Name: Selektive Zellelimination aus Mixed 3D Culture Mit einem Nah-Infrarot-Technik Photoimmunotherapy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 18 s
Description: Lernen Sie die selektive Zellelimination aus gemischten 3D-Zellkulturen mit Nah-Infrarot-Photoimmunotherapie. Diese Methode ermöglicht präzise Zielzell-Auswahl bei minimalem Schaden für umliegende Zellen.

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Diese Forschung wurde von der Intramural Research Program der National Institutes of Health, National Cancer Institute, Zentrum für Krebsforschung unterstützt.

Hinweis: Das folgende Protokoll beschreibt die notwendigen Schritte spezifischen Zellen unter Verwendung von NIR-PIT zu beseitigen. Kontrollen und andere Details über NIR-PIT und die Lebensfähigkeit der Zellen kann an anderer Stelle 18 zu finden. 1. Konjugation von IR700 monoklonale Antikörper (mAb) <ol><li> Bereiten Sie mAb von Interesse bei 2-5 mg / ml in 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,6) Lösung. </li><li> Mischungs 6,8 nmol von mAb mit 30,8 nmol von 10 mM IR700 in 0,1 M Na 2 HPO 4 -Lösung (pH 8,6) in einem Mikrozentrifugenröhrchen und Inkubieren bei RT für 1 h, mit einer Aluminiumfolie abgedeckt. </li><li> Waschen Sie die PD-10-Säule (siehe Tabelle der Materialien / Ausrüstung) mit 15 ml PBS, zweimal. Legen Sie die Probe aus Schritt 1.2. </li><li> Man reinige das Gemisch über den PD-10-Säule durch Elution PBS entsprechend den Anweisungen des Herstellers. Hinweis: Hier wird die Elution entlang der Bandfarbe von IR700 war. Für eine 300 ul Probe Fraktion PBS Elution liegt typischerweise zwischen 2,5 ml bis 4,4 ml. </li><li> Bestimmen dieProteinkonzentration mit Coomassie - Färbung durch die Absorption bei 595 nm mit einem Spektrophotometer 9 gemessen wird . Bestimmen Sie die Konzentration von IR700 mit Absorption bei 689 nm , die Anzahl der Fluorophormoleküle zu bestätigen , konjugiert an jedem mAb Molekül 9. Hinweis: Es ist wichtig, eine optimale Anzahl von conjugation IR700 Moleküle in 1 mAb mit einem Spektrophotometer bestimmt werden. Im Allgemeinen etwa 3 IR700 Moleküle in 1 mAb - Molekül ist optimal sowohl für in vitro und in vivo arbeiten. HPLC und SDS-PAGE-Methoden können verwendet werden, um zu bestätigen, ob der mAb und IR700 gebunden sind oder nicht. </li><li> Lagerung bei 4 ° C nach der Proteinkonzentration zu bestimmen. </li></ol> 2. Herstellung von Misch 3D-Zellkultur (Mixed Sphäroid) <ol><li> Tragen Sie steriles Wasser (ca. 1 ml) in den Plattenbehälterabschnitt der Platten Tropfen hängen. </li><li> Bereiten Sie verschiedene Verhältnisse der Zelltypen von Interesse - A431-luc-GFP-Zellen und 3T3-RFP-Zellen -mit jeder Probe, die 5000 Zellen insgesamt, in 50 ul Kulturmedium suspendiert. Anmerkung: Bereiten 1: 100, 10: 100, 25: 100, 50: 100 etc. Verhältnisse von Zelltypen von Interesse in Kulturmedien je nach Zelltyp. </li><li> Inkubieren der Mischung für 5-7 Tage in 96-Well-Fallplatte bei 37 ° C und 5% Kohlendioxid in einem befeuchteten Inkubator hängt. Ändern Sie die Kulturmedien alle 2 Tage. Hinweis: Um die 3D-spheroid präzise, ​​handhaben die Platte sanft, als Tropfen machen die Zellen enthalten, fallen leicht vor 3D-Formen zu bilden. </li><li> Achten Sie auf die Morphologie und die Größe der Sphäroiden eines invertierten Hell- Mikroskop bei 10X - 40-facher Vergrößerung. Hinweis: Obwohl es von Zelltypen und der Größe des hängenden Tropfen abhängig ist, sicherzustellen, dass der Durchmesser des Sphäroids herum ist 400-600 &amp; mgr; m nach 7 Tagen Inkubation in der 96-Well-Platte hängenden Tropfens. </li></ol> 3. In - vitro - NIR-PIT für 3D gemischten Zellkultur <ol><li> Ändern Sie die Medien des harn de Tropfenplatten 10 ug / ml Antikörper-Konjugat Photoabsorptionsmittel (APC) enthaltenden Medium und in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5% Kohlendioxid für 6 Stunden inkubiert. </li><li> Nach 6-stündiger Inkubation, waschen Sie die Sphäroid zweimal mit frischem Kulturmedien (Phenolrot frei). übertragen Sie vorsichtig die Sphäroid mit einem Glasboden-50-mm-Schale mit 100 &amp; mgr; l frisch Phenolrot freien Kulturmedien mit einer sterilen 200 ul Pipettenspitze mit der Spitze abgeschnitten. Legen Sie ein Sphäroid in jedem Gericht. </li><li> Beachten Sie die Sphäroid mit einem invertierten Hellfeldmikroskop die Änderung der Morphologie zu erkennen. Zur Beobachtung der optischen Reporter (zB GFP und RFP) verwenden Fluoreszenzmikroskop mit folgenden Filtereinstellungen: GFP - 469 nm Anregungsfilter und 525 nm Emissionsfilter; RFP - 559 nm Anregungsfilter und 630 nm Emissionsfilter. </li><li> Setzen Sie die Leuchtdiode (LED) über dem Glasbodenschale für die Bestrahlung. Hinweis: Sphäroide können NIR ausgesetzt werdenLicht entweder auf dem Mikroskop oder in der laminaren Abzugshaube. <ol><li> Messen Sie die Leistungsdichte des NIR-Licht mit einem optischen Leistungsmesser 9. Gemäß dieser Messung bestrahlen NIR-Licht über Leuchtdioden (LEDs) , welche Licht emittieren bei Wellenlängen von 670 bis 710 nm bei 2 J / cm 2. Hinweis: LED-Licht kann eine maximale Tiefe von etwa 5 Zoll eindringen. Zytotoxischen Wirkungen von NIR-PIT abhängig ist nur auf bestimmten Energie unabhängig von der Leistungsdichte und Dauer der Exposition 23. </li></ol></li><li> Nach der Bestrahlung übertragen das Sphäroid in eine neue hängenden Tropfens Platte mit 50 ul frischem Kulturmedien und für 1 Tag in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5% Kohlendioxid inkubiert. </li><li> übertragen Sie vorsichtig die Sphäroid auf einem Glasbodenschale mit 100 ml frisches Kulturmedien (Phenolrot frei) mit einer sterilen 200 ul Pipettenspitze mit der Spitze abgeschnitten werden. Beachten Sie die Sphäroid mit einem Fluoreszenzmikroskop 1 Tag nach NIR-PIT mit fiFiltereinstellungen in Schritt 3.3 beschrieben. <ol><li> Erkennen toten Zellen Propidiumiodid auf das Medium in einer Endkonzentration von 2 &amp; mgr; g / ml, oder durch den Verlust von cytoplasmatischen GFP-Fluoreszenz mit einem Fluoreszenzmikroskop (2B) durch Zugabe 14,18,22. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3,1-3,6 wenn Zielzellen nicht vollständig eliminiert. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Wir veranschaulichen ein Verfahren zur spezifischen Zellelimination aus einer gemischten 3D-Zellkultur ohne Schaden an Nicht-Zielzellen durch NIR-PIT verwenden. Bisher gibt es keine praktische Methode der Zellelimination, wenn das Gewebe hergestellt wird oder nach der Transplantation. So NIR-PIT ist eine vielversprechende Methode, dies zu erreichen. Diese Technik könnte auch in vivo 18,22 verwendet werden, da APCs eine ähnliche Pharmakokinetik wie mAb selbst zeigen. Die Zielzelltyp kann mit ...

Die Beseitigung bestimmter Zellen, ohne dass andere Zellen zu schädigen ist extrem schwierig, vor allem in den etablierten Gewebe, und es besteht ein dringender Bedarf für eine Zelle Eliminationsverfahren im Tissue-Engineering-Bereich. Heute auf dem Gebiet der regenerativen Medizin, Gewebekulturen embryonale Stammzellen (ES), pluripotente Stammzellen (PSCs) oder induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) sind vielversprechende Materialien 1 unter Verwendung von - 3. Obwohl diese Geweberegeneration vielversprechend ist, eine Kontamination mit unerwünschten Zellen ist ein wichtiges Anliegen. Darüber hinaus gibt es ein Sicherheitsproblem von tumorigenicity nach der Transplantation 4,5. Obwohl viele Studien zu diesen Themen konzentriert haben spezifische Zellen zu beseitigen, vor allem in der regenerativen Medizin 6 - 8, hat keine praktische Methode entwickelt worden. Nah-Infrarot-photoimmunotherapy (NIR-PIT) ist eine Behandlung, basierend auf einem Antikörper-Photoabsorptions conjugate (APC). Eine APC besteht aus einem zellspezifischen monoklonalen Antikörper (mAb) und einem Photoabsorptionsmittel, IR700. IR700 ist ein hydrophiles Derivat Siliciumdioxid-Phthalocyanin und nicht induziert Phototoxizität von selbst 9. IR700 ist kovalent an den Antikörper über Amidreste an der Seitenkette von Lysin-Moleküle konjugiert. Die APC bindet Zielmoleküle auf der Zellmembran und induziert dann fast sofort Zellnekrose nach Einwirkung von NIR-Licht bei 690 nm. Während der Einwirkung von NIR-Licht, die Zellmembran reißt , was zu Zelltod 9-14. NIR-PIT hat sich mit mehreren Antikörpern oder Antikörperfragmente , um wirksam zu sein, einschließlich anti-EGFR, anti-HER2, Anti-PSMA, anti-CD25, anti-Mesothelin, Anti-GPC3 und Anti-CEA 15-21. Daher NIR-PIT kann gegen eine Vielzahl von Zielmolekülen verwendet werden. Darüber hinaus ist NIR-PIT eine gut kontrollierte Behandlung, die durch die Einschränkung der NIR-ligh selektive Behandlung bestimmter Regionen erlaubtt Bestrahlung 18,22. Hier stellen wir ein Verfahren zur spezifischen Zelleliminierung mittels NIR-PIT aus gemischten 3D-Kulturen.

<table><tbody><tr><td>IRDye 700DX Ester Infrarot-Farbstoff</td><td>LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA)</td><td>929-70011</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA)</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G25 Säule (PD-10)&nbsp;</td><td>GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA)</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie (Bradford) Plus Protein Assay</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA)</td><td>PI-23200</td><td></td></tr><tr><td>Perfecta3D 96-Well hängende Fallplatten</td><td>3D Biomatrix Inc (Ann Arbor, MI, USA)</td><td>HDP1096-8</td><td></td></tr><tr><td>Optisches Leistungsmessgerät</td><td>Thorlabs (Newton, NJ, USA)</td><td>PM100</td><td></td></tr><tr><td>LED: L690-66-60</td><td>Marubeni America Co. (Santa Clara, CA, USA)</td><td>L690-66-60</td><td></td></tr><tr><td>Vectibix (Panitumumab)</td><td>Amgen (Thousand Oaks, CA, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35&nbsp; mm Glasbodenschale, Schalengröße 35&nbsp; mm, Vertiefungsgröße 10&nbsp; mm</td><td>Cellvis (Mountain View, CA, USA)</td><td>D35-10-0-N</td><td></td></tr></tbody></table>

selektive zellelimination aus mixed 3d culture mit einem nah-infrarot-technik photoimmunotherapy

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Jüngste Entwicklungen im Tissue Engineering bieten innovative Lösungen für viele Krankheiten. So entwickelte sich beispielsweise das Tissue Engineering mit induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS) als neue Methode in der regenerativen Medizin. Obwohl diese Geweberegeneration vielversprechend ist, ist die Kontamination mit unerwünschten Zellen während der Gewebekulturen ein großes Problem. Darüber hinaus bestehen Sicherheitsbedenken hinsichtlich der Tumorigenität nach der Transplantation. Daher besteht ein dringender Bedarf, bestimmte Zellen zu eliminieren, ohne andere Zellen zu schädigen, die geschützt werden müssen, insbesondere in etablierten Geweben. In dieser Arbeit stellen wir eine Methode zur spezifischen Zelleliminierung aus einer gemischten 3D-Zellkultur in vitro mit Nahinfrarot-Photoimmuntherapie (NIR-PIT) vor, ohne nicht-zielgerichtete Zellen zu schädigen. Diese Technik ermöglicht die Eliminierung spezifischer Zellen aus gemischten Zellkulturen oder Geweben.

Um optisch die Wirkung von NIR-PIT überwachen, die A431-Zelllinie, die EGFR überexprimiert wurde genetisch modifiziert, um auch GFP und Luciferase (A431-luc-GFP) exprimieren. Als Nicht-Ziel von NIR-PIT wurde die Balb / 3T3-Zelllinie optisch modifiziert RFP (3T3-RFP) zum Ausdruck bringen. Die APC, Panitumumab-IR700 (pan-IR700), synthetisiert. Misch Sphäroide, die aus verschiedenen Verhältnissen von Zellen (A431-luc-GFP und 3T3-RFP) zusammengesetzt wurden , wurden gemäß diesem Protokoll <s...

Spezifische Zellen zu eliminieren, ohne andere Zellen zu schädigen, ist extrem schwierig, insbesondere in etablierten Geweben, dennoch besteht ein dringender Bedarf an einer Zelleliminierungsmethode im Bereich der Gewebezüchtung. In dieser Arbeit stellen wir eine Methode zur spezifischen Zelleliminierung aus einer gemischten 3D-Zellkultur mittels Nahinfrarot-Photoimmuntherapie (NIR-PIT) vor.

Selektive Zellelimination aus Mixed 3D Culture Mit einem Nah-Infrarot-Technik Photoimmunotherapy

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Verfahrens besteht darin, die Eliminierung spezifischer Zellen aus einem gemischten 3D-Zellkulturmodell mittels Nahinfrarot-Photoimmuntherapie zu demonstrieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich des Gewebegeneration in der regenerativen Medizin zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie gegen eine Vielzahl von Zielmolekülen eingesetzt werden kann und die Behandlung auf spezifische Läsionen beschränkt werden kann.So können Nebenwirkungen minimiert werden. Für die Konjugation von IR700 an monoklonale Antikörper inkubieren Sie die gewünschten Antikörper mit IR700 in Dinatriumphosphat in einem Mikrozentrifugenröhrchen eine Stunde lang bei Raumtemperatur, abgedeckt mit Aluminiumfolie. Am Ende der Inkubation spülen Sie eine PD10-Säule zweimal mit jeweils 15 Milliliter PBS.Danach die Antikörperlösung auf die Säule auftragen und das Gemisch gemäß den Herstelleranweisungen durch PBS-Elution reinigen. Um die Anzahl der an jedes monoklonale Antikörpermolekül gebundenen Fluoro-4-Moleküle zu bestimmen, die Proteinkonzentration des monoklonalen Antikörpers mit einem Spektrophotometer messen. Anschließend das Konjugat bei 4 Grad Celsius lagern.Um die gemischte 3D-Zellkultur vorzubereiten, geben Sie 1 Milliliter sterilem Wasser in den Reservoorteil einer 96-Loch-Hanging-Drop-Platte. Anschließend säen Sie verschiedene Verhältnisse der gewünschten Zelltypen in geeignetem Zellkulturmedium mit mindestens 5.000 Zellen pro 50 Mikroliter Medium pro Loch für fünf bis sieben Tage in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid aus. Erneuern Sie das Kulturmedium alle zwei Tage und beobachten Sie täglich die Morphologie und Größe der Sphäroide mit einem invertierten Hellfeldmikroskop bei 10- bis 40facher Vergrößerung.Wenn die Sphäroide einen Durchmesser von 400 bis 600 Mikrometern erreicht haben, ersetzen Sie das Medium in der Hanging-Drop-Platte durch Medium, das mit Antikörper-Photoabsorber-Konjugat versetzt ist, und stellen Sie die Platte für sechs Stunden zurück in den Inkubator. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Sphäroide zweimal mit frischem, phenolrotfreiem Kulturmedium. Anschließend verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze mit abgeschnittenem Ende, um nacheinander jeweils einen Sphäroid in einzelne Glasboden-Kulturschalen mit 50 Millimeter Durchmesser zu überführen, die pro Schale 100 Mikroliter frisches, phenolrotfreies Kulturmedium enthalten.Verwenden Sie das umgekehrte Mikroskop, um Veränderungen in der Sphäroid-Morphologie zu beobachten. Um die Sphäroide zu bestrahlen, platzieren Sie eine Leuchtdiode in einem Abstand von nicht mehr als 5 Zoll über den Glasboden-Dishs. Verwenden Sie zudem ein optisches Leistungsmessgerät, um die Emission einer Wellenlänge zwischen 670 und 710 Nanometern mit einer Energie von 2 Joule pro Quadratzentimeter zu bestätigen.Nach der NIR-Infrarot-Photoimmuntherapie überführen Sie die Sphäroide in eine neue Hanging-Drop-Platte mit jeweils 50&nbsp;Mikroliter frischem Kulturmedium pro Mulde und inkubieren sie einen Tag lang im Zellkulturinkubator. Anschließend übertragen Sie die Sphäroide vorsichtig mit einer weiteren 200-Mikroliter-Pipettenspitze mit abgeschnittenem Ende in neue Glasboden-Dishs, die jeweils 100&nbsp;Mikroliter phenolrotfreies Kulturmedium enthalten, und bewerten die Expression des optischen Reporters im Fluoreszenzmikroskop. Schließlich weisen Sie tote Zellen nach, indem Sie Propidiumiodid dem Medium zugeben.Oder durch den Verlust der zytoplasmatischen GFP-Fluoreszenz. In diesem repräsentativen Experiment wurden gemischte Sphäroide, die aus verschiedenen Verhältnissen von A431-luc-GFP- und 3T3-RFP-Zellen bestanden, wie gerade gezeigt vorbereitet. Anschließend wurde wiederholt eine Nahinfrarot-Photoimmuntherapie unter Zugabe von Panitumumab-IR700 durchgeführt, wie dargestellt. Und die Eliminierung der Zielzellen wurde durch die Bewertung der fluoreszenten und Luciferase-Aktivitäten in den Hänge-Tropfen-Kulturen überwacht. Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung innerhalb einer Stunde abgeschlossen werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass die Lichtenergie gemäß dem quadratischen Abstandsgesetz abnimmt.

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Eine Nahinfrarot-Photoimmuntherapietechnik zur Behandlung von Lungenkrebs im Mausmodell

Dieses Video zeigt eine Technik zur selektiven Entnahme spezifischer Zellen aus einer gemischten 3D-Zellkultur durch Nahinfrarot-Photoimmuntherapie. Bei dieser Methode werden Zielzellen mit Hilfe eines Antikörpers, der mit einem NIR-Photoabsorber konjugiert ist, genau identifiziert. Die anschließende Bestrahlung mit Infrarotlicht induziert den Zelltod, wodurch die Zielzellen effektiv aus der 3D-Kultur eliminiert werden.

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Die Nahinfrarot-Photoimmuntherapie (NIR-PIT) ist eine aufstrebende krebstherapeutische Strategie, die ein Antikörper-Photoabsorber-Konjugat (IR700Dye) und NIR-Licht verwendet, um Krebszellen zu zerstören. Hier stellen wir eine Methode vor, um die Antitumorwirkung von NIR-PIT in einem Mausmodell für pleural disseminierten Lungenkrebs und malignes Pleuramesotheliom mittels Biolumineszenzbildgebung zu bewerten.

Nahinfrarot-Photoimmuntherapie für Mausmodelle der Pleuraverbreitung

Die chorioallantoische Membran (CAM) des Vogelembryos ist ein sehr nützliches und anwendbares Werkzeug für verschiedene Forschungsbereiche. Ein spezielles Ex-Ovo-Modell der japanischen Wachtel-CAM eignet sich für die photodynamische Behandlungsuntersuchung.

Wachtel-Chorioallanto-Membran - ein Werkzeug für die photodynamische Diagnose und Therapie

Hier beschreiben wir ein neuartiges, einfaches und kostengünstiges Gerät zur erfolgreichen Durchführung von In-vitro-Tests der photodynamischen Therapie (PDT) unter Verwendung zweidimensionaler HeLa-Zellkultur und Verteporfin als Photosensibilisator.

Ein selbst gebautes photodynamisches Therapiegerät auf Basis von Leuchtdioden zur Verbesserung der Verteporfin-Zytotoxizität in einem 2D-Zellkulturmodell

Dieses Protokoll stellt eine Reihe von Experimenten vor, die für die Evaluierung von photoschaltbaren Antikrebspeptiden verwendet wurden, die für das präklinische Screening solcher Verbindungen verwendet werden können. Dazu gehören die Bewertung der Zytotoxizität in 2D- und 3D-Zellkulturen, die Bewertung der Ex-vivo-Photoisomerisierungseffizienz (Modellgewebe) und der In-vivo-Wirksamkeit.

In-vitro - und In-vivo-Evaluierung photokontrollierter biologisch aktiver Substanzen - potenzielle Wirkstoffkandidaten für die Krebspharmakologie

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Optimierter Workflow für iteratives Bleaching erweitert die Multiplex-Bildgebung von stark autofluoreszierenden klinischen Proben

Dieses Protokoll bietet einen standardisierten in-vitro. Arbeitsablauf für die konsistente Messung der natürlichen, chimerischen Antigenrezeptor-vermittelten und antikörperabhängigen Zytotoxizität menschlicher natürlicher Killerzellen mittels lebender Zellbildgebung und Durchflusszytometrie.

Quantifizierung der NK-Zell-Zytotoxizität, verstärkt durch chimerische Antigenrezeptoren und therapeutische Antikörper mittels lebender Zellbildgebung und Durchflusszytometrie

Lernen Sie die selektive Zellelimination aus gemischten 3D-Zellkulturen mit Nah-Infrarot-Photoimmunotherapie. Diese Methode ermöglicht präzise Zielzell-Auswahl bei minimalem Schaden für umliegende Zellen.

Selektive Zellelimination aus Mixed 3D Culture Mit einem Nah-Infrarot-Technik Photoimmunotherapy

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