Name: Generieren von CRISPR / Cas9 Mediated monoallelic Löschungen Enhancer-Funktion in embryonalen Stammzellen der Maus zu studieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Erfahren Sie, wie CRISPR/Cas9-vermittelte Deletionen in Maus-embryonalen Stammzellen genutzt werden, um Enhancer-Funktionen und allelspezifische Genregulation zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht präzise funktionale Genomanalysen.

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Wir möchten uns bei allen Mitgliedern des Mitchell-Labors für hilfreiche Diskussionen bedanken. Diese Arbeit wurde von den Canadian Institutes of Health Research, der Canada Foundation for Innovation und dem Ministerium für Forschung und Innovation von Ontario unterstützt (Betriebs- und Infrastrukturzuschüsse im Besitz von JAM).

<ol><li>Sagai, T., Hosoya, M., Mizushina, Y., Tamura, M., Shiroishi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+a+long-range+cis-regulatory+module+causes+complete+loss+of+limb-specific+Shh+expression+and+truncation+of+the+mouse+limb%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Elimination of a long-range cis-regulatory module causes complete loss of limb-specific Shh expression and truncation of the mouse limb.</a> Development. 132 (4), 797-803 (2005).</li>
<li>Kleinjan, D. A., Lettice, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+gene+control+and+genetic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Genet%22%5BJournal%5D)">Long-range gene control and genetic disease.</a> Adv Genet. 61, 339-388 (2008).</li>
<li>Visel, A., Rubin, E. M., Pennacchio, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+views+of+distant-acting+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genomic views of distant-acting enhancers.</a> Nature. 461 (7261), 199-205 (2009).</li>
<li>Maurano, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+localization+of+common+disease-associated+variation+in+regulatory+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA.</a> Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).</li>
<li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modifications+at+human+enhancers+reflect+global+cell-type-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression.</a> Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).</li>
<li>Shen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+map+of+the+cis-regulatory+sequences+in+the+mouse+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A map of the cis-regulatory sequences in the mouse genome.</a> Nature. 488 (7409), 116-120 (2012).</li>
<li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).</li>
<li>Whyte, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Master+transcription+factors+and+mediator+establish+super-enhancers+at+key+cell+identity+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes.</a> Cell. 153 (2), 307-319 (2013).</li>
<li>Chen, C. Y., Morris, Q., Mitchell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+identification+in+mouse+embryonic+stem+cells+using+integrative+modeling+of+chromatin+and+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Enhancer identification in mouse embryonic stem cells using integrative modeling of chromatin and genomic features.</a> BMC Genomics. 13 (1), 152(2012).</li>
<li>Patwardhan, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+functional+dissection+of+mammalian+enhancers+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Massively parallel functional dissection of mammalian enhancers in vivo.</a> Nat Biotechnol. 30 (3), 265-270 (2012).</li>
<li>Melnikov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+dissection+and+optimization+of+inducible+enhancers+in+human+cells+using+a+massively+parallel+reporter+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay.</a> Nat Biotechnol. 30 (3), 271-277 (2012).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).</li>
<li>Cho, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+off-target+effects+of+CRISPR%2FCas-derived+RNA-guided+endonucleases+and+nickases%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases.</a> Genome Res. 24 (1), 132-141 (2014).</li>
<li>Zhou, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Sox2+distal+enhancer+cluster+regulates+embryonic+stem+cell+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A Sox2 distal enhancer cluster regulates embryonic stem cell differentiation potential.</a> Genes Dev. 28 (24), 2699-2711 (2014).</li>
<li>Fujii, W., Kawasaki, K., Sugiura, K., Naito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+large-scale+genome-modified+mice+using+gRNA+and+CAS9+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of large-scale genome-modified mice using gRNA and CAS9 endonuclease.</a> Nucleic Acids Res. 41 (20), e187(2013).</li>
<li>Tuan, D. Y., Solomon, W. B., London, I. M., Lee, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+erythroid-specific%2C+developmental-stage-independent+enhancer+far+upstream+of+the+human+%27beta-like+globin%27+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An erythroid-specific, developmental-stage-independent enhancer far upstream of the human 'beta-like globin' genes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (8), 2554-2558 (1989).</li>
<li>Amano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+dynamics+at+the+Shh+locus%3A+limb+bud-specific+differential+regulation+of+competence+and+active+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Chromosomal dynamics at the Shh locus: limb bud-specific differential regulation of competence and active transcription.</a> Dev Cell. 16 (1), 47-57 (2009).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+reveals+a+distal+super-enhancer+required+for+Sox2+expression+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">CRISPR reveals a distal super-enhancer required for Sox2 expression in mouse embryonic stem cells.</a> PLoS One. 9 (12), e114485(2014).</li>
<li>Canver, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+genomic+deletion+efficiency+mediated+by+clustered+regularly+interspaced+palindromic+repeats+%28CRISPR%29%2FCas9+nuclease+system+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of genomic deletion efficiency mediated by clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 nuclease system in mammalian cells.</a> J Biol Chem. 289 (31), 21312-21324 (2014).</li>
<li>Mlynarczyk-Evans, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X+chromosomes+alternate+between+two+states+prior+to+random+X-inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">X chromosomes alternate between two states prior to random X-inactivation.</a> PLoS Biol. 4 (6), e159(2006).</li>
<li>Lefever, S., Pattyn, F., Hellemans, J., Vandesompele, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleotide+polymorphisms+and+other+mismatches+reduce+performance+of+quantitative+PCR+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Single-nucleotide polymorphisms and other mismatches reduce performance of quantitative PCR assays.</a> Clin Chem. 59 (10), 1470-1480 (2013).</li>
<li>Huang, M. M., Arnheim, N., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extension+of+base+mispairs+by+Taq+DNA+polymerase%3A+implications+for+single+nucleotide+discrimination+in+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Extension of base mispairs by Taq DNA polymerase: implications for single nucleotide discrimination in PCR.</a> Nucleic Acids Res. 20 (17), 4567-4573 (1992).</li>
<li>Keane, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+genomic+variation+and+its+effect+on+phenotypes+and+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mouse genomic variation and its effect on phenotypes and gene regulation.</a> Nature. 477 (7364), 289-294 (2011).</li>
<li>Yalcin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-based+characterization+of+structural+variation+in+the+mouse+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sequence-based characterization of structural variation in the mouse genome.</a> Nature. 477 (7364), 326-329 (2011).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+synthesis+of+the+mouse+mitochondrial+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome.</a> Nat Methods. 7 (11), 901-903 (2010).</li>
<li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+efficiency+of+human+pluripotent+stem+cell+genome+editing+through+replacing+TALENs+with+CRISPRs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs.</a> Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> J Vis Exp. (41), (2010).</li>
<li>Forlenza, M., Kaiser, T., Savelkoul, H. F., Wiegertjes, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+real-time+quantitative+PCR+for+the+analysis+of+cytokine+mRNA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The use of real-time quantitative PCR for the analysis of cytokine mRNA levels.</a> Methods Mol Biol. 820, 7-23 (2012).</li>
<li>Wu, J. H., Hong, P. Y., Liu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+effects+of+position+and+type+of+single+mismatch+on+single+base+primer+extension%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative effects of position and type of single mismatch on single base primer extension.</a> J Microbiol Methods. 77 (3), 267-275 (2009).</li>
<li>Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long-range+interaction+landscape+of+gene+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The long-range interaction landscape of gene promoters.</a> Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren haben JoVE Politik über Interessenkonflikte und haben keine Konflikte lesen offen zu legen.

CRISPR / Cas9 vermittelte Genome Editing-Technologie bietet eine einfache, schnelle und kostengünstige Methode für die Genommodifikation. Die Methode, die hier detailliert zu erzeugen und monoallelic Enhancer Deletion für die funktionelle Charakterisierung Enhancer nimmt in F1 Mauszellen Vorteil von SNPs analysieren. Die Vorteile dieser Art von Ansatz sind: 1) monoallelic Enhancer Deletionen produzieren keine Verwechselung Wirkungen , die auftreten , wenn ein kritischer Enhancer aus beiden Allelen deletiert ist, dh<...

Transkriptions - Regulationselemente sind entscheidend für die räumlich-zeitliche Feinabstimmung der Genexpression während der Entwicklung 1 und Modifikation dieser Elemente in Krankheits 2 aufgrund aberrant Genexpression führen kann. Viele krankheitsassoziierten Regionen durch genomweite Assoziationsstudien identifiziert sind in nicht-kodierenden Regionen und verfügen über Funktionen von Transkriptionsverstärker 3-4. Identifizieren Enhancer und passender sie mit den Genen regulieren sie ist kompliziert , da sie oft mehrere Kilobasen entfernt von den Genen liegen sie regulieren und kann 5-6 in einer gewebespezifischen Weise aktiviert werden. Enhancer Prognosen werden auf Histonmodifikation Marken, Mediator-cohesin Komplexe häufig basiert und Bindung von zelltypspezifischen Transkriptionsfaktoren 7-10. Validierung des vorhergesagten Verstärker wird am häufigsten durch einen vektorbasierten Assay durchgeführt , in dem der Verstärker 11-12 Expression eines Reportergens aktiviert. Diese Daten liefern valuable Informationen über das regulatorische Potential mutmaßlicher Enhancer-Sequenzen, aber nicht offenbaren ihre Funktion in ihrer endogenen genomischen Kontext oder zu identifizieren, die Gene, die sie regulieren. Genome Bearbeitung dient als leistungsfähiges Werkzeug, um die Funktion von Transkriptionsregulationselemente in ihrer endogenen Zusammenhang mit loss-of-function-Analyse zu untersuchen. Jüngste Fortschritte in der Genombearbeitung, nämlich die CRISPR / Cas9 Genom Editing-System, ermöglichen die Untersuchung der Genomfunktion. Der CRISPR / Cas9 System ist einfach zu bedienen und anpassungsfähig für viele biologische Systeme. Das Cas9 Protein wird durch eine Führungs RNA (gRNA) 13 in das Genom an einer bestimmten Stelle ausgerichtet sind . Der SpCas9 / gRNA Komplex durchsucht das Genom für seine Ziel genomischen Sequenz , die 5 &#39;angrenzend Motiv (PAM) Sequenz, NGG 14-15 zu einem protospacer sein muss. Basenpaarung der gRNA zu seinem Ziel, eine 20 Nukleotid (nt) Sequenz, die komplementär zu der gRNA aktiviert SpCas9 Aktivität Nuklease in einem Doppe ergebe Strangbruch (DSB) 3 bp stromaufwärts der PAM-Sequenz. Die Spezifität wird durch vollständige Basenpaarung in der Seed-Region gRNA erreicht, die 6-12 nt neben dem PAM; Umgekehrt Mismatches 5 &#39;des Saatgutes werden üblicherweise 16-17 toleriert. Das eingeführte DSB repariert werden können, entweder durch die nicht-homologen Endverbindung (NHEJ) DNA-Reparatur oder Homologie gerichteten Reparatur (HDR) mechanisms.NHEJ DNA-Reparatur oft Einfügen / Löschen (indels) von wenigen bp an der Zielstelle erzeugt, die stören können der offene Leserahmen (ORF) eines Gens. Um größere Deletionen im Genom zwei gRNAs erzeugen, welche die Region von Interesse flankieren, können 18-19 verwendet werden. Dieser Ansatz ist besonders nützlich für die Untersuchung der transkriptionalen Enhancer geclustert in Locus - Kontrollregionen oder super-Enhancer , die größer sind als herkömmliche Enhancer 9,18,20-22. Monoallelic Streichungen sind ein wertvolles Modell für cis -Regelung der Transkription zu studieren. Die beobachtete change in Transkriptebene nach monoallelic Deletion eines Enhancers korreliert mit der Stellung dieser Enhancer in Genregulation ohne die verwirrende Wirkungen, die potenziell Zell fitness Beeinflussung beeinträchtigt wird, wenn die Transkription von beiden Allelen auftreten können. reduzierte Expression Auswertung ist schwierig, jedoch ohne die Fähigkeit, die gelöscht aus dem Wildtyp-Allel zu unterscheiden. Weiterhin ohne die Fähigkeit , an jedem Allel - Deletionen Genotypisierung die beiden Allele zu unterscheiden , ist eine Herausforderung, insbesondere für große Deletionen von&gt; 10 kb bis 1 Mb 23 , in dem es schwierig ist, die gesamte Wildtyp - Region durch PCR zu amplifizieren. Die Verwendung von F1 - ES - Zellen erzeugt durch Kreuzen Mus musculus 129 mit Mus castaneus können die zwei Allele durch allelspezifische PCR 18,24 unterscheiden. Das Hybrid-Genom in diesen Zellen erleichtert Allel-spezifische Deletion Screening und Expressionsanalyse. Im Durchschnitt gibt es eine SNP alle 125 bp zwischen diesen beiden GenomeFlexibilität für den Ausdruck und die Genotypisierung in Primer-Design, Untersuchungen. Die Anwesenheit eines SNP können die Primer Schmelztemperatur (T m) beeinflussen und Zielspezifität in real-time quantitative PCR (qPCR) Amplifikation unter Berücksichtigung Unterscheidung der beiden Allele 25. Weiterhin ist ein Mismatch innerhalb des Endes des Primers &#39;3 beeinflußt stark die Fähigkeit der DNA - Polymerase aus dem Primer verhindert Amplifikation des Allels unerwünschten Ziel 26 zu erstrecken. Beschrieben in dem folgenden Protokoll ist die Verwendung von F1 - ES - Zellen für die Allel - spezifische Enhancer - Deletionen von mehr als 1 kb und anschließende Expressionsanalyse unter Verwendung des CRISPR / Cas9 Genom Editiersystem (Abbildung 1). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53552/53552fig1.jpg" /> Abbildung 1. Enhancer Löschen mit CRISPR / Cas9 cis -REG zu studierenulation der Genexpression. (A) F1 ES durch eine Kreuzung zwischen Mus musculus sind 129 und Mus castaneus erzeugten Zellen für Allel - spezifische Löschen zu ermöglichen. (B) Zwei Führungs RNAs (gRNA) verwendet , um eine große Cas9-vermittelte Deletion des Enhancer - Region zu induzieren. (C) werden Primer - Sets verwendet , um große mono- und bi-allelische Deletionen zu identifizieren. Die orangefarbenen Primer sind die inneren Primer sind die lila Primer die äußeren Primer und die grünen Primer werden die gRNA flankierenden Primer. (D) Änderungen in der Genexpression verwenden allelspezifischen qPCR überwacht. RFU bezeichnet relative Fluoreszenzeinheiten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53552/53552fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53552/53552fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

<table><tbody><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td>High-Fidelity-DNA-Polymerase für die gRNA-Assemblierung</td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2611L</td><td></td></tr><tr><td>gRNA_Cloning Vector</td><td>Addgene</td><td>41824</td><td>In diesen Vektor wird eine Zielsequenz kloniert, um das gRNA-Plasmid</td></tr><tr><td>pCas9_GFP</td><td>Addgene</td><td>44719</td><td>Codon-optimiertes SpCas9 und EGFP zu erzeugen Co-Expressions-Plasmid</td></tr><tr><td>AflII</td><td>NEB</td><td>R0520S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>NEB</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>Neon-Transfektionssystem 100 & micro; L Kit</td><td>Life Technologies</td><td>MPK10096</td><td>Microporator Transfektionstechnologie</td></tr><tr><td>prepGEM</td><td>ZyGEM</td><td>PT10500</td><td>Reagenz zur genomischen DNA-Extraktion</td></tr><tr><td>Nucleo Spin Gel & PCR-Aufreinigung</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.5</td><td></td></tr><tr><td>Hochgeschwindigkeits-Plasmid-Mini-Kit</td><td>Geneaid</td><td>PD300</td><td></td></tr><tr><td>Maxi-Plasmid-Kit Endotoxin-frei&nbsp;</td><td>Geneaid</td><td>PME25</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Select Mix für CFX</td><td>Life Technologies</td><td>4472942</td><td>qPCR-Reagenz</td></tr><tr><td>iScript cDNA-Synthesekit</td><td>Bio-rad</td><td>170-8891</td><td>Reverse Transkriptionsreagenz</td></tr><tr><td>0,25% Trypsin mit EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>PBS ohne Ca/Mg2+</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Bioshop</td><td>EDT111.500</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>13630080 BSA-Fraktion</td><td></td></tr><tr><td>V (7,5%)</td><td>Life Technologies</td><td>15260037</td><td></td></tr><tr><td>Max Efficiency DH5&alpha; kompetente Zellen</td><td>Invitrogen</td><td>18258012</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ES-Zellen qualifiziert</td><td></td><td>FBS wird zuvor in ES-Zellen der Maus auf Pluripotenz getestet</td></tr>: <tr><td>DMSO</td>, <td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr>, <tr><td>Glutamax</td>, <td>Invitrogen</td><td>35050</td><td></td></tr>, <tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11960069</td><td></td></tr><tr><td>Pencillin/Streptomycin</td>, <td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr>, <tr><td>Natriumpyruvat</td>, <td>Invitrogen</td><td>11360</td><td></td></tr>, <tr><td>Nicht essentiell aminosäure</td><td>Invitrogen</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platte</td><td>Sarstedt</td><td>83.3924</td><td></td></tr><tr><td>Dichtband</td><td>Sarstedt</td><td>95.1994</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell LX</td><td>Biocision</td><td>BCS-405</td><td>alkoholfreier Zellgefrierbehälter</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Biovision</td><td>1748-5</td><td>Inhibitor für F1 ES-Zellkultur</td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Invivogen</td><td>inh-pd32</td><td>Inhibitor für F1 ES-Zellkultur</td></tr><tr><td>LIF</td><td>Chemicon</td> ESG1107 <td>Inhibitor für F1 ES-Zellkultur</td><td></td></tr></tbody></table>

generieren von crispr / cas9 mediated monoallelic löschungen enhancer-funktion in embryonalen stammzellen der maus zu studieren

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Enhancer steuern die Zellidentität, indem sie die gewebespezifische Genexpression positions- und orientierungsunabhängig regulieren. Diese Enhancer befinden sich oft distal vom regulierten Gen in intergenen Regionen oder sogar im Körper eines anderen Gens. Die positionsunabhängige Natur der Enhancer-Aktivität macht es schwierig, Enhancer mit den Genen in Einklang zu bringen, die sie regulieren. Die Deletion einer Enhancer-Region liefert einen direkten Beweis für die Enhancer-Aktivität und ist der Goldstandard, um die Rolle eines Enhancers bei der endogenen Gentranskription aufzudecken. Herkömmliche homologe rekombinationsbasierte Deletionsmethoden wurden durch die jüngsten Fortschritte in der Genome-Editing-Technologie übertroffen, die schnelle und präzise lokalisierte Veränderungen an den Genomen zahlreicher Modellorganismen ermöglichen. Die CRISPR/Cas9-vermittelte Genomeditierung kann verwendet werden, um das Genom in vielen Zelltypen und Organismen schnell und kostengünstig zu manipulieren, da Cas9 durch eine Leit-RNA aus einem maßgeschneiderten Expressionsplasmid leicht auf das Genom ausgerichtet werden kann. Die homozygote Deletion essentieller genregulatorischer Elemente könnte zur Letalität führen oder den zellulären Phänotyp verändern, während die monoallelische Deletion von Transkriptionsverstärkern die Untersuchung der cis-Regulation der Genexpression ohne dieses verwirrende Problem ermöglicht. Hier wird ein Protokoll für die CRISPR/Cas9-vermittelte Deletion in embryonalen Stammzellen (ES) der Maus (Mus musculus129 x Mus castaneus) vorgestellt. Die monoallelische Deletion, das Screening und die Expressionsanalyse werden durch Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNP) zwischen den beiden Allelen erleichtert, die in diesen Zellen durchschnittlich alle 125 bp auftreten.

Das hier beschriebene Protokoll verwendet Zellen F1 ES cis -Regelung der Genexpression in monoallelic Enhancer deletiert Zellen zu untersuchen CRISPR / Cas9 Genom Bearbeitung (Figur 1) erzeugt. Die gRNA und Allel-spezifische Primer-Design für die Genotypisierung und der Genexpression sind die Schlüsselfaktoren in diesem Ansatz. Jedes Allel-spezifische Primer-Set muss von qPCR validiert werden Allel-Spezifität zu bestätigen. Allelspezifischen Primer , die nur ihr...

Die experimentelle Validierung der Enhancer-Aktivität erfolgt am besten durch eine Funktionsverlustanalyse. Hier wird ein effizientes Protokoll vorgestellt, das die CRISPR/Cas9-vermittelte Deletion verwendet, um die allelspezifische Regulation der Gentranskription in F1-ES-Zellen zu untersuchen, die ein Hybridgenom (Mus musculus129 x Mus castaneus) enthalten.

Generieren von CRISPR / Cas9 Mediated monoallelic Löschungen Enhancer-Funktion in embryonalen Stammzellen der Maus zu studieren

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mithilfe einer allelespezifischen, durch CRISPR/Cas9 vermittelten Deletion die Regulation der Genexpression in embryonalen Stammzellen der Maus zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie ein Hybridgenom nutzt, um monoallelische Deletionen zu erzeugen und zu analysieren. Dadurch entfällt die Notwendigkeit, monoallelische, verstärkte Deletionen zu analysieren, die möglicherweise nicht lebensfähig sind.Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen im Bereich der funktionellen Genomik zu beantworten. Zum Beispiel, welches Gen ein bestimmter Enhancer reguliert und inwieweit dieses Gen von einem einzelnen Enhancer für seine Aktivität abhängt. Obwohl diese Methode Einblicke in die Pluripotenz von Stammzellen ermöglichen kann, ist sie auch auf andere Systeme anwendbar.Beispielsweise kann es uns helfen zu verstehen, wie sich Stammzellen verändern, um Neuronen, Blutzellen oder Muskelzellen zu werden. Nachdem der Entwurf, die Konstruktion und die Bestätigung der Sequenz der zu verwendenden Leit-RNA (gRNA) abgeschlossen sind, bereiten Sie die Transfektion endotoxinfreier Plasmide in ES-Zellen vor. Pelletieren Sie mit einem Zentrifugator 1 × 10⁶ F1-embryonale Stammzellen, die durch die Kreuzung von Mus musculus 129 mit Mus castaneus gewonnen wurden, in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen bei 300 × g für fünf Minuten.Nach dem Zentrifugieren das Überstand verwerfen und 100 Mikroliter des von dem Kit-Hersteller bereitgestellten Resuspendierpuffers hinzufügen. Zur Löschung des Ziel-DNA-Abschnitts jeweils fünf Mikrogramm der P-Cas9-GFP-5'- und 3'-gRNA-Plasmide hinzufügen. Vorsichtig mit einer Pipette mischen.Vermeiden Sie das Einführen von Luftblasen. Saugen Sie anschließend mit der elektronischen Pipettenspitze des Microporators 100 Mikroliter der Elektroporationsmischung auf und achten Sie darauf, keine Luft in die Spitze aufzunehmen. Stecken Sie danach die Pipette in das Transfektionsgerät. Wählen Sie das geeignete Protokoll aus und drücken Sie auf Start. Während die Elektroporation läuft, beobachten Sie die Spitze. Bei korrekter Einrichtung sollten kleine Bläschen von der Röhrenelektrode austreten.Ein Funke weist auf das Vorhandensein einer Luftblase hin und stört die Transfektion. Tritt dies auf, muss die Elektroporation mit einer neuen Zellprobe wiederholt werden. Nach der Elektroporation die transfizierten Zellen in eine zehn Zentimeter große, mit Gelatine beschichtete Petrischale abgeben, die zehn Milliliter ES-Zellmedium enthält.Inkubieren Sie die transfizierten Zellen bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid. Verwenden Sie nach 48 Stunden einen Durchflusszytometer, um die cast nine GFP-positiven ES-Zellen zu sortieren und zu isolieren. Füttern Sie dann 1 bis 1,5 mal 10 hoch vier GFP-positive Zellen in eine 10 Zentimeter große, mit Gelatine beschichtete Petrischale, die 10 Milliliter ES-Zellmedium enthält.Das Ausplattieren bei dieser geringen Dichte erleichtert das Aufnehmen einzelner ES-Zellkolonien. Vier bis fünf Tage später einzelne, kugelförmige Kolonien aus einzelnen ES-Zellen mit einem Mikroskop identifizieren. Jede Kolonie mithilfe einer Pipette in eine Vertiefung einer mit Gelatine vorbehandelten 96-Well-Platte überführen, die 30 Mikroliter Tripsom enthält. Nachdem alle Kolonien aufgenommen und in Medium aufgelöst wurden, kultivieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius im Kohlendioxid-Inkubator, bis die meisten Vertiefungen über 70 % konfluent sind. Dies dauert gewöhnlich etwa zwei Tage. Wenn die Zellen zum Teilen bereit sind, entfernen Sie das Medium und geben Sie 30 Mikroliter Trypsin hinzu.Inkubieren Sie die Zellen fünf Minuten lang. Geben Sie dann 180 Mikroliter ES-Zellmedium in jede Vertiefung, um das Tripsom zu neutralisieren. Pipettieren Sie mehrmals auf und ab, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten.Überführen Sie aus jedem Well 70 Mikroliter in jeweils drei mit Gelatine beschichtete 96-Well-Platten, die in jedem Well 130 Mikroliter ES-Zellmedium enthalten. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius. Sobald die Platten 70 bis 85 % Konfluenz erreicht haben, verwenden Sie sie zur Genotypisierung und Expressionsanalyse jedes Klons, wie in den folgenden Abschnitten beschrieben.Tiefgefrieren Sie die Zellbestände wie in dem begleitenden Dokument beschrieben. Hier werden vier Primer-Sets entworfen, um die Klone auf die gewünschte Deletion zu screenen. Dazu gehören: innere Primer, äußere Primer sowie gRNA-flankierende Primer für beide 5'- und 3'-gRNA-Zielstellen.Beginnen Sie damit, die hier gezeigte Website aufzurufen, um die Single-Nucleotide-Polymorphismus- oder Snip-Tracks der 129- und Cas-Genotypen zu erhalten. Dies führt zur CRISPR-Webseite des Mitchell-Labors. Klicken Sie dort auf den angegebenen Link.Die Seite wird zur UCSC-Genom-Browser weiterleiten, der die Spur mit den SNPs zwischen den 129- und Cas-Genomen in der MM-9-Maus-Genom-Assembly enthält. Geben Sie als Nächstes die Koordinaten des zu löschenden Bereichs ein und klicken Sie auf „Go“. Vergrößern Sie einen Bereich von etwa 500 Basenpaaren in der Mitte der gewünschten Deletion, der mehr als drei SNPs enthält.Der Entwurf allelespezifischer Primer kann kompliziert sein, wenn SNPs selten sind. Falls es nicht möglich ist, absolut allelespezifische Primer zu entwerfen, können moderate allelespezifische Primer verwendet werden. Denken Sie jedoch daran, die CT-Werte zwischen den deletierten und nicht-deletierten Klonen bei der Analyse der qPCR-Ergebnisse zu vergleichen.Klicken Sie nun im oberen Bereich auf „Ansicht“. Wählen Sie in dem Dropdown-Menü DNA aus. Die Seite „DNA abrufen im Fenster“ wird angezeigt.Wählen Sie in den Sequenzformatierungsoptionen „alles in Großbuchstaben“ und klicken Sie dann auf „Get DNA“, um die Zielsequenz in ausschließlich Großbuchstaben anzuzeigen. Kopieren Sie diese Sequenz und fügen Sie sie in eine Word-Dokumentdatei ein. Vergleichen Sie anschließend die Sequenz mit der 129-cast-Snip-Spur, markieren Sie die Snip-Positionen durch Hervorhebung und kennzeichnen Sie die 129-Snips mit Kleinbuchstaben.Wenn Sie mit der 129-Sequenz fertig sind, kopieren Sie sie, um zwei im Fastq-Format vorliegende Sequenzen zu erstellen: eine für 129 und eine für Cas. Ersetzen Sie in der Cas-Sequenz an jeder Schnittstelle die korrekte Base und kennzeichnen Sie den Schnitt mit einem Kleinbuchstaben.Als Nächstes beschriften Sie die Sequenz mit ihrem entsprechenden Genom, 129 oder Cas. Geben Sie dann im Browser die Adresse für Primer3Plus ein. Fügen Sie im entsprechenden Bereich die ausgetauschte 129-Sequenz ein.Verwenden Sie die Standardeinstellungen, um die Primer zu entwerfen. Um die innen liegenden allelespezifischen Primer zu entwerfen, klicken Sie auf das Dropdown-Menü rechts neben „Task“ und wählen Sie „Primer List“, dann klicken Sie auf „Pick Primers“. Eine neue Seite öffnet sich und zeigt eine Liste von vorwärts- und rückwärtsgerichteten Primern an.Wählen Sie das Kontrollkästchen aus, um einen Vorwärts- oder Rückwärtsprimer auszuwählen, bei dem eine SNIP durch einen Kleinbuchstaben entweder am 3'-Ende oder innerhalb von vier Basen zum 3'-Ende hin markiert ist. Beachten Sie, dass Primer mit einer SNIP am 3'-Ende eine erhöhte Allelspezifität während der qPCR aufweisen. Klicken Sie unten auf dem Bildschirm auf „Senden an Primer3-Manager“.Es öffnet sich eine neue Seite, auf der der ausgewählte Primer angezeigt wird. Um den zweiten Primer auszuwählen, kehren Sie zur Seite mit der Primerliste zurück und klicken Sie auf den Zurück-Button, um zur Hauptseite zu gelangen. Wählen Sie im Aufgaben-Auswahlfeld die Option Nachweis aus.Die Hauptseite wird aktualisiert und unten erscheint ein Feld für die linke und rechte Primersequenz. Fügen Sie die erste Primersequenz in das entsprechende Feld ein. Navigieren Sie anschließend zum Reiter „Allgemeine Einstellungen“ neben dem Reiter „Haupt“ und ändern Sie die Einstellung für den Produktgrößenbereich auf 80 bis 200 Basenpaare.Klicken Sie auf „Primern auswählen“. Eine Seite öffnet sich, die fünf mögliche Primer-Paare für die erste Primer-Sequenz anzeigt. Wählen Sie einen Primer-Satz aus der Liste der Primer-Paare aus, indem Sie die Kästchen links neben den Primern ankreuzen, und klicken Sie dann unten auf der Seite auf „An Primer3-Manager senden“. Dies sind die 129 innenliegenden allelespezifischen Primer.Wiederholen Sie diese Schritte, um Primer für das Cast-Allel zu entwerfen. Wenden Sie diese Technik anschließend auf den Entwurf von außen liegenden allelspezifischen und nicht allelspezifischen Primern an. Testen Sie schließlich die Primer auf Allelspezifität mittels qPCR, wie in dem begleitenden Dokument beschrieben.Extrahieren Sie die genomische DNA aus der zuvor vorbereiteten 96-Well-Platte. Zentrifugieren Sie die Platte kurz, um eventuelle Kondensationsflüssigkeit am Boden der Wells zu sammeln. Diese DNA dient als Vorlage für die Deletionsanalyse.Als Nächstes führen Sie auf einer 384-Well-Platte eine qPCR in Duplikat für jeden Klon durch. Verwenden Sie eine zweistufige PCR, gefolgt von einer Schmelzkurvenanalyse mit Detektion. Überprüfen Sie nach Beendigung des Laufs zunächst jede Allelverstärkung mit den innen liegenden, allelspezifischen Primern.Keine Amplifikation eines Allels oder CT-Wert-Unterschiede von mehr als fünf Zyklen zwischen den Allelen deuten darauf hin, dass diese Klone eine heterozygote Deletion tragen. Die fehlende Amplifikation beider Allele deutet darauf hin, dass sie eine homozygote Deletion tragen. Überprüfen Sie anschließend jedes Allel mittels der außen liegenden, allelspezifischen Primer auf Amplifikation.Wenn die Zieldeletion größer als ein KB ist, erfolgt die Amplifikation mit äußeren Primern nur, wenn eine Deletion vorliegt. Ein CT-Wert zwischen 22 und 28 bestätigt die Deletion. Bei Zieldeletionen kleiner als ein KB bestätigen Sie die Amplikon-Größe mittels Elektrophorese.Eine 96-Well-Platte mit Deletionsklonen wurde mittels qPCR unter Verwendung allelespezifischer interner Primer untersucht. Graue Balken zeigen die Amplifikation mit Cas-spezifischen Primern, schwarze Balken die Amplifikation mit 129-spezifischen Primern an. Ein niedriger CT-Wert oder kein Amplifikationssignal mit den internen Primern weist auf eine Ziel-Deletion hin.Klone mit einer Deletion an einem oder beiden Allelen werden anschließend mit den äußeren Primersequenzen untersucht. Die Amplifikation mit den äußeren Primern bestätigt die Deletion. Klone mit einer monoallelischen Deletion werden mittels Primersequenzen, die die gRNA-Zielregion flankieren, analysiert, um das Fehlen von Insertionen oder Deletionen – sogenannten Indels – auf dem nicht-deletierten Allel zu bestätigen.Nur monoallelische Klone ohne große Indels an den Zielstellen auf dem nicht-deletierten Allel werden in der anschließenden Expressionsanalyse verwendet. Hier dargestellt sind repräsentative Ergebnisse von 129- oder Cas-SCR-deletierten Klonen. Der SCR ist ein kürzlich beschriebener, Sox2-spezifischer Enhancer in ES-Zellen.Rote Balken stellen die Expression des Sox2-Cas-Allels dar und blaue Balken die Amplifikation des Sox2-129-Allels. Wie anhand dieser Abbildung ersichtlich ist, führte die Deletion des SCR auf dem 129- oder Cas-Allel zu einer verminderten Expression von Sox2 in CIS. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man mithilfe der CRISPR-Technologie eine große Deletion erzeugt und allelespezifische Primer verwendet, um die Genotypisierung Ihrer deletierten Klone durchzuführen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

CRISPR/Cas9 ist ein robustes System, um Störungen von Genen und genetischen Elementen zu erzeugen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur effizienten Erzeugung genomischer Deletionen in Säugetierzelllinien mittels CRISPR/Cas9.

Generierung von Genomic Löschungen in Säugerzelllinien über CRISPR / Cas9

Proteine ​​enthalten oft mehrere Domänen, die verschiedene zelluläre Funktionen ausüben kann. Gen-Knock-outs (KO) nicht über diese funktionelle Vielfalt berücksichtigen. Hier berichten wir über eine Rekombination vermittelten Kassettenaustausch (RMCE) -basierte Struktur-Funktions-Ansatz in KO embryonalen Stammzellen, die für die molekulare Präparation von verschiedenen funktionellen Domänen oder Varianten eines Proteins ermöglicht.

Struktur-Funktions-Studien in embryonalen Maus-Stammzellen Rekombinase-vermittelten Kassettenaustausch

Dieses Protokoll beschreibt die erforderlichen Schritte zum Entwerfen und ausführen gemultiplexten Ausrichtung der Enhancer mit deaktivieren Fusionsproteins SID4X-dCas9-KRABBE, auch bekannt als Enhancer Störungen (Enhancer-i). Dieses Protokoll ermöglicht die Identifizierung von Enhancer, die Genexpression regulieren und erleichtert das Sezieren von Beziehungen zwischen Enhancer Regulierung ein gemeinsames Zielgen.

Dissektion der Enhancer-Funktion mit Multiplex CRISPR-basierte Enhancer Einmischung in Zell-Linien

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Lentiviral CRISPR/Cas9-Vermittelte Genombearbeitung zur Untersuchung hämatopoetischer Zellen in Krankheitsmodellen

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Hier stellen wir eine modifizierte Methode zur Kryokonservierung von Einzellembryonen sowie ein Protokoll vor, das die Verwendung von gefriergetauten Embryonen und Elektroporation für die effiziente Erzeugung genetisch veränderter Mäuse koppelt.

Verwendung von gefriergetauten Embryonen für die hocheffiziente Produktion von gentechnisch veränderten Mäusen

Hier beschreiben wir eine einfache Technik zur effizienten Erzeugung von genetisch veränderten Mäusen namens CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Diese Methode liefert Editierreagenzien durch Elektroporation in Embryonen mit einer Effizienz von nahezu 100%. Dieses Protokoll ist wirksam bei Punktmutationen, kleinen genomischen Insertionen und Deletionen in Säugetierembryonen.

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Hier stellen wir ein Protokoll zur Entwicklung genetisch veränderter Mausmodelle mit embryonalen Stammzellen vor, insbesondere für große DNA-Knock-In (KI). Dieses Protokoll wird mithilfe der CRISPR/Cas9-Genom-Editierung optimiert, was zu einer signifikant verbesserten KI-Effizienz im Vergleich zur konventionellen homologen rekombinationsvermittelten linearisierten DNA-Targeting-Methode führt.

CRISPR/Cas9-vermitteltes hocheffizientes Gen-Targeting in embryonalen Stammzellen zur Entwicklung genmanipulierter Mausmodelle

Dieser Artikel berichtet über die Konstruktion von Zentromer-assoziierten Protein-E (CENP-E) Knockout-Zellen unter Verwendung des CRISPR/Cas9-Systems und drei phänotypbasierter Screening-Strategien. Wir haben die CENP-E-Knockout-Zelllinie verwendet, um einen neuartigen Ansatz zur Validierung der Spezifität und Toxizität der CENP-E-Inhibitoren zu etablieren, der für die Arzneimittelentwicklung und die biologische Forschung nützlich ist.

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Erfahren Sie, wie CRISPR/Cas9-vermittelte Deletionen in Maus-embryonalen Stammzellen genutzt werden, um Enhancer-Funktionen und allelspezifische Genregulation zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht präzise funktionale Genomanalysen.

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