Herstellung von Thermoresponsive nanostrukturierte Oberflächen für Tissue Engineering

Das übergeordnete Ziel dieser Langmuir-Schaefer-Methode mit Blockcopolymeren besteht darin, Zellschichten unter verschiedenen Bedingungen auf temperatursensitiven Oberflächen herzustellen, indem die Stärke der Zelladhäsion und -anheftung gesteuert wird. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Biomaterialien zu beantworten, beispielsweise hinsichtlich biokompatibler Materialien, Zellkulturoberflächen und Bioabtrennung. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass die Wechselwirkung zwischen der temperatursensitiven Oberfläche und den Zellen kontrolliert werden kann und die Modifikationsbedingungen zur Gewinnung von Zellschichten optimiert werden können.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Wechselwirkung zwischen Zelle und Oberfläche ermöglichen kann, ist sie auch auf andere Systeme wie die Bioabtrennung und Biofilme anwendbar. Lösen Sie zunächst Styrol, ECT und ACVA in 40 Milliliter 1,4-Dioxan. Frosten Sie die Lösung unter Vakuum 15 bis 20 Minuten lang in flüssigem Stickstoff ein, um die reaktiven Spezies zu entfernen.

Nachdem die Lösung langsam bei Raumtemperatur aufgetaut wurde, diesen Gefrier-, Pump-, Auftau-, Entgasungszyklus dreimal wiederholen. Das Polystyrol als makroskopisches RAFT-Agens durch Polymerisation bei 70 Grad Celsius für 15 Stunden in einem Ölbad gewinnen. Das makroskopische RAFT-Polystyrol mit 800 Millilitern Ether ausfällen und im Vakuum trocknen.

Lösen Sie als Nächstes das IPAAm-Monomer, das Polystyrol-Makro-RAFT-Agens und ACVA in vier Millilitern 1,4-Dioxan auf. Entfernen Sie den Sauerstoff in der Lösung durch Gefriertrocknung, Pumpen und Auftauen zur Entgasung, wie zuvor beschrieben. Führen Sie eine Polymerisation bei 70 Grad Celsius für 15 Stunden in einem Ölbad nach der Entgasung durch.

Erhalten Sie schließlich das synthetisierte St-IPAAm-Molekül auf die gleiche Weise wie das Polystyrol-Makro-RAFT-Agens. Waschen Sie die Glassubstrate mit überschüssigem Aceton und Ethanol und behandeln Sie sie fünf Minuten lang im Ultraschallbad, um Oberflächenverunreinigungen zu entfernen. Trocknen Sie die Substrate im Ofen bei 65 Grad Celsius für 30 Minuten.

Verwenden Sie anschließend Sauerstoffplasma, um die Oberflächen der Substrate bei Raumtemperatur zu aktivieren. Tauchen Sie die Substrate über Nacht bei Raumtemperatur in Toluol, das 1 % Hexatrimethoxysilan enthält, ein, um die Substrate zu silylisieren. Waschen Sie die silylisierten Substrate danach in Toluol und tauchen Sie sie 30 Minuten lang in Aceton ein, um unumgesetzte Reagenzien zu entfernen.

Die Substrate zwei Stunden bei 110 Grad Celsius anlassen, um die Oberfläche vollständig zu immobilisieren. Schneiden Sie die silanisierten Substrate abschließend mit einem Glasschneider auf eine Größe von 25 Millimetern mal 24 Millimetern zu, um sie an die Zellkulturschalen anzupassen. Stellen Sie das Langmuir-Film-Gerät in einen Schrank, um die Ansammlung von Staub zu verhindern.

Spülen Sie die Langmuir-Trogbarrieren mit destilliertem Wasser und Ethanol, um Verunreinigungen zu entfernen. Trocknen Sie den Trog und die Barrieren durch Abwischen mit einem fusselfreien Tuch. Füllen Sie anschließend den Trog mit etwa 110 Milliliter destilliertem Wasser und platzieren Sie die Barrieren auf beiden Seiten des Trogs.

Erhitzen Sie anschließend eine Platinscheibe nach Wilhelmy zur Überwachung der Oberflächenspannung mit einem Gasbrenner, bis die Platte rotglühend ist. Reinigen Sie die Platte dann mit destilliertem Wasser, um Verunreinigungen zu entfernen. Hängen Sie die Wilhelmy-Platte an einem Draht auf, der mit dem Gerät zur Messung des Oberflächendrucks verbunden ist.

Nullen Sie das Messgerät für die Oberflächenspannung gemäß der Herstelleranleitung. Komprimieren Sie die Luft-Wasser-Grenzfläche in der Wanne mithilfe der Barrieren auf beiden Seiten der Wanne, bis die Grenzfläche etwa 50 Quadratzentimeter erreicht, ohne dass Polymertröpfchen vorhanden sind. Aspirieren Sie alle kleinen Verunreinigungen, bis die Oberflächenspannung nahezu null Millinewton pro Meter beträgt.

Stellen Sie die Barrieren auf beiden Seiten neu positioniert ein und fügen Sie destilliertes Wasser hinzu, um den Verlust an destilliertem Wasser auszugleichen. Lösen Sie anschließend fünf Milligramm des synthetisierten St-IPAAm-Moleküls in fünf Millilitern einer Entwicklungslösung aus Chloroform. Geben Sie dann vorsichtig 27 Mikroliter der in Chloroform gelösten St-IPAAm-Lösung mit einer Mikrospritze oder Mikropipette in die Wanne.

Nach einer Wartezeit von fünf Minuten, um die vollständige Verdampfung von Chloroform zu ermöglichen, bewegen Sie beide Barrieren horizontal, um das St-IPAAm-Molekül an der Oberfläche zu komprimieren. Halten Sie die Kompressionsgeschwindigkeit der Barrieren bei 0,5 Millimetern pro Sekunde aufrecht, bis die Zielfläche von 50 Quadratzentimetern erreicht ist. Messen Sie die Oberflächendruck-Pi-A-Isothermen mit der an das Oberflächendruck-Messgerät angebrachten platinbeschichteten Wilhelmy-Platte während der Kompression gemäß der Herstelleranleitung.

Nach Erreichen der Zielflächengröße die Oberfläche fünf Minuten lang beibehalten, damit sich die St-IPAAm-Moleküle entspannen können. Die Moleküle erreichen nach der Kompression nicht sofort das Gleichgewicht. Anschließend den Langmuir-Film mithilfe einer Transfervorrichtung fünf Minuten lang auf ein hydrophob modifiziertes Glas-Substrat übertragen, um den Film stabil zu adsorbieren.

Befestigen Sie das hydrophobe Glas-Substrat parallel am Gerät. Schließen Sie das Gerät an eine Justierstufe an und bewegen Sie es senkrecht. Heben Sie das Substrat horizontal mit der Transfervorrichtung an und trocknen Sie es einen Tag lang in einem Trockenexsikkator.

Zur Herstellung von Zellsuspensionen kultivieren Sie bovine Endothelzellen der Carotisarterie oder BAECs bis zu einer Konfluenz von 1/3 bei 37 Grad Celsius in 5 % CO2 und 95 % Luft auf Polystyrol für Zellkultur mit DMEM, das FBS und Penicillin enthält. Nach Erreichen der Konfluenz behandeln Sie die BAECs drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius in 5 % CO2 und 95 % Luft mit drei Millilitern 0,25 %iger Trypsin-EDTA-Lösung. Inaktivieren Sie das Trypsin-EDTA durch Zugabe von 10 Millilitern DMEM, das 10 % FBS enthält.

Und sammeln Sie die Zellsuspension in einem kegelförmigen 50-Milliliter-Röhrchen. Nach einer Zentrifugation bei 120 × g für fünf Minuten wird der Überstand abgesaugt und die Zellen in 10 Milliliter DMEM resuspendiert. Die gewonnenen Zellen werden auf den St-IPAAm-Oberflächen mit einer Dichte von 10.000 Zellen pro Quadratzentimeter ausgesät, gezählt mithilfe eines Einweg-Blutzählkammers.

Beobachten Sie die Zellen auf den Oberflächen unter einem Mikroskop, das mit einem Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % CO2 und 95 % Luft ausgestattet ist. Anschließend sterilisieren Sie die St-IPAAm-Oberflächen mittels UV-Licht, das in einer sterilen Arbeitsbank integriert ist. Zeichnen Sie Zeitrafferaufnahmen der anhaftenden BAECs für etwa 24,5 Stunden bei 37 Grad Celsius mit einem Phasenkontrastmikroskop mit 10facher Vergrößerung auf.

Nach der BAEC-Adhäsion die Ablösung der BAECs von der St-IPAAm-Oberfläche bei 20 Grad Celsius über einen Zeitraum von etwa 3,5 Stunden aufzeichnen. Nach der Optimierung von Zelladhäsion und -ablösung auf der übertragenen Langmuir-Schicht die Zellschichten herstellen, indem BAECs zunächst wie zuvor kultiviert werden. Pro Quadratzentimeter 100.000 Zellen auf St-IPAAm-Oberflächen ansäen.

Und inkubieren Sie drei Tage bei 37 Grad Celsius in 5 % CO2. Konfluente BAECs lösten sich spontan bei 20 Grad Celsius ab. Die Herstellung einer temperaturreagiblen übertragenen Langmuir-Schichtoberfläche wird hier gezeigt.

Die synthetisierte St-IPAAm-Chloroformlösung wurde vorsichtig auf eine Luft-Wasser-Grenzfläche gegeben. Zwei Barrieren wurden verwendet, um die St-IPAAm-Moleküle an der Grenzfläche zu komprimieren, bis eine Zielfläche von 50 Quadratzentimetern erreicht war. Der Oberflächendruck wurde während der Kompression gemessen, um eventuelle Defekte im Langmuir-Film zu erkennen.

Nach der Komprimierung wurde ein hydrophob modifiziertes Deckglas-Substrat mithilfe eines Justierstages horizontal auf die Grenzfläche platziert. Das Substrat wurde horizontal angehoben und einen Tag lang getrocknet. Nach diesem Schritt waren die St-IPAAm-Oberflächen zur Verwendung in Zellkulturversuchen bereit.

Hier werden repräsentative Ergebnisse von topografischen Bildern der St-IPAAm-Oberflächen mittels Rasterkraftmikroskopie gezeigt. Auf beiden St-IPAAm-Oberflächen wurden Nanostrukturen beobachtet. Größe und Form der Nanostrukturen hingen stark von AM sowie von der Zusammensetzung des St-IPAAm ab.

Hier ist ein makroskopisches Bild einer gewonnenen Zellschicht auf einer Langmuir-Film-übertragenen Oberfläche mit St-IPAAm 480 und einer AM von 40 Quadratnanometern pro Molekül dargestellt. Die Zellen erreichten nach drei Tagen Konfluenz in Kultur auf Oberflächen mit St-IPAAm 170 und St-IPAAm 480 bei 37 Grad Celsius. Und die Zellschicht wurde rasch nach Absenkung der Temperatur von 37 auf 20 Grad Celsius gewonnen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Herstellung und die Gestaltung der molekularen Zusammensetzung eines Polymers durchführt, einen Langmuir-Film herstellt und überträgt, die Zelladhäsion und -ablösung steuert und eine Zellschicht zurückgewinnt. Durch ihre Entwicklung ebnet diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Biomaterialien und des Gewebeengineerings den Weg, um Wechselwirkungen zwischen Zellen und Oberflächen sowie Zellkultivierungsstrategien für den Einsatz in der regenerativen Medizin zu erforschen. Die Bedeutung dieser Technik reicht bis in die Therapie der Zelltransplantation hinein, da sie das Potenzial besitzt, Zellschichten verschiedener Zelltypen herzustellen, die von Patienten stammen.