Die Verbesserung der 2D- und 3D-Haut In Vitro Modellen mithilfe von Macromolecular Crowding

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Ablagerung extrazellulärer Matrizen zu verbessern und aktuelle 2D- und 3D-Hautmodelle durch makromolekulares Crowding zu verbessern. Crowding verbessert die Generierung von zellabgeleiteten Matrizen und reift organotypische Kulturen in einem komprimierten Zeitrahmen. Diese Methode kann Schlüsselfragen im Bereich des Tissue Engineering beantworten, da sie verbesserte Möglichkeiten zur Generierung von zellabgeleiteten extrazellulären Matrizen für das Bioengineering von Haut und anderen Geweben bietet.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass zellabgeleitete Matrizen und organotypische Hautkonstrukte in einem deutlich verkürzten Zeitrahmen erzeugt werden können, wenn makromolekulares Crowding auf diese Kulturen angewendet wird. Die Technik der Interferenzreflexionsmikroskopie ermöglicht es Ihnen, die gesamte Ablagerung der extrazellulären Matrix zu visualisieren, ohne dass eine Antikörperfärbung erforderlich ist. Die Anwendungen dieser Techniken reichen von Studien zur Ablagerung extrazellulärer Matrix durch Hautzellen bis hin zu verbesserten Wundtherapien, insbesondere mit der Generierung besserer Hautäquivalente und Gewebekulturen für die Transplantation.

Zu Beginn säen Sie 50.000 primäre Fibroblasten, primäre Keratinozyten oder eine Co-Kultur von beidem in einem Milliliter Medium Pro Well in die Vertiefungen einer 24-Well-Platte. Lassen Sie die Zellen über Nacht in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid anhaften. Entsorgen Sie dann das alte Medium und ersetzen Sie es durch einen Milliliter frisches Medium, das makromolekulare Crowder und 100 mikromolare Ascorbinsäure enthält.

Inkubieren Sie die Kulturen sechs Tage lang und wechseln Sie das Medium alle zwei Tage. Führen Sie Immunfluoreszenz und Western Blotting gemäß dem Textprotokoll durch. Um eine zellabgeleitete Matrix herzustellen und zu verwenden, dezellularisieren Sie nach sechstägiger Kultivierung der Zellen mit molekularen Crowdern und Ascorbinsäure, wie gerade gezeigt, die Zellschichten, um eine zellabgeleitete Matrix zu erhalten, indem Sie zuerst 1X PBS verwenden, um die Zellschichten zweimal zu waschen.

Aspirieren Sie das PBS und fügen Sie dann 250 Mikroliter 0,5%iges Natriumdesoxycholat hinzu und inkubieren Sie es 10 Minuten lang auf Eis. Aspirieren Sie das Zelllysat, fügen Sie dann weitere 250 Mikroliter 0,5 % Natriumdesoxycholat hinzu und wiederholen Sie die 10-minütige Inkubation und Aspiration zwei weitere Male. Verwenden Sie destilliertes Wasser, um die aus der Zelle stammende Matrix zweimal zu waschen.

Saugen Sie das Wasser an und fügen Sie dann 1X PBS hinzu. Lagern Sie die Matrix bis zu einer Woche bei vier Grad Celsius. Um eine sekundäre Zellsuspension herzustellen, aspirieren Sie das PBS aus der Matrix und säen Sie beispielsweise 50.000 Keratinozyten auf die F-Matte.

Lassen Sie die Zellen über Nacht anhaften. Um die Interferenzreflexionsmikroskopie (RIM) an einer von Zellen abgeleiteten Matrix durchzuführen, führen Sie die Bildaufnahme mit einem konfokalen Mikroskop gemäß dem Textprotokoll durch. Um ein Kollagengel mit Fibroblasten zu gießen, die in einem Zellkultureinsatz eingekapselt sind, aliquotieren Sie 10 Milliliter Rattenschwanzkollagen Typ eins in ein kaltes Becherglas.

Fügen Sie einen Milliliter kaltes DMEM und 0,5 Milliliter eines molaren Natriumhydroxids hinzu, um das saure Kollagen zu neutralisieren. Fügen Sie dann 0,5 Milliliter Fibroblastensuspension hinzu. Verteilen Sie die 12 Milliliter der Lösung mit einer kalten Pipette gleichmäßig in Zellkultureinsätze in einer Sechs-Well-Kulturplatte.

Inkubieren Sie das Gel eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Sobald das Gel erstarrt ist, tauchen Sie es in Fibroblastenmedium oder FM. Nachdem Sie es 24 Stunden lang inkubiert haben, aspirieren Sie das FM. Verwenden Sie vier Milliliter frisches Medium mit makromolekularen Crowdern, um das alte FM zu ersetzen, indem Sie zwei Milliliter in das Innere des Zellkultureinsatzes und zwei Milliliter in die Außenseite des Zellkultureinsatzes geben. Nach einer 24-stündigen Inkubation verwenden Sie 0,125 % Trypsin-Betrugmittel, um die Keratinozyten zu trysonisieren.

Klopfen Sie vorsichtig auf die Seiten des Kolbens, um die Zellen zu lösen, und fügen Sie serumhaltiges Medium hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren. Bereiten Sie nach dem Zählen der Zellen eine Keratinozytensuspension vor. Als nächstes aspirieren Sie das Medium aus den Zellkultureinsätzen und fügen Sie die Keratinozyten an die Oberseite des Gels hinzu.

Inkubieren Sie das Gel eine Stunde lang. Nachdem sich die Keratinozyten an der Geloberfläche festgesetzt haben, verwenden Sie zwei Milliliter KSFM oder CTN-57 serumfreies Medium, um die Zelle in den Gelkultureinsatz einzutauchen, und fügen Sie zwei Milliliter FM an der Außenseite des Zellkultureinsatzes hinzu. Nach einer 24-stündigen Inkubation wird das alte Medium verworfen und durch frisches Medium ersetzt, das makromolekulare Crowder enthält.

Um die Kultur nach sieben Tagen in der untergetauchten Kultur auf eine Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche zu bringen, überführen Sie den Kultureinsatz auf eine Deep-Well-Platte. Geben Sie 10 Milliliter Schichtungsmedium an der Außenseite des Zellkultureinsatzes und halten Sie das Innere des Einsatzes trocken. Zum Schluss inkubieren Sie die Kulturen und wechseln Sie das Medium alle drei Tage für 14 Tage.

Ernten und verarbeiten Sie sie gemäß dem Textprotokoll. Wie hier gezeigt, ermöglichte das makromolekulare Crowding den Fibroblasten, im Vergleich zu Kontrollkulturen mehr extrazelluläre Matrix oder EZM abzulagern. Bei der Säkularisierung zeigte sich, dass Fibroblasten die Hauptlagerer von Kollagen eins, Kollagen vier und Fibronektin waren.

Diese Abbildung zeigt, dass es Fibroblasten und nicht Keratinozyten waren, die die Hauptlagerer von Kollagen Sieben waren, und dies ist der erste Bericht über eine erfolgreiche Ablagerung von Kollagen Sieben in vitro. Mit RIM wurde die volle Ausdehnung der von der Zelle abgeleiteten Matrix erfasst. Eine Überlagerung des RIM-Bildes mit einer Antikörperfärbung zeigt die relative Menge dieser EZM-Komponente im Verhältnis zur Gesamtmenge an EZM.

In einem 3D-In-vitro-Hautmodell verkürzte sich die Kulturzeit durch makromolekulares Crowding (MMC) von fünf auf drei Wochen, um eine reife organotypische Haut-Co-Kultur zu erhalten. Wie hier durch H- und E-Färbung zu sehen ist, bestand die Kultur mit MMC nach drei Wochen aus einer pleuristratifizierten Epidermis und einer Stromolkammdermis. Darüber hinaus wurde eine intensive und kontinuierliche Kollagen-Sieben-Immunfärbung an der dermalen epidermalen Verbindung von überfüllten Zellkulturen im Vergleich zu einer schwachen und fleckigen Kollagen-7-Immunfärbung in Kontrollkulturen nachgewiesen.

Die Transmissionselektronenmikroskopie zeigt auch das Vorhandensein von Verankerungsfibrillen in organotypischen Kulturen, die mit MMC erzeugt wurden, und zeigt funktionelles Kollagen sieben. Aus Zellen gewonnene Matrizen könnten für sekundäre Zellaussaatzwecke als alternatives Gerüst verwendet werden, da die Komplexität der extrazellulären Matrix erhalten bleibt und von den Zellen selbst produziert wird. Organotypische Hautkulturen, die unter makromolekularem Crowding erzeugt werden, könnten als verbessertes 3D-Hautmodell verwendet werden, da sie eine stromale Leistendermis, eine große dermalepidermale Verbindung und eine pleuristratigefütterte Epidermis enthalten.

Organotypische oder hautäquivalente Kulturen, die mit makromolekularen Crowdern erzeugt wurden, können auch für die Hauttransplantation verwendet werden, da sie eine besser entwickelte dermalepidermale Verbindung aufweisen, die wahrscheinlich den Transplantaterfolg verbessert. Zusätzlich zur verstärkten Abscheidung extrazellulärer Matrix kann makromolekulares Crowding auf andere in vitro-Systeme angewendet werden, um Reaktionen mit begrenzter Geschwindigkeit zu verstärken, ohne dass die Menge der Reagenzien erhöht werden muss. Zum Beispiel Polymerase-Kettenreaktionen.