Herstellung von Thermoresponsive nanostrukturierte Oberflächen für Tissue Engineering

Das übergeordnete Ziel dieser Langmuir-Schaefer-Methode mit Block-Copolymeren ist es, Zellfaltblätter unter verschiedenen Bedingungen der temperaturempfindlichen Oberfläche herzustellen, indem die Stärke der Zelladhäsion und -bindung kontrolliert wird. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Biomaterialien zu beantworten, wie z. B. biokompatible Materialien, Zellkulturoberflächen und Bioseparation. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Wechselwirkung zwischen temperaturempfindlicher Oberfläche und Zellen kontrolliert und die modifizierenden Bedingungen für die Zellblattrückgewinnung optimiert werden können.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Wechselwirkung zwischen Zelle und Oberfläche geben kann, kann sie auch auf andere Systeme wie Bioseparation und Biofilm angewendet werden. Lösen Sie zunächst Styrol, ECT und ACVA in 40 Millilitern 1,4-Dioxan auf. Frieren Sie die Lösung 15 bis 20 Minuten lang in flüssigem Stickstoff unter Vakuum ein, um die reaktiven Spezies zu entfernen.

Nachdem Sie die Lösung allmählich bei Raumtemperatur aufgetaut haben, wiederholen Sie diesen Gefrier-, Pumpen-, Auftau- und Entgasungszyklus dreimal. Das Polystyrol als Makro-RAFT-Mittel erhält man durch Polymerisation bei 70 Grad Celsius für 15 Stunden in einem Ölbad. Das Polystyrol-Makro-RAFT-Mittel mit 800 Millilitern Äther ausfällen und im Vakuum trocknen.

Als nächstes lösen Sie IPAAm-Monomer, Polystyrol-Makro-RAFT-Mittel und ACVA in vier Millilitern 1,4-Dioxan auf. Entfernen Sie den Sauerstoff in der Lösung durch Einfrieren, Pumpen und Auftauen der Entgasungszyklen wie zuvor. Führen Sie nach dem Entgasen eine Polymerisation bei 70 Grad Celsius für 15 Stunden in einem Ölbad durch.

Schließlich erhält man das synthetisierte St-IPAAm-Molekül auf die gleiche Weise wie das Polystyrol-Makro-RAFT-Mittel. Waschen Sie Glassubstrate mit einem Überschuss an Aceton und Ethanol und beschallen Sie sie fünf Minuten lang, um Oberflächenverunreinigungen zu entfernen. Trocknen Sie die Substrate im Backofen bei 65 Grad Celsius für 30 Minuten.

Verwenden Sie dann Sauerstoffplasma, um die Oberflächen der Substrate bei Raumtemperatur zu aktivieren. Tauchen Sie die Substrate über Nacht bei Raumtemperatur in Toluol mit einem Gehalt von 1 % Hexatrimethoxysilan, um das Substrat zu silianisieren. Waschen Sie dann die silianisierten Substrate in Toluol und tauchen Sie sie 30 Minuten lang in Aceton, um die nicht umgesetzten Wirkstoffe zu entfernen.

Glühen Sie die Substrate zwei Stunden lang bei 110 Grad Celsius, um die Oberfläche gründlich zu immobilisieren. Zum Schluss schneiden Sie die sylanisierten Substrate mit einem Glasschneider auf 25 Millimeter x 24 Millimeter zu, damit sie in die Zellkulturschalen passen. Stellen Sie das Langmuir-Filminstrument in einen Schrank, um die Ansammlung von Staub zu verhindern.

Waschen Sie den Langmuir-Trog in Barrieren mit destilliertem Wasser und Ethanol, um die Verunreinigungen zu entfernen. Trocknen Sie die Wanne und die Barrieren, indem Sie sie mit einem fusselfreien Handtuch abwischen. Füllen Sie dann den Trog mit ca. 110 Millilitern destilliertem Wasser und setzen Sie die Barrieren auf beiden Seiten des Troges.

Als nächstes erhitzen Sie eine Platin-Wilhelmy-Platte zur Überwachung der Oberflächenspannung mit einem Gasbrenner, bis die Platte rot wird. Waschen Sie dann die Platte mit destilliertem Wasser, um die Verunreinigungen zu entfernen. Hängen Sie die Wilhelmy-Platte an einen Draht, der am Oberflächendruckmessgerät befestigt ist.

Stellen Sie das Flächendruckmessgerät gemäß dem Protokoll des Herstellers auf Null. Komprimieren Sie die Luft-Wasser-Grenzfläche auf dem Trog durch die Barrieren auf beiden Seiten des Troges, bis die Grenzfläche etwa 50 Quadratzentimeter ohne Polymertropfen erreicht. Saugen Sie alle kleinen Verunreinigungen an, bis die Oberflächenpressung nahezu null Millinewton pro Meter beträgt.

Positionieren Sie die Barrieren auf beiden Seiten wieder und fügen Sie destilliertes Wasser hinzu, um die Abnahme des destillierten Wassers auszugleichen. Als nächstes lösen wir fünf Milligramm des synethesierten St-IPAAm-Moleküls in fünf Millilitern einer Entwicklungslösung von Chloroform. Geben Sie dann vorsichtig 27 Mikroliter St-IPAAm, gelöst in Chloroform, mit einer Mikrospritze oder Mikropipette auf den Trog.

Nachdem Sie fünf Minuten gewartet haben, bis das Chloroform vollständig verdampft ist, bewegen Sie beide Barrieren horizontal, um das St-IPAAm-Molekül an der Oberfläche zu komprimieren. Halten Sie die Kompressionsrate der Barrieren bei 0,5 Millimetern pro Sekunde, bis der Zielbereich von 50 Quadratzentimetern erreicht ist. Messen Sie die Flächenpressung Pi-A-Isothermen mit der Platin-Wilhelmy-Platte, die während der Kompression am Oberflächendruckmessgerät befestigt ist, gemäß dem Protokoll des Herstellers.

Halten Sie die Oberfläche nach Erreichen der Zielbereichsgröße fünf Minuten lang aufrecht, damit sich die St-IPAAm-Moleküle entspannen können. Die Moleküle erreichen nicht unmittelbar nach der Kompression das Gleichgewicht. Übertragen Sie dann die Langmuir-Folie mit einem Transfergerät fünf Minuten lang auf ein hydrophobisch modifiziertes Glassubstrat, um die Folie robust zu absorbieren.

Befestigen Sie das hydrophobe Glassubstrat parallel auf dem Gerät. Verbinden Sie das Gerät mit einem Ausrichtungstisch und bewegen Sie es senkrecht. Heben Sie das Substrat mit dem Transfergerät waagerecht an und trocknen Sie es einen Tag lang in einem Exsikkator.

Zur Herstellung von Zellsuspensionen werden Endothelzellen (BAECs) der Rinderhalsschlagader bei 37 Grad Celsius in 5 % CO2 und 95 % Luft auf Gewebekulturpolystyrol mit DMEM, das FBS und Penicillin enthält, kultiviert. Nachdem die Konfluenz erreicht ist, werden BAECs drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius in 5 % CO2 und 95 % Luft mit drei Millilitern 0,25 % Trypsin-EDTA behandelt. Deaktivieren Sie das Trypsin-EDTA, indem Sie 10 Milliliter des DMEM mit 10 % FBS hinzufügen.

Und sammeln Sie die Zellsuspension in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen. Nach dem Zentrifugieren bei 120 mal g für fünf Minuten aspiriert man das Supernatent und resuspendiert die Zellen in 10 Millilitern des DMEM. Aussaat der gewonnenen Zellen auf den St-IPAAm-Oberflächen in einer Konzentration von 10.000 Zellen pro Quadratzentimeter, gezählt mit einem Einweg-Hämozytometer.

Beobachten Sie die Zellen auf den Oberflächen mit einem Mikroskop, das mit einem Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % CO2 und 95 % Luft ausgestattet ist. Sterilisieren Sie anschließend die St-IPAAm-Oberflächen mit ultraviolettem Licht, das mit einer sauberen Bank ausgestattet ist. Nehmen Sie Zeitrafferbilder von adhärenten BAECs für ca. 24,5 Stunden bei 37 Grad Celsius mit einem Phasenkontrastmikroskop mit 10-facher Vergrößerung auf.

Nach der BAEC-Adhäsion ist die Abspaltung der BAECs von der St-IPAAm-Oberfläche bei 20 Grad Celsius für etwa 3,5 Stunden aufzuzeichnen. Nach der Optimierung der Zelladhäsion und -ablösung auf der übertragenen Oberfläche des Langmuir-Films stellen Sie die Zellfaltblätter her, indem Sie zuerst BAECs wie zuvor kultivieren. Säen Sie insgesamt 100.000 Zellen pro Quadratzentimeter auf St-IPAAm-Oberflächen.

Und inkubieren drei Tage lang bei 37 Grad Celsius in 5 % CO2. Konfluente BAECs lösen sich spontan bei 20 Grad Celsius ab. Hier ist die Vorbereitung einer temperaturempfindlichen Langmuir-Film-übertragenen Oberfläche dargestellt.

Die synthetisierte St-IPAAm-Chloroformlösung wurde vorsichtig auf eine Luft-Wasser-Grenzfläche abgegeben. Zwei Barrieren wurden verwendet, um die St-IPAAm-Moleküle auf der Grenzfläche zu komprimieren, bis eine Zielfläche von 50 Quadratzentimetern erreicht war. Während der Kompression wurde die Flächenpressung gemessen, um eventuelle Defekte im Langmuir-Film zu erkennen.

Nach der Verdichtung wurde ein hydrophobisch modifiziertes Deckglassubstrat mit einem Ausrichtungstisch horizontal auf die Grenzfläche aufgebracht. Das Substrat wurde horizontal angehoben und einen Tag lang getrocknet. Nach diesem Schritt waren die St-IPAAm-Oberflächen bereit für den Einsatz in Zellkulturexperimenten.

Repräsentative Ergebnisse von topographischen Rasterkraftmikroskopie-Bildern von St-IPAAm-Oberflächen sind hier dargestellt. Nanostrukturen wurden auf beiden St-IPAAm-Oberflächen beobachtet. Die Größe und Form der Nanostrukturen hing stark von AM und der Zusammensetzung von St-IPAAm ab.

Hier wird ein makroskopisches Bild einer wiedergewonnenen Zellfalte auf einer Langmuir-Filmoberfläche gezeigt, die mit St-IPAAm 480 und einer AM von 40 Quadratnanometern pro Molekül übertragen wurde. Die Zellen erreichten nach drei Tagen in Kultur auf St-IPAAm 170 und St-IPAAm 480 Oberflächen bei 37 Grad Celsius die Konfluenz. Und das Zellblatt wurde schnell wiederhergestellt, nachdem die Temperatur von 37 auf 20 Grad Celsius gesenkt wurde.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man herstellt, wie man die molekulare Zusammensetzung des Polymers entwirft, wie man Langmuir-Film herstellt und überträgt, wie man die Zelladhäsion und -ablösung kontrolliert und wie man das Zellblatt wiederherstellt. Nach ihrer Entwicklung ebnet diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Biomaterialien und des Tissue Engineering den Weg, um Wechselwirkungen zwischen Zellen und Oberflächen sowie Zellkulturstrategien für den Einsatz in der degenerativen Medizin zu erforschen. Die Implikation dieser Technik erstreckt sich auch auf die Therapie der Zelltransplantation, da diese Technik das Potenzial hat, Zellfaltblätter verschiedener Zelltypen herzustellen, die von Patienten zur Verfügung gestellt werden.