Name: Beurteilung der Maternal Vascular Remodeling während der Schwangerschaft in der Gebärmutter Maus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Lernen Sie die stereologische Analyse mütterlicher Gefäßanpassungen während der Mausschwangerschaft. Diese Methode ermöglicht die quantitative Bewertung von Spiralarterienumbau und dessen Validierung durch Immunhistochemie.

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Die Autoren möchten sich bei allen Mitgliedern des Colucci-Labors für hilfreiche Diskussionen bedanken. Diese Arbeit wurde finanziert von The Wellcome Trust [094073/Z/10/Z], dem Centre for Trophoblast Research und der British Heart Foundation.

Alle Verfahren in diesem Manuskript beschrieben werden, werden in Übereinstimmung mit britischen Innenministeriums Verordnungen und werden von der Cambridge ethischen Prüfungsausschuss genehmigt. 1. Probenentnahme <ol><li> Up zeitlich Paarung mit 8-12 Wochen alte weibliche C57BL / 6-Mäuse mit erwachsenen Männern (bis 2 Weibchen pro Männchen) am Nachmittag gesetzt. Prüfen Sie auf das Vorhandensein von vaginalen Stecker als Zeichen der Kopulation früh am Morgen an den folgenden Tagen. Die Anwesenheit eines Steckers am Morgen Marken gd0.5. </li><li> Auf gd9.5, einschläfern das Tier durch Genickbruch und öffnen Sie die Bauchhöhle. Beachten Sie, dass die Euthanasie von CO 2 kann Vasodilatation verursachen. </li><li> Zahnseide, um sanft zu ligieren uterinen Arterien (1, gestrichelte Pfeile). Binden die Zahnseide um die Arterien an der Spitze jedes Uterushorn, proximal zu den Eierstöcken, sowie im Bereich der Zervix. Anmerkung: Bruch nicht die Gefäße, da dies zu stürzt Arterien führen. </li> &lt;li&gt; Präparieren des Uterus schnell mit Dissektion Schere, Herausschneiden des gesamten Uterus distal zu den drei Ligationsstellen an der Spitze des Uterushorns und des Gebärmutterhalses. </li><li> Platzieren des Uterus auf einem vorbereiteten Polystyrol Stück, so dass beide Hörner sind entlang der gleichen Längsachse in entgegengesetzten Richtungen aus dem Gebärmutterhals fluchten. Vorsichtig dehnen, und an Ort und Stelle mit 2-3 25 G Nadeln stecken. </li><li> Tauchen Sie das Polystyrol in eine vorbereitete 50 ml konischen Röhrchen. Aufstockung auf 50 ml mit 10% Formalin. Fix für 5-6 Stunden bei Raumtemperatur. </li><li> Entsorgen Sie die Formalin-Lösung und ersetzen mit 50 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 5 min. </li><li> Auszuschneiden die beiden Uterushörner proximal an der Ligationsstelle an jedem Ende und proximal an der Zervix in der Mitte, schneiden Sie überschüssiges Fett um die Implantationsstellen und waschen zweimal in PBS für 5 Minuten, um Spuren von Formalin zu entfernen. </li><li> Speichern der Proben in 70% Ethanol bei 4 ° C (bis zu zwei Wochen), bis die Verarbeitung. ACHTUNG: Ethanol ist leicht entflammbar. </li><li> Verwenden eines automatisierten Verarbeitungssystems unter Verwendung der in Tabelle 1 angegebenen Parametern. Einbetten die Hörner einzeln in Paraffin, so daß sie in der Ebene senkrecht zu der langen Achse des Uterus geschnitten werden. Dies stellt sicher, dass die maximale Fläche jedes Implantationsstelle wird zur Analyse in der Mitte des Blocks (2A) ausgesetzt ist. OPTIONAL: Dies ist eine bequeme Zeitpunkt für die Randomisierung der Blöcke, falls gewünscht. </li><li> Mit Hilfe eines Mikrotoms geschnitten Serienschnitte von 7 um Dicke aus den Blöcken. Fleck ein Abschnitt an jedem 49 &amp; mgr; m-Intervall mit Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E, siehe Abschnitt 2.1). Bewahren Sie die übrigen Abschnitte bei Raumtemperatur für SMA Färbung und andere Downstream-Anwendungen. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:99px;"> Lösung </td><td style="width:43px;"> Zeit<html></td><td style="width:97px;"> Temperatur </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 70% Ethanol </td><td> 1 Stunde </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% Ethanol </td><td> 1 Stunde </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% Ethanol </td><td> 1 Stunde </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% Ethanol </td><td> 1 Stunde </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% Ethanol </td><td> 1 Stunde </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% Ethanol </td><td> 1 Stunde </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% Ethanol </td><td> 1 Stunde </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21">: 21px; &quot;&gt; Xylol </td><td> 1 Stunde </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Xylol </td><td> 1 Stunde </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Xylol </td><td> 1 Stunde </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Paraffin </td><td> 1 Stunde </td><td> 63 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Paraffin </td><td> 1 Stunde </td><td> 63 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Paraffin </td><td> 1 Stunde </td><td> 63 ° C </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"> Paraffin </td><td> 1 Stunde </td><td> 63 ° C </td></tr></tbody></table> Tabelle 1:. Einstellungen für automatisierte Gewebeverarbeitung Übersicht von der Einstellung für die Verarbeitung von Uterusgewebe verwendet 2. Stereological Bewertung <ol><li> H &amp; E-Färbung <ol><li> Entparaffinieren Abschnitten durch Eintauchen Objektträger in einer Objektträgerhalter in einer 100% -igen Xylen-Bad für 10 Minuten bei Raumtemperatur gelagert. VORSICHT: Xylol ist brennbar und Verdacht, krebserzeugend, die durch Kontakt und Einatmen giftig. Diese Arbeit muss in einem Abzug durchgeführt werden, unter Verwendung von persönlicher Schutzausrüstung (PSA). </li><li> Tauchen Sie Folien in Bad, das sauber Xylol für weitere 10 min. </li><li> Sequentielles Tauchen Folien in Bädern, die 100% Ethanol, 95% Ethanol, 70% Ethanol und gereinigtes Wasser für jeweils 5 Minuten. </li><li> Tauchen Dias in 50% Gill No 3 Hämatoxylin-Lösung, verdünnt mit gereinigtem Wasser, 5 min. ACHTUNG: Hämatoxylin ist gesundheitsschädlich beim Verschlucken und Kontakt mit Augen. Tragen Sie geeignete PSA bei der Handhabung. </li><li> Waschen Sie Folien in einer Färbung Wanne unter fließendem Leitungswasser für 10 Minuten. </li><li> Einzutauchen gleitet in 1% Säure / Alkohol-Lösung (1% 10 M Chlorwasserstoffsäure in 70% Ethanol) 10 Sekund waschen in einem Färbetrog unter fließendem Leitungswasser. </li><li> Tauchen Sie Folien in Eosin-Lösung für 30 Sekunden und waschen in einem Färbetrog unter fließendem Wasser für 10 min. </li><li> Innerhalb eines Laborabzugs, sequentiell einzutauchen Folien in Bädern, die 70% Ethanol, 95% Ethanol und 100% Ethanol für jeweils 5 min. </li><li> Tauchen Sie Folien in Bad, das Xylol für 10 min. </li><li> Berg Deckgläser mit einem Xylol-basierte Montage Medium. Horizontal und gründlich trocknen in einem Abzug vor der Visualisierung der Objektträger unter dem Mikroskop. </li></ol></li><li> Stereo Bewertung der Behältergröße und Remodeling-Status <ol><li> Für jede Implantationsstelle, festzustellen, welche Bereiche in der Nähe des Mediapunkt sind. Die Chorioallantois Befestigung zwischen dem Fötus und sich entwickelnden Plazenta dient als ein guter Indikator für die Mediapunkt. </li><li> Wählen Sie 3 Abschnitte auf 49 &amp; mgr; m Abständen nahe dem Mediapunkt für die Analyse. Scannen ausgewählten Folien. Um zu vermeiden, incLuding Venen, die gezeigt haben, um mehr peripher in den Implantationsstellen 16 befinden, beschränken die Analyse auf dem zentralen 2/4 jedes Implantationsstelle (Abbildung 2A). </li><li> Um Lumengröße zu bewerten, um das Innere der Behälter zu ziehen und Aufzeichnung der Fläche dieser Form. Für die gesamte Gefäßgröße, ziehen um die Außenwand des Gefäßes, einschließlich Endothelzellen, Perizyten und intra-Leukozyten. Anmerkung: Der Anteil des gesamten Gefäßgröße zum Lumen ist ein Proxy für den Umbau Status eines Behälters. Als die Gefäße der Spule durch die Ebene, die der Schnitt entlang schneiden kann es mehrere Querschnitte des gleichen Arterie in eine Folie sein. Vermeiden Sie die Messung der gleichen Arterie mehrmals. </li><li> Die Messungen werden von den 5 Schiffe in jedem Implantationsstelle mit den größten und rund Lumen. Jeweils eine Messung Implantationsort in dreifacher Ausfertigung (drei Abschnitte 49 um beabstandet voneinander). Der Durchschnitt dieser 15 Messungen represengen des mittleren Durchmessers der größten Gefäße. </li><li> Um Überrepräsentation von größeren Schiffen in einigen Proben zu vermeiden, messen Sie die gleiche Anzahl von Schiffen in jedem Implantationsstelle. </li></ol></li></ol> 3. Qualitative Bewertung mittels Immunhistochemie <ol><li> Entparaffinierung und Rehydrierung <ol><li> Entparaffinieren Abschnitten durch Eintauchen in eine hitzebeständige Folien Gleitzahnstange in einen 100% -igen Xylen-Bad für 10 Minuten bei Raumtemperatur gelagert. </li><li> Tauchen Sie Folien in Bad, das sauber Xylol für weitere 10 min. </li><li> Sequentiell tauchen Folien in Bädern, die 100% Ethanol, 95% Ethanol und 70% und gereinigtes Wasser für jede 5 min. </li></ol></li><li> Antigen-Retrieval <ol><li> Bereiten Sie eine 10 mM Natriumcitratpuffer in gereinigtem Wasser und auf pH 6 mit 10 M Chlorwasserstoffsäure. </li><li> Füllen Sie einen hitzebeständigen Behälter, der 600 ml mit 400 ml Natriumcitratpuffer und in einen heimischen Kochtopf, die ausreichend wat halten kanner auf die Hälfte des Behälters eintauchen. Lose befestigen Sie den Deckel des Druckkochtopf und Hitze zum Kochen bringen. </li><li> Den Objektträger-Rack in die Natriumcitratpuffer und fest fixieren den Deckel des Dampfkochtopf. Sobald unter Druck, zu ermöglichen, für 3 Minuten kochen. </li><li> Drucklos machen Schnellkochtopf, und entfernen Sie den Innenbehälter. Die Objektträger in der Natriumcitrat-Puffer für 10 min bei Raumtemperatur abkühlen. </li><li> Wasch gleitet in einem Bad, das gereinigte Wasser für 5 min. </li><li> Umkreisen die Abschnitte unter Verwendung einer hydrophoben Barriere Stift. </li><li> Waschen Folien durch Eintauchen in PBS für 5 min. </li></ol></li><li> Blockier Endogene Peroxidase und nicht-spezifische Bindung <ol><li> Inkubieren Schnitte mit 3% Wasserstoffperoxid in gereinigtem Wasser in einer feuchten Kammer für 30 Minuten bei Raumtemperatur verdünnt. ACHTUNG: Wasserstoffperoxid ist stark reizend auf Augen, Haut und beim Verschlucken. Tragen Sie geeignete PSA. </li><li> Tippen Sie überschüssiges Wasserstoffperoxid-Lösung und waschen slides zweimal durch Eintauchen in Tris-gepufferter Salzlösung (TBS), jeweils 2 min. </li><li> Inkubieren Abschnitte mit Maus-Immunglobulin Blockierungsreagens aus der Maus zu Maus-Kit nach den Anweisungen des Herstellers hergestellt. </li><li> Wasch gleitet zweimal in TBS für jeweils 2 Min. </li></ol></li><li> Immundetektion von Glattmuskelaktin <ol><li> Bereiten Antikörper-Verdünnungslösung (im Kit enthalten) und Inkubation mit Abschnitten für 5 min bei Raumtemperatur oder nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Verdünnen Sie 1: 100 Maus-Anti-Human-Glattmuskelaktin (DAKO M0851) in Antikörperverdünnungslösung. Verdünnte Maus-IgG2a Isotyp-Kontrolle bei der Antikörperverdünnungslösung, um sicherzustellen, dass die endgültige Immunglobulinkonzentration entspricht in beiden Lösungen. </li><li> Tippen Sie überschüssiges Antikörperverdünnungslösung und Deckelabschnitte entweder mit verdünnten Antikörpers oder Isotypkontrolle Lösungen. Inkubieren in einer befeuchteten Kammer für 30 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Wasch gleitet zweimal in TBS2 Minuten jeweils. </li><li> Verdünnter biotinylierter Anti-Maus-Sekundär-Antikörper und Inkubation Schnitte für 10 Minuten bei Raumtemperatur oder entsprechend den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Wasch gleitet je einmal mit TBS und PBS für 2 min auf. </li><li> Vorbereitung 3,3&#39;-Diaminobenzidin (DAB) Lösung gemäß den Anweisungen des Herstellers. Deckelabschnitte mit DAB-Lösung und Inkubation für bis zu 4 min, wodurch die Abschnitte zu überwachen, um überschüssige Farbentwicklung zu vermeiden. ACHTUNG: DAB ist brennbar und Verdacht, krebserzeugend, die durch Kontakt und Einatmen giftig. Tragen Sie geeignete PSA bei der Handhabung. </li><li> Tauchen Dias in gereinigtem Wasser, sobald gewünschte Intensität der Färbung erreicht ist. </li><li> Mit 50% Gill No. 3 Hämatoxylin 20 Sek Gegenfärben und waschen in einem Färbetrog unter fließendem Wasser bis das Wasser klar. </li></ol></li><li> Dehydrierung und Montage <ol><li> Innerhalb einer Abzugshaube, nacheinander eintauchen Folien in Bädern, die 70% der ETHnol, 95% Ethanol und 100% Ethanol für jeweils 5 min. </li><li> Tauchen Sie Folien in Bad, das Xylol für 10 min. </li><li> Berg Deckgläser mit einem Xylol-basierte Montage Medium. Horizontal und gründlich trocknen in einem Abzug vor der Visualisierung der Objektträger unter dem Mikroskop </li></ol></li></ol>

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<li>Colucci, F., Kieckbusch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+uterine+natural+killer+cells+nurture+fetal+growth%3A+in+medio+stat+virtus%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Maternal uterine natural killer cells nurture fetal growth: in medio stat virtus.</a> Trends Mol Med. 21 (2), 60-67 (2015).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Das hier vorgestellte Protokoll ist so ausgelegt, ein reproduzierbares Verfahren, mit dem die Gefäßveränderungen, die für eine erfolgreiche Schwangerschaft erforderlich bewerten. Entscheidend für den Erfolg dieser Auswertung ist die Qualität der Gewebeschnitten. Sowohl die genaue Bestimmung der Schwangerschaftsalter der Implantationsstellen sowie zuverlässig Ligieren der Gebärmutterarterien sind entscheidende Schritte. Veränderungen in Parametern wie Zeitpunkt der Fixierung, Gewebeverarbeitung Protokoll usw. kann ebenfalls Einfluss auf das Ergebnis. Für eine unvoreingenommene stereoBewertung, ist es wichtig, die gleiche Anzahl von Schiffen in jedem Implantationsstelle zu messen. Es wird empfohlen, 5 Schiffe pro Implantationsstelle und jeder Implantationsstelle in dreifacher Ausführung zu messen. Der Mittelwert dieser 15 Messungen repräsentiert die mittlere Größe der 5 größten Gefäße. Zusätzlich zu den Daten aus alymphoid Rag2 - / - IL2RG - / - hier gezeigten Mäuse, fanden wir dieses protOcol für eine Anzahl von Modellen von unzureichender mütterlichen Immunfunktion, einschließlich einer von NK-Zellen inhibierten 14. Defekte im arteriellen Umbau wurden auch in Modellen von beeinträchtigt Trophoblastinvasion 18 gezeigt und die hier beschriebenen Techniken können hilfreich sein, die Gefäßsystem in diesen Fällen zu beurteilen. Wir optimiert und validiert dieses Protokoll für die Untersuchung der Dezidua-vaskulären Remodelling in der Mitte der Schwangerschaft bei Mäusen, aber es ist auch denkbar, dieses Protokoll anzupassen in anderen Modellsystemen (zB Ratten) oder auch in andere Organe zu arbeiten. Während wir feststellen, dass die NK-abhängige Remodeling kann kräftig an gd9.5 beurteilt werden kann, kann es auch für andere Zeitpunkte wie gd12.5, wenn die mütterliche Vaskulatur ist komplett neu geändert werden. Zu diesem Zeitpunkt ist die endovaskuläre Trophoblastinvasion tiefere 16 und dieser Zeitpunkt besser geeignet für die Untersuchung der Rolle von Trophoblasten für vaskuläre Veränderungen. Wenn zusätzliche quantitative Ablesungen gewünscht werden,Ermittler können auch die Anzahl der Abschnitte für SMA befleckt zu erhöhen und zu bewerten den Anteil der teilweise umgebaut Gefäße innerhalb jeder Implantationsstelle. Eine Einschränkung dieses Protokolls ist der beschreibende Charakter histologische Untersuchungen. Funktionelle Assays sind jedoch erst langsam verfügbar (zB Doppler-Ultraschall-19). Diese Techniken erfordern technisches Know-how und viel höhere Ausgaben für den Erwerb und die Aufrechterhaltung Ausrüstung, haben aber den Vorteil, dass eine Längs in vivo Anzeige für den Effekt der Änderungen, die histologisch beobachtet werden können. Ein möglicher Nachteil aller stereo Untersuchungen ist die Subjektivität der Ermittler. Zu diesem Zweck wird mit Hilfe von zwei unabhängigen Prüfern, die unabhängig voneinander alle Proben zu analysieren kann helfen, dieses Problem zu vermeiden. Während das Protokoll hier skizzierten gibt Einblick in, wie viel Blut das fetomaternalen Schnittstelle zu erreichen, kann es vorteilhaft sein, es mit dem kompl kombinierenementary Ansatz zur Bewertung der Gesamtblutmenge zu einem bestimmten Zeitpunkt in dem Gefäßsystem durch plastische wirft 16. Die Stärke dieses Protokolls ist, dass sie zwei unabhängigen Ansätzen. Gefäßwechsel wird zunächst quantitativ durch Stereologie untersucht und das Ergebnis wird dann qualitativ mittels Immunhistochemie validiert. Die Zuverlässigkeit der Ergebnisse können weiter verstärkt werden durch Randomisierung der Proben. Die für dieses Protokoll hergestellten Proben können leicht verwendet werden, um auch untersuchen, andere Parameter der Schwangerschaft wie Dezidualisierung, Entwicklung des mesometrial lymphatischen Aggregat der Schwangerschaft (mlap) oder Immundetektion von Zellen von Interesse, konsequent zu bewerten, eine Schwangerschaft Phänotyp bei midgestation werden. Arterielle Remodeling ist ein entscheidender Schritt für die unkomplizierte Schwangerschaften bei Frauen und Misserfolg dieser Veränderungen untermauert die großen geburtshilflichen Syndromen (GOS), nämlich eine Präeklampsie, fetale Wachstumsrestriktion undTotgeburt. Wir stellen Ihnen hier Techniken, um sorgfältig zu prüfen, eine Schwangerschaft Phänotyp in Maus-Modellen, die einige Merkmale der Pathophysiologie der GOS imitieren.

Der Austausch von Nährstoffen, Gasen und Abfallprodukten bei eutherian Schwangerschaft wird durch die Plazenta vermittelt. In der weiblichen Genitaltrakt, die Gebärmutterarterien sind die Hauptleitungen von Blut in die Gebärmutter. Nach der Implantation dieser Zweig in Spezialschiffe genannt Spiralarterien, die durch die Dezidua basalis Richtung fetoplazentaren Einheitsspule. Durchmesser und Elastizität dieser Spiralarterien, die durch Leukozyten umgeben sind, insbesondere Gebärmutter natürliche Killerzellen (unk) -Zellen, diktieren Volumen und die Geschwindigkeit des Blutes zur Verfügung Plazenta 1,2. Korrekte hämodynamischen Veränderungen infolge der Umgestaltung der Spiralarterien sind entscheidend für Erfolg der Schwangerschaft. Während die zugrunde liegenden Mechanismen unterscheiden sich im Detail zwischen humanen und murinen Schwangerschaft, ist das endgültige Ergebnis der Umbauprozess in beiden Spezies erweitert, hoher Leitfähigkeit Gefäßsystem, das seinen glatten Muskulatur verliert. Bei Mäusen UNK-Zellen abgeleiteten Interferon (IFN-) γ ist notwendig, um diese Änderungen bei etwa der Mitte der Schwangerschaft 3-5 induzieren. Mäuse, die entweder NK-Zellen oder Komponenten der IFN-γ-Signalweg fehlt nicht, um diese Änderungen zu unterziehen, und dies wird mit reduzierter fetale Wachstum 6,7 zugeordnet, was die Wichtigkeit einer ausreichenden Blutversorgung des fetoplazentaren Einheit. Während der frühen Schwangerschaft, die interstitielle und endovaskuläre Invasion extravillösen Trophoblasten und ihre Wechselwirkung mit unk Zellen sind wichtig für die Induktion von Gefäßveränderungen und die Förderung der fetale Wachstum 8-10. unk Zellen können menschliche Trophoblasten-Invasion durch Chemokine 11 und Cytokine, wie Granulozyten-Makrophagen dirigieren - Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) 12. Shallow Trophoblastinvasion mit reduziertem arteriellen Umbau und Schwangerschaftskomplikationen wie Präeklampsie 9 verbunden. Dieses Protokoll wird von der Pionierarbeit von Anne Croy, der die wichtigsten beschrieben auf der BasisRolle des Immunsystems und insbesondere NK-abgeleitete IFN-γ für eine erfolgreiche vaskuläre Remodelling durch Immunhistochemie und elegant Transferexperimente 5,13. Hier beschreiben wir eine schnelle und kostengünstige Möglichkeit, um den Umbau Status der Spiralarterien zu bewerten. Obwohl unser Labor routinemäßig beurteilt dies auf der Mitte der Schwangerschaft (Schwangerschafts Tag (gd) 9,5) 14, zwischen gd8.5 und 12,5 15 nimmt der Umbauprozess statt. Das Aufkommen von automatisierten Diascanner hat stark die Beurteilung der Gefäßlumen und Bereiche von Abschnitten erleichtert, und wir fanden, dass dies ein reproduzierbarer Ansatz als Messgefäßdurchmesser sein. Die Zugabe von immunhistochemischen Nachweis von SMA ermöglicht eine einfache Überprüfung der aus dem stereo Beurteilung erhaltenen Ergebnisse. Wie bei allen stereo Techniken, ist es empfehlenswert, die Beurteilung als blind Experiment von mindestens zwei Prüfern durchzuführen. Zu diesem Zweck kann eine Randomisierung Schritt eingeführt wird, wenn seriell schneidenting die Proben so, dass die Ermittler die Beurteilung der Objektträger nicht wissen, aus dem Versuchsgruppe die Proben kommen. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, ein zuverlässiges Werkzeug, um sorgfältig zu prüfen, die Umgestaltung der Spiralarterien bei Mäusen mit definierten mütterlichen und väterlichen Genotypen, im Zusammenhang mit der Mausmodelle für Schwangerschaftskomplikationen zu schaffen. Die Ergebnisse unterstreichen die Abhängigkeit von Unk Zellen dieser Prozess, der für die normale fetale Wachstum ist.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6 Mäuse (8-12 Wochen alt)</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zahnseide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polystyrol</td><td></td><td></td><td>Wird verwendet, um das Gewebe an Ort und Stelle zu halten</td></tr><tr><td>Gerade Dissektionschere</td><td>EMS</td><td>72940</td><td></td></tr><tr><td>25 G Nadeln</td><td>BD&nbsp;</td><td>300600</td><td>Zur Fixierung von Gewebe</td></tr><tr><td>50 ml konische Röhrchen</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Formalinlösung, neutral gepuffert, 10%</td><td>Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Phosphat gepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma</td><td>P3813-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma</td><td>32221-2,5L</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Sigma</td><td>327204-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Fisher Scientific</td><td>X/0250/17</td><td></td></tr><tr><td>Automatisierter Gewebeprozessor</td><td>Sakura</td><td>6032</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Leica</td><td>RM2245</td><td></td></tr><tr><td>Objektträgergestell</td><td>Sigma</td><td>Z710989</td><td></td></tr><tr><td>Coplin-Gefäß</td><td>Sigma</td><td>S5891</td><td></td></tr><tr><td>Gereinigtes Wasser</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hämatoxylinlösung, Kieme Nr. 3</td><td>Sigma</td><td>GHS332-1L</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y-Lösung</td><td>Sigma</td><td>HT110116-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Abzug</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eindeckmedien auf Xylolbasis</td><td>VWR</td><td>361254D</td><td></td></tr><tr><td>Diascanner</td><td>Hamamatsu</td><td>NanoZoomer</td><td></td></tr><tr><td>Diascanner Software</td><td>Hamamatsu</td><td>NDP Viewer</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcitrat tribasisches Dihydrat</td><td>Sigma</td><td>32320</td><td>10 mM Lösung herstellen und pH-Wert auf 6 einstellen</td></tr><tr><td>Schnellkochtopf</td><td></td><td></td><td>Wird für die Antigenrückgewinnung</td></tr><tr><td>verwendet Heizplatte</td><td></td><td></td><td>Wird für die Antigenrückgewinnung</td></tr><tr><td>verwendet Hydrophober Barrierestift</td><td>Vektor</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid</td><td>Fisher Scientific</td><td>H/1800/15</td><td></td></tr><tr><td>Tris gepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma</td><td>T6664-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Maus auf Maus</td><td>Kit Vektor</td><td>BMK-2202</td><td>Reduziert den Hintergrund</td></tr> Maus <tr><td>Anti-Mensch glatte Muskelmasse Aktin</td><td>DAKO</td><td>M0851</td><td>Kreuzreagiert mit Maus</td></tr><tr><td>IgG2a Isotypkontrolle</td><td>DAKO</td><td>X0943</td><td></td></tr><tr><td>Befeuchtete Kammer</td><td>Sigma</td><td>H6644</td><td></td></tr><tr><td>3,3'-Diaminobenzidinlösung</td><td>Sigma</td><td>D4293-5SET</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>Fisher Scientific</td><td>H/1050/PB17</td><td></td></tr></tbody></table>

beurteilung der maternal vascular remodeling während der schwangerschaft in der gebärmutter maus

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

Die Plazenta vermittelt den Austausch von Faktoren wie Gasen und Nährstoffen zwischen Mutter und Fötus und hat spezifische Anforderungen an die Versorgung mit Blut aus dem mütterlichen Kreislauf. Das mütterliche Uterusgefäßsystem muss sich an diesen vorübergehenden Bedarf anpassen, und der Erfolg dieses arteriellen Umbauprozesses hat Auswirkungen auf das Wachstum des Fötus. Zellen des mütterlichen Immunsystems, insbesondere natürliche Killerzellen (NK), spielen dabei eine entscheidende Rolle. Hier beschreiben wir eine Methode zur Beurteilung des Grades des Umbaus der mütterlichen Spiralarterien während der Schwangerschaft von Mäusen. Hämatoxylin- und Eosin-gefärbte Gewebeschnitte werden gescannt und die Größe der Gefäße analysiert. Als ergänzende Validierungsmethode stellen wir auch eine qualitative Bewertung des Erfolgs des Umbauprozesses durch immunhistochemischen Nachweis von Aktin der glatten Muskulatur (SMA) vor, das normalerweise in der Mitte der Schwangerschaft aus den arteriellen Gefäßmedien verschwindet. Zusammen ermöglichen diese Methoden die Bestimmung eines wichtigen Parameters des Schwangerschaftsphänotyps. Diese Ergebnisse können mit anderen Endpunkten der Schwangerschaft von Mäusen kombiniert werden, um einen Einblick in die Mechanismen zu geben, die schwangerschaftsbedingten Komplikationen zugrunde liegen.

Rag2 - / - IL2RG - / - Mäusen fehlt alle reifen Lymphozyten, NK-Zellen, einschließlich 17, und deren Gebärmutterarterien nicht den Gefäßveränderungen in kongenen Wildtyp C57BL / 6 (WT) Mäusen etwa Mitte der Trächtigkeit 5,14 gesehen, zu unterziehen. Als Ergebnis dieser verringerten Umbau Rag2 - / - IL2RG - / - Mäuse zeigen deutlich kleiner Lumenoberflächenbereiche, indikativ für allgemeine kleinere Schiffe, die auf H &amp; E-gefärbten Schnitten sichtbar gemacht werden kann und quantifiziert stereologically (Abbildung 2). Ferner ist die relative Wandstärke (Gefäß-Lumen-Verhältnis) in der Spiralarterien in diesen Mäusen höher, was auf verringerte Blutzufuhr und eine höhere Strömungsgeschwindigkeit des Blutes. Diese quantitative Bewertung wurde mit immunhistochemischen Nachweis von SMA bestätigt. Es ist charakteristisch für die WT-Mäusen, die meisten der SMA im Gefäß Medien verlierender Spiralarterien von der Mitte der Schwangerschaft. Wenn dieser NK-Zell-gesteuerten Prozess nicht stattfindet, bleibt SMA in den Medien der Gefäße und kann leicht immunhistochemisch wie Ringe um die Blutgefäße (Abbildung 3) festgestellt werden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53534/53534fig1.jpg" /> Abbildung 1: Maus-Uterus bei gd9.5, schematische Übersicht Zeichnung, die die relativen Positionen des Uterushörner, Zervix (blau) und Hauptgebärmutterarterien (rot).. Angegeben ist jeweils die lange Achse des Uterushorns (Pfeile) und die Ligationspunkte (gestrichelte Pfeile). Die Abschnitte für die Immunhistochemie entlang der Sichtebene geschnitten. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53534/53534fig2.jpg" /> Abb. 2: stereo Beurteilung der arteriellen Umbau an der Mitte der Schwangerschaft (A) Beispiel assessment der luminalen und Gesamtgefäß Bereiche auf H &amp; E-gefärbten Schnitten von WT Frauen im mittleren 2/4 der Dezidua basalis (durch die vertikale schwarze abgegrenzt gestrichelte Linien) bei gd9.5. In den Gefäßen bei höherer Vergrößerung, gestrichelte rote Linie abgrenzt Gesamtgefäßfläche, gelb gestrichelte Linie abgrenzt Lumenfläche. Bar = 500 &amp; mgr; m (links), 50 &amp; mgr; m (rechts). Die lange Achse des Uterus ist eine horizontale Linie in dieser Ausrichtung. (B) Quantifizierung der luminalen Bereiche (links) und das Verhältnis von Lumenfläche insgesamt Gefäßfläche (rechts) von WT (C57BL / 6) und Rag2 - / - IL2RG - / - Mäuse (auf C57BL / 6 Hintergrund). Jeder Datenpunkt stellt den Mittelwert von 15 Messungen (5 Messungen pro Abschnitt 3 Abschnitte pro Implantationsstelle). Balken stellen von n = 11-13 Implantationsstellen aus 4 Schwangerschaften pro Gruppe bedeuten; p-Wert aus einem zweiseitigen, ungepaarten Mann-Whitney-Test. WT: Wildtyp. <img alt = &quot;3&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 53534 / 53534fig3.jpg&quot; /&gt; Abb. 3: Immunhistochemische Detektion von Glattmuskelaktin in der Dezidua basalis Vertreter SMA Färbung auf WT (oben) und Rag2 - / - IL2RG - / - Mäusen (auf C57BL / 6 Hintergrund, unten) an gd9.5. Bar = 100 &amp; mgr; m. WT: Wildtyp.

Dieses Protokoll beschreibt eine Technik zur Beurteilung von Veränderungen im mütterlichen Gefäßsystem während der Schwangerschaft bei Mäusen. Mit stereologischen Methoden wird der Umbau der dezidualen Spiralarterien quantitativ beurteilt und die Ergebnisse immunhistochemisch qualitativ bestätigt.

Beurteilung der Maternal Vascular Remodeling während der Schwangerschaft in der Gebärmutter Maus

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die für ein normales fetale und plazentares Wachstum während der Maus-Schwangerschaft notwendigen mütterlichen Gefäßveränderungen zu bewerten. Diese Methode eignet sich daher zur sorgfältigen Charakterisierung der mütterlichen Gefäßanpassungen, die während der Schwangerschaft auftreten, und diese Anpassungen können erhebliche Auswirkungen auf das fetale Wachstum haben. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie einen robusten und reproduzierbaren stereologischen Endpunkt liefert, der durch die Visualisierung des verbliebenen vaskulären glatten Muskelaktins mittels Immunhistochemie validiert werden kann.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die korrekte Präparationsorientierung des Uterusgewebes, die sich während der Schwangerschaft deutlich verändert, für den Erfolg dieses Verfahrens von zentraler Bedeutung ist. Am 9,5. Gestationstag führen Sie vorsichtig ein Stück Zahnseide unter ein Uterushorn einer schwangeren, zeitlich abgestimmten C57 Black Six-Maus nahe der Eierstöcke hindurch und binden die Seide sanft, aber fest zu, um die Uterusarterie zu ligieren. Wiederholen Sie die Ligatur unter dem anderen Horn und um den Gebärmutterhals, um ein Zusammenfallen der Arterien zu verhindern.Entfernen Sie dann schnell die gesamte Gebärmutter distal zu den drei Ligationsstellen an der Spitze der Gebärmutterhörner und am Gebärmutterhals. Legen Sie die Gebärmutter auf ein Stück Polystyrol, wobei beide Gebärmutterhörner entlang derselben langen Achse in entgegengesetzte Richtungen vom Gebärmutterhals aus ausgerichtet sind. Dehnen Sie das Gewebe dann vorsichtig mit zwei bis drei Nadeln der Größe 25 Gauge aus, um es durch Fixierung an Ort und Stelle zu halten.Das Polystyrol in einem 50-Milliliter-Konischgefäß eintauchen und das Uterusgewebe mit bis zu 50 Millilitern 10 % Formalin bei Raumtemperatur fixieren. Uterusgewebe ist sehr empfindlich und muss vor der Fixierung sorgfältig behandelt werden, um Schäden oder Einrisse zu vermeiden. Nach fünf bis sechs Stunden das Formalin durch 50 Milliliter PBS ersetzen und fünf Minuten lang waschen.Danach die Uterushörner an beiden Enden nahe den Ligaturpunkten sowie in der Mitte nahe dem zervikalen Ligaturpunkt präparieren. Überschüssiges Fettgewebe an den Implantationsstellen entfernen. Anschließend die Gebärmutter noch zweimal für jeweils fünf Minuten in PBS spülen, um letzte Reste von Formalin zu entfernen, und das Gewebe bei vier Grad Celsius in 70 %igem Ethanol mit einem automatisierten Verarbeitungssystem unter den in der Tabelle angegebenen Parametereinstellungen aufbewahren.Betten Sie die H&ouml;rner einzeln in Paraffin ein, sodass sie entlang der Ebene senkrecht zur langen Achse des Uterus geschnitten werden k&ouml;nnen. Es ist entscheidend, alle Proben in derselben Orientierung einzubetten, da dies gew&auml;hrleistet, dass bei der Schnittpr&auml;paration an den Einnistungstellen ein einheitliches Querschnittsprofil vorliegt. Nach dem Anfertigen von seriellen Schnitten mit einer Dicke von sieben Mikrometern an einem Mikrotom f&auml;rben Sie jeden siebten Schnitt alle 49 Mikrometer mit H&auml;matoxylin und Eosin und lagern die Schnitte bei Raumtemperatur f&uuml;r weitere nachgeschaltete Analysen.Um die Gefäßgröße und den Zustand der Gewebeumgestaltung an jedem Implantationsort zu beurteilen, wählen Sie drei Schnitte in 49-Mikrometer-Abständen aus, die nahe dem mittleren Sagittalebene liegen. Nach dem Scannen der ausgewählten Objektträger beschränken Sie die Analysen auf die mittleren beiden Viertel jedes Implantationsorts, um Venen auszuschließen. Zur Beurteilung der Lumengröße wählen Sie einen interessierenden Bereich entlang des inneren Gefäßrandes aus und notieren die Fläche dieses Bereichs, um die gesamte Gefäßgröße zu ermitteln.Zeichnen Sie einen interessierenden Bereich um die äußere Wand des Gefäßes herum, einschließlich der endothelialen Zellen, Parasiten und intramuralen Leukozyten. Messen Sie abschließend, darauf bedacht, dieselbe Arterie nicht mehrfach zu erfassen, jeweils dreifach an den fünf Gefäßen pro Implantationsstelle mit den größten und rundensten Lumina, die sich aufgrund des reduzierten Remodelings bei immundefizienten Rag-zwei-IL-zwei-Rezeptor-gamma-Ketten-Knockout-Mäusen ergeben. Diese Tiere weisen außerdem signifikant kleinere luminalen Oberflächenflächen auf, was auf insgesamt kleinere Gefäße hinweist, die mittels H-und-E-Färbung sichtbar gemacht werden können, wie hier für Wildtyp-Mäuse gezeigt, und stereologisch quantifiziert werden können.Außerdem ist das relative Gefäß-Lumen-Verhältnis in den Spiralarterien dieser Mäuse erhöht, was auf eine verminderte Blutversorgung und eine höhere Blutgeschwindigkeit bei immundefizienten Mäusen hindeutet. Die quantitative Bewertung dieses repräsentativen Experiments wurde durch immunhistochemische Nachweise von glattem Muskelaktin bestätigt, von dem der größte Teil in den Spiralarterien des Wildtyps zur Mitte der Tragzeit aus der vaskulären Media verloren geht. Falls dieser, von NK-Zellen gesteuerte Prozess jedoch nicht stattfindet, bleibt das glatte Muskelaktin in der Media der Gefäße erhalten und kann als braune ringförmige Färbung um die Blutgefäße herum nachgewiesen werden. Sobald die Schnitte vollständig vorbereitet sind, können die Messungen und die Validierung mittels Immunhistochemie innerhalb weniger Tage sinnvoll abgeschlossen werden, um die erforderliche Anzahl von Versuchstieren zu reduzieren.Dieses Protokoll kann mit anderen Techniken wie der Durchflusszytometrie kombiniert werden, um mütterliche Leukozytenpopulationen oder die Immunfunktion zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die mütterlichen vaskulären Anpassungen bewerten kann, die während der meisten Schwangerschaften auftreten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

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