Generieren von CRISPR / Cas9 Mediated monoallelic Löschungen Enhancer-Funktion in embryonalen Stammzellen der Maus zu studieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mithilfe einer allelespezifischen, durch CRISPR/Cas9 vermittelten Deletion die Regulation der Genexpression in embryonalen Stammzellen der Maus zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie ein Hybridgenom nutzt, um monoallelische Deletionen zu erzeugen und zu analysieren. Dadurch entfällt die Notwendigkeit, monoallelische, verstärkte Deletionen zu analysieren, die möglicherweise nicht lebensfähig sind.

Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen im Bereich der funktionellen Genomik zu beantworten. Zum Beispiel, welches Gen ein bestimmter Enhancer reguliert und inwieweit dieses Gen von einem einzelnen Enhancer für seine Aktivität abhängt. Obwohl diese Methode Einblicke in die Pluripotenz von Stammzellen ermöglichen kann, ist sie auch auf andere Systeme anwendbar.

Beispielsweise kann es uns helfen zu verstehen, wie sich Stammzellen verändern, um Neuronen, Blutzellen oder Muskelzellen zu werden. Nachdem der Entwurf, die Konstruktion und die Bestätigung der Sequenz der zu verwendenden Leit-RNA (gRNA) abgeschlossen sind, bereiten Sie die Transfektion endotoxinfreier Plasmide in ES-Zellen vor. Pelletieren Sie mit einem Zentrifugator 1 × 10⁶ F1-embryonale Stammzellen, die durch die Kreuzung von Mus musculus 129 mit Mus castaneus gewonnen wurden, in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen bei 300 × g für fünf Minuten.

Nach dem Zentrifugieren das Überstand verwerfen und 100 Mikroliter des von dem Kit-Hersteller bereitgestellten Resuspendierpuffers hinzufügen. Zur Löschung des Ziel-DNA-Abschnitts jeweils fünf Mikrogramm der P-Cas9-GFP-5'- und 3'-gRNA-Plasmide hinzufügen. Vorsichtig mit einer Pipette mischen.

Vermeiden Sie das Einführen von Luftblasen. Saugen Sie anschließend mit der elektronischen Pipettenspitze des Microporators 100 Mikroliter der Elektroporationsmischung auf und achten Sie darauf, keine Luft in die Spitze aufzunehmen. Stecken Sie danach die Pipette in das Transfektionsgerät.

Wählen Sie das geeignete Protokoll aus und drücken Sie auf Start. Während die Elektroporation läuft, beobachten Sie die Spitze. Bei korrekter Einrichtung sollten kleine Bläschen von der Röhrenelektrode austreten.

Ein Funke weist auf das Vorhandensein einer Luftblase hin und stört die Transfektion. Tritt dies auf, muss die Elektroporation mit einer neuen Zellprobe wiederholt werden. Nach der Elektroporation die transfizierten Zellen in eine zehn Zentimeter große, mit Gelatine beschichtete Petrischale abgeben, die zehn Milliliter ES-Zellmedium enthält.

Inkubieren Sie die transfizierten Zellen bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid. Verwenden Sie nach 48 Stunden einen Durchflusszytometer, um die cast nine GFP-positiven ES-Zellen zu sortieren und zu isolieren. Füttern Sie dann 1 bis 1,5 mal 10 hoch vier GFP-positive Zellen in eine 10 Zentimeter große, mit Gelatine beschichtete Petrischale, die 10 Milliliter ES-Zellmedium enthält.

Das Ausplattieren bei dieser geringen Dichte erleichtert das Aufnehmen einzelner ES-Zellkolonien. Vier bis fünf Tage später einzelne, kugelförmige Kolonien aus einzelnen ES-Zellen mit einem Mikroskop identifizieren. Jede Kolonie mithilfe einer Pipette in eine Vertiefung einer mit Gelatine vorbehandelten 96-Well-Platte überführen, die 30 Mikroliter Tripsom enthält.

Nachdem alle Kolonien aufgenommen und in Medium aufgelöst wurden, kultivieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius im Kohlendioxid-Inkubator, bis die meisten Vertiefungen über 70 % konfluent sind. Dies dauert gewöhnlich etwa zwei Tage. Wenn die Zellen zum Teilen bereit sind, entfernen Sie das Medium und geben Sie 30 Mikroliter Trypsin hinzu.

Inkubieren Sie die Zellen fünf Minuten lang. Geben Sie dann 180 Mikroliter ES-Zellmedium in jede Vertiefung, um das Tripsom zu neutralisieren. Pipettieren Sie mehrmals auf und ab, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten.

Überführen Sie aus jedem Well 70 Mikroliter in jeweils drei mit Gelatine beschichtete 96-Well-Platten, die in jedem Well 130 Mikroliter ES-Zellmedium enthalten. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius. Sobald die Platten 70 bis 85 % Konfluenz erreicht haben, verwenden Sie sie zur Genotypisierung und Expressionsanalyse jedes Klons, wie in den folgenden Abschnitten beschrieben.

Tiefgefrieren Sie die Zellbestände wie in dem begleitenden Dokument beschrieben. Hier werden vier Primer-Sets entworfen, um die Klone auf die gewünschte Deletion zu screenen. Dazu gehören: innere Primer, äußere Primer sowie gRNA-flankierende Primer für beide 5'- und 3'-gRNA-Zielstellen.

Beginnen Sie damit, die hier gezeigte Website aufzurufen, um die Single-Nucleotide-Polymorphismus- oder Snip-Tracks der 129- und Cas-Genotypen zu erhalten. Dies führt zur CRISPR-Webseite des Mitchell-Labors. Klicken Sie dort auf den angegebenen Link.

Die Seite wird zur UCSC-Genom-Browser weiterleiten, der die Spur mit den SNPs zwischen den 129- und Cas-Genomen in der MM-9-Maus-Genom-Assembly enthält. Geben Sie als Nächstes die Koordinaten des zu löschenden Bereichs ein und klicken Sie auf „Go“. Vergrößern Sie einen Bereich von etwa 500 Basenpaaren in der Mitte der gewünschten Deletion, der mehr als drei SNPs enthält.

Der Entwurf allelespezifischer Primer kann kompliziert sein, wenn SNPs selten sind. Falls es nicht möglich ist, absolut allelespezifische Primer zu entwerfen, können moderate allelespezifische Primer verwendet werden. Denken Sie jedoch daran, die CT-Werte zwischen den deletierten und nicht-deletierten Klonen bei der Analyse der qPCR-Ergebnisse zu vergleichen.

Klicken Sie nun im oberen Bereich auf „Ansicht“. Wählen Sie in dem Dropdown-Menü DNA aus. Die Seite „DNA abrufen im Fenster“ wird angezeigt.

Wählen Sie in den Sequenzformatierungsoptionen „alles in Großbuchstaben“ und klicken Sie dann auf „Get DNA“, um die Zielsequenz in ausschließlich Großbuchstaben anzuzeigen. Kopieren Sie diese Sequenz und fügen Sie sie in eine Word-Dokumentdatei ein. Vergleichen Sie anschließend die Sequenz mit der 129-cast-Snip-Spur, markieren Sie die Snip-Positionen durch Hervorhebung und kennzeichnen Sie die 129-Snips mit Kleinbuchstaben.

Wenn Sie mit der 129-Sequenz fertig sind, kopieren Sie sie, um zwei im Fastq-Format vorliegende Sequenzen zu erstellen: eine für 129 und eine für Cas. Ersetzen Sie in der Cas-Sequenz an jeder Schnittstelle die korrekte Base und kennzeichnen Sie den Schnitt mit einem Kleinbuchstaben.

Als Nächstes beschriften Sie die Sequenz mit ihrem entsprechenden Genom, 129 oder Cas. Geben Sie dann im Browser die Adresse für Primer3Plus ein. Fügen Sie im entsprechenden Bereich die ausgetauschte 129-Sequenz ein.

Verwenden Sie die Standardeinstellungen, um die Primer zu entwerfen. Um die innen liegenden allelespezifischen Primer zu entwerfen, klicken Sie auf das Dropdown-Menü rechts neben „Task“ und wählen Sie „Primer List“, dann klicken Sie auf „Pick Primers“. Eine neue Seite öffnet sich und zeigt eine Liste von vorwärts- und rückwärtsgerichteten Primern an.

Wählen Sie das Kontrollkästchen aus, um einen Vorwärts- oder Rückwärtsprimer auszuwählen, bei dem eine SNIP durch einen Kleinbuchstaben entweder am 3'-Ende oder innerhalb von vier Basen zum 3'-Ende hin markiert ist. Beachten Sie, dass Primer mit einer SNIP am 3'-Ende eine erhöhte Allelspezifität während der qPCR aufweisen. Klicken Sie unten auf dem Bildschirm auf „Senden an Primer3-Manager“.

Es öffnet sich eine neue Seite, auf der der ausgewählte Primer angezeigt wird. Um den zweiten Primer auszuwählen, kehren Sie zur Seite mit der Primerliste zurück und klicken Sie auf den Zurück-Button, um zur Hauptseite zu gelangen. Wählen Sie im Aufgaben-Auswahlfeld die Option Nachweis aus.

Die Hauptseite wird aktualisiert und unten erscheint ein Feld für die linke und rechte Primersequenz. Fügen Sie die erste Primersequenz in das entsprechende Feld ein. Navigieren Sie anschließend zum Reiter „Allgemeine Einstellungen“ neben dem Reiter „Haupt“ und ändern Sie die Einstellung für den Produktgrößenbereich auf 80 bis 200 Basenpaare.

Klicken Sie auf „Primern auswählen“. Eine Seite öffnet sich, die fünf mögliche Primer-Paare für die erste Primer-Sequenz anzeigt. Wählen Sie einen Primer-Satz aus der Liste der Primer-Paare aus, indem Sie die Kästchen links neben den Primern ankreuzen, und klicken Sie dann unten auf der Seite auf „An Primer3-Manager senden“. Dies sind die 129 innenliegenden allelespezifischen Primer.

Wiederholen Sie diese Schritte, um Primer für das Cast-Allel zu entwerfen. Wenden Sie diese Technik anschließend auf den Entwurf von außen liegenden allelspezifischen und nicht allelspezifischen Primern an. Testen Sie schließlich die Primer auf Allelspezifität mittels qPCR, wie in dem begleitenden Dokument beschrieben.

Extrahieren Sie die genomische DNA aus der zuvor vorbereiteten 96-Well-Platte. Zentrifugieren Sie die Platte kurz, um eventuelle Kondensationsflüssigkeit am Boden der Wells zu sammeln. Diese DNA dient als Vorlage für die Deletionsanalyse.

Als Nächstes führen Sie auf einer 384-Well-Platte eine qPCR in Duplikat für jeden Klon durch. Verwenden Sie eine zweistufige PCR, gefolgt von einer Schmelzkurvenanalyse mit Detektion. Überprüfen Sie nach Beendigung des Laufs zunächst jede Allelverstärkung mit den innen liegenden, allelspezifischen Primern.

Keine Amplifikation eines Allels oder CT-Wert-Unterschiede von mehr als fünf Zyklen zwischen den Allelen deuten darauf hin, dass diese Klone eine heterozygote Deletion tragen. Die fehlende Amplifikation beider Allele deutet darauf hin, dass sie eine homozygote Deletion tragen. Überprüfen Sie anschließend jedes Allel mittels der außen liegenden, allelspezifischen Primer auf Amplifikation.

Wenn die Zieldeletion größer als ein KB ist, erfolgt die Amplifikation mit äußeren Primern nur, wenn eine Deletion vorliegt. Ein CT-Wert zwischen 22 und 28 bestätigt die Deletion. Bei Zieldeletionen kleiner als ein KB bestätigen Sie die Amplikon-Größe mittels Elektrophorese.

Eine 96-Well-Platte mit Deletionsklonen wurde mittels qPCR unter Verwendung allelespezifischer interner Primer untersucht. Graue Balken zeigen die Amplifikation mit Cas-spezifischen Primern, schwarze Balken die Amplifikation mit 129-spezifischen Primern an. Ein niedriger CT-Wert oder kein Amplifikationssignal mit den internen Primern weist auf eine Ziel-Deletion hin.

Klone mit einer Deletion an einem oder beiden Allelen werden anschließend mit den äußeren Primersequenzen untersucht. Die Amplifikation mit den äußeren Primern bestätigt die Deletion. Klone mit einer monoallelischen Deletion werden mittels Primersequenzen, die die gRNA-Zielregion flankieren, analysiert, um das Fehlen von Insertionen oder Deletionen – sogenannten Indels – auf dem nicht-deletierten Allel zu bestätigen.

Nur monoallelische Klone ohne große Indels an den Zielstellen auf dem nicht-deletierten Allel werden in der anschließenden Expressionsanalyse verwendet. Hier dargestellt sind repräsentative Ergebnisse von 129- oder Cas-SCR-deletierten Klonen. Der SCR ist ein kürzlich beschriebener, Sox2-spezifischer Enhancer in ES-Zellen.

Rote Balken stellen die Expression des Sox2-Cas-Allels dar und blaue Balken die Amplifikation des Sox2-129-Allels. Wie anhand dieser Abbildung ersichtlich ist, führte die Deletion des SCR auf dem 129- oder Cas-Allel zu einer verminderten Expression von Sox2 in CIS. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man mithilfe der CRISPR-Technologie eine große Deletion erzeugt und allelespezifische Primer verwendet, um die Genotypisierung Ihrer deletierten Klone durchzuführen.