Name: Imaging Serotonerge Fasern im Rückenmark der Maus Mit der CLARITY / CUBIC Technik (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Lernen Sie die CLARITY/CUBIC-Technik zur 3D-Visualisierung serotonerger Fasern im Rückenmark der Maus. Diese Methode ermöglicht die in-situ-Beobachtung neuronaler Strukturen und liefert neue Erkenntnisse über die Neuroanatomie.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Australian Research Council Centre of Excellence for Integrative Brain Function (ARC Centre Grant CE140100007), ein NHMRC-Projektstipendium (#1086643). Prof. George Paxinos wird durch ein Senior Principal Research Fellow NHMRC Stipendium (#1043626) unterstützt.

Ethikerklärung: Alle Verfahren unter Verwendung tierischer Probanden folgen den Richtlinien der Animal Care and Ethics Committee (ACEC) an der University of New South Wales (die zugelassene ACEC Nummer 14 / 94A). 1. Herstellung des Transparent-Maus Spinal Cord <ol><li> Herstellung von Ice Cold Hydrogellösung <ol><li> Herstellung von 16% Paraformaldehyd-Lösung (PFA) <ol><li> In 16 g Paraformaldehydpulver in 70 ml vorgewärmten destilliertem Wasser (50-55 ° C) und unter Rühren auf einem beheizten Magnetrührer bis Paraformaldehyd gelöst ist. Hinweis: Nicht in die Lösung über 55 ° C zu erwärmen und sich bewusst sein, dass Paraformaldehyd toxisch ist. </li><li> Übertragen Sie die Paraformaldehydlösung zu einem Zylinder und mit destilliertem Wasser auf 100 ml. Kühlen Sie die Paraformaldehydlösung eine 4 ° C Kühlschrank mit. </li></ol></li><li> Man löst 125 mg VA-044-Initiator in 26,25 ml destilliertem Wasser und kühlt die Lösung in einem 4° C Kühlschrank. </li><li> Cool 5 ml Acrylamidlösung (40%), 1,25 ml Bis-Lösung (2%) (ACHTUNG: Bis und Acrylamid-Lösungen sind giftig, können genetische Defekte oder Krebs verursachen), 5 ml 10x PBS, 12,5 ml 16% PFA-Lösung und die VA-044 Initiatorlösung auf Eis. </li><li> Mischen Sie die oben genannten Lösungen auf Eis. Bemerkung: das Gesamtvolumen 50 ml beträgt. </li></ol></li><li> Perfusions und Sammlung der Maus Spinal Cord <ol><li> Anästhesieren eine Maus mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (80 mg / kg) und xyzaline (5 mg / kg) in 0,9% physiologischer Kochsalzlösung verdünnt. Die Dosierung für die Maus kann für Ratten als niedriger sein. </li><li> Auf einem geeigneten Kunststoffoberfläche in einer Abzugshaube, befestigen Sie die Schenkel der Maus vom Körper weg (Klebeband ist wirksam), sobald die Maus auf eine Prise seiner Haut des Fußes reagiert nicht. </li><li> Schneiden Sie die Maus Haut über der Brust und dann die Knochen Brust das Herz mit einer Schere zu belichten. </li><li> Mit Hilfe einer Schlauchpumpe mit einer 25 G Nadel befestigt Atee Ende des Schlauchs, legen Sie die Nadel in den linken Ventrikel des Herzens, schnippeln in den rechten Vorhof ein Ausgangspunkt für das Blut zu schaffen und dann mit 40 ml 0,9% physiologischer Kochsalzlösung mit einer Rate von etwa 10 ml / min beginnen Waschen. </li><li> Wenn Sie fertig sind, perfuse die Maus mit 35 ml eiskaltem Hydrogel-Lösung. Anmerkung: mit einer Geschwindigkeit von 10 ml perfundieren / min Quellung des Nervengewebes zu vermeiden. </li><li> Inzision in die Haut über den Rücken mit einem Messer und dann die Muskeln entfernen neben dem wirbel. der Wirbelbögen, auf der einen Seite nach dem Schneiden und sie auf die andere Seite, nehmen Sie das Rückenmark aus der Wirbelsäule mit einer feinen Schere Spiegeln. </li></ol></li><li> Löschen der Maus Spinal Cord <ol><li> Legen Sie das Rückenmark in 15 ml Hydrogel-Lösung über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie 10 ml des Hydrogels Lösung und gießen Sie den Rest der Lösung mit den Rückenmarksegmente zu einem 5-ml-Tube. Füllen Sie das 5-ml-Röhrchen mit dem Hydrogel-Lösung, bis er vollständig gefüllt ist. </li><li> Strecken Sie ein kleines Stück Parafilm über den oberen Teil der 5-ml-Tube und dann wickeln Parafilm um den Hals des Rohres. Hinweis: Achten Sie darauf, die Kontakte Parafilm das Hydrogel-Lösung und es gibt keine Blasen zwischen dem Hydrogel-Lösung und der Parafilm. </li><li> Setzen Sie die 5-ml-Röhrchen in einem 37 &#160; Ofen über Nacht ° C. Beachten Sie die Hydrogel-Lösung, bis es ein Gel wird. </li><li> Nehmen Sie die 5-ml-Röhrchen aus dem Ofen heraus und entfernen Sie das Gel aus der Tube mit einem Schraubenschlüssel (wie ein geschaufelt 1 ml Pipettenspitze). Entfernen Sie das Gel aus dem Rückenmarksgewebe durch das grobe Gewebe auf das Gel kleben und dann die groben Gewebe entfernt (das Gel mit dem Gewebe haften und wird daher von dem Gewebe entfernt werden). </li><li> das Gel aus dem Rückenmarksgewebe, waschen das Rückenmark 4-mal mit 1x PBS (pH 7,4) für 24 Stunden auf einem Schüttler Nach dem Entfernen. </li><li> Bereiten Sie die CUBIC Clearing-Lösung durch Auflösen von 3,85 g Harnstoff und 3,85 g N, N, N &#39;, N&#39;-Tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine in 5,38 ml destilliertem Wasser. Hinweis: Ein heißer Rührer verwendet wird. Hinzufügen, 2,31 g Polyethylenglykol-mono-p-isooctylphenylether / Triton X-100 zu der Lösung, wenn es klar ist, und kühlt auf Raumtemperatur. Hinweis: 10 g dieser drei Chemikalien sind für eine Maus. </li><li> Schneiden Sie das Rückenmark der Maus koronalen in 2-3 mm lange Segmente mit einer Rasierklinge und steckte sie in 5 ml der obigen CUBIC Clearing-Lösung. Platzieren auf einem Schüttler in dem Ofen bei 37 &#160; ° C für 3 Tage. </li><li> Drei Tage später, ändern Sie die Clearing-Lösung auf ein frisches. Anmerkung: Die obige Lösung wird vor der Verwendung hergestellt. </li><li> Zwei bis drei Tage später nach der CUBIC Clearing-Lösung erfrischend, überprüfen Sie die Transparenz des Gewebes gegen ein Papier mit Schrift 8 Buchstaben. Wenn es transparent ist, können die Buchstaben durch die gelöscht Gewebe zu sehen. Entfernen Sie die Clearing-Lösung und 4 ml PBST (0,1% Triton-X100) das Gewebe 4-mal pro Tag (alle 6 Stunden) zu waschen. </li></ol></li></ol><ol><li> Inkubieren der Rückenmarksegmente in der primären Antikörperlösung (anti-Serotonin, in rabbit angehoben, verdünnt 1: 100 in PBST) für 3 Tage auf einem Schüttler in einem Ofen 37 ° C. </li><li> Entfernen Sie die Antikörperlösung und 4 ml PBST (0,1% Triton-X100), um die Rückenmarksegmente 4 mal pro Tag (alle 6 Stunden) in einem 37 ° C warmen Ofen zu waschen. </li><li> Entfernen Sie die PBST-Lösung und fügen Sie den sekundären Antikörper-Lösung (594 konjugierten Ziege-Anti-Kaninchen-IgG, 1: 100 verdünnt in PBST), um das Gewebe für 3 Tage auf einem Schüttler in einem 37 ° C Ofen inkubiert. </li><li> Entfernen Sie die sekundäre Antikörperlösung und 4 ml PBST Rückenmark Segmente 4-mal täglich zu waschen (alle 6 Stunden) auf einem Schüttler in einem Ofen 37 ° C. Am nächsten Tag ist das Gewebe für die Bildgebung bereit. </li></ol> 3. Imaging <ol><li> Entfernen Sie die PBST-Lösung und 4 ml 85% Glycerin auch den Brechungsindex des Gewebes zu machen. </li><li&gt; Überprüfen Sie die Klarheit des Gewebes. Sobald klar in etwa 1 Stunde, legte das Gewebe, auf einem großen, dünnen Glasträger, die den Halterahmen des Multi Foto Fluoreszenzmikroskop passt. </li><li> Ein paar Tropfen von 85% Glycerin neben dem Rückenmarksgewebe und das Deckglas mit einem 22 x 50 mm 2 Deckglas. Hinweis: Die Ausrichtung des Rückenmarks entscheidet, wie das Bild aussieht. </li><li> Setzen Sie den Glasobjektträger auf den Halterahmen des Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskop und das Gewebe in den Lichtweg zu bewegen. </li><li> Wählen Sie den Helium-Neon-Laser-Linie 594 nm und stellen Sie die Intensität des Lasers auf das optimale Niveau, indem die Helligkeit des positiven Signals im Livebild zu überprüfen. </li><li> Wählen Sie den Scanbereich des Rückenmarksgewebe das 20x-Objektiv mit (in Wasser, NA 0,7) und bereiten Sie einen Z-Stapel zu schaffen, und die Tiefe jeder Schritt auf 3 &amp; mgr; m. </li><li> Scannen Sie das Gewebe von oben nach unten in der z-Stapel unter dem 20X objective und 63X Ziel dann (in Öl, NA 1,4) (Schrittweite betrug 1 &amp; mgr; m) sind. Rekonstruieren von 3D - Videos mit einer 3D - Software - 28. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Das Protokoll beschrieben zeigt, wie auf Bild serotonergen Fasern im Rückenmark der Maus mit dem kombinierten CLARITY und CUBIC Techniken. Es wird ein schneller Clearing - Prozess im Vergleich zum passiven Clearing - Protokoll von Cheung et al. Entwickelte 14 und Tomer et al. 15 und ermöglicht es dem Rückenmarksgewebe gut durch das Hydrogel während Clearing unterstützt werden. Ein wichtiger Schritt bei der Fixierung der Rückenmark der Maus, wie von Che...

Supraspinale Projektionen sind verantwortlich für die Modulation verschiedener Verhaltensweisen wie z.B. der Schmerzwahrnehmung. Eine der Projektionen, die nozizeptive Informationen tragen, enthält serotoninerge Fasern, die aus der Raphe des Hinterhirns und den angrenzenden retikulären Kernenstammen 1,2. Physiologische und pharmakologische Studien haben eine vermehrte Freisetzung von Serotonin im Hinterhorn des Rückenmarks nach elektrischer Stimulation der Raphe-Kerne im Hinterhirnnachgewiesen 3-5. Bei der Ratte und dem Opossum haben die serotonergen raphespinalen Fasern dichte Endendigungen, nicht nur im Hinterhorn6-8, sondern auch in der Zwischenzone7,9,10, im Bauchhorn7,11 und sogar in der Lamina 1012,13. Es gibt keine ähnlichen Studien an der Maus. Ziel der vorliegenden Studie war es, das Terminationsmuster serotonerger Fasern, die aus den Raphe-Kernen des Hinterhirns und ihren angrenzenden retikulären Kernen im Rückenmark der Maus entstehen, unter Verwendung der kürzlich veröffentlichten CLARITY14-Methode und ihrer Modifikation - CUBIC15 - zu kartieren. 
Die konventionelle Fluoreszenz- oder Peroxidase-Immunhistochemie des Rückenmarks zeigt deutlich die Verteilung der serotonergen Fasern in der grauen Substanz des Rückenmarks in 30-40 μm dicken Querschnitten. Dieser Ansatz zeigt jedoch nicht die Kontinuität der serotonergen Faserbahnen in der weißen Substanz und ihrer Kollateralen in der grauen Substanz. Obwohl die 3D-Rekonstruktion histologischer Schnitte unser Wissen über Faserbahnen erweitert hat, bleibt es für Histologen und Anatomen eine Herausforderung, einen einzelnen Trakt zu verfolgen, da durch das Schneiden kleine Verzerrungen im Gewebe verursacht werden. Um dieses Hindernis zu umgehen, haben eine Reihe von Forschern verschiedene Protokolle entwickelt, um die gesamte Gewebestruktur transparent zu machen und ein Bild von unverändertem Gewebe in einer einzigen Videodatei zu sammeln17-21. Bisher sind die klare, lipidausgetauschte, Acrylamid-hybridisierte starre, Bildgebungs-/Immunfärbungs-kompatible Gewebe-Hydrogel-Technik (CLARITY), die von Deisseroths Gruppe14,15 entwickelt wurde, sowie CUBIC, entwickelt von Susaki et al.16, am erfolgreichsten. Seit der Veröffentlichung der Protokolle haben viele Forscher begonnen, diese Techniken zu nutzen, um verschiedene Aspekte biologischer Gewebe zu untersuchen, darunter nicht nur das Gehirn22-25, sondern auch das Herz, die Nieren, den Darm und die Lunge26,27. 
Durch Fixieren des Rückenmarks der Maus mit der Hydrogellösung (CLARITY) und Reinigen mit den CUBIC-Reagenzien (was eine viel schnellere Methode ist als die im ursprünglichen CLARITY-Protokollbeschrieben 14,15), wurde ein Rückenmarksgewebeblock von 2-3 mm Länge innerhalb von zwei Wochen beseitigt und die Immunfluoreszenzfärbung für Serotonin in acht Tagen abgeschlossen. Mit nur einer Kombination chemischer Wirkstoffe kann die konventionelle Immunhistochemie verwendet werden, um in etwa einem Monat ein Bild einzelner Faserbahnen in einer 3D-Videodatei zu erstellen.

<table><tbody><tr><td>Photoinitiator VA044</td><td>Wako</td><td>va-044/225-02111</td><td>http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm</td></tr><tr><td>40%ige Acrylamidlösung</td><td>Bio Rad</td><td>161-0140</td><td>http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0140-40-acrylamide-solution</td></tr><tr><td>2%ige Bis-Lösung</td><td>Bio Rad</td><td>161-0142</td><td>http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0142-2-bis-solution?parentCategoryGUID=5e7a4f31- 879c-4d63-ba0b-82556a0ccf1d</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td></td><td>158127 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/158127?lang=en&region=AU</td></tr><tr><td>Harnstoff</td><td>Merck Millipore</td><td>66612</td><td>http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Urea---CAS-57-13-6---Calbiochem,EMD_BIO-66612</td></tr><tr><td>N,N,N',N'-Tetrakis (2-Hydroxypropyl)-ethylendiamin</td><td>Merck Millipore</td><td>821940</td><td>http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Ethylenediamin-N,N,N',N'-tetra-2-propanol,MDA_CHEM-821940</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Merck Millipore</td><td>648462</td><td>http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/TRITON&reg;-X-100-Detergent---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648462</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=en&region=AU</td></tr><tr><td>Serotonin-Antikörper</td><td>Merck Millipore</td><td>AB938</td><td>http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Anti-Serotonin-Antibody,MM_NF-AB938</td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L)-Sekundärantikörper, Alexa Fluor&reg; 594-Konjugat</td><td>Life Technologies</td><td>&nbsp; A-11012</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/genome-database/antibody/Rabbit-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012</td></tr><tr><td>Multiphotonenmikroskop</td><td>Leica</td><td>Leica TCS SP5 MP STED</td><td>http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/details/product/leica-tcs-sp5-mp/</td></tr></tbody></table>

imaging serotonerge fasern im rückenmark der maus mit der clarity / cubic technik

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Langabsteigenden Fasern auf das Rückenmark sind für die Fortbewegung, die Schmerzwahrnehmung und andere Verhaltensweisen. Die Faserabschlußmuster im Rückenmark der Mehrheit dieser Fasersysteme wurden nicht gründlich in einer beliebigen Spezies untersucht. Serotonergen Fasern, die an das Rückenmark projizieren, wurden in Ratten und opossums auf histologischen Schnitten und ihre funktionelle Bedeutung abgeleitet wurde im Rückenmark auf ihre Faserabschlußmuster untersucht basiert. Mit der Entwicklung der Klarheit und kubischem Techniken ist es möglich, dieses Fasersystem und seiner Verteilung in das Rückenmark zu untersuchen, die bisher unbekannte Eigenschaften von serotonergen supraspinal Wege aufzuzeigen wahrscheinlich ist. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Abbildung der serotonergen Fasern im Rückenmark der Maus die kombinierte CLARITY und CUBIC Techniken. Das Verfahren beinhaltet die Perfusion einer Maus mit einem Hydrogel-Lösung und Klärung des Gewebes mit einer combination Reagenzien zu löschen. Rückenmarksgewebe wurde in knapp zwei Wochen und die anschließende Immunfluoreszenzanfärbung gegen Serotonin gelöscht wurde in weniger als zehn Tagen abgeschlossen. Mit einem Multi-Photonen-Fluoreszenzmikroskop wurde das Gewebe abgetastet und ein 3D-Bild rekonstruiert wurde Osirix Software.

Dieser Abschnitt zeigt die Ergebnisse von Serotonin-Antikörper-Färbung in der transparenten Rückenmark der Maus eine Kombination aus der CLARITY und CUBIC-Protokolle. Wir zeigen , dass serotonerge Fasern in allen Schichten des Rückenmarks vorhanden sind , mit einer Vorherrschaft im ventralen Teil des ventralen Horn (Abbildung 1, siehe auch Video 1). Das Kontrollgewebe hatte keine positive Fasern (Ergebnis nicht gezeigt). Im ventralen Horn, dicht gepackte...

Supraspinale Projektionen sind wichtig für die Schmerzwahrnehmung und andere Verhaltensweisen, und serotonerge Fasern sind eines dieser Fasersysteme. Die vorliegende Studie konzentrierte sich auf die Anwendung des kombinierten CLARITY/CUBIC-Protokolls auf das Rückenmark der Maus, um die Terminierung dieser serotonergen Fasern zu untersuchen.

Imaging Serotonerge Fasern im Rückenmark der Maus Mit der CLARITY / CUBIC Technik

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Das übergeordnete Ziel dieses CLARITY/CUBIC-Experiments besteht darin, die dreidimensionalen Merkmale serotonerger Fasern im Maus-Rückenmark sichtbar zu machen, die mit herkömmlicher Histologie nicht beobachtbar sind. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neuroanatomie zu beantworten, beispielsweise wie serotonerge Fasern im gesamten Rückenmark verteilt sind. Die wesentlichen Vorteile dieser Technik liegen darin, dass serotonerge Fasern in situ beobachtet werden können, zusammen mit der Identifizierung von Vektoren, die mittels herkömmlicher Histologie nicht sichtbar sind.Obwohl diese Methode Einblicke in die Organisation des zentralen Nervensystems ermöglichen kann, lässt sie sich auch auf andere Systeme anwenden, beispielsweise auf das kardiovaskuläre System. Wir versuchten erstmals, diese Methode einzusetzen, als wir bei der Analyse serotonerger Fasern im Mausrückenmark an die Grenzen einer herkömmlichen Verfolgungsmethode stießen. Befestigen Sie zunächst die Gliedmaßen einer anästhesierten Maus an einer Kunststoff-Präparationsplatte in einer Abzugshaube.Überprüfen Sie das Fehlen einer Reaktion auf das Quetschen der Zehen und öffnen Sie mit einer Schere die Haut über dem Brustkorb. Öffnen Sie anschließend den Brustkorb, um das Herz freizulegen, und führen Sie eine 25-Gauge-Nadel, die an eine Schlauchpumpe angeschlossen ist, in den linken Ventrikel ein. Schneiden Sie das rechte Atrium an, um einen Austrittspunkt für das Blut zu schaffen.Waschen Sie dann das Herz mit 40 Milliliter 9-prozentiger Kochsalzlösung mit einer Geschwindigkeit von etwa 10 Milliliter pro Minute. Wenn das gesamte Blut ausgespült ist, perfundieren Sie das Tier mit 35 Milliliter frisch zubereiteter, eiskalter Hydrogel-Lösung mit derselben Perfusionsrate. Anschließend schneiden Sie die Haut über dem Rücken der Maus auf und dissezieren Sie die Muskeln neben den Wirbeln.Nachdem die Wirbelbögen auf einer Seite durchtrennt und auf die andere Seite umgeklappt wurden, entfernen Sie das Rückenmark mit einer feinen Schere aus der Wirbelsäule. Unmittelbar nach der Gewinnung wird das Rückenmark in 15 Milliliter frisch zubereitete Hydrogellösung über Nacht bei vier Grad Celsius gegeben. Am nächsten Tag werden 10 Milliliter des Hydrogels entfernt, und der Rest der Lösung zusammen mit dem Rückenmark in ein fünf Milliliter fassendes Gefäß umgefüllt.Frische Hydrogel-Lösung hinzufügen, bis das Röhrchen voll ist, und dann ein kleines Stück Parafilm über die Öffnung des Röhrchens spannen, wobei darauf geachtet werden muss, dass das Parafilm das Hydrogel berührt und keine Blasen zwischen der Lösung und dem Film entstehen. Das Entfernen von Luft aus dem Röhrchen ist der schwierigste Schritt. Um sicherzustellen, dass keine Blasen vorhanden sind, sollte das Röhrchen langsam mit der Hydrogel-Lösung gefüllt und das Parafilm anschließend vorsichtig über die Öffnung des Röhrchens gelegt werden, ohne dass das Gel verschüttet wird.Wickeln Sie nun ein zweites Stück Parafilm um den Hals des Röhrchens und inkubieren Sie das Rückenmark über Nacht in einem Ofen bei 37 Grad Celsius. Wenn die Hydrogellösung zu einem Gel geworden ist, verwenden Sie einen Schraubenschlüssel, um das Gel und das Nervengewebe aus dem Röhrchen zu entfernen. Um das Hydrogel vom Rückenmark zu lösen, drücken Sie kurz ein grobes Tuch gegen das Gel.Das Gel bleibt beim Herausnehmen am Gewebe haften. Wenn das Rückenmark sauber ist, legen Sie es für vier bis sechs Stunden in PBS und waschen es dabei auf einem Schüttler. Nach 24 Stunden schneiden Sie das Rückenmark mit einer Rasierklinge koronal in zwei bis drei Millimeter lange Segmente und überführen die Gewebestücke in fünf Milliliter frisch zubereitete CUBIC-Klärlösung.Schütteln Sie die Stücke 72 Stunden lang im 37-Grad-Celsius-Ofen und ersetzen Sie dann die dreitägige Klärungslösung durch frisch zubereitete Klärungslösung. Zwei bis drei Tage später überprüfen Sie die Transparenz des Gewebes anhand von Schriftgröße-8-Buchstaben auf Papier. Sobald die Buchstaben durch das geklärte Gewebe hindurch sichtbar sind, ersetzen Sie die CUBIC-Klärungslösung durch vier Milliliter frische PBST-Lösung und waschen viermal sechs Stunden lang.Um die Rückenmarkssegmente für die fluoreszenzbasierende Bildgebung zu färben, inkubieren Sie das Gewebe drei Tage lang in der entsprechenden Primärantikörperlösung auf einem Schüttler im 37-Grad-Celsius-Ofen. Am Ende der Primärantikörper-Färbung tauchen Sie das Gewebe zur Reinigung viermal für jeweils sechs Stunden in vier Milliliter PBST im 37-Grad-Celsius-Ofen ein. Danach ersetzen Sie das PBST durch die entsprechende Sekundärantikörperlösung und inkubieren das Gewebe weitere drei Tage lang auf dem Schüttler im 37-Grad-Celsius-Ofen.Am vierten Tag spülen Sie, wie gerade gezeigt, das nicht gebundene sekundäre Antik&ouml;rper mit PBST aus. Um die Segmente abzubilden, ersetzen Sie die letzte PBST-Waschung durch vier Milliliter 85-prozentiges Glycerin, um den Brechungsindex des Gewebes anzugleichen. Pr&uuml;fen Sie nach etwa einer Stunde die Durchsichtigkeit des Gewebes.Wenn das Gewebe durchsichtig ist, überführen Sie die Rückenmarksegmente auf einen großen, dünnen Objektträger. Geben Sie anschließend einige Tropfen 85-prozentiges Glycerin neben das Rückenmarkgewebe und bedecken Sie das Gewebe mit einem 22 mal 50 Millimeter großen Deckglas. Stellen Sie den Objektträger in den Halterahmen des Mikroskops und schieben Sie das Gewebe in den Lichtweg.Danach den Helium-Neon-Laser auswählen und die Helligkeit des positiven Signals im Live-Bild überprüfen, um die Laserintensität anzupassen. Bei optimaler Laserintensität mithilfe eines 20x-Objektivs den Scanning-Bereich des Rückenmarkgewebes auswählen. Anschließend das Gerät so einstellen, dass ein Z-Stack erstellt wird, wobei die Tiefe jedes einzelnen Stacks drei Mikrometer beträgt.Scannen Sie abschließend das Gewebe von der Oberseite bis zur Unterseite des Z-Stapels zuerst mit dem 20x-Objektiv und anschließend einen Z-Stapel-Scan mit dem 63x-Objektiv. Mit einer 3D-Software können dann entsprechende 3D-Videos rekonstruiert werden. Hier kann das Vorhandensein serotonerger Fasern in allen Laminae des Rückenmarks beobachtet werden, wobei ein Schwerpunkt im ventralen Bereich des Vorderhorns liegt.Im Vorderhorn sind dicht gepackte serotonerge Fasern im ventromedialen Bereich vorhanden, die sich in Richtung des lateralen Teils des Vorderhorns erstrecken, wobei sich einige der immunpositiven Fasern zusätzlich vom Vorderhorn in Richtung Hinterhorn oder Zentralrohr fortsetzen. Immunpositive Fasern finden sich in allen Laminae des Hinterhorns, allerdings besteht eine kleine Lücke zwischen den positiven Fasern in den Laminae zwei und vier, insbesondere im lateralen Teil des Hinterhorns. In einer horizontalen Schnittebene lassen sich dicht gepackte serotonerge Fasern im Vorderhorn entlang der Längsachse des Rückenmarks beobachten, die regelmäßig entlang der zur Faserbündelachse senkrechten Achse Zweige abgeben.Diese Äste verzweigen sich entlang ihres Verlaufs weiter in den seitlichen Bereich des Vorderhorns. Im Vergleich zu diesen Ästen sind diejenigen, die sich zur Mittellinie erstrecken, unregelmäßiger und kleiner. Unter dem 63x-Objektiv beobachtet man, dass die serotonergen Fasern im Hinterhorn entlang der Achse des Rückenmarks verlaufen und an verschiedenen Stellen entlang der Bahn, wo sie mit dicken Fasern enden, sporadisch zwischen den dünnen Fasern verteilt sind.Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie in weniger als drei Wochen abgeschlossen werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden, wie die Doppelfärbung mit Antikörpern gegen Cholinacetyltransferase, angewendet werden, um zusätzliche Fragen bezüglich der Frage zu beantworten, ob serotonerge Fasern Motoneurone terminieren. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher im Bereich der biomedizinischen Bildgebung, um die komplexen räumlichen Beziehungen zwischen verschiedenen Zelltypen in Tierpräparaten oder menschlichem Gewebe zu untersuchen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das Maus-Rückenmarkgewebe nach einer immunfluoreszenten Färbung für die 3D-Bildgebung klärt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Ein minimal-invasiven Protokoll, um die Maus Wirbelsäule zu stabilisieren und sich...

In-vivo-Imaging von der Maus Spinal Cord mit Zwei-Photonen-Mikroskopie

Quelle: Pekarek, B. T., et. al., Bildgebung und Quantifizierung von intakten neuronalen Dendriten mittels CLARITY Tissue Clearing. (2021)In diesem Video demonstrieren wir die Präparation, Bildgebung und Analyse eines gereinigten Mäusegehirns, um dendritische Dorne, die Morphologie der Wirbelsäule und die neuronale Verteilung mithilfe von konfokaler Mikroskopie und 3D-Rekonstruktionstechniken zu untersuchen.

Konfokalmikroskopische Bildgebung von intakten dendritischen Dornen und der Morphologie der Wirbelsäule in einem gereinigten Mausgehirn

Um hochauflösende Bilder von fluoreszenzmarkierten Zellen in großen Geweben zu erhalten, sollten idealerweise die biologischen Proben ohne Schnitte abgebildet werden. 3DISCO ist ein unkompliziertes Gewebereinigungsverfahren, das auf sequentieller Inkubation mit organischen Lösungsmitteln basiert. Nach der Freigabe werden die Organe transparent, was einen End-to-End-Laserscan der Probe ermöglicht.

Imaging Geräumte Intact Biological Systems auf zellulärer Ebene durch 3DISCO

In diesem Video, beschreiben wir ein Verfahren zum Implantieren einer chronischen optischen Abbildungskammer über der dorsalen Rückenmark von einer Live-Maus. Die Kammer, chirurgischen Eingriff und chronische Bildgebung werden überprüft und demonstriert.

Ein Verfahren für die Implantation eines Spinal Kammer für Längs In-vivo- Imaging der Maus Spinal Cord

Eine neue ex vivo Herstellung zum Abbilden der Rückenmark der Maus. Dieses Protokoll ermöglicht die Zwei-Photonen-Bildgebung von lebenden zellulären Interaktionen ganzen Rückenmark.

Zwei-Photonen-Imaging von Zelluläre Dynamik in der Maus Spinal Cord

Optische Clearing-Techniken revolutionieren die Art und Weise, wie Gewebe visualisiert wird. In diesem Bericht beschreiben wir Modifikationen des ursprünglichen CLARITY-Protokolls (Clear Lipid-exchange Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel), das konsistentere und kostengünstigere Ergebnisse liefert.

Optische Clearing der Maus Zentralnervensystem Passive CLARITY Verwendung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Anpassung der CLARITY-Methode des Hirngewebes für ganzklächige Netzhäute vor, um die Qualität der immunhistochemischen Standardfärbung und hochauflösenden Bildgebung von Netzhautneuronen und ihren subzellulären Strukturen zu verbessern.

Immunfärbung von Whole-Mount-Netzhäuten mit der CLARITY Tissue Clearing Methode

Neuronale dendritische Morphologie liegt oft der Funktion zugrunde. Tatsächlich manifestieren sich viele Krankheitsprozesse, die die Entwicklung von Neuronen beeinflussen, mit einem morphologischen Phänotyp. Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und leistungsfähige Methode zur Analyse intakter dendritischer Dornen und der dazugehörigen Stacheln.

Bildgebung und Quantifizierung intakter neuronaler Dendriten mittels CLARITY Tissue Clearing

Das Protokoll bietet eine detaillierte Methode der neuronalen Bildgebung in Gehirnschnitten unter Verwendung einer Gewebereinigungsmethode, ScaleSF. Das Protokoll umfasst die Vorbereitung des Hirngewebes, die Gewebeklärung, die Handhabung von abgeräumten Schnitten und die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie-Bildgebung neuronaler Strukturen von mesoskopischer bis mikroskopischer Ebene.

Eine Gewebereinigungsmethode für die neuronale Bildgebung von der mesoskopischen bis zur mikroskopischen Skala

Minimalinvasive Techniken und ein einfaches Laborgerät verbessern die Reproduzierbarkeit des Rückenmarksverletzungsmodells, indem sie operative Schäden an den Versuchstieren reduzieren und die Aufrechterhaltung der anatomischen Morphologie ermöglichen. Die Methode lohnt sich, weil die zuverlässigen Ergebnisse und das reproduzierbare Vorgehen die Untersuchung der Mechanismen der Krankheitsheilung erleichtern.

Etablierung eines Maus-Kontusionsmodells für Rückenmarksverletzungen basierend auf einer minimal-invasiven Technik

Lernen Sie die CLARITY/CUBIC-Technik zur 3D-Visualisierung serotonerger Fasern im Rückenmark der Maus. Diese Methode ermöglicht die in-situ-Beobachtung neuronaler Strukturen und liefert neue Erkenntnisse über die Neuroanatomie.

Imaging Serotonerge Fasern im Rückenmark der Maus Mit der CLARITY / CUBIC Technik

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