Name: Selektive Zellelimination aus Mixed 3D Culture Mit einem Nah-Infrarot-Technik Photoimmunotherapy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 18 s
Description: Lernen Sie die selektive Zellelimination aus gemischten 3D-Zellkulturen mit Nah-Infrarot-Photoimmunotherapie. Diese Methode ermöglicht präzise Zielzell-Auswahl bei minimalem Schaden für umliegende Zellen.

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Diese Forschung wurde von der Intramural Research Program der National Institutes of Health, National Cancer Institute, Zentrum für Krebsforschung unterstützt.

Hinweis: Das folgende Protokoll beschreibt die notwendigen Schritte spezifischen Zellen unter Verwendung von NIR-PIT zu beseitigen. Kontrollen und andere Details über NIR-PIT und die Lebensfähigkeit der Zellen kann an anderer Stelle 18 zu finden. 1. Konjugation von IR700 monoklonale Antikörper (mAb) <ol><li> Bereiten Sie mAb von Interesse bei 2-5 mg / ml in 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,6) Lösung. </li><li> Mischungs 6,8 nmol von mAb mit 30,8 nmol von 10 mM IR700 in 0,1 M Na 2 HPO 4 -Lösung (pH 8,6) in einem Mikrozentrifugenröhrchen und Inkubieren bei RT für 1 h, mit einer Aluminiumfolie abgedeckt. </li><li> Waschen Sie die PD-10-Säule (siehe Tabelle der Materialien / Ausrüstung) mit 15 ml PBS, zweimal. Legen Sie die Probe aus Schritt 1.2. </li><li> Man reinige das Gemisch über den PD-10-Säule durch Elution PBS entsprechend den Anweisungen des Herstellers. Hinweis: Hier wird die Elution entlang der Bandfarbe von IR700 war. Für eine 300 ul Probe Fraktion PBS Elution liegt typischerweise zwischen 2,5 ml bis 4,4 ml. </li><li> Bestimmen dieProteinkonzentration mit Coomassie - Färbung durch die Absorption bei 595 nm mit einem Spektrophotometer 9 gemessen wird . Bestimmen Sie die Konzentration von IR700 mit Absorption bei 689 nm , die Anzahl der Fluorophormoleküle zu bestätigen , konjugiert an jedem mAb Molekül 9. Hinweis: Es ist wichtig, eine optimale Anzahl von conjugation IR700 Moleküle in 1 mAb mit einem Spektrophotometer bestimmt werden. Im Allgemeinen etwa 3 IR700 Moleküle in 1 mAb - Molekül ist optimal sowohl für in vitro und in vivo arbeiten. HPLC und SDS-PAGE-Methoden können verwendet werden, um zu bestätigen, ob der mAb und IR700 gebunden sind oder nicht. </li><li> Lagerung bei 4 ° C nach der Proteinkonzentration zu bestimmen. </li></ol> 2. Herstellung von Misch 3D-Zellkultur (Mixed Sphäroid) <ol><li> Tragen Sie steriles Wasser (ca. 1 ml) in den Plattenbehälterabschnitt der Platten Tropfen hängen. </li><li> Bereiten Sie verschiedene Verhältnisse der Zelltypen von Interesse - A431-luc-GFP-Zellen und 3T3-RFP-Zellen -mit jeder Probe, die 5000 Zellen insgesamt, in 50 ul Kulturmedium suspendiert. Anmerkung: Bereiten 1: 100, 10: 100, 25: 100, 50: 100 etc. Verhältnisse von Zelltypen von Interesse in Kulturmedien je nach Zelltyp. </li><li> Inkubieren der Mischung für 5-7 Tage in 96-Well-Fallplatte bei 37 ° C und 5% Kohlendioxid in einem befeuchteten Inkubator hängt. Ändern Sie die Kulturmedien alle 2 Tage. Hinweis: Um die 3D-spheroid präzise, ​​handhaben die Platte sanft, als Tropfen machen die Zellen enthalten, fallen leicht vor 3D-Formen zu bilden. </li><li> Achten Sie auf die Morphologie und die Größe der Sphäroiden eines invertierten Hell- Mikroskop bei 10X - 40-facher Vergrößerung. Hinweis: Obwohl es von Zelltypen und der Größe des hängenden Tropfen abhängig ist, sicherzustellen, dass der Durchmesser des Sphäroids herum ist 400-600 &amp; mgr; m nach 7 Tagen Inkubation in der 96-Well-Platte hängenden Tropfens. </li></ol> 3. In - vitro - NIR-PIT für 3D gemischten Zellkultur <ol><li> Ändern Sie die Medien des harn de Tropfenplatten 10 ug / ml Antikörper-Konjugat Photoabsorptionsmittel (APC) enthaltenden Medium und in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5% Kohlendioxid für 6 Stunden inkubiert. </li><li> Nach 6-stündiger Inkubation, waschen Sie die Sphäroid zweimal mit frischem Kulturmedien (Phenolrot frei). übertragen Sie vorsichtig die Sphäroid mit einem Glasboden-50-mm-Schale mit 100 &amp; mgr; l frisch Phenolrot freien Kulturmedien mit einer sterilen 200 ul Pipettenspitze mit der Spitze abgeschnitten. Legen Sie ein Sphäroid in jedem Gericht. </li><li> Beachten Sie die Sphäroid mit einem invertierten Hellfeldmikroskop die Änderung der Morphologie zu erkennen. Zur Beobachtung der optischen Reporter (zB GFP und RFP) verwenden Fluoreszenzmikroskop mit folgenden Filtereinstellungen: GFP - 469 nm Anregungsfilter und 525 nm Emissionsfilter; RFP - 559 nm Anregungsfilter und 630 nm Emissionsfilter. </li><li> Setzen Sie die Leuchtdiode (LED) über dem Glasbodenschale für die Bestrahlung. Hinweis: Sphäroide können NIR ausgesetzt werdenLicht entweder auf dem Mikroskop oder in der laminaren Abzugshaube. <ol><li> Messen Sie die Leistungsdichte des NIR-Licht mit einem optischen Leistungsmesser 9. Gemäß dieser Messung bestrahlen NIR-Licht über Leuchtdioden (LEDs) , welche Licht emittieren bei Wellenlängen von 670 bis 710 nm bei 2 J / cm 2. Hinweis: LED-Licht kann eine maximale Tiefe von etwa 5 Zoll eindringen. Zytotoxischen Wirkungen von NIR-PIT abhängig ist nur auf bestimmten Energie unabhängig von der Leistungsdichte und Dauer der Exposition 23. </li></ol></li><li> Nach der Bestrahlung übertragen das Sphäroid in eine neue hängenden Tropfens Platte mit 50 ul frischem Kulturmedien und für 1 Tag in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5% Kohlendioxid inkubiert. </li><li> übertragen Sie vorsichtig die Sphäroid auf einem Glasbodenschale mit 100 ml frisches Kulturmedien (Phenolrot frei) mit einer sterilen 200 ul Pipettenspitze mit der Spitze abgeschnitten werden. Beachten Sie die Sphäroid mit einem Fluoreszenzmikroskop 1 Tag nach NIR-PIT mit fiFiltereinstellungen in Schritt 3.3 beschrieben. <ol><li> Erkennen toten Zellen Propidiumiodid auf das Medium in einer Endkonzentration von 2 &amp; mgr; g / ml, oder durch den Verlust von cytoplasmatischen GFP-Fluoreszenz mit einem Fluoreszenzmikroskop (2B) durch Zugabe 14,18,22. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3,1-3,6 wenn Zielzellen nicht vollständig eliminiert. </li></ol>

<ol><li>Robinton, D. A., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+research+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy.</a> Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).</li>
<li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: past, present, and future.</a> Cell stem cell. 10 (6), 678-684 (2012).</li>
<li>Birchall, M. A., Seifalian, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering%27s+green+shoots+of+disruptive+innovation%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering's green shoots of disruptive innovation.</a> Lancet. 6736 (14), 11-12 (2014).</li>
<li>Ben-David, U., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumorigenicity+of+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The tumorigenicity of human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Nat. Rev. Cancer. 11 (4), 268-277 (2011).</li>
<li>Hanna, J. H., Saha, K., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotency+and+cellular+reprogramming%3A+facts%2C+hypotheses%2C+unresolved+issues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Pluripotency and cellular reprogramming: facts, hypotheses, unresolved issues.</a> Cell. 143 (4), 508-525 (2010).</li>
<li>Lee, M. -O., Moon, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+pluripotent+stem+cell-derived+teratoma+formation+by+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Inhibition of pluripotent stem cell-derived teratoma formation by small molecules.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (35), 3281-3290 (2013).</li>
<li>Miura, K., Okada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+the+safety+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Variation in the safety of induced pluripotent stem cell lines.</a> Nat. Biotechnol. 27 (8), 743-745 (2009).</li>
<li>Tang, C., Lee, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antibody+against+SSEA-5+glycan+on+human+pluripotent+stem+cells+enables+removal+of+teratoma-forming+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">An antibody against SSEA-5 glycan on human pluripotent stem cells enables removal of teratoma-forming cells.</a> Nat. Biotechnol. 29 (9), 829-834 (2011).</li>
<li>Mitsunaga, M., Ogawa, M., Kosaka, N., Rosenblum, L. T., Choyke, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+-+selective+in+vivo+near+infrared+photoimmunotherapy+targeting+specific+membrane+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Cancer cell - selective in vivo near infrared photoimmunotherapy targeting specific membrane molecules.</a> Nat. Med. 17 (12), 1685-1691 (2011).</li>
<li>Mitsunaga, M., Nakajima, T., Sano, K., Kramer-Marek, G., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immediate+in+vivo+target-specific+cancer+cell+death+after+near+infrared+photoimmunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Immediate in vivo target-specific cancer cell death after near infrared photoimmunotherapy.</a> BMC Cancer. 12 (1), 345(2012).</li>
<li>Nakajima, T., Sano, K., Mitsunaga, M., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+in+vivo+acute+necrotic+cancer+cell+death+induced+by+near+infrared+photoimmunotherapy+using+fluorescence+lifetime+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of in vivo acute necrotic cancer cell death induced by near infrared photoimmunotherapy using fluorescence lifetime imaging.</a> Cancer Res. 72 (18), 4622-4628 (2012).</li>
<li>Sano, K., Mitsunaga, M., Nakajima, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+cytotoxic+effects+of+photoimmunotherapy+assessed+by+18F-FDG+PET%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nucl.+Med%22%5BJournal%5D)">Acute cytotoxic effects of photoimmunotherapy assessed by 18F-FDG PET.</a> J. Nucl. Med. 54 (5), 770-775 (2013).</li>
<li>Sato, K., Watanabe, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoimmunotherapy%3A+Comparative+effectiveness+of+two+monoclonal+antibodies+targeting+the+epidermal+growth+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Photoimmunotherapy: Comparative effectiveness of two monoclonal antibodies targeting the epidermal growth factor receptor.</a> Mol. Oncol. 8 (3), 620-632 (2014).</li>
<li>Sato, K., Nagaya, T., Mitsunaga, M., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+infrared+photoimmunotherapy+for+lung+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Near infrared photoimmunotherapy for lung metastases.</a> Cancer Lett. 365 (1), 112-121 (2015).</li>
<li>Sato, K., Hanaoka, H., Watanabe, R., Nakajima, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+Infrared+Photoimmunotherapy+in+the+Treatment+of+Disseminated+Peritoneal+Ovarian+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Near Infrared Photoimmunotherapy in the Treatment of Disseminated Peritoneal Ovarian Cancer.</a> Mol. Cancer Ther. 14 (8), 141-150 (2014).</li>
<li>Sato, K., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoimmunotherapy+of+Gastric+Cancer+Peritoneal+Carcinomatosis+in+a+Mouse+Model%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Photoimmunotherapy of Gastric Cancer Peritoneal Carcinomatosis in a Mouse Model.</a> PloS one. 9 (11), 113276(2014).</li>
<li>Sato, K., Nagaya, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+Infrared+Photoimmunotherapy+in+the+Treatment+of+Pleural+Disseminated+NSCLC+Preclinical+Experience%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Near Infrared Photoimmunotherapy in the Treatment of Pleural Disseminated NSCLC Preclinical Experience.</a> Theranostics. 5 (7), 698-709 (2015).</li>
<li>Sato, K., Nakajima, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+cell+elimination+in+vitro+and+in+vivo+from+tissues+and+tumors+using+antibodies+conjugated+with+a+near+infrared+phthalocyanine%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Adv%22%5BJournal%5D)">Selective cell elimination in vitro and in vivo from tissues and tumors using antibodies conjugated with a near infrared phthalocyanine.</a> RSC Adv. 5, 25105-25114 (2015).</li>
<li>Watanabe, R., Hanaoka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoimmunotherapy+Targeting+Prostate-Specific+Membrane+Antigen%3A+Are+Antibody+Fragments+as+Effective+as+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nucl.+Med%22%5BJournal%5D)">Photoimmunotherapy Targeting Prostate-Specific Membrane Antigen: Are Antibody Fragments as Effective as Antibodies.</a> J. Nucl. Med. 56 (1), 140-144 (2014).</li>
<li>Nakajima, T., Sano, K., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+efficacy+of+Photoimmunotherapy+%28PIT%29+using+a+cocktail+of+antibody+conjugates+in+a+multiple+antigen+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Improving the efficacy of Photoimmunotherapy (PIT) using a cocktail of antibody conjugates in a multiple antigen tumor model.</a> Theranostics. 3 (6), 357-365 (2013).</li>
<li>Shirasu, N., Yamada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+antitumor+effect+of+CEA-targeted+photoimmunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Potent and specific antitumor effect of CEA-targeted photoimmunotherapy.</a> Int J Cancer. 135 (11), 1-14 (2014).</li>
<li>Sato, K., Nagaya, T., Nakamura, Y., Harada, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+infrared+photoimmunotherapy+prevents+lung+cancer+metastases+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Near infrared photoimmunotherapy prevents lung cancer metastases in a murine model.</a> Oncotarget. 6 (23), 19747-19758 (2015).</li>
<li>Nakajima, T., Sato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+conjugate+and+light+dose+on+photo-immunotherapy+induced+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cancer%22%5BJournal%5D)">The effects of conjugate and light dose on photo-immunotherapy induced cytotoxicity.</a> BMC cancer. 14 (1), 389(2014).</li>
<li>Klimanskaya, I., Rosenthal, N., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derive+and+conquer%3A+sourcing+and+differentiating+stem+cells+for+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Derive and conquer: sourcing and differentiating stem cells for therapeutic applications.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7 (2), 131-142 (2008).</li>
<li>Burmester, G. R., Feist, E., Dörner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+cell+and+cytokine+targets+in+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Emerging cell and cytokine targets in rheumatoid arthritis.</a> Nat. Rev. Rheumatol. 10 (2), 77-88 (2014).</li>
<li>Pardoll, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blockade+of+immune+checkpoints+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy.</a> Nat. Rev. Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Wir veranschaulichen ein Verfahren zur spezifischen Zellelimination aus einer gemischten 3D-Zellkultur ohne Schaden an Nicht-Zielzellen durch NIR-PIT verwenden. Bisher gibt es keine praktische Methode der Zellelimination, wenn das Gewebe hergestellt wird oder nach der Transplantation. So NIR-PIT ist eine vielversprechende Methode, dies zu erreichen. Diese Technik könnte auch in vivo 18,22 verwendet werden, da APCs eine ähnliche Pharmakokinetik wie mAb selbst zeigen. Die Zielzelltyp kann mit ...

Die Beseitigung bestimmter Zellen, ohne dass andere Zellen zu schädigen ist extrem schwierig, vor allem in den etablierten Gewebe, und es besteht ein dringender Bedarf für eine Zelle Eliminationsverfahren im Tissue-Engineering-Bereich. Heute auf dem Gebiet der regenerativen Medizin, Gewebekulturen embryonale Stammzellen (ES), pluripotente Stammzellen (PSCs) oder induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) sind vielversprechende Materialien 1 unter Verwendung von - 3. Obwohl diese Geweberegeneration vielversprechend ist, eine Kontamination mit unerwünschten Zellen ist ein wichtiges Anliegen. Darüber hinaus gibt es ein Sicherheitsproblem von tumorigenicity nach der Transplantation 4,5. Obwohl viele Studien zu diesen Themen konzentriert haben spezifische Zellen zu beseitigen, vor allem in der regenerativen Medizin 6 - 8, hat keine praktische Methode entwickelt worden. Nah-Infrarot-photoimmunotherapy (NIR-PIT) ist eine Behandlung, basierend auf einem Antikörper-Photoabsorptions conjugate (APC). Eine APC besteht aus einem zellspezifischen monoklonalen Antikörper (mAb) und einem Photoabsorptionsmittel, IR700. IR700 ist ein hydrophiles Derivat Siliciumdioxid-Phthalocyanin und nicht induziert Phototoxizität von selbst 9. IR700 ist kovalent an den Antikörper über Amidreste an der Seitenkette von Lysin-Moleküle konjugiert. Die APC bindet Zielmoleküle auf der Zellmembran und induziert dann fast sofort Zellnekrose nach Einwirkung von NIR-Licht bei 690 nm. Während der Einwirkung von NIR-Licht, die Zellmembran reißt , was zu Zelltod 9-14. NIR-PIT hat sich mit mehreren Antikörpern oder Antikörperfragmente , um wirksam zu sein, einschließlich anti-EGFR, anti-HER2, Anti-PSMA, anti-CD25, anti-Mesothelin, Anti-GPC3 und Anti-CEA 15-21. Daher NIR-PIT kann gegen eine Vielzahl von Zielmolekülen verwendet werden. Darüber hinaus ist NIR-PIT eine gut kontrollierte Behandlung, die durch die Einschränkung der NIR-ligh selektive Behandlung bestimmter Regionen erlaubtt Bestrahlung 18,22. Hier stellen wir ein Verfahren zur spezifischen Zelleliminierung mittels NIR-PIT aus gemischten 3D-Kulturen.

<table><tbody><tr><td>IRDye 700DX Ester Infrarot-Farbstoff</td><td>LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA)</td><td>929-70011</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA)</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G25 Säule (PD-10)&nbsp;</td><td>GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA)</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie (Bradford) Plus Protein Assay</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA)</td><td>PI-23200</td><td></td></tr><tr><td>Perfecta3D 96-Well hängende Fallplatten</td><td>3D Biomatrix Inc (Ann Arbor, MI, USA)</td><td>HDP1096-8</td><td></td></tr><tr><td>Optisches Leistungsmessgerät</td><td>Thorlabs (Newton, NJ, USA)</td><td>PM100</td><td></td></tr><tr><td>LED: L690-66-60</td><td>Marubeni America Co. (Santa Clara, CA, USA)</td><td>L690-66-60</td><td></td></tr><tr><td>Vectibix (Panitumumab)</td><td>Amgen (Thousand Oaks, CA, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35&nbsp; mm Glasbodenschale, Schalengröße 35&nbsp; mm, Vertiefungsgröße 10&nbsp; mm</td><td>Cellvis (Mountain View, CA, USA)</td><td>D35-10-0-N</td><td></td></tr></tbody></table>

selektive zellelimination aus mixed 3d culture mit einem nah-infrarot-technik photoimmunotherapy

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Jüngste Entwicklungen im Tissue Engineering bieten innovative Lösungen für viele Krankheiten. So entwickelte sich beispielsweise das Tissue Engineering mit induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS) als neue Methode in der regenerativen Medizin. Obwohl diese Geweberegeneration vielversprechend ist, ist die Kontamination mit unerwünschten Zellen während der Gewebekulturen ein großes Problem. Darüber hinaus bestehen Sicherheitsbedenken hinsichtlich der Tumorigenität nach der Transplantation. Daher besteht ein dringender Bedarf, bestimmte Zellen zu eliminieren, ohne andere Zellen zu schädigen, die geschützt werden müssen, insbesondere in etablierten Geweben. In dieser Arbeit stellen wir eine Methode zur spezifischen Zelleliminierung aus einer gemischten 3D-Zellkultur in vitro mit Nahinfrarot-Photoimmuntherapie (NIR-PIT) vor, ohne nicht-zielgerichtete Zellen zu schädigen. Diese Technik ermöglicht die Eliminierung spezifischer Zellen aus gemischten Zellkulturen oder Geweben.

Um optisch die Wirkung von NIR-PIT überwachen, die A431-Zelllinie, die EGFR überexprimiert wurde genetisch modifiziert, um auch GFP und Luciferase (A431-luc-GFP) exprimieren. Als Nicht-Ziel von NIR-PIT wurde die Balb / 3T3-Zelllinie optisch modifiziert RFP (3T3-RFP) zum Ausdruck bringen. Die APC, Panitumumab-IR700 (pan-IR700), synthetisiert. Misch Sphäroide, die aus verschiedenen Verhältnissen von Zellen (A431-luc-GFP und 3T3-RFP) zusammengesetzt wurden , wurden gemäß diesem Protokoll <s...

Spezifische Zellen zu eliminieren, ohne andere Zellen zu schädigen, ist extrem schwierig, insbesondere in etablierten Geweben, dennoch besteht ein dringender Bedarf an einer Zelleliminierungsmethode im Bereich der Gewebezüchtung. In dieser Arbeit stellen wir eine Methode zur spezifischen Zelleliminierung aus einer gemischten 3D-Zellkultur mittels Nahinfrarot-Photoimmuntherapie (NIR-PIT) vor.

Selektive Zellelimination aus Mixed 3D Culture Mit einem Nah-Infrarot-Technik Photoimmunotherapy

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Verfahrens besteht darin, die Eliminierung spezifischer Zellen aus einem gemischten 3D-Zellkulturmodell mittels Nahinfrarot-Photoimmuntherapie zu demonstrieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich des Gewebegeneration in der regenerativen Medizin zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie gegen eine Vielzahl von Zielmolekülen eingesetzt werden kann und die Behandlung auf spezifische Läsionen beschränkt werden kann.So können Nebenwirkungen minimiert werden. Für die Konjugation von IR700 an monoklonale Antikörper inkubieren Sie die gewünschten Antikörper mit IR700 in Dinatriumphosphat in einem Mikrozentrifugenröhrchen eine Stunde lang bei Raumtemperatur, abgedeckt mit Aluminiumfolie. Am Ende der Inkubation spülen Sie eine PD10-Säule zweimal mit jeweils 15 Milliliter PBS.Danach die Antikörperlösung auf die Säule auftragen und das Gemisch gemäß den Herstelleranweisungen durch PBS-Elution reinigen. Um die Anzahl der an jedes monoklonale Antikörpermolekül gebundenen Fluoro-4-Moleküle zu bestimmen, die Proteinkonzentration des monoklonalen Antikörpers mit einem Spektrophotometer messen. Anschließend

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Forschung

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Biotechnik

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Multiplex-Immunfluoreszenz-Bildgebung zur Analyse immuntherapieresistenter T-Zell-Subpopulationen

Dieses Video demonstriert eine Nahinfrarot-Photoimmuntherapietechnik zur Behandlung von Lungenkrebs in einem manipulierten Mausmodell, das Luciferase-exprimierende Tumorzellen zeigt. Nach der Injektion eines Antikörper-Photosensibilisator-Konjugats (APC), das an spezifische Antigene auf den Tumorzellen bindet, wird die Maus Nahinfrarotstrahlung ausgesetzt, die photochemische Veränderungen im APC induziert und zum nekrotischen Tod der gebundenen Tumorzellen führt. Die Wirksamkeit der Behandlung...

Eine Nahinfrarot-Photoimmuntherapietechnik zur Behandlung von Lungenkrebs im Mausmodell

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Nahinfrarot-Photoimmuntherapie zur gezielten Zelleliminierung in gemischten 3D-Kulturen

Dieses Protokoll beschreibt die anpassbare Oberflächenfunktionalisierung des Desthiobiotin-, Streptavidin- und APTES-Systems, um bestimmte Zelltypen von Interesse zu isolieren. Darüber hinaus behandelt dieses Manuskript die Anwendungen, die Optimierung und die Verifizierung dieses Prozesses.

Ein Verfahren zur gezielten Zellisolierung über Glas Oberflächenfunktionalisierung

Photodynamische Therapie (PDT) ist ein medizinisches Verfahren, Inkubation von einer exogen angewandte Photosensitizer (PS) gefolgt von sichtbaren Licht photoaktivierungen Apoptose induzieren. Wir präsentieren Ihnen eine in-vitro- PDT-Protokoll PDT zu simulieren, die verwendet werden, um Unterschiede in PS Inkubation und Lichtbehandlung Parameter untersuchen soll.

Ein In-vitro- Ansatz zur Photodynamischen Therapie

Die Nahinfrarot-Photoimmuntherapie (NIR-PIT) ist eine aufstrebende krebstherapeutische Strategie, die ein Antikörper-Photoabsorber-Konjugat (IR700Dye) und NIR-Licht verwendet, um Krebszellen zu zerstören. Hier stellen wir eine Methode vor, um die Antitumorwirkung von NIR-PIT in einem Mausmodell für pleural disseminierten Lungenkrebs und malignes Pleuramesotheliom mittels Biolumineszenzbildgebung zu bewerten.

Nahinfrarot-Photoimmuntherapie für Mausmodelle der Pleuraverbreitung

Die chorioallantoische Membran (CAM) des Vogelembryos ist ein sehr nützliches und anwendbares Werkzeug für verschiedene Forschungsbereiche. Ein spezielles Ex-Ovo-Modell der japanischen Wachtel-CAM eignet sich für die photodynamische Behandlungsuntersuchung.

Wachtel-Chorioallanto-Membran - ein Werkzeug für die photodynamische Diagnose und Therapie

Hier beschreiben wir ein neuartiges, einfaches und kostengünstiges Gerät zur erfolgreichen Durchführung von In-vitro-Tests der photodynamischen Therapie (PDT) unter Verwendung zweidimensionaler HeLa-Zellkultur und Verteporfin als Photosensibilisator.

Ein selbst gebautes photodynamisches Therapiegerät auf Basis von Leuchtdioden zur Verbesserung der Verteporfin-Zytotoxizität in einem 2D-Zellkulturmodell

Dieses Protokoll stellt eine Reihe von Experimenten vor, die für die Evaluierung von photoschaltbaren Antikrebspeptiden verwendet wurden, die für das präklinische Screening solcher Verbindungen verwendet werden können. Dazu gehören die Bewertung der Zytotoxizität in 2D- und 3D-Zellkulturen, die Bewertung der Ex-vivo-Photoisomerisierungseffizienz (Modellgewebe) und der In-vivo-Wirksamkeit.

In-vitro - und In-vivo-Evaluierung photokontrollierter biologisch aktiver Substanzen - potenzielle Wirkstoffkandidaten für die Krebspharmakologie

Die Implementierung einer kostengünstigen, vielseitigen Photobestrahlungstechnik mit der manuellen IBEX-Methode ermöglicht eine optimale Bildgebung von menschlichem Gewebe mit signifikanter nativer Autofluoreszenz. Dieses Protokoll beschreibt, wie man Multiplex-Bilder von Ganzobjektträgern aus archivierten klinischen Proben mit einem inversen Mikroskop, weit verbreiteten Reagenzien und Open-Source-Software für die Bildausrichtung und -verarbeitung erhält.

Optimierter Workflow für iteratives Bleaching erweitert die Multiplex-Bildgebung von stark autofluoreszierenden klinischen Proben

Dieses Protokoll bietet einen standardisierten in-vitro. Arbeitsablauf für die konsistente Messung der natürlichen, chimerischen Antigenrezeptor-vermittelten und antikörperabhängigen Zytotoxizität menschlicher natürlicher Killerzellen mittels lebender Zellbildgebung und Durchflusszytometrie.

Quantifizierung der NK-Zell-Zytotoxizität, verstärkt durch chimerische Antigenrezeptoren und therapeutische Antikörper mittels lebender Zellbildgebung und Durchflusszytometrie

Lernen Sie die selektive Zellelimination aus gemischten 3D-Zellkulturen mit Nah-Infrarot-Photoimmunotherapie. Diese Methode ermöglicht präzise Zielzell-Auswahl bei minimalem Schaden für umliegende Zellen.

Selektive Zellelimination aus Mixed 3D Culture Mit einem Nah-Infrarot-Technik Photoimmunotherapy

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