Entwicklung eines Backbone zyklische Peptid-Bibliothek als potentielle Antiparasiten Therapeutics unter Mikrowellenbestrahlung
January 26th, 2016
Eine einfache und allgemeine Methode zur Synthese von zyklischen Peptiden mittels Mikrowellenbestrahlung wird skizziert. Dieses Verfahren ermöglicht die Synthese von zyklischen Peptiden des Rückgrats mit einer Sammlung verschiedener Konformationen unter Beibehaltung der Seitenketten und der pharmakophoren Einheiten und ermöglicht daher das Screening auf die bioaktive Konformation.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Entwicklung einer fokussierten zyklischen Peptidomimetika-Bibliothek mit Konformationsdiversität unter Verwendung von Mikrowellenbestrahlung für neuartige antiparasitäre Therapeutika. Diese Methode kann dazu beitragen, neuartige Werkzeuge zu entwickeln, um Protein-Protein-Wechselwirkungen gezielt zu beeinflussen. Um diesen Vorgang zu starten, geben Sie 2,5 Milliliter der gewünschten Aminosäure, einen Milliliter Aktivator und 0,5 Milliliter Aktivatorbasis in eine Polypropylenpatrone.
Legen Sie die Tonabnehmer in einen automatisierten Mikrowellensynthesizer und lassen Sie die Kopplungsreaktion 300 Sekunden lang bei 25 Watt und 75 Grad Celsius ablaufen. Sobald die Reaktion abgeschlossen ist, waschen Sie das Harz 120 Sekunden lang mit sieben Millilitern N, N-Dimethylformamid oder DMF bei Raumtemperatur. Nachdem Sie den vorherigen Schritt fünfmal wiederholt haben, geben Sie sieben Milliliter 20%iges Piperidin in DMF mit 0,1 molaren 1-Hydroxybenzotriazol oder HOBt in die Polypropylenpatrone und inkubieren Sie 30 Sekunden lang bei 45 Watt und 75 Grad Celsius.
Wenn Sie fertig sind, lassen Sie das Reaktionsgemisch ab. Geben Sie anschließend sieben Milliliter 20%iges Piperidin in DMF mit 0,1 molaren HOBt in die Polypropylen-Kartusche und inkubieren Sie 180 Sekunden lang bei 45 Watt und 75 Grad Celsius. Nach dem Abtropfen des Reaktionsgemisches wird das Harz mit sieben Millilitern DMF 120 Sekunden lang bei Raumtemperatur gewaschen
.Waschen Sie dann das Harz mit sieben Millilitern Dichlormethan (DCM) 120 Sekunden lang bei Raumtemperatur. Für die Anhydridkopplung waschen Sie das Harz 120 Sekunden lang mit sieben Millilitern 1-Methyl-2-pyrrolidinon oder NMP bei Raumtemperatur. Wenn Sie fertig sind, lassen Sie das Reaktionsgemisch ab.
Nachdem Sie den vorherigen Schritt dreimal wiederholt haben, lösen Sie 10 Äquivalente des entsprechenden Anhydrids in fünf Millilitern NMP in einem 50-Milliliter-Polypropylenröhrchen. Fügen Sie dann der Lösung ein Äquivalent 4-Dimethylaminopyridin oder DMAP und 10 Äquivalente N, N-Diisopropylethylamin oder DIEA hinzu. Geben Sie diese Mischung zum Harz und inkubieren Sie sie 300 Sekunden lang bei 25 Watt und 75 Grad Celsius.
Nachdem Sie das Harz mit NMP gewaschen haben, waschen Sie es mit sieben Millilitern DMF für 120 Sekunden bei Raumtemperatur. Übertragen Sie das Harz zu diesem Zeitpunkt in eine Polypropylenkartusche, die mit einem Verschlussstopfen und einem Absperrhahn ausgestattet ist. Nachdem das Harz mit DCM gewaschen wurde, fügen Sie der Polypropylenpatrone pro 1 Gramm Harz 15 bis 25 Milliliter einer Mischung aus 1 % Trifluoressigsäure, 5 % Triisopropylsilan und 94 % DCM hinzu.
Legen Sie die Polypropylen-Kartusche auf einen Schüttler und schütteln Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Lassen Sie anschließend die Lösung aus der Polypropylenkartusche ab, indem Sie ein Vakuum anwenden. Nachdem Sie die vorherigen Schritte dreimal wiederholt haben, waschen Sie das Harz mit sieben Millilitern DCM für 120 Sekunden bei Raumtemperatur.
Diese Schritte sind von großer Bedeutung, da festgestellt wurde, dass die Tritylschutzgruppen in mehreren Harzen in den DCM-Trifluoressigsäurelösungen teilweise gespalten sind. Das Entfernen von Methyltritylgruppen ist ein langsamer Prozess, der mehrere Wäschen erfordert. In einem 50-Milliliter-Polypropylen-Röhrchen werden fünf Äquivalente Benzotriazol-1-ly-oxy-tris-pyrrolidinophosphoniumhexafluorphosphat in fünf Millilitern Dibrommethan gelöst.
Fügen Sie dann der Lösung 10 Äquivalente von DIEA hinzu. Gib die Mischung in das DCM-gespülte Harz und inkubiere sie 300 Sekunden lang bei 25 Watt und 75 Grad Celsius. Waschen Sie anschließend das Harz mit sieben Millilitern DCM für 120 Sekunden bei Raumtemperatur.
Übertragen Sie das Harz nach zwei Wäschen mit DCM in eine Polypropylenkartusche und waschen Sie es zweimal mit Diethylether. Trocknen Sie das Harz in einem Vakuumexsikkator bei Raumtemperatur mindestens drei Stunden lang über Kaliumhydroxid. Fügen Sie als Nächstes 10 Milliliter eines vorgekühlten Trifluoressigsäure-Spaltcocktails zu jedem Gramm Harz hinzu.
Legen Sie die Polypropylen-Kartusche auf einen Schüttler und schütteln Sie sie 3 Stunden lang bei Raumtemperatur. Anschließend die Spaltlösung auffangen, indem das Harz in ein 50-Milliliter-Polypropylen-Röhrchen filtriert wird. Geben Sie 35 Milliliter kalten Diethylether in das Röhrchen.
Zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 1.207 mal g bei vier Grad Celsius. Dekantieren Sie dann die Ätherschicht. Bereiten Sie für den Kaiser-Test Lösung A vor, indem Sie 16,5 Milligramm Kaliumcyanid in 25 Millilitern destilliertem Wasser auflösen.
Verdünnen Sie einen Milliliter der Lösung mit 49 Millilitern Peridin. Bereiten Sie als Nächstes Lösung B vor, indem Sie ein Gramm Ninhydrin in 20 Millilitern Ethanol auflösen. Bereiten Sie Lösung C vor, indem Sie 40 Gramm Phenol in 20 Millilitern Ethanol auflösen.
Nachdem die Lösungen hergestellt wurden, geben Sie einige Kügelchen aus dem Harz in ein Reagenzglas. Geben Sie drei Tropfen jeder Lösung in das Röhrchen und mischen Sie. Zum Schluss erhitzen Sie das Reagenzglas auf einem Heizblock fünf Minuten lang bei 110 Grad Celsius.
Die Synthese der zyklischen Peptide des Rückgrats erfolgte mit einem automatisierten Mikrowellensynthesizer auf festem Träger nach dem FMOC, t-Butyl-Protokoll. Das Produkt wurde massenspektrometrisch analysiert und sein Reinheitsgrad mittels HPLC bestimmt. Biologisches Screening zeigte, dass das Peptid pL1 gegen Leishmania donovani wirksam war, einen Parasiten, der die viszerale Leishmaniose, die schwerste Leishmaniose beim Menschen, verursacht.
Peptid pL1 reduzierte die Lebensfähigkeit der Parasiten um 75 % im Vergleich zur Kontrollbehandlung. Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei bis fünf Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher in einer Vielzahl von Bereichen, um Peptide als pharmakologische Regulatoren in der Grundlagenforschung und in der Therapie zu erforschen.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine fokussierte Bibliothek von Peptidomimetika mit Konformationsvielfalt entwickeln können, um speziell auf Protein-Protein-Wechselwirkungen abzuzielen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Trifluoressigsäure äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen eines Augenschutzes, eines Laborkittels und Handschuhe bei der Arbeit in einer gut belüfteten Haube sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden.
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Überblick
Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Synthese zyklischer Peptide mittels Mikrowellenbestrahlung. Das Verfahren ermöglicht die Herstellung verschiedener Konformationen bei gleichzeitiger Erhaltung von Seitenketten und pharmakophorischen Einheiten, was das Screening für bioaktive Konformationen erleichtert.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Biochemie
- Pharmazeutische Entwicklung
Hintergrund
- Zyklische Peptide sind in der Arzneimittelentwicklung wichtig.
- Mikrowellenbestrahlung kann die Syntheseeffizienz verbessern.
- Vielfältige Konformationen können zu besserer Bioaktivität führen.
- Die Zielsetzung von Protein-Protein-Interaktionen ist entscheidend für therapeutische Fortschritte.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer zyklischen Peptidomimetik-Bibliothek mit konformationeller Vielfalt.
- Erstellung neuartiger antiparasitärer Therapeutika.
- Bereitstellung von Werkzeugen zur Zielsetzung spezifischer Proteininteraktionen.
Verwendete Methoden
- Vorbereitung von Aminosäuren und Aktivatoren in einem Polypropylen-Cartridge.
- Mikrowellensynthese bei kontrollierter Leistung und Temperatur.
- Waschen des Harzes mit N,N-Dimethylformamid (DMF).
- Inkubation mit Piperidin und HOBt zur Deblockierung.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Synthese zyklischer Peptide mit verschiedenen Konformationen.
- Beibehaltung von Seitenketten und pharmakophorischen Einheiten.
- Potenzial für das Screening bioaktiver Konformationen.
- Etablierung einer Methode für zukünftige therapeutische Entwicklungen.
Schlussfolgerungen
- Die mikrowellengestützte Methode ist effizient für die zyklische Peptidsynthese.
- Vielfältige Konformationen erhöhen das Potenzial für Bioaktivität.
- Dieser Ansatz kann bei der Entwicklung gezielter Therapeutika helfen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Targeting parasite-specific protein-protein interactions (PPIs) with cyclic peptidomimetics offers a path to selective anti-parasitic therapeutics with improved bioavailability and metabolic stability. This microwave-assisted backbone cyclic peptide library approach enables rapid generation of conformational diversity for systematic screening, supporting early-stage target validation and lead identification in infectious disease programs. The method reduces synthesis time and increases library accessibility, facilitating hit-to-lead progression for neglected disease targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of parasite-specific PPI interfaces derived from conserved LACK scaffold regions absent in mammalian hosts.
- Operational Value: Supports rapid synthesis of focused peptidomimetic libraries using microwave irradiation to accelerate coupling and deprotection steps.
- Predictive Value: Facilitates systematic screening of backbone cyclic peptides with varied ring sizes to identify bioactive conformations.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates conformationally diverse cyclic peptide libraries suitable for high-throughput screening against parasite PPI targets.
- Operational Value: Produces peptides with retained side chains and pharmacophoric moieties, ensuring structural integrity for reliable assay readouts.
- Scalability: Enables library synthesis in 3–5 days, supporting iterative screening campaigns and structure-activity relationship (SAR) exploration.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Peptide pL1 demonstrated 75% reduction in Leishmania donovani viability, providing proof-of-concept for antiparasitic activity.
- Translational Continuity: Links target validation through PPI disruption to phenotypic screening in a clinically relevant parasite strain.
- De-risking: Early efficacy data supports prioritization of cyclic peptidomimetics for further optimization and preclinical evaluation.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the early discovery continuum, enabling target validation through PPI interference, feeding into lead identification via conformational screening, and supporting preclinical progression through demonstrated antiparasitic activity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of parasite-specific PPIs by generating conformationally constrained peptidomimetics from evolutionarily divergent sequences.
- Screening: Delivers standardized, soluble cyclic peptides suitable for biochemical or cellular assays measuring target engagement or parasite viability.
- Analytics: Relies on mass spectrometry and HPLC for identity and purity confirmation, enabling quantitative batch-to-batch consistency.
- Translational Research: Connects molecular design to phenotypic outcomes in Leishmania, supporting biomarker-aligned advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Microwave-assisted solid-phase synthesis platform is adaptable to other target classes, enabling cross-project library generation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target confidence by enabling selective disruption of parasite PPIs with conformationally defined peptidomimetics.
- Operational Value: Microwave irradiation reduces synthesis cycle times, improves coupling efficiency, and increases library throughput.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early efficacy signals (e.g., 75% parasite viability reduction) before significant investment.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of antiparasitic candidates based on target specificity and mechanistic de-risking.
Implementation Considerations
- Requires expertise in solid-phase peptide synthesis and microwave synthesizer operation.
- Needs access to automated microwave synthesizer, HPLC, and mass spectrometry for purification and analysis.
- Demands standardized washing and deprotection protocols to ensure resin integrity and peptide fidelity.
- Must account for safe handling of trifluoroacetic acid and piperidine mixtures during cleavage and deprotection steps.
- Library diversity is constrained by amino acid solubility and coupling efficiency, requiring optimization per sequence.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:27
Fmoc-protected Amino Acid Coupling
2:03
Anhydride/Acid Coupling
3:01
N-methyltrityl (Mtt) Protecting Group Deprotection
4:18
Cyclization of the Linear Peptide
4:57
Cleavage and Deprotection of Side-chain Groups
6:04
Kaiser (Ninhydrin) Test
7:01
Results: Synthesis of Cyclic Peptides Using Microwave Irradiation
7:45
Conclusion
