten lang in Aceton ein, um unumgesetzte Reagenzien zu entfernen.Die Substrate zwei Stunden bei 110 Grad Celsius anlassen, um die Oberfläche vollständig zu immobilisieren. Schneiden Sie die silanisierten Substrate abschließend mit einem Glasschneider auf eine Größe von 25 Millimetern mal 24 Millimetern zu, um sie an die Zellkulturschalen anzupassen. Stellen Sie das Langmuir-Film-Gerät in einen Schrank, um die Ansammlung von Staub zu verhindern.Spülen Sie die Langmuir-Trogbarrieren mit destilliertem Wasser und Ethanol, um Verunreinigungen zu entfernen. Trocknen Sie den Trog und die Barrieren durch Abwischen mit einem fusselfreien Tuch. Füllen Sie anschließend den Trog mit etwa 110 Milliliter destilliertem Wasser und platzieren Sie die Barrieren auf beiden Seiten des Trogs.Erhitzen Sie anschließend eine Platinscheibe nach Wilhelmy zur Überwachung der Oberflächenspannung mit einem Gasbrenner, bis die Platte rotglühend ist. Reinigen Sie die Platte dann mit destilliertem Wasser, um Verunreinigungen zu entfernen. Hängen Sie die Wilhelmy-Platte an einem Draht auf, der mit dem Gerät zur Messung des Oberflächendrucks verbunden ist.Nullen Sie das Messgerät für die Oberflächenspannung gemäß der Herstelleranleitung. Komprimieren Sie die Luft-Wasser-Grenzfläche in der Wanne mithilfe der Barrieren auf beiden Seiten der Wanne, bis die Grenzfläche etwa 50 Quadratzentimeter erreicht, ohne dass Polymertröpfchen vorhanden sind. Aspirieren Sie alle kleinen Verunreinigungen, bis die Oberflächenspannung nahezu null Millinewton pro Meter beträgt.Stellen Sie die Barrieren auf beiden Seiten neu positioniert ein und fügen Sie destilliertes Wasser hinzu, um den Verlust an destilliertem Wasser auszugleichen. Lösen Sie anschließend fünf Milligramm des synthetisierten St-IPAAm-Moleküls in fünf Millilitern einer Entwicklungslösung aus Chloroform. Geben Sie dann vorsichtig 27 Mikroliter der in Chloroform gelösten St-IPAAm-Lösung mit einer Mikrospritze oder Mikropipette in die Wanne.Nach einer Wartezeit von fünf Minuten, um die vollständige Verdampfung von Chloroform zu ermöglichen, bewegen Sie beide Barrieren horizontal, um das St-IPAAm-Molekül an der Oberfläche zu komprimieren. Halten Sie die Kompressionsgeschwindigkeit der Barrieren bei 0,5 Millimetern pro Sekunde aufrecht, bis die Zielfläche von 50 Quadratzentimetern erreicht ist. Messen Sie die Oberflächendruck-Pi-A-Isothermen mit der an das Oberflächendruck-Messgerät angebrachten platinbeschichteten Wilhelmy-Platte während der Kompression gemäß der Herstelleranleitung.Nach Erreichen der Zielflächengröße die Oberfläche fünf Minuten lang beibehalten, damit sich die St-IPAAm-Moleküle entspannen können. Die Moleküle erreichen nach der Kompression nicht sofort das Gleichgewicht. Anschließend den Langmuir-Film mithilfe einer Transfervorrichtung fünf Minuten lang auf ein hydrophob modifiziertes Glas-Substrat übertragen, um den Film stabil zu adsorbieren.Befestigen Sie das hydrophobe Glas-Substrat parallel am Gerät. Schließen Sie das Gerät an eine Justierstufe an und bewegen Sie es senkrecht. Heben Sie das Substrat horizontal mit der Transfervorrichtung an und trocknen Sie es einen Tag lang in einem Trockenexsikkator.Zur Herstellung von Zellsuspensionen kultivieren Sie bovine Endothelzellen der Carotisarterie oder BAECs bis zu einer Konfluenz von 1/3 bei 37 Grad Celsius in 5 % CO2 und 95 % Luft auf Polystyrol für Zellkultur mit DMEM, das FBS und Penicillin enthält. Nach Erreichen der Konfluenz behandeln Sie die BAECs drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius in 5 % CO2 und 95 % Luft mit drei Millilitern 0,25 %iger Trypsin-EDTA-Lösung. Inaktivieren Sie das Trypsin-EDTA durch Zugabe von 10 Millilitern DMEM, das 10 % FBS enthält.Und sammeln Sie die Zellsuspension in einem kegelförmigen 50-Milliliter-Röhrchen. Nach einer Zentrifugation bei 120 × g für fünf Minuten wird der Überstand abgesaugt und die Zellen in 10 Milliliter DMEM resuspendiert. Die gewonnenen Zellen werden auf den St-IPAAm-Oberflächen mit einer Dichte von 10.000 Zellen pro Quadratzentimeter ausgesät, gezählt mithilfe eines Einweg-Blutzählkammers.Beobachten Sie die Zellen auf den Oberflächen unter einem Mikroskop, das mit einem Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % CO2 und 95 % Luft ausgestattet ist. Anschließend sterilisieren Sie die St-IPAAm-Oberflächen mittels UV-Licht, das in einer sterilen Arbeitsbank integriert ist. Zeichnen Sie Zeitrafferaufnahmen der anhaftenden BAECs für etwa 24,5 Stunden bei 37 Grad Celsius mit einem Phasenkontrastmikroskop mit 10facher Vergrößerung auf.Nach der BAEC-Adhäsion die Ablösung der BAECs von der St-IPAAm-Oberfläche bei 20 Grad Celsius über einen Zeitraum von etwa 3,5 Stunden aufzeichnen. Nach der Optimierung von Zelladhäsion und -ablösung auf der übertragenen Langmuir-Schicht die Zellschichten herstellen, indem BAECs zunächst wie zuvor kultiviert werden. Pro Quadratzentimeter 100.000 Zellen auf St-IPAAm-Oberflächen ansäen.Und inkubieren Sie drei Tage bei 37 Grad Celsius in 5 % CO2. Konfluente BAECs lösten sich spontan bei 20 Grad Celsius ab. Die Herstellung einer temperaturreagiblen übertragenen Langmuir-Schichtoberfläche wird hier gezeigt.Die synthetisierte St-IPAAm-Chloroformlösung wurde vorsichtig auf eine Luft-Wasser-Grenzfläche gegeben. Zwei Barrieren wurden verwendet, um die St-IPAAm-Moleküle an der Grenzfläche zu komprimieren, bis eine Zielfläche von 50 Quadratzentimetern erreicht war. Der Oberflächendruck wurde während der Kompression gemessen, um eventuelle Defekte im Langmuir-Film zu erkennen.Nach der Komprimierung wurde ein hydrophob modifiziertes Deckglas-Substrat mithilfe eines Justierstages horizontal auf die Grenzfläche platziert. Das Substrat wurde horizontal angehoben und einen Tag lang getrocknet. Nach diesem Schritt waren die St-IPAAm-Oberflächen zur Verwendung in Zellkulturversuchen bereit.Hier werden repräsentative Ergebnisse von topografischen Bildern der St-IPAAm-Oberflächen mittels Rasterkraftmikroskopie gezeigt. Auf beiden St-IPAAm-Oberflächen wurden Nanostrukturen beobachtet. Größe und Form der Nanostrukturen hingen stark von AM sowie von der Zusammensetzung des St-IPAAm ab.Hier ist ein makroskopisches Bild einer gewonnenen Zellschicht auf einer Langmuir-Film-übertragenen Oberfläche mit St-IPAAm 480 und einer AM von 40 Quadratnanometern pro Molekül dargestellt. Die Zellen erreichten nach drei Tagen Konfluenz in Kultur auf Oberflächen mit St-IPAAm 170 und St-IPAAm 480 bei 37 Grad Celsius. Und die Zellschicht wurde rasch nach Absenkung der Temperatur von 37 auf 20 Grad Celsius gewonnen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Herstellung und die Gestaltung der molekularen Zusammensetzung eines Polymers durchführt, einen Langmuir-Film herstellt und überträgt, die Zelladhäsion und -ablösung steuert und eine Zellschicht zurückgewinnt. Durch ihre Entwicklung ebnet diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Biomaterialien und des Gewebeengineerings den Weg, um Wechselwirkungen zwischen Zellen und Oberflächen sowie Zellkultivierungsstrategien für den Einsatz in der regenerativen Medizin zu erforschen. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis in die Therapie der Zelltransplantation hinein, da sie das Potenzial besitzt, Zellschichten verschiedener Zelltypen herzustellen, die von Patienten stammen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

In diesem Protokoll demonstrieren wir die Herstellung von biomimetischen Herzzellkultursubstraten, die aus zwei unterschiedlichen Polymermaterialien mittels Kapillarkraftlithographie hergestellt werden.  Die beschriebenen Methoden bieten eine skalierbare, kostengünstige Technik, um die Struktur und Funktion von makroskopischem Herzgewebe für in vitro und in vivo Anwendungen zu entwickeln.

Kapillar-Force-Lithographie für Herz-Tissue Engineering

Um hochorganisierte Strukturen aus komplexem Gewebe zu erzeugen, muss man mehrere Materialien und Zelltypen zu einem integrierten Komposit zusammenfügen.  Dieses kombinatorische Design umfasst organspezifische geschichtete Zellblätter mit zwei unterschiedlichen biologisch abgeleiteten Materialien, die eine starke fibröse Matrixbasis enthalten, und Endothelzellen zur Verbesserung der Bildung neuer Gefäße.

Tissue Engineering: Aufbau eines Multizelluläre 3D Gerüst für die Lieferung von Layered Zellschichten

Eine Methode, um komplexe Nanofasern und Nanostrukturen aus einzelnen oder mehreren extrazellulären Matrixproteinen zu erhalten, wird beschrieben. Diese Methode verwendet Protein-Oberflächen-Wechselwirkungen zu frei stehenden Materialien auf Proteinbasis mit abstimmbaren Zusammensetzung und Architektur für den Einsatz in einer Vielzahl von Gewebe-und Biotechnologie-Anwendungen zu erstellen.

ECM-Protein-Nanofasern und Nanostrukturen Engineered Mit Oberflächen initiierte Versammlung

Wir berichten über ein Verfahren zur Herstellung von Mikrotaschen in elektro Membranen, bei denen auf das Zellverhalten zu untersuchen. Insbesondere beschreiben wir eine Kombination von Mikrostereo und Elektro zur Herstellung von PLGA (Poly (lactid-co-glycolid)) Hornhaut Biomaterial Geräten mit Mikromerkmalen ausgestattet.

Kombination von Mikrostereolithographie und Elektrospinnen auf Membranen Ausgestattet mit Nischen für die Hornhautregeneration Produzieren

Zellkultursubstrate, funktionalisiert mit mikroskaligen Mustern biologischer Liganden, haben einen immensen Nutzen im Bereich des Tissue Engineering. Hier demonstrieren wir die vielseitige und automatisierte Herstellung von Gewebekultursubstraten mit mehreren, mikrostrukturierten Poly(ethylenglykol)-Bürsten und präsentieren orthogonale Chemien, die eine räumlich präzise und ortsspezifische Immobilisierung von biologischen Liganden ermöglichen.

Herstellung von komplexen Kultursubstrate verwenden Robotic Mikrokontaktdrucken (R-mCP) und Sequential Nucleophile Substitution

Injizierbare tissue engineering Gerüst aus Poly (N-isopropylacrylamid) -Pfropf-Chondroitinsulfat Mikroteilchen (PNIPAAm-g-CS) -haltigen Alginat besteht, wurde hergestellt. Die Haftfestigkeit, Quelleigenschaften und Biokompatibilität in vitro sind in dieser Studie untersucht. Die Charakterisierungstechniken hier entwickelt, können auf andere thermogelierende Systeme anwendbar sein.

Synthese von thermogelierenden Poly (N-isopropylacrylamid) -Pfropf-Chondroitinsulfat Composites mit Alginate Mikroteilchen für Tissue Engineering

Protokolle werden für die Herstellung von abbaubaren Thermoresponsive Hydrogele basierend auf Hydrazone Vernetzung von Polymeren Oligomere auf der Schüttgut-Skala, Microscale, und nanoskaligen, letztere für die Zubereitung von Gel-Nanopartikeln und Nanofasern beschrieben.

Herstellung von abbaubaren Thermoresponsive Hydrogele auf mehreren Längenskalen über reaktive Extrusion, Mikrofluidik, Selbstmontage und Elektrospinnen

Dieses Protokoll beschreibt eine Bioprinting-Methodik, die ein automatisiertes robotergestütztes Abscheidesystem verwendet, das geätzte topographische Leitfäden mit der präzisen Abscheidung einer Zelle mit Hydrogel-Biotinte verbindet. Die gedruckten Zellen werden direkt auf die geätzten Merkmale aufgebracht und sind in der Lage, diese zu erfassen und sich daran zu orientieren.

Automatische Robotic Dosiertechnik für Oberflächen Ausrichtungs- und Bioprinting von Zellen

Eine Methode, um Dendrimer-basierte ungleiche Nanopatterns zu erhalten, die die nanoskaligen Kontrolle über lokale Arginin Glycin Asparagin (RGD) Oberfläche Säuredichte ermöglichen ist beschrieben und für das Studium der Zelldifferenzierung Adhäsion und Chondrogenic angewendet.

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Dargestellt ist eine einfache Methode, Nano-Micro Multiskalen Strukturen, für funktionale Oberflächen durch Aggregation Nanofasern hergestellt unter Verwendung eines anodischen Aluminiumoxid-Filters zu fabrizieren.

Multiskalen Strukturen aggregiert nach aufgedruckten Nanofasern für funktionale Oberflächen

Ziel dieses Protokolls ist es, die Montage einer biomimetischen Nanomatrix (NM) mit Janus-Basis-Nanoröhren (JBNTs) und Fibronectin (FN) zu zeigen. Bei der Kokultur mit humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSCs) weisen die NMs eine ausgezeichnete Bioaktivität bei der Förderung der hMSCs Adhäsion auf.

Herstellung einer biomimetischen Nano-Matrix mit Janus Base Nanotubes und Fibronectin zur Stammzellhaftung

Erfahren Sie die Herstellung thermoresponsiver nanostrukturierter Oberflächen mittels Langmuir-Schaefer-Methode für Tissue Engineering. Diese Technik ermöglicht die kontrollierte Zelladhäsion und den Zell-Sheet-Transfer.

Herstellung von Thermoresponsive nanostrukturierte Oberflächen für Tissue Engineering

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