Synthese von Gold-Nanopartikeln Integrated Photo-responsive Liposomen und Messung ihrer Mikroblasen Kavitation auf Pulse Laseranregung

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, die Synthese lichtresponsiver Liposomen zu demonstrieren und den Mechanismus für die lichtgesteuerte Freisetzung von Wirkstoffen aus diesen Liposomen aufzuzeigen. Diese Methode trägt dazu bei, zentrale Fragen zur figurativen Lichtantwort von Liposomen in der Arzneimittelabgabe zu beantworten, wobei die wesentlichen Herausforderungen in der Synthese der Liposomen und der Verbesserung des Maßes an kontrollierter Freisetzung liegen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in der zellulären Synthese lichtresponiver Liposomen unter Verwendung kommerziell verfügbarer Materialien.

Die Bedeutung dieser Technologie erstreckt sich auf die Therapie oberflächennaher Gewebe. Die Verwendung minimalinvasiver Verfahren sowie eines Teils der Laservorrichtung wird die Technologieplattform für Patienten besser zugänglich machen. Neben der Bereitstellung von Erkenntnissen zur optimalen Versorgung und präzisen Arzneimittelaufbringung kann unser System auch auf andere Systeme wie das kleine ani-ma-mo-rose sowie das Schleimsystem durch geführte Laser angewendet werden.

Reinigen Sie zunächst einen 100-Milliliter-Rundkolben mit Königswasser. Nach dem Spülen mit entionisiertem Wasser und Autoklavieren trocknen Sie den Kolben 15 Minuten lang bei 100 Grad Celsius im Heißluftofen. Anschließend den sterilen Kolben verpacken und bis zur Verwendung aufbewahren.

Ein handgehaltenes Mini-Extruderset mit 70 % Ethanol sterilisieren. Anschließend den Rotationsverdampfer einschalten und die Temperatur des Heizwasserbades bzw. des Kühlturms auf 37 bzw. 4 Grad Celsius einstellen. Eine 60 Millimolar starke Kalzium-Standardlösung herstellen, indem 374 Milligramm Calcein in 10 Milliliter 0,1 Millimolar Phosphat-gepufferter Salzlösung oder PBS gelöst werden.

Stellen Sie den pH-Wert mit einer einmolaren Natriumhydroxidlösung auf 7,4 ein. Entnehmen Sie die Lipide aus dem Gefrierschrank und lassen Sie sie auf Raumtemperatur auftauen. Lösen Sie nach dem Auftauen 15,9 Milligramm DPPC, 1,3 Milligramm MPPC und 2,8 Milligramm DSPE-PEG2000 in zwei Milliliter Chloroform.

Nachdem die Chloroformlösung in einen sterilen Rundkolben überführt wurde, verdampfen Sie das Lösungsmittel unter vermindertem Druck mittels Rotationsverdampfer, um einen dünnen, trockenen Lipidfilm zu erhalten. Anschließend hydratisieren Sie den Lipidfilm 30 Minuten lang bei 45 Grad Celsius mit zwei Millilitern wässriger Lösung, die 1,95 Milliliter der zuvor hergestellten 60 Millimolar Calciumlösung und 50 Mikroliter Gold-Nanopartikel enthält. Heizen Sie einen Heizblock auf 45 Grad Celsius vor.

Platzieren Sie einen 200 Nanometer durchmessenden Polycarbonat-Membranfilter zwischen die Filterhalterungen und bauen Sie den Mini-Extruder zusammen. Überprüfen Sie anschließend auf mögliche Leckagen mit entionisiertem Wasser. Füllen Sie eine der Spritzen mit einem Milliliter der zuvor hergestellten Liposomenlösung und extrudieren Sie die Probe, indem Sie die Lösung durch die am anderen Ende des montierten Mini-Extruders befindliche Spritze leiten.

Nachdem der vorherige Schritt 11-mal wiederholt wurde, werden die synthetisierten Liposomen über eine PD-10-Entsalzungssäule geleitet, um freie Goldnanopartikel, Lipide und Calcein mithilfe von PBS als Elutionspuffer gemäß dem Herstellerrprotokoll zu entfernen. Nach Beendigung werden die Proben in sterilen Röhrchen bei vier Grad Celsius gelagert. An diesem Punkt wird die Lipidmolarität der Stammlösung berechnet, indem die Molaritäten von DPPC, MPPC und DSPE-PEG2000 addiert werden.

Verdünnen Sie die Liposomen-Grundlösung auf eine Lipidkonzentration von 5 Millimolar unter Verwendung von 0,1 Millimolar PBS und überführen Sie die Proben anschließend in 2-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Danach stellen Sie die Röhrchen in ein heißes Wasserbad und erhöhen die Temperatur schrittweise von 25 auf 70 Grad Celsius. Sammeln Sie 10-Mikroliter-Aliquote bei verschiedenen Temperaturpunkten.

Geben Sie 10 µL einer zweiprozentigen Triton X-100-Lösung zu einem zwei Milliliter großen Aliquot der liposomalen Lösung hinzu, um die Liposomen 10 Minuten bei Raumtemperatur zu digerieren und eine vollständige Freisetzung von Calcein zu erzielen. Danach übertragen Sie 200 µL der liposomalen Lösung in jedes Loch einer 96-Loch-Mikrotiterplatte. Messen Sie die Fluoreszenzintensität der gesammelten Proben mithilfe eines Fluoreszenz-Mikroplattenlesegeräts.

Unter Annahme der Fluoreszenzintensität der mit Triton X-100 behandelten Proben als 100 Prozent Freisetzung berechnen Sie den Prozentsatz des freigesetzten Calceins zu jedem Zeitpunkt anhand der folgenden Formel: Übertragen Sie 100 Mikroliter der Liposomenlösung in eine Quarzküvette und stellen Sie die Küvette in einen Küvettenhalter. Führen Sie den kollimierten Laserstrahl durch die Küvette, sodass das Licht durch die Liposomenlösung tritt. Anschließend entnehmen Sie Aliquots nach verschiedenen Impulsen.

Im Anschluss 10 µL 2 % Triton X-100 zu einem 2-mL-Aliquot der liposomalen Lösung hinzufügen, um die Liposomen 10 Minuten bei Raumtemperatur zu digerieren und eine vollständige Freisetzung von Calcein zu erzielen. Um den Bleichungseffekt des Lasers auf die Calcein-Lösung vorab zu messen, wird die Lösung einem Laser mit einer Frequenz von 1 Hertz über unterschiedliche Pulszahlen ausgesetzt. Die Fluoreszenzintensität von Calcein wird mit Anregungs- und Emissionswellenlängen von jeweils 480 und 515 Nanometern vor und nach der Laserexposition gemessen.

Nach der Berechnung der Bleichmengen verwenden Sie diesen Faktor, um die aus den Liposomenproben erhaltenen Werte zu normalisieren, indem Sie die Fluoreszenzintensität der Liposomen mit dem Faktor multiplizieren. Anschließend messen Sie die Fluoreszenzintensität der gesammelten Probe mithilfe eines Fluoreszenz-Mikroplattenlesegeräts bei Anregungs- und Emissionswellenlängen von jeweils 480 und 515 Nanometern. Unter Annahme der Fluoreszenzintensität der mit Triton X-100 behandelten Proben als 100 Prozent Freisetzung berechnen Sie den Prozentsatz des freigesetzten Calceins bei jeder Impulsanzahl.

Geben Sie 100 Mikroliter der Probe auf einen Objektträger und stellen Sie anschließend den Fokus des Lasers auf die Probe ein. Der Laser wird manuell durch die Probe geführt, weshalb es wichtig ist, sicherzustellen, dass der Fokuspunkt des Strahls gut innerhalb der Probe und nicht auf dem Objektträger liegt, um spätere Experimente zu vermeiden. Danach tauchen Sie ein Nadelhydrophon in die Lösung ein.

Die Spitze des Hydrofons wird in die Probe eingetaucht, wobei ein ausreichender Abstand zum Fokuspunkt des Lasers eingehalten wird. Dies dient dazu, laserinduzierte Schäden am Hydrofon zu vermeiden. Bestrahlen Sie die Probe mit dem Impuls-Laser bei variierender Impulsanzahl und Impulsenergie.

Notieren Sie abschließend die Drucksignale mithilfe eines digitalen Oszilloskops. Es wird kein signifikanter Unterschied in der Freisetzungsrate für Liposomen mit und ohne Gold-Nanopartikel beobachtet. Die Liposomen waren bei physiologischer Temperatur nahezu intakt, wobei eine Leckagerate von weniger als 10 Prozent mit oder ohne Gold-Nanopartikel auftrat.

Wenn die Temperatur auf 42 Grad Celsius erhöht wurde, wurden innerhalb von zwei Minuten 60 bis 80 Prozent des eingeschlossenen Calceins aus den Liposomen freigesetzt. Liposomen mit Gold-Nanopartikeln setzten das eingeschlossene Calcein nach Anregung frei, wobei die Menge des freigesetzten Calceins mit zunehmender Anzahl der Pulse anstieg. Die für die Gold-Nanopartikel, die Liposomen mit Gold-Nanopartikeln und die Liposomen ohne Gold-Nanopartikel aufgezeichneten akustischen Signale sind hier dargestellt: Der Druckimpuls weist sowohl positive als auch negative Phasen auf und deutet darauf hin, dass Mikrobläschen in der Lösung entstehen und zerplatzen.

Wie erwartet nahm die Amplitude des akustischen Signals allmählich mit steigender Laserenergie zu und sollte auf die erhöhte Intensität der Schwingung der Teilchen zurückzuführen sein, die auf die anschließende thermoelastische Expansion und Kontraktion zurückzuführen ist. Sobald die Herstellung beherrscht ist, kann die Herstellung von Liposomen innerhalb von 3 Stunden erfolgen, vorausgesetzt, dass sämtliches Glaswerk und die Ausrüstung im Voraus vorbereitet wurden. Bei dem Versuch der laserinduzierten Freisetzung ist es wichtig zu beachten, dass der Laserstrahl vollständig auf die Probe fokussiert wird, um Verluste an Laserenergie zu vermeiden.

Nach dieser Methode können weitere Experimente wie in vitro und in vivo laserkontrollierte Freisetzung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise wie physiologische Bedingungen die laserkontrollierte Freisetzung beeinflussen. Nach dieser Entwicklung wird diese Technik im Bereich der Reaktivität nützlich sein, um die Freisetzung an Haut, Augen und Schleimhäuten zu untersuchen, zu lokalisieren und zu kontrollieren.