Selektive Zellelimination aus Mixed 3D Culture Mit einem Nah-Infrarot-Technik Photoimmunotherapy
14. März 2016
Spezifische Zellen zu eliminieren, ohne andere Zellen zu schädigen, ist extrem schwierig, insbesondere in etablierten Geweben, dennoch besteht ein dringender Bedarf an einer Zelleliminierungsmethode im Bereich der Gewebezüchtung. In dieser Arbeit stellen wir eine Methode zur spezifischen Zelleliminierung aus einer gemischten 3D-Zellkultur mittels Nahinfrarot-Photoimmuntherapie (NIR-PIT) vor.
Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Verfahrens besteht darin, die Eliminierung spezifischer Zellen aus einem gemischten 3D-Zellkulturmodell mittels Nahinfrarot-Photoimmuntherapie zu demonstrieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich des Gewebegeneration in der regenerativen Medizin zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie gegen eine Vielzahl von Zielmolekülen eingesetzt werden kann und die Behandlung auf spezifische Läsionen beschränkt werden kann.
So können Nebenwirkungen minimiert werden. Für die Konjugation von IR700 an monoklonale Antikörper inkubieren Sie die gewünschten Antikörper mit IR700 in Dinatriumphosphat in einem Mikrozentrifugenröhrchen eine Stunde lang bei Raumtemperatur, abgedeckt mit Aluminiumfolie. Am Ende der Inkubation spülen Sie eine PD10-Säule zweimal mit jeweils 15 Milliliter PBS.
Danach die Antikörperlösung auf die Säule auftragen und das Gemisch gemäß den Herstelleranweisungen durch PBS-Elution reinigen. Um die Anzahl der an jedes monoklonale Antikörpermolekül gebundenen Fluoro-4-Moleküle zu bestimmen, die Proteinkonzentration des monoklonalen Antikörpers mit einem Spektrophotometer messen. Anschließend das Konjugat bei 4 Grad Celsius lagern.
Um die gemischte 3D-Zellkultur vorzubereiten, geben Sie 1 Milliliter sterilem Wasser in den Reservoorteil einer 96-Loch-Hanging-Drop-Platte. Anschließend säen Sie verschiedene Verhältnisse der gewünschten Zelltypen in geeignetem Zellkulturmedium mit mindestens 5.000 Zellen pro 50 Mikroliter Medium pro Loch für fünf bis sieben Tage in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid aus. Erneuern Sie das Kulturmedium alle zwei Tage und beobachten Sie täglich die Morphologie und Größe der Sphäroide mit einem invertierten Hellfeldmikroskop bei 10- bis 40facher Vergrößerung.
Wenn die Sphäroide einen Durchmesser von 400 bis 600 Mikrometern erreicht haben, ersetzen Sie das Medium in der Hanging-Drop-Platte durch Medium, das mit Antikörper-Photoabsorber-Konjugat versetzt ist, und stellen Sie die Platte für sechs Stunden zurück in den Inkubator. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Sphäroide zweimal mit frischem, phenolrotfreiem Kulturmedium. Anschließend verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze mit abgeschnittenem Ende, um nacheinander jeweils einen Sphäroid in einzelne Glasboden-Kulturschalen mit 50 Millimeter Durchmesser zu überführen, die pro Schale 100 Mikroliter frisches, phenolrotfreies Kulturmedium enthalten.
Verwenden Sie das umgekehrte Mikroskop, um Veränderungen in der Sphäroid-Morphologie zu beobachten. Um die Sphäroide zu bestrahlen, platzieren Sie eine Leuchtdiode in einem Abstand von nicht mehr als 5 Zoll über den Glasboden-Dishs. Verwenden Sie zudem ein optisches Leistungsmessgerät, um die Emission einer Wellenlänge zwischen 670 und 710 Nanometern mit einer Energie von 2 Joule pro Quadratzentimeter zu bestätigen.
Nach der NIR-Infrarot-Photoimmuntherapie überführen Sie die Sphäroide in eine neue Hanging-Drop-Platte mit jeweils 50 Mikroliter frischem Kulturmedium pro Mulde und inkubieren sie einen Tag lang im Zellkulturinkubator. Anschließend übertragen Sie die Sphäroide vorsichtig mit einer weiteren 200-Mikroliter-Pipettenspitze mit abgeschnittenem Ende in neue Glasboden-Dishs, die jeweils 100 Mikroliter phenolrotfreies Kulturmedium enthalten, und bewerten die Expression des optischen Reporters im Fluoreszenzmikroskop. Schließlich weisen Sie tote Zellen nach, indem Sie Propidiumiodid dem Medium zugeben.
Oder durch den Verlust der zytoplasmatischen GFP-Fluoreszenz. In diesem repräsentativen Experiment wurden gemischte Sphäroide, die aus verschiedenen Verhältnissen von A431-luc-GFP- und 3T3-RFP-Zellen bestanden, wie gerade gezeigt vorbereitet. Anschließend wurde wiederholt eine Nahinfrarot-Photoimmuntherapie unter Zugabe von Panitumumab-IR700 durchgeführt, wie dargestellt.
Und die Eliminierung der Zielzellen wurde durch die Bewertung der fluoreszenten und Luciferase-Aktivitäten in den Hänge-Tropfen-Kulturen überwacht. Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung innerhalb einer Stunde abgeschlossen werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass die Lichtenergie gemäß dem quadratischen Abstandsgesetz abnimmt.
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Übersicht
Diese Studie stellt eine Methode zur gezielten Eliminierung von Zielzellen aus einer gemischten 3D-Zellkultur unter Verwendung der nahinfraroten Photoimmuntherapie (NIR-PIT) vor. Diese Technik begegnet den Herausforderungen im Gewebeengineering, indem sie Schäden an umgebenden Zellen minimiert.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Gewebetechnik
- Zellbiologie
- Photoimmuntherapie
Hintergrund
- Die gezielte Eliminierung bestimmter Zellen in etablierten Geweben ist schwierig.
- Es besteht Bedarf an Methoden zur gezielten Zelleliminierung in der regenerativen Medizin.
- Mithilfe der NIR-PIT können Zellen selektiv angegriffen werden, ohne angrenzende Gewebe zu beeinträchtigen.
- Diese Methode kann auf verschiedene Zielmoleküle angewendet werden.
Zweck der Studie
- Veranschaulichung der gezielten Eliminierung bestimmter Zellen aus 3D-Zellkulturen.
- Untersuchung der Auswirkungen für das Gewebeengineering und die regenerative Medizin.
- Minimierung von Nebenwirkungen, die mit herkömmlichen Methoden der Zelleliminierung verbunden sind.
Verwendete Methoden
- Konjugation von IR700 an monoklonale Antikörper.
- Inkubation der Antikörper mit IR700 in Dinatriumphosphat.
- Waschen der PD10-Säulen mit PBS.
- Anwendung der NIR-PIT zur gezielten Behandlung spezifischer Zellen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Eliminierung von Zielzellen aus gemischten Kulturen.
- Nachgewiesene Spezifität der NIR-PIT bei der Zielgerichtetheit von Läsionen.
- Minimierte Schädigung von Nicht-Zielzellen.
- Potenzial für weiterreichende Anwendungen in der regenerativen Medizin.
Schlussfolgerungen
- Die NIR-PIT ist eine wirksame Methode zur gezielten Zelleliminierung.
- Diese Technik kann Strategien der Gewebeengineering voranbringen.
- Weitere Forschung ist erforderlich, um ihr volles Potenzial zu erschließen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
In der Gewebeengineering- und regenerativen Medizin bleibt die Eliminierung spezifischer kontaminierender oder tumorigener Zellen aus komplexen 3D-Kulturen, ohne gewünschte Zellpopulationen zu schädigen, eine entscheidende Herausforderung. Die nahinfrarote Photoimmuntherapie (NIR-PIT) bietet einen gezielten Ansatz, um unerwünschte Zellen selektiv abzutöten, während die Gewebeintegrität erhalten bleibt, was sicherere und zuverlässigere präklinische Modelle unterstützt. Diese Fähigkeit erhöht die Vorhersagegenauigkeit in der frühen Forschung, indem sie eine mechanistische Risikominderung zellulärer Therapien vor der Übertragung in vivo ermöglicht.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch gezielte Entfernung spezifischer Zellpopulationen, um deren funktionelle Beiträge in gemischten Kulturen zu bewerten.
- Operativer Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung durch präzise Eliminierung tumorigener oder falschzielgerichteter Zellen und verringert so falsch-positive Signale in Funktionsanalysen.
- Prädiktiver Wert: Erleichtert die Selektion von Projekten, indem Forschenden ermöglicht wird, die Auswirkungen der gezielten Zellentfernung auf die Sphäroid-Morphologie, -Lebensfähigkeit und Reporteraktivität zu isolieren.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative Messwerte mittels Fluoreszenz und Luciferase-Aktivität, um die Effizienz und Spezifität der Eliminierung von Zielzellen zu bestimmen.
- Operationaler Wert: Liefert reproduzierbare, standardisierte Ergebnisse, wenn konjugierte Antikörper mittels Spektrophotometrie gereinigt und validiert werden, wodurch eine Skalierung des Assays ermöglicht wird.
- Assay-Eignung: Bereitet validierte 3D-Sphäroid-Modelle für die anschließende Wirkstoff-Screening-Phase vor, indem eine definierte zelluläre Zusammensetzung vor der Behandlung sichergestellt wird.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verwendet 3D-Sphäroidmodelle (400–600 μm Durchmesser), die die in-vivo-Gewebearchitektur besser nachahmen und somit die Relevanz für Anwendungen in der regenerativen Medizin verbessern.
- Mechanistische Risikominimierung: Demonstriert eine läsionsspezifische Zielgerichtetheit, ohne angrenzende Zellen zu schädigen, und begegnet damit Sicherheitsbedenken hinsichtlich Nebenwirkungen in zellbasierten Therapien.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Ermöglicht die Bewertung des therapeutischen Index durch den Vergleich des Verlusts von Zielzellen (mittels Propidiumiodid oder GFP-Verlust) mit der Erhaltung der Integrität nicht-zielgerichteter Sphäroide.
Pipeline- und Workflow-Integration
NIR-PIT ist in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung bis zur Verfeinerung präklinischer Modelle eingebettet, insbesondere dort, wo eine räumliche Kontrolle über Zellpopulationen erforderlich ist, um therapeutische Spezifität und Sicherheit zu bewerten.
- Entdeckungsbiochemie Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem die bedingte Entfernung spezifischer Zelltypen (z. B. A431-luc-GFP) aus Co-Kulturen ermöglicht wird, um Pfabhängigkeiten und funktionelle Rollen zu klären.
- Screening: Verbessert die Zuverlässigkeit des Assays durch die Erzeugung standardisierter, kontaminationsfreier 3D-Modelle nach selektiver Ablation, wodurch die Reproduzierbarkeit über mehrere Testrunden mit Verbindungen hinweg verbessert wird.
- Analytik: Bietet multiplexierte Messwerte (Fluoreszenz, Luciferase, Propidiumiodid) zur Quantifizierung der Eliminationskinetik und -spezifität und unterstützt datengestützte Go/No-Go-Entscheidungen.
- Translationale Forschung Behält die phänotypische Relevanz bei, indem 3D-Kultursysteme verwendet werden, die Zell-Zell-Interaktionen bewahren, und verbindet so in-vitro-Ergebnisse mit der präklinischen Validierung.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Etabliert eine modulare Plattform, die durch die Konjugation von Antikörpern mit IR700 an verschiedene Zielstrukturen angepasst werden kann und eine Wiederverwendung in mehreren Projekten ermöglicht, die unterschiedliche Zelloberflächenmarker ansprechen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht das Vertrauen in die Zielvalidierung, indem mechanistische Studien durch präzise räumliche Kontrolle über die Zelleliminierung in komplexen Modellen ermöglicht werden.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit durch standardisierte Konjugations-, Reinigungs- und Bestrahlungsprotokolle (2 J/cm² bei 670–710 nm) und verringert so die Variabilität der Eliminierungsergebnisse.
- Strategischer Wert: Reduziert biologische Risiken in späteren Entwicklungsstadien, indem die frühe Beurteilung der Beseitigung tumorigener Kontaminationen ermöglicht wird und somit die Herstellung sicherer Zelltherapien unterstützt wird.
- Portfolio-Implikation: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung, indem klare vergleichende Daten zur selektiven und nicht-selektiven Zellverlustrate in gemischten Kulturen generiert werden.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Antikörperkonjugation, spektrophotometrischen Quantifizierung und im Umgang mit 3D-Kulturen, um eine konsistente Herstellung der IR700-Antikörper sicherzustellen.
- Ist abhängig vom Zugang zu LED-Lichtquellen und optischen Leistungsmessgeräten für eine präzise Nahinfrarotabgabe im Bereich von 670–710 nm bei definiertem Fluenz.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Arbeitsgruppen hinweg hinsichtlich der Sphäroidgröße (400–600 μm) und Inkubationszeiten (6 Stunden Antikörperinkubation, Erholungsphase nach Nahinfrarotbestrahlung) voraus, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.
- Erfordert Anpassungen beim Übertragen der Methode auf verschiedene Zelltypen oder extrazelluläre Matrizen, da sich die Eindringtiefe und Antikörperverfügbarkeit unterscheiden können.
- Beinhaltet praktische Einschränkungen wie die Lichtdämpfung gemäß dem Abstandsgesetz, weshalb der Abstand zwischen LED-Quelle und Kultur während der Bestrahlung sorgfältig gering gehalten werden muss (<5 Zoll).
