Optische Kontrolle von lebenden Zellen elektrische Aktivität von konjugierten Polymeren

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, das Zellmembranpotential bei Stimulation durch sichtbare Lichtimpulse zu kontrollieren. Der Phototransduktionsprozess wird durch ein lichtempfindliches konjugiertes Polymer vermittelt. Diese Methode stellt ein neues Werkzeug im Bereich der Technologien dar, da sie eine wertvolle Alternative zu bestehenden Methoden wie der Optogenetik und der thermischen Stimulation zur optischen Kontrolle der Aktivität lebender Zellen darstellt.

Die Hauptvorteile dieser Technik sind die schnelle Integrierbarkeit mit jedem Elektrophysiologentyp, die potenziell hohe spezielle und zeitliche Auflösung, sie reduzieren die Invasivität. Darüber hinaus ermöglicht es, einen Gentransfer zu vermeiden, der von der Optogenetik gefordert wird. Unsere hier beschriebene Methode zur Photostimulation von in vitro Zellkulturen.

Es könnte aber auch interessante Möglichkeiten für in vivo-Anwendungen eröffnen. Caterina Bossio und Susana Vaquero Morata werden das Verfahren von Postdocs aus unseren Labors mit biologischem bzw. physikalisch-chemischem Hintergrund demonstrieren. Zu Beginn wird eine Lösung des lichtempfindlichen konjugierten Polymers hergestellt, indem P3HT und PCBM in Chlorbenzin in einer relativen Konzentration von eins zu eins gemischt werden.

Mischen Sie die Lösung mit einem Magnetrührer mindestens vier Stunden lang bei 60 Grad Celsius. Reinigen Sie anschließend mit Indiumzinnoxid beschichtete Objektträger mit aufeinanderfolgenden 10-minütigen Bädern aus deionisiertem Wasser, Aceton und Isopropanol in einem Ultraschallgerät. Trocknen Sie die Deckgläser mit einer Stickstoffpistole und behandeln Sie die Substrate dann mit einem Plasmareiniger.

Nach der Reinigung den Schieber mit der ITO-beschichteten Seite nach oben auf das Futter eines Spincoaters setzen. Geben Sie als Nächstes 150 Mikroliter der P3HT PCBM-Lösung auf den Objektträger und drehen Sie die Probe. Nachdem der Spincoater fertiggestellt ist, entfernen Sie die Probe und verwenden Sie einen in Aceton getauchten Reinraumtupfer, um die Rückseite des Substrats zu reinigen.

Sterilisieren Sie die photoaktiven Substrate, indem Sie sie in einen abgedeckten, hitzebeständigen Behälter legen und zwei Stunden lang auf 120 Grad Celsius erhitzen. Geben Sie die Proben dann in eine sterile Haube und lassen Sie sie abkühlen. Von diesem Zeitpunkt an ist die Sterilität der Proben zu erhalten.

Legen Sie die photoaktiven Substrate in eine Sechs-Well-Platte. Angesichts der Hydrophobizität der konjugierten Polymerschicht ist eine Polydimethylsiloxan-Vertiefung herzustellen, um die Probe zu fixieren, und die Lösungen wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben eingeschlossen. Legen Sie dann die photoaktiven Substrate in die Vertiefungen der Platte und bedecken Sie die gesamte Oberfläche jeder Probe mit 500 bis 750 Mikrolitern einer Lösung von zwei Milligramm pro Liter Fibronektin in PBS.

Inkubieren Sie die Proben mindestens eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie nach der Inkubation eine Glaspipette, um die Fibronektinlösung zu entfernen, und waschen Sie die Substrate einmal mit zwei Millilitern PBS. Zuerst fügen Sie ein Gesamtvolumen von 750 bis 1.000 Mikrolitern vollständigem Wachstumsmedium pro Vertiefung hinzu.

Als nächstes werden 15.000 AGK293-Zellen pro Quadratzentimeter photoaktives Substrat in jede Vertiefung eingefüllt. Inkubieren Sie die Zellen dann 24 bis 48 Stunden lang. Zellen können auf den photoaktiven Substraten leicht kultiviert werden, vorausgesetzt, dass eine geeignete Adhäsionsschicht, wie Fibronektin, abgeschieden wird.

Bereiten Sie zunächst sowohl die extrazelluläre als auch die intrazelluläre Lösung vor, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Sterilisieren Sie die Lösungen, indem Sie sie durch einen 0,2-Mikron-Filter leiten. Erwärmen Sie dann die extrazelluläre Lösung, indem Sie sie in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius geben.

Füllen Sie außerdem eine Ein-Milliliter-Spritze mit der intrazellulären Lösung und statten Sie sie mit einer 34-Gauge-Nadel aus. Halten Sie die intrazelluläre Lösung in Kontakt mit Eis, um einen Abbau des ATP zu vermeiden. Nehmen Sie als Nächstes ein zellbeschichtetes Substrat aus dem Inkubator und entfernen Sie vorsichtig die PDMS-Vertiefung.

Entfernen Sie dann das Wachstumsmedium mit einer Glaspipette und spülen Sie die Probe langsam mit extrazellulärer Lösung ab, um eine Zellablösung zu vermeiden. Geben Sie drei Milliliter extrazelluläre Lösung in jede Vertiefung und geben Sie die Platte dann in den Probenhalter der Elektrophysiologie-Station. Sobald sie an Ort und Stelle ist, setzen Sie die Referenzelektrode in die Vertiefung ein, die getestet werden soll.

Bereiten Sie als Nächstes eine frische Mikropipette aus Glas für die Patch-Klemme mit einem Mikropipettenabzieher vor. Füllen Sie die Hälfte der Pipette mit intrazellulärer Lösung. Verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Patch-Pipette in unmittelbarer Nähe der ausgewählten Zellmembran zu positionieren.

Während der Positionierung üben Sie einen Überdruck auf die Pipette aus, um zu vermeiden, dass Schmutz an der Spitze haften bleibt. Beginnen Sie mit der Pipette einige Mikrometer über der Zelle, die Pipette in Richtung Zellmembran zu senken, während Sie den Pipettenwiderstand in der Patch-Control-Software steuern. Wenn der Pipettenwiderstand um etwa ein Megaohm ansteigt, entfernen Sie den Überdruck und saugen Sie sanft daran, um den Gigaseal zwischen Pipette und Zellmembran zu bilden.

Legen Sie anschließend ein negatives Potential von minus 40 Millivolt an die Pipette an, um die Dichtung zu stabilisieren. Kompensieren Sie die kapazitive Flüchtigkeit aufgrund der Pipettenkapazität mit den entsprechenden Befehlen am Patch-Verstärker und/oder der Patch-Control-Software. Üben Sie einen kurzen und intensiven Saugimpuls auf die Pipette aus, um die Membran zu durchbrechen und den elektrischen Zugang zum Zytoplasma der Zelle zu ermöglichen.

Stellen Sie dann den Patch-Verstärker auf den Stromklemmenmodus ein, sodass kein Strom in die Zelle eingespeist wird. Verfolgen Sie im Strom-Clamp-Modus das Zellmembranpotenzial und warten Sie einige Minuten, bis es sich stabilisiert hat. Sobald sie stabil ist, wenden Sie das gewünschte Beleuchtungsprotokoll auf die Zelle an, indem Sie die photoaktive Membran unter der Zelle mit Licht im Bereich von 450 bis 600 Nanometern beleuchten.

Erfassen Sie die Wirkung des Lichts auf das Membranpotential. Kurze Lichtimpulse von etwa 10 bis 20 Millisekunden führen zu einer vorübergehenden Depolarisation der Zelle, während bei längerer Beleuchtung in der Größenordnung von Hunderten von Millisekunden eine Hyperbolisation beobachtet wird, bis das Licht ausgeschaltet wird. Die optische Stimulation der Zellen, die durch die photoaktiven Substrate vermittelt wird, kann je nach Dauer des Lichtreizes unterschiedliche Effekte auf die Zellmembran zur Folge haben.

Auf eine schnelle Spitze, wie die hier gezeigte, folgt eine vorübergehende Depolarisation in der Größenordnung von Dutzenden von Millisekunden. Bei kurzen Lichtimpulsen beim Ausschalten des Lichts ist ein gegenteiliges Verhalten zu beobachten. Diese Signale wurden auf eine Variation der Membrankapazität aufgrund lokaler Erwärmung nach Lichtabsorption zurückgeführt.

Bei längerer Beleuchtung verwandelt sich die anfängliche Depolarisation in eine Zellhyperpolarisation. Dieses Phänomen hat wiederum einen thermischen Ursprung, aber in diesem Fall hängt es mit einer Variation des Membrangleichgewichtspotentials zusammen, die auf eine Änderung der Leitfähigkeiten des Ionenkanals zurückzuführen ist, die durch die erhöhte Temperatur induziert wird. Es ist wichtig zu beachten, dass diese Technik sehr flexibel ist und an die besonderen Bedürfnisse eines bestimmten Experiments angepasst werden kann, z. B. durch Änderung des phototoxischen Polymers, des Herstellungsprozesses oder des Beleuchtungsprotokolls.

Bevor jedoch das Protokoll geändert wird, sollte man zunächst die wichtigen Eigenschaften des aktiven Polymers wie seine Biokompatibilität, Eignung für den Sterilisationsprozess, elektrochemische und zeitliche Stabilität überprüfen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine hybride Schnittstelle zwischen Bindepolymeren und lebenden Zellen realisiert und wie man sie zur optischen Kontrolle der Zellaktivität verwendet. Wir glauben, dass diese Technik auch verspricht, ein komplementäres Werkzeug in den Neurowissenschaften für In-vitro-Untersuchungen zu werden und eine neue Perspektive für In-vivo-Anwendungen zu eröffnen.

Um das Protokoll zu verfeinern, ist jedoch eine starke und gemeinsame Anstrengung von Materialwissenschaftlern und Neurowissenschaftlern, Physikern und Medizinern erforderlich.