Die Induktion der mütterliche Immunaktivierung bei Mäusen in der Mitte der Schwangerschaft Bühne mit Viral Mimic Poly (I: C)

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, bei Mäusen durch intraperitoneale Injektion des viralen Mimikums Poly im mittleren embryonalen Entwicklungsstadium eine maternale Immunaktivierung, oder MIA, auszulösen. Diese Methode kann uns helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neuroimmunologie zu beantworten, beispielsweise, wie Immunstörungen zu Störungen der Gehirnentwicklung und des Verhaltens führen können. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie speziell für Forschende konzipiert ist, die sich für die Untersuchung der MIA als umweltbedingten Risikofaktor für Autismus und Schizophrenie interessieren.

Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da kleine Unterschiede in der MIA-Induktionsmethode die nachgeschaltete Reaktion bei den Nachkommen erheblich verändern können. Um ein zeitlich gesteuertes Paarungssystem einzurichten, beginnen Sie damit, fünf weibliche Mäuse pro Käfig nebeneinander in Standard-Mauskäfigen unterzubringen, um ihre Östruszyklen zu synchronisieren, und kennzeichnen Sie jedes Tier mit einer Ohrmarkierung. Null bis zwei Stunden vor Beginn der Dunkelphase unterbringen Sie die weiblichen Mäuse zu zweit pro Käfig, wiegen und notieren das Körpergewicht jeder einzelnen Maus und geben anschließend eine männliche Maus pro Käfig mit zwei weiblichen Mäusen hinzu.

Null bis vier Stunden nach dem Ende des Dunkelzyklus die weibliche Maus am Schwanzansatz vorsichtig anheben, sodass das Tier mit den Vorderpfoten das Käfiggitter ergreifen kann, um das Vorhandensein einer weißlichen Masse im Vaginaleingang zu überprüfen. Falls ein Plugsichtbar ist, vorsichtig eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze in den Vaginaleingang einführen. Ein Widerstand durch Koagulation bestätigt die Bildung eines Plugs.

Gruppieren Sie die pluggetragenden Mäuse in einen neuen Käfig, da das Vorhandensein eines Vaginalpfropfens lediglich bestätigt, dass eine Kopulation stattgefunden hat. Heben Sie zwischen den embryonalen Tagen 10,5 und 11,5 jede pluggetragende weibliche Maus am Schwanzansatz an, suchen Sie nach einer Bauchwölbung, wiegen Sie die Tiere anschließend zur Bestätigung der Trächtigkeit und stellen Sie die trächtigen Tiere in individuelle saubere Käfige. Wiegen Sie das Poly(I:C)-Pulver in einem 50-Milliliter-Kegelröhrchen ab.

Am embryonalen Tag 12,5 geben Sie das entsprechende Volumen von 0,9 % Natriumchlorid in einem kegelförmigen Reaktionsgefäß zu dem entsprechenden Volumen von Poly(I:C) hinzu und schließen Sie die Kappe. Rollen Sie den Salzlösungstropfen vorsichtig über das Pulver, bis die Lösung klar ist. Zentrifugieren Sie anschließend das Reaktionsgefäß und überführen Sie die Poly(I:C)-Lösung in ein Mikrozentrifugenröhrchen.

Verwenden Sie ein Spektrophotometer, um das Verhältnis von 260 zu 280 der Poly(I:C)-Lösung zu messen. Das Verhältnis sollte zwischen 1,54 und 1,82 liegen, wie vom Hersteller beschrieben. Wiegen Sie anschließend die erste Maus und befüllen Sie eine 0,3-Milliliter-Insulin-Spritze mit dem entsprechend berechneten Volumen der Poly(I:C)-Lösung.

Dann das Mäuschen am Schwanz nehmen, auf den Käfigdeckel stellen und am Nackenfell fixieren. Nun die Nadel mit der Schräge nach oben in die Mitte der beiden oberen Brustwarzen unter einem Winkel von etwa 20 Grad relativ zur Maus einführen und die Poly(I:C)-Lösung verabreichen. Anschließend das Mäuschen zurück in den Käfig setzen.

Nachdem alle Mäuse injiziert wurden, sollten die Käfige in einem ruhigen Raum mit geringem Verkehr untergebracht werden, um zusätzliche störende Einflüsse zu vermeiden, und die Mäuse am nächsten Morgen gewogen werden. Mindestens drei Tage vor den Verhaltensversuchen sollte die Einstreu der Käfige von acht bis zwölf Wochen alten adulten Nachkommen mit maternaler Immunaktivierung oder MIA gewechselt werden. 30 Minuten vor dem Test werden die Mäuse an den Versuchsraum gewöhnt.

Bei einem Pre-Pulse-Inhibitions-Test werden die Mäuse in Plexiglaszylindern auf einem piezoelektrischen Sensor fixiert. Gewöhnen Sie die Maus fünf Minuten lang an die Pre-Pulse-Inhibitionskammer, wobei sechs Durchgänge mit weißem Rauschen von 120 Dezibel erfolgen. Danach werden die Tiere zufällig gemischten Tönen ausgesetzt, wie in der Tabelle dargestellt, und die Ergebnisse mit der basalen Schreckreaktion verglichen, um die Pre-Pulse-Inhibition der MIA-Tiere zu bestimmen.

Bei einem Open-Field-Test wird eine Maus in die Ecke einer offenen quadratischen Versuchsanlage mit einer definierten zentralen Zone von 17 mal 17 Zentimeter platziert, und die Bewegungsbahn der Maus wird für 10 Minuten mittels einer an der Decke montierten Kamera aufgezeichnet. Anschließend werden die Anzahl der Betretungen der zentralen Zone sowie die darin verbrachte Zeit quantifiziert. Bei einem Murmelvergrabens-Test wird eine Maus zunächst 10 Minuten lang an einen Versuchskäfig mit fünf Zentimeter tiefem, komprimiertem, sauberem Espenholzstreue gewöhnt; danach wird die Maus in ihren Heimkäfig zurückgebracht, und 20 dunkelblaue Glas-Murmeln mit einem Durchmesser von 1,5 Zentimetern werden vorsichtig in einem Raster von vier mal fünf im Versuchskäfig angeordnet.

Bringen Sie die Maus nun für 10 Minuten in den Testkäfig zurück, stellen Sie das Tier danach wieder in den Heimkäfig und zählen Sie die Anzahl der während des Testzeitraums vergrabenen Murmeln. Eine Poly(I:C)-Injektion am embryonalen Tag 12,5 kann eine akute entzündliche Reaktion entlang der mütterlich-plazentalen-fetalen Achse hervorrufen und langfristige Auswirkungen auf die Gehirnentwicklung sowie auf verhaltensbezogene Phänotypen auslösen. Tatsächlich induziert Poly(I:C) drei Stunden nach der Injektion eine stärkere Il6-Genexpression in der mütterlichen Milz, der Plazenta und dem fetalen Gehirn.

Im Allgemeinen weisen MIA-Erzeuglinge im Vergleich zu mit Kochsalzlösung behandelten erwachsenen Nachkommen weniger Eintritte in die zentrale Zone und eine kürzere Verweildauer in der zentralen Zone im offenen Feldtest auf. Die mit poly(I:C) injizierten Tiere zeigen außerdem häufiger Begrabungsverhalten im Murmel-Begrabungs-Test sowie eine geringere präpulsinduzierte Hemmung. Der Verlust von Purkinje-Zellen im Cerebellarlappen sieben stellt ein weiteres Kennzeichen von MIA-Nachkommen dar, wobei bei diesen Tieren im Vergleich zu den mit Kochsalzlösung injizierten Kontrollen weniger calbindinpositive Purkinje-Zellen im Cerebellarlappen sieben beobachtet werden.

Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die trächtigen Mäuse nach der MIA-Induktion nicht zu stören. Anschließend können weitere Faktoren wie postnatale Stressbelastung oder Infektionen ausgelöst werden, um zusätzliche Umwelt-Umwelt-Wechselwirkungen zu untersuchen.