Elektroaktiven Polymer-Nanopartikel Teilnahmephotothermische Eigenschaften

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, leitfähige Polymer-Nanopartikel herzustellen, die photothermische Eigenschaften aufweisen, und ihre Zytotoxizität zu bewerten. Leitfähige Polymer-Nanopartikel sind ideale Wirkstoffe für die photothermische Therapie, da sie Licht im nahen Infrarotbereich absorbieren und in Wärme umwandeln, um Krebszellen abzutöten. Der Hauptvorteil polymerer Phototherapien besteht darin, dass sie so angepasst werden können, dass sie ihre Absorptionseigenschaften durch eine Verträglichkeit und Tumortargeting-Fähigkeit abstimmen, um eine effektive nicht-invasive lokalisierte Krebstherapie zu ermöglichen.

Die Polymere, die wir für die photothermische Therapie verwenden, können auch für alternative Energieanwendungen, Sensoren und Elektrochromie verwendet werden. Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, können Schwierigkeiten haben, da die Reaktion feuchtigkeitsempfindlich ist. Ein gutes Verständnis der Airless-Synthesetechniken ist unerlässlich.

visuelle Demonstration von Zellkultur-Assays ist von entscheidender Bedeutung, da sterile Techniken schwer zu beherrschen sind. Alle Multi-Role-Play-Assays erfordern Genauigkeit und Konsistenz, um korrekte Ergebnisse zu erzielen. An einem dreihalsigen Kolben mit rundem Boden befestigen Sie ein Septum, einen Kondensator mit einem Einlasssteueradapter und einen Gasauslasssteueradapter.

Verbinden Sie den Gasauslassadapter mit einem Bubbler. Verbinden Sie anschließend den Einlassadapter mit einer Argon-Shlenk-Leitung mit dickwandigem PVC-Schlauch. Beginnen Sie mit dem Fließen von Argon in den Reaktionskolben und lassen Sie das Gas einige Minuten lang strömen.

Nach dem Einschalten des Vakuums die Reaktion mit einem Bunsenbrenner flammentrocknen und dann das Gerät mit Argon reinigen. Wiederholen Sie dies noch zweimal, um eine Airless-Umgebung zu erreichen. Verwenden Sie eine Spritze, um einen Punkt Null, sieben Gramm EDOT durch das Septum in das Gerät zu geben.

20 Milliliter Tetrahydrofuran in den Kolben geben und umrühren. Bereiten Sie ein Trockeneis-Aceton-Bad in einem Dewargefäß der niedrigen Form vor und kühlen Sie den EDOT-Kolben 15 Minuten lang bei minus 78 Grad Celsius. Dann tropfenweise auf 11 Millimol n-Butyllithium in Hexanen bei einer Temperatur von minus 78 Grad Celsius.

Nach vollständiger Zugabe eine weitere Stunde rühren. Beim Umgang mit Organolithium-Reagenzien ist äußerste Vorsicht geboten. Diese Lösungen sind außergewöhnlich gefährlich und sollten nur von jemandem gehandhabt werden, der umfassend in ihrer Verwendung geschult wurde.

Entfernen Sie das Trockeneis-Acetonbad. Und beginnen Sie sofort mit einer tropfenweisen Zugabe von 14 Komma 13 Millilitern einer molaren Zinkchloridlösung unter einstündigem Rühren bei Raumtemperatur. Als nächstes fügen Sie der Reaktion vier Millimol von einem, vier Dialkoxy, zwei fünf Dibromobenzol und 80 Mikromol Palladium tetrakis, Triphenylphosphin hinzu.

Beginnen Sie mit dem Refluxen der Reaktion bei 75 Grad Celsius mit einem Ölbad. Verwenden Sie jeden Tag eine Spritze, um eine kleine Probe des Reaktionsgemisches zu entnehmen. Die Probe wird in zwei Milliliter eines molaren Salzsäures ausgefällt und das Material mit zwei Millilitern Dichlormethan extrahiert.

Platzieren Sie den Extrakt auf einer Siliziumdioxid-Dünnschichtchromatographie oder DC-Platte, zusammen mit vorgefertigten Lösungen aus gereinigtem EDOT und dem entsprechenden vier Dialkoxy zwei fünf Dibromobenzol. Verwenden Sie eine 60- bis 40-Lösung aus Ethylacetat und Hexanen, um die Platte in einer Glaskammer zu entwickeln. Sobald die Reaktion abgeschlossen ist, in drei bis fünf Tagen, kühlen Sie die Reaktion auf Raumtemperatur ab.

Fügen Sie 10 Milliliter einer molaren Salzsäure hinzu, gefolgt von 20 Millilitern Dichlormethan, um die Reaktion zu löschen. Die Reaktionsaufarbeitung wird in einen Scheidetrichter überführt und die organische Schicht isoliert. Waschen Sie die organischen Stoffe mit entionisiertem Wasser, bis das Wasser nicht mehr sauer ist.

Trocknen Sie anschließend die organischen Stoffe über 15 Gramm Magnesiumsulfat. Nach dem Abfiltrieren des Feststoffs das Lösungsmittel mit einem Rotationsverdampfer entfernen, um einen gelb-orangefarbenen Feststoff zu erhalten. Bereiten Sie in einem Glas einen Milliliter PSS-co-MA mit zwei Volumenprozent PSS-co-MA in Wasser vor und fügen Sie einen kleinen Rührstab hinzu.

Bereiten Sie eine Monomerlösung von 16 Milligramm pro Milliliter in Chloroform vor und überführen Sie 100 Mikroliter davon in ein Mikrozentrifugationsröhrchen. Lösen Sie 30 Milligramm Dodecylbenzolsulfonsäure im Mikrozentrifugenröhrchen auf und verwenden Sie dann einen automatischen Vortex-Mischer für 30 bis 60 Minuten, um die Lösung zu homogenisieren. Geben Sie anschließend alle 60 Sekunden die homogenisierte organische Phase in 10 Mikroliter Aliquot zu der zwei Prozent PSS-co-MA-Lösung.

Nach vollständiger Zugabe verdünnen Sie die Lösung mit zwei Millilitern Wasser und entfernen Sie den Rührstab. Legen Sie die Emulsion in ein Eisbad und verwenden Sie dann eine Sonde, um die Emlusion in zwei 10-Sekunden-Intervallen bei einer Amplitude von 30 Prozent zu beschallen. Nehmen Sie das Fläschchen aus dem Eisbad und setzen Sie den Rührstab wieder ein, um die Emulsion weiter zu mischen.

Als nächstes fügen Sie der Monomeremulsion drei Komma acht Mikroliter einer wässrigen Lösung von Eisenchlorid hinzu und rühren Sie eine Stunde lang, um Polymer-Nanopartikel zu erhalten, die mit PSS-co-MA stabilisiert sind. Übertragen Sie die Suspension der Nanopartikel in ein Sieben-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie die Suspension drei Minuten lang bei 75.600 Mal G. Zum Schluss wird der Überstand geborgen und 24 Stunden lang in Wasser mit einem Dialyseschlauch mit einem Molekulargewicht von 100 Kilodalton dialysiert.

Kultivieren Sie SCOV: Drei Eierstockkrebszellen in DMEMs, ergänzt mit 10 Prozent fötalem Rinderserum bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid in T 75-Flaschen. Nach der Dissoziation und Zählung der Zellen unter Verwendung von Standardprotokollen werden die Zellen mit einer Dichte von 5.000 Zellen pro Well in einer 96-Well-Platte zugeführt. Inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid.

Unmittelbar vor der Anwendung ist die Suspension der Nanopartikel in Vollwachstumsmedium in einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter zu überführen. Filtrieren Sie die Suspension der Nanopartikel durch einen sterilen Nullpunktfilter mit zwei Mikrometern. Verdünnen Sie dann die Suspension auf die gewünschten Expositionskonzentrationen mit Vollwachstumsmedium, das mit einem Prozent Penicillin-Streptomycin ergänzt ist.

Entfernen Sie das Medium vorsichtig aus jeder Vertiefung und ersetzen Sie es durch 100 Mikroliter der Nanopartikelsuspension in verschiedenen Expositionskonzentrationen. Entfernen Sie nach dem Inkubieren der Zellen vorsichtig die Lösung und ersetzen Sie das Medium durch 100 Mikroliter sterile gefilterte Nullkomma-Lösung von fünf Milligramm pro Milliliter. Inkubieren Sie die Zellen für zwei bis vier Stunden im Inkubator.

Untersuchen Sie dann die Zellen unter einem Mikroskop, um zu überprüfen, ob sich Formazankristalle bilden. Entfernen Sie vorsichtig die MTT-Lösung und ersetzen Sie sie durch 100 Mikroliter Dimethylsulfoxid. Stellen Sie den Teller auf einen Shaker und mixen Sie ihn einige Minuten lang.

Messen Sie abschließend die Absorptionsmittel jeder Vertiefung bei 590 Nanometern und 700 Nanometern. Diese Werte entsprechen den Spitzenabsorptionsmitteln des Formazan-Produkts bzw. einem Ausgangswert. Die resultierenden Monomere können mittels Wasserstoff- und Kohlenstoff-13-NMR-Spektroskopie charakterisiert werden.

Negishi-Kupplungsreaktionen binden den Phenylring an das EDOT, wodurch sich der Phenylprotonenpeak von sieben Komma eins ppm auf sieben komma acht ppm verschiebt. Das Theyenel-Proton verschiebt sich ebenfalls auf sechs Komma fünf PPM. Die vier Protonen auf den Ethylendioxy-Brückenkohlenstoffen spalten sich bei vier Komma drei PPM in zwei Sätze von Multipletten auf.

Das Kohlenstoff-13-NMR-Spektrum weist Peaks bei eins 70, einem 45, einem 40 und einem 13 für die Thyenelkohlenstoffe und einem 50, einem 20 und einem 12 für die Phenylenkohlenstoffe auf. Die citale Verträglichkeit von Polymer-Nanopartikeln wird mit Hilfe eines MTT-Zellviabilitätsassays bestimmt. Innerhalb des Nanapartikel-Konzentrationsbereichs von null Komma zwei drei bis 56 Mikrogramm pro Milliliter verringern Nanopartikel die Lebensfähigkeit der Zellen nicht auf weniger als 90 Prozent der Kontrolle.

Typischerweise wird eine Verringerung der Zellviabilität von weniger als 20 Prozent als akzeptabel angesehen. Sobald das Monomer gemeistert ist, dauert es etwa eine Woche, um es zu synthetisieren, eine weitere Woche, um es zu reinigen, und weniger als einen Tag, um die Nanopartikel vorzubereiten und zu reinigen. Die Citotoxizitätsstudie kann in zweieinhalb Tagen von der Zellaussaat bis zum Abschluss des Assays abgeschlossen werden.

Bei der Durchführung von In-vitro-Zellstudien ist es wichtig, die richtigen aseptischen Techniken zu befolgen. Zusätzliche Studien wie Assays für lebende Tote, Mikroskopiestudien sowie In-vivo-Bioverteilungs- und photothermale Ovulationsstudien können mit den Nanopartikeln durchgeführt werden, die durch diese Protokolle hergestellt wurden, um ihr Potenzial als photothermische Wirkstoffe für die Krebstherapie besser zu verstehen.