Name: Die Kultivierung humanen pluripotenten und Neurale Stammzellen in einem geschlossenen Zellkultursystem für Grund- und Präklinische Forschung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Lernen Sie die Kultivierung pluripotenter und neuraler Stammzellen in einem geschlossenen Zellkultursystem für maximale Sterilität und reproduzierbare Ergebnisse nach cGMP-Standards.

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Die Autoren möchten die Mitarbeiter der Biospherix für ihre Hilfe anzuerkennen, beim Erlernen der Xvivo geschlossenen Zellkultursystem zu verwenden, insbesondere Matt Freeman; das Personal von Miles &amp; Kelley Construction Company, Inc. für ihre Arbeit in der Labor-Infrastruktur, insbesondere Russ Hughes Einrichtung; die Mitarbeiter der Kinderkrankenhaus von Orange County Abteilung von Einrichtungen und Support Services für ihre Arbeit im Labor umbauen zu koordinieren, vor allem Adam Lukhard und Devin Hugie; die Mitarbeiter der Kinderkrankenhaus von Orange County Abteilung für Informationssysteme für ihre Hilfe bei der Datenmanagement-Infrastruktur und Remote-Zugriff, insbesondere Viet Tran Einrichtung; Kinderkrankenhaus von Orange County Executive Management Team für ihre langjährige Unterstützung des Projekts, vor allem Dr. Maria Minon und Brent Dethlefs. Diese Arbeit wurde von Kinderkrankenhaus von Orange County und dem California Institute for Regenerative Medicin finanzierte durch Gewährung TR3-05476 zu PHS. Alle Autoren trugen gleichermaßen zu dieser Arbeit.

<ol><li>Brick, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Autism+Spectrum+Disorders+Stem+Cell+Resource+at+Children%27s+Hospital+of+Orange+County%3A+Implications+for+Disease+Modeling+and+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl.Med%22%5BJournal%5D)">The Autism Spectrum Disorders Stem Cell Resource at Children's Hospital of Orange County: Implications for Disease Modeling and Drug Discovery.</a> Stem Cells Transl.Med. 3 (11), 1275-1286 (2014).</li>
<li>Nethercott, H. E., Brick, D. J., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+induced+pluripotent+stem+cells+by+lentiviral+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">Derivation of induced pluripotent stem cells by lentiviral transduction.</a> Methods Mol.Biol. 767, 67-85 (2011).</li>
<li>Pistollato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+HIF1alpha+repress+the+differentiative+effects+of+BMPs+in+high-grade+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and HIF1alpha repress the differentiative effects of BMPs in high-grade glioma.</a> Stem Cells. 27 (1), 7-17 (2009).</li>
<li>Pistollato, F., Chen, H. L., Schwartz, P. H., Basso, G., Panchision, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+tension+controls+the+expansion+of+human+CNS+precursors+and+the+generation+of+astrocytes+and+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Oxygen tension controls the expansion of human CNS precursors and the generation of astrocytes and oligodendrocytes.</a> Mol.Cell Neurosci. 35, 424-435 (2007).</li>
<li>Raval, J. S., Koch, E., Donnenberg, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+non-viable+airborne+particles+correlates+with+airborne+colonies+and+represents+an+acceptable+surrogate+for+daily+assessment+of+cell-processing+cleanroom+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of non-viable airborne particles correlates with airborne colonies and represents an acceptable surrogate for daily assessment of cell-processing cleanroom performance.</a> Cytotherapy. 14 (9), 1144-1150 (2012).</li>
<li>Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+stem+cell+therapies+for+neurological+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.Rev.Neurother%22%5BJournal%5D)">The potential of stem cell therapies for neurological diseases.</a> Expert.Rev.Neurother. 6, 153-161 (2006).</li>
<li>Schwartz, P. H., Brick, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+therapies+for+the+lysosomal+storage+diseases+-+the+quintessential+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.Stem+Cell+Res.Ther%22%5BJournal%5D)">Stem cell therapies for the lysosomal storage diseases - the quintessential neurodegenerative diseases.</a> Curr.Stem Cell Res.Ther. 3 (2), 88-98 (2008).</li>
<li>Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traditional+human+embryonic+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">Traditional human embryonic stem cell culture.</a> Methods Mol.Biol. 767, 107-123 (2011).</li>
<li>Stover, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process-based+expansion+and+neural+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+for+transplantation+and+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci.Res%22%5BJournal%5D)">Process-based expansion and neural differentiation of human pluripotent stem cells for transplantation and disease modeling.</a> J Neurosci.Res. 91 (10), 1247-1262 (2013).</li>
<li>Stover, A. E., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+feeder-free+conditions+in+chemically+defined+medium+with+enzymatic+single-cell+passaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging.</a> Methods Mol.Biol. 767, 137-146 (2011).</li>
<li>Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+enhances+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5 (3), 237-241 (2009).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Zellen innerhalb der CPF gewachsen sehen keine Veränderungen in Sauerstoff oder Kohlendioxid-Konzentrationen, wie sie von Inkubator bewegen Kammer zu Behandlungskammer zu Mikroskop und zurück. Es ist wichtig, dass die Bedingungen in jeder Kammer an den jeweiligen Inkubator abgestimmt sind, in dem die Zellen gehalten werden, bevor die Zellen aus dem Inkubator entfernt werden. Die Atmosphäre innerhalb der Vorrichtung kontinuierlich HEPA-gefilterten und ist anpassbar in bezug auf Sauerstoff und Kohlendioxid-Konzentrationen. Zellen können in Standardkonzentrationen für PSCs oder NSC, 5% und 9%, jeweils aufgewachsen werden; oder alternative Konzentrationen können für verschiedene Zelltypen oder für bestimmte Experimente ausgewählt werden. Somit ist die Vorrichtung mit konstantem Quellen medizinischer Qualität Sauerstoff, Kohlendioxid und Stickstoff (Figur 4) zugeführt wird . Alle drei dieser Gase werden durch gasspezifische Verteilersysteme geliefert, die die konstante Versorgung gewährleisten. Die Vorrichtung ist außerdem mit einem Kalibriergas zugeführt Mischung, bestehend aus10% (± 0,01%) Kohlendioxid in Sauerstoff. Die Verteilersysteme sind außerhalb der Zelle Produktionsanlage untergebracht ist und die Gase in die Anlage durch die Decke geleitet. Das Kalibrierungsgas wird innerhalb der Anlage untergebracht. Das Gerät ist zusätzlich mit Hausvakuum, auch durch die Decke geliefert. Mit einem elektronischen Überwachungssystem und drahtlose Sendeeinheiten werden die Ausgangsdrücke aller Sammelleitungen ständig überwacht. Im Falle, dass jeder Druck außerhalb des Bereichs fällt, werden die Zellproduktionsanlagenbetreiber automatisch angerufen und mitgeteilt, so dass entsprechende Maßnahmen ergriffen werden können. Der Energiebedarf der Vorrichtung werden durch sechs dedizierte 120 V-Stromkreise erfüllt die von der Decke herabfahren und des Krankenhauses Back-up-Generatoren verbunden, um eine konstante Versorgung zu gewährleisten. Der Betrieb der Vorrichtung wird über die Software auf einem PC-basierten Computer über eine unterbrechungsfreie Stromversorgung mit Strom versorgt gesteuert. Diese Macht und Computeranordnungensicherzustellen, dass die Systemfunktionen kontinuierlich auch im Falle eines öffentlichen Netzsystemausfall. Die Software die Steuervorrichtung hat eine benutzerfreundliche graphische Schnittstelle (Abbildung 1) , die ebenso wie Temperatur, Feuchtigkeit, und die Kammer ermöglicht Drücke für die Kontrolle von Sauerstoff- und Kohlendioxidkonzentrationen. Die Werte aller dieser Parameter werden kontinuierlich eine laufende Aufzeichnung aller Geräteparameter zur Verfügung zu stellen aufgezeichnet. Diese Daten werden jede Nacht auf einem Remote-Server gesichert, um ihre Integrität zu schützen. Der Computer und die Software kann von Administratoren Remote-Zugriff zu bewerten und / oder jeden Parameter ändern. Darüber hinaus kann der Computer und Software aus der Ferne zugegriffen werden kann, interaktive Beurteilung von Geräteparametern ermöglicht und mit lokalen Benutzern zur Fehlerbehebung. Eine zusätzliche Alarm-Sendeeinheit ist mit dem Gerät verbunden, so dass die Zellproduktion Anlagenbetreiber jeglicher Out-of-Range-Zustand des Gerätes informiert werden. Der RAS-capabilities lassen sich einloggen und Beurteilung der Besonderheiten des Out-of-Range-Zustand. Die Vorrichtung ist als modulares System entwickelt, um sowohl in einer Makro- und einer Mikro Sinn. Einzelnen Zellkulturmodule wie Inkubatoren und Behandlungskammern können in Bezug auf ihre Abmessungen und Anforderungen sowie in deren Anordnung in Bezug zueinander angepasst werden. Darüber hinaus sind die meisten der Steuerfunktionen der einzelnen Module selbst modular, so daß einzelne atmosphärische Gasregler, beispielsweise kann leicht ohne wesentliche Störung des Systems ausgetauscht werden. Spezialisierten Verarbeitungskammern, beispielsweise eine für die mikroskopische Visualisierung und Manipulation von Zellkulturen, an das System leicht angepasst werden. Sowohl Phasenkontrast und Fluoreszenzmikroskop sind innerhalb des Systems (Figur 6) , so daß Zellen können lebende gefärbt werden, und Kolonien können in den gleichen atmosphärischen Bedingungen wie im Inneren t zerlegt werdener Inkubatoren. Verlegen von Kabeln durch abgedichtete Durchführungen in den Seitenwänden der Behandlungskammer ermöglicht Geräten wie Stromversorgungen und Computer außerhalb der Vorrichtung gehalten werden, in der Regel auf einem Wagen (6). Die Behandlungskammern in der Zellproduktionsanlage haben einen anderen Luftstrom Muster als herkömmliche BSCs. Bei herkömmlichen BSCs fließt Luftstrom von einem zentralen Abluftöffnung nach unten und spaltet sich in zwei getrennte Ströme, die dann durch zwei verschiedene Belüftungsöffnungen im vorderen und hinteren Teil des Kabinetts des Boden aufgenommen. Im Gegensatz dazu hat das CPF eine einzige Entlüftungsöffnung in dem vorderen Teil der Decke. Luft strömt nach unten und in Richtung der Rückseite der Kammer, wo sie dann nach oben in eine Lufteinlassöffnung gesaugt wird. Obwohl die CPF von Natur aus sehr sauber ist, ist dieser einzigartige Luftstrom Muster bedeutet, dass Techniker müssen leicht ihre Technik anpassen das Risiko einer Kontamination zu reduzieren. Wie bei einem herkömmlichen BSC, ein Laborant should vermeiden, dass ihre Hände vor offenen Zellkulturplatten und Medien Flaschen platzieren. Jedoch, die die Richtung stromaufwärts wurde in dem CPF verändert Die Zellproduktionsstätte Labor selbst ist ziemlich Standard und ist mit einem -20 ° C Gefrierschrank ausgestattet, einem -80 ° C Gefrierschrank, 4 ° C Kühlschrank, eine Zentrifuge und ein Wasserbad. Das Labor hat auch ein Waschbecken mit Fußschalter für die bequeme Freisprechbetrieb. Um diesem Labor eine funktionelle klinischen Zellproduktionsstätte zu werden, müssen jedoch einige zusätzliche Modifikationen noch vorgenommen werden. Erstens muss die Vorrichtung selbst aufgerüstet werden, um die Fähigkeit zu haben, flüchtige organische Verbindungen, Partikel zu überwachen, und die Konzentrationen an Chlordioxid, die zur Dekontamination eingesetzt wird. Zweitens wird eine Verarbeitungskammer mit einer FACS-Maschine enthält, kann über einen Puffermodul mit dem Rest der Vorrichtung untergebracht und angeschlossen werden. Dies wird für die Zellsortierung und Reinigung von tr ermöglichenansplantable Zellpopulationen unter den entsprechenden Umgebungsbedingungen. Schließlich muss die gesamte Vorrichtung innerhalb einer weichen Wand Reinraum untergebracht werden. Dies sorgt für eine Internationale Organisation für Normung (ISO) Klasse 8 - Umgebung für die Vorrichtung 5. Die hohe Sterilität und computergesteuerten Charakter des CPF macht es zum idealen System für zukünftige Anwendungen mit zellbasierten Therapie und gute Herstellungsverfahren. Das Risiko einer Kontamination stark abgeschwächt, aber noch wichtiger, sind die Bedingungen für die Zellexpansion automatisch erfasst und durch das Computersystem archiviert. Abweichungen in Gaskonzentrationen, Temperatur, Feuchtigkeit und allen Ereignissen des Zugangs in das System werden rigoros dokumentiert. Dies kann erheblich dazu beitragen, wenn das Produkt Qualitätsprobleme zu untersuchen. Jedoch gibt es immer noch Beschränkungen auf. Die Verwendung von irgendwelchen und allen Reagenzien und Verbrauchsmaterialien (zB Medienkomponenten, Pipetten, Platten) sind separat zu dokumentieren. Hinzufügenitionally, gibt es eine Vielzahl von möglichen Problemen (einschließlich vieler Formen menschlicher Fehler), die durch das Überwachungssystem entstehen können, welche die CPF dokumentiert den Variablen völlig unabhängig sind. Somit bleibt der Bedarf an hoch qualifiziertes Personal und ausführliches Handbuch Dokumentation von Aufgaben an Ort und Stelle.

Standard-Stammzellkulturtechniken leiden unter mehreren Umwelteinflüssen, die die Zellen übermäßig belasten und die Zellen inakzeptablen Kontaminationsrisiken aussetzen. Zu den Belastungen, denen Zellen unter Standard-Zellkulturbedingungen ausgesetzt sein können, gehören steile Veränderungen der Kohlendioxid- und Sauerstoffkonzentrationen3,4. Dies geschieht, wenn die Zellen aus dem Inkubator in die Biosicherheitswerkbank und/oder das Mikroskop gebracht werden, was für die Zellen möglicherweise nicht optimal ist. Frühere Studien haben die Vorteile der Kultivierung sowohl pluripotenter als auch neuraler Stammzellen unter hypoxischen Bedingungen bestätigt4,11, und für beste Ergebnisse müssen diese Bedingungen kontinuierlich sein. Darüber hinaus ist das Risiko einer zellulären Kontamination höher, da die Laborumgebung und das Personal bei fast jedem Schritt ihrer Kultivierung und Manipulation auf die Zellen einwirken. Herkömmliche Reinräume sind eine wirksame Methode, um das Kontaminationsrisiko erheblich zu verringern, aber sie sind teuer, haben einen großen Platzbedarf und können Stressfaktoren im Zusammenhang mit Kohlendioxid- und Sauerstoffkonzentrationen nicht berücksichtigen. 
Eine Zellproduktionsanlage, die sowohl Kontaminationsrisiken als auch Gaskonzentrationen abdecken kann und die qualifiziert werden kann, die cGMP-Kriterien9 zu erfüllen, bietet hochwertige Zellen für die Grundlagenforschung sowie für klinische Anwendungen1,6,7. Eine solche Zellproduktionsanlage besteht mindestens aus den folgenden Komponenten: einer Prozesskammer, die als beheizter Arbeitsbereich für die Zuführung und Manipulation von Zellkulturen dient; eine Laminar-Flow-Haube für die Erststerilisation von Reagenzien, Röhrchen und Werkzeugen; zwei Pufferschleusenkammern zwischen der Haube und der Prozesskammer; zwei Zellkultur-Inkubatoren, die von der Prozesskammer aus zugänglich sind; eine Mikroskopkammer, die an die Prozesskammer angrenzt; und schließlich Computersoftware, um die Bedingungen innerhalb dieser Module einzustellen und zu überwachen. Mit dieser grundlegenden Infrastruktur kann eine Vielzahl von Aufgaben durchgeführt werden, wie z.B. die Standardfütterung und Passage von pluripotenten Stammzellen und multipotenten neuralen Stammzellen, aber auch speziellere Methoden wie Sendai-Virus-basierte Reprogrammierung, in vitro Migrationsstudien und die Differenzierung von neuralen Stammzellen für die elektrophysiologische Charakterisierung.

<table><tbody><tr><td>Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xvivo System</td><td>Biospherix</td><td>custom made</td><td></td></tr><tr><td>Xvivo Software</td><td>Biospherix</td><td>Version i.o.2.1.2.1</td><td></td></tr><tr><td>O2 Verteiler</td><td>Amico</td><td>P-M2H-C3-S-U-OXY</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Verteiler</td><td>Amico</td><td>M2H-C3-D-U-CO2</td><td></td></tr><tr><td>N2 Verteiler</td><td>Western Innovator</td><td>CTM75-7-2-2-BM</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop mit DP21 Kamera und Fluoreszenz</td><td>Olympus Corporation</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td><>Unternehmen</td><td>Katalognummer<</td><td>strong>Kommentare</td></tr><tr><td>Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>StemPro hESC Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>A100006-01</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Millipore</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>phosphatgepuffertes</td><td>Natriumhyklon</td><td>9236</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2</td><td>Forschung & Forschung D Systems</td><td>AFL233</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Protid</td><td>PP1130</td><td></td></tr><tr><td>Zelldissoziationspuffer auf Hank-Basis</td><td>Life Technologies</td><td>13150-016</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Epidermaler Wachstumsfaktor</td><td>R& D Systems</td><td>AFL236</td><td></td></tr><tr><td>Oct-3/4 Antikörper</td><td>Millipore</td><td>AB3209</td><td></td></tr><tr><td>TRA-1-60 Antikörper</td><td>Millipore</td><td>MAB4260</td><td></td></tr><tr><td>SSEA4 Antikörper</td><td>Millipore</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>BIT-9500 Serum Supplement</td><td>Stemcell Technologies</td><td>9500</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company </td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Verbrauchsmaterialien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 ml Serologische Pipette</td><td>VWR</td><td>89130-894</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Serologische Pipette</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-102</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Serologische Pipette</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-104</td><td></td></tr><tr><td>25 ml serologische Pipette</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-106</td><td></td></tr><tr><td>50 ml serologische Pipette</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-107</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platte</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>12-Well-Platte</td><td>Corning</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>T25 Flasche</td><td>TPP</td><td>90026</td><td></td></tr><tr><td>T-75 Flasche</td><td>TPP</td><td>90076</td><td></td></tr><tr><td>20 & Mikro; l Pipettenspitzen</td><td>Eppendorf</td><td>22491130</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; l Pipettenspitzen</td><td>Eppendorf</td><td>22491148</td><td></td></tr><tr><td>1.000 Pipettenspitzen</td><td>Eppendorf</td><td>22491156</td><td></td></tr><tr><td>Kryofläschchen</td><td>Thermo Scientific</td><td>5000.102</td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>BDH</td><td>BDH1164-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Sanimaster 4</td><td>Ecolab</td><td>65332960</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Clorox</td><td>A714239</td><td></td></tr></tbody></table>

die kultivierung humanen pluripotenten und neurale stammzellen in einem geschlossenen zellkultursystem für grund- und präklinische forschung

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Dieser Artikel beschreibt, wie ein speziell hergestelltes, kommerziell erhältliches geschlossenes Zellkultursystem für die Grundlagen- und präklinische Forschung verwendet wird. Biosicherheitswerkbänke (BSCs) und Inkubatoren sind seit langem der Standard für die Kultivierung und Erweiterung von Zelllinien für die Grundlagen- und präklinische Forschung. Da sich der Schwerpunkt vieler Stammzelllabore jedoch von der Grundlagenforschung zur klinischen Translation verlagert, werden zusätzliche Anforderungen an das Zellkultursystem gestellt. Alle Prozesse müssen gut dokumentiert sein und stellen außergewöhnliche Anforderungen an Sterilität und Reproduzierbarkeit. In herkömmlichen Inkubatoren schwanken die Gaskonzentrationen und Temperaturen stark, wenn die Zellen zur Fütterung, Passage oder anderen Manipulationen entnommen werden. Solche Unterbrechungen tragen zu einer Umgebung bei, die nicht dem Standard für cGMP- und GLP-Richtlinien entspricht. Diese Unterbrechungen müssen vor allem dann minimiert werden, wenn Zellen zu therapeutischen Zwecken genutzt werden. Die Motivation, von dem Standard-BSC- und Inkubatorsystem zu einem geschlossenen System überzugehen, besteht darin, dass solche Unterbrechungen vernachlässigbar gemacht werden können. Geschlossene Systeme bieten einen Arbeitsraum, um Zellkulturen zu füttern und zu manipulieren und sie in einer kontrollierten Umgebung zu halten, in der Temperatur und Gaskonzentrationen konstant sind. Auf diese Weise können pluripotente und multipotente Stammzellen vom Zeitpunkt ihrer Gewinnung bis zu ihrem endgültigen Einsatz in der Therapie in optimaler Gesundheit erhalten werden.

Dieses Manuskript beschreibt im Detail eine Zelle Produktionsstätte, und die einzigartigen Aspekte von Zellen in einem geschlossenen System kultiviert werden. Der Großteil der Zellproduktionsstätte umfasst eine maßgeschneiderte, beiliegend, Zellkulturvorrichtung , die eine kleine Stellfläche und lässt sich in 6 x 7,5 m 2 Zimmer (2) untergebracht werden. Zu keinem Zeitpunkt sind die Zellen innerhalb der Vorrichtung ausgesetzt Laborpersonal oder der Umgebung. Die Vorrichtung besteht aus mehreren Modulen: eine Prozesskammer, eine Laminarströmungshaube, 2 Pufferung Schleusenkammern zwischen der Haube und der Prozesskammer, zwei Zellkultur - Inkubatoren, und einem Mikroskopkammer benachbart zu der Prozesskammer (3). Das System wird durch Software gesteuert , so dass Umgebungsvariablen (Figur 1) gesteuert und überwacht werden. Der Computer mit dieser Software läuft auf einer unterbrechungsfreien Stromversorgung. Die Gase werden in th gefüttertE - System durch eine Reihe von Verteilern für Sauerstoff, Stickstoff und Kohlendioxid (Abbildung 4). Gase für das Gerät sind durch Verteilersysteme geliefert, die zwei Sätze von Tanks haben jeweils - ein aktives Set und ein Reservesatz. Wenn der aktive Satz wird nach unten gezogen, schaltet der Verteiler automatisch an die Reserve eingestellt und das Personal Tanks, um Ersatz. Die Leistung ist auf einem Backup-Generator-System. Pluripotente und neurale Stammzellen können in hypoxischen Bedingungen in dieser Anlage unter Verwendung von zuvor entwickelten Protokolle 9, mit den zusätzlichen Komplikationen inhärenten dem neuen Gerät angebaut werden. Pluripotente Stammzellen können mit Sendai-Virus abgeleitet werden, Pluripotenz-spezifische Antikörper unter Verwendung von vollständig transfizierten Kolonien zu identifizieren, die dann isoliert und expandiert. (5A und B), Aus diesen iPSCs, neuralen Stammzellen und Neuronen kann mit dual SMAD Inhibierung abgeleitet werden, und deren Phänotyp prüft usi<html> ng NSC-spezifischen Antikörpern (5C und D). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig1.jpg" /> Abbildung 1. Grafische Oberfläche für die Zellproduktionsanlage. (A) Die graphische Darstellung des CPF ist der Standardbildschirm und stimmt mit der CAD - Zeichnung in Abbildung 3 dargestellt. Ein Klick der Maus über das Puffermodul 1 (2F in Abbildung 1) öffnet seine Kontrollbildschirm (B) , wobei O 2 Werte eingestellt werden , um die Bearbeitungskammer (3 in Abbildung 3) zu entsprechen. In ähnlicher Weise auf der Prozess klicken Kammer oder Incubator 1 bringt ihre jeweiligen Steuerbildschirme (C bzw. D), wo Werte geändert werden können , oder in angemessener Weise überwacht.<html> rget = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig2.jpg" /> Abbildung 2. Die Zellproduktionsanlage. (A) Das System , wie aus einer Ansicht von vorne rechts gesehen. Beachten Sie die Strom- und Gasanschlüsse in der Decke und den Wagen mit den Mikroskop-Zubehör und Computer auf der rechten Seite. (B) Die Laminarströmungshaube mit den Zugangstüren zu den Puffermodulen an der rechten Seite zu sehen. (C) Die Prozesskammer mit den beiden Inkubatoren (schwarze Türen) auf der Rückseite gesehen. (D) Ein Blick durch die rechte Seite des Systems , das Mikroskop zeigt und Monitor mit den Türen zu den Pufferkammern in der Ferne zu sehen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> t &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig3.jpg" /> Abbildung 3. Ein CAD ​​- Zeichnung der Zellproduktionsanlage. Alle Einzelteile in das Gerät gelangen zunächst mit Alkohol und luftgetrocknet , in der Laminar - Flow - Haube (1) abgewischt. Die Artikel werden dann auf die geeignete Atmosphäre im vorderen Puffermodul (2F) überführt, bevor sie in das UCPC Modul übergeben wird, oder Prozesskammer (3). Zellen werden in den beiden Inkubatoren (4, 5). Lebendzellfärbung, Kolonie Kommissionierung, die Beurteilung der allgemeinen Zellmorphologie und Migrationsanalyse erfolgt in der UPC - Modul oder Mikroskopkammer (6). Schließlich Abfall das System durch den hinteren Puffermodul (2R) austritt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> &lt;<html> / P&gt; <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig4.jpg" /> Abbildung 4. Quellen von Gasen und Energie. (A) Die CO 2 Verteiler ist ein 4 x 4 - Setup , da es alle Inkubatoren des Labors liefert. (B) Der O 2 Verteiler ist ein 2 x 2 - Setup und liefert nur die Zellproduktionsanlage. Stickstoff für das System wird in einem Verdampfer erzeugt wird (C, knapp unterhalb des Ausgangszeichen) , die an einem flüssigen Stickstoffverteiler (nach rechts) , die auch cryofreezers (unten links) füllt automatisch. Der Verteiler ist ein 2 x 2-Setup durch zwei Paare von 160 L flüssigem Stickstoff Tanks zugeführt wird. CO 2, O 2 und N 2 werden von der Decke durch Absperrungen (D) zugeführt wird . Hausvakuum wird auch an dieser Stelle zugeführt wird. Gesehen direkt hinter den Versorgungsgasabschaltungen ein Paar von Stromkabeln, die Stromversorgung des Systems liefern.f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig4large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig5.jpg" /> Abbildung 5. pluripotenten Stammzellen in Hypoxie mit Sendai - Virus stammt. (A) SC187-SF4-2I0-E3 iPSCs iPSCs (Nomenklatur in Stover gefunden et al. 9), Phasenkontrast 10X. (B) SC88.1-UH1-2I0 iPSCs Live-gefärbt mit AF-594-markiertem Tra-1-60, 1: 100 Verdünnung in Medien. Alle iPSCs wurden in der Zellproduktion in 5% O 2 mit Sendai - Virus transduziert. (C) Phasenkontrast-SC68.1 UH0-2I0-M0S13-N2G6 iPSC abgeleitetes NSC, bei 5% O 2 in chamber slides gezüchtet. Die Zellen wurden dann in 4% Paraformaldehyd fixiert und mit anti-human Nestin primären Antikörper und Alex-488 sekundärem Antikörper gefärbt. Alle Maßstabsbalken sind bei 100. 1, m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Hier ist ein Protokoll zur Züchtung von pluripotenten Stammzellen (PSC) und neuralen Stammzellen (NSC) in einem geschlossenen Zellkultursystem, das maximale Sterilität und Reproduzierbarkeit ermöglicht und die traditionelle Biosicherheitswerkbank und den Inkubator ersetzt. Dieses Gerät entspricht den Richtlinien der Clinical Good Manufacturing Practice (cGMP) und der Clinical Good Lab Practice (cGLP).

Die Kultivierung humanen pluripotenten und Neurale Stammzellen in einem geschlossenen Zellkultursystem für Grund- und Präklinische Forschung

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Das übergeordnete Ziel bei der Verwendung dieser Ausrüstung besteht darin, Stammzellen unter definierten atmosphärischen Bedingungen mit maximaler Sterilität zu kultivieren. Heute werden wir die Anwendung einer geschlossenen Zellkultur-Anlage demonstrieren, die eine exakte Kontrolle über die Parameter der Zellkultur ermöglicht. In unserem Labor nutzen wir diese Anlage zur Kultivierung von multipotenten und pluripotenten Stammzellen.Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass die Zellen unabhängig von ihrem jeweiligen Ort während der gesamten Bearbeitung einer konstanten Umgebung ausgesetzt sind. Egal, ob man die Zellen bearbeitet, sie im Inkubator hält oder am Mikroskop untersucht – ihre Sauerstoff- und CO2-Exposition sowie die Temperaturen bleiben während des gesamten Zyklus konstant. Die Durchführung des Verfahrens wird Alexander Stover, ein wissenschaftlicher Mitarbeiter in meinem Labor, demonstrieren.Um dieses Verfahren zu beginnen, klicken Sie auf ein Modul, um die Gas­konzentration einzustellen. Klicken Sie im neuen Fenster, das die aktuellen Einstellungen anzeigt, unter „Setpoint“ auf den vorhandenen Sollwert für Sauerstoff und geben Sie die erforderliche Sauerstoff­konzentration für dieses Modul ein. Bestätigen Sie anschließend den Sollwert durch Klicken auf das grüne Häkchen.Wiederholen Sie diesen Schritt für Kohlendioxid und geben Sie einen Sollwert von 5 % Kohlendioxid für alle Module ein, mit Ausnahme der Pufferkammern, die nur für Sauerstoff einstellbar sind. Überwachen Sie danach die aktuellen Gas-konzentrationen, die als Prozesswerte gekennzeichnet sind, um sicherzustellen, dass sie die neuen Sollwerte erreichen. Anschließend stellen Sie die Gassollwerte aller Module auf die jeweils geeigneten Werte ein.Passen Sie die Kohlendioxid- und Sauerstoffkonzentrationen der Kammern an, die miteinander in Kontakt gebracht werden sollen. Zum Beispiel sollte die Prozesskammer auf 5 % Sauerstoff eingestellt werden, bevor ein Inkubator geöffnet wird, in dem Zellen bei 5 % Sauerstoff kultiviert werden. Stellen Sie außerdem die Pufferkammer, die zum Hinzufügen von Materialien in die Prozesskammer verwendet wird, auf 5 % Sauerstoff ein.Stellen Sie anschließend mithilfe desselben Bildschirms für Gasanpassungen die Temperatur der Prozesskammer auf 37 Grad Celsius ein. Danach stellen Sie die Temperatur des Bodens der Prozesskammer auf 37 Grad Celsius ein. Klicken Sie auf die Inkubationsmodul-Bänke unterhalb jedes Inkubators und stellen Sie die Temperatur der Bänke auf 37 Grad Celsius ein.Sprühen Sie im laminaren Flusswerk alle in das System eingebrachten Materialien mit 70 %igem Ethanol ein und lassen Sie sie trocknen. Wischen Sie Zellkulturgefäße oder -platten vorsichtig mit einem sterilen Mulltupfer ab, der mit 70 %igem Ethanol gesättigt ist. Stellen Sie anschließend sicher, dass sowohl die äußere als auch die innere Tür der Pufferkammer sicher geschlossen sind, öffnen Sie dann die äußere Tür, stellen Sie die Gegenstände hinein und schließen Sie sie wieder.Wählen Sie mit der Software das Puffermodul aus und klicken Sie auf den Reiter Verdünnungsfaktor. Geben Sie eine Eins in das Feld Log-Faktor ein und klicken Sie anschließend auf Start. Sobald die grafische Benutzeroberfläche mit dem Blinken des Verdünnungsfaktors aufhört, öffnen Sie die innere Tür der Pufferkammer und bringen Sie die Materialien in die Prozesskammer.Um Gegenstände aus der Prozesskammer zu entfernen, stellen Sie zunächst sicher, dass die Pufferkammer einem Verdünnungsfaktor unterzogen wurde. Öffnen Sie dann die innere Tür, legen Sie die zu entfernenden Gegenstände hinein und schließen Sie sie. Danach öffnen Sie die äußere Tür und nehmen die Gegenstände heraus. Stellen Sie drei Petrischalen in das Wasserfach an der Unterseite jedes Inkubators. Füllen Sie diese Schalen mit steriler Flüssigkeit auf und halten Sie den Wasserstand in diesen Schalen aufrecht, da sie entscheidend für die Aufrechterhaltung des eingestellten relativen Feuchtepegels im Inkubator sind. Klicken Sie in der grafischen Benutzeroberfläche auf den Inkubator.Klicken Sie anschließend auf den vorhandenen Wert für die relative Luftfeuchtigkeit unter dem Sollwert und geben Sie 85 % ein. Klicken Sie dann auf das grüne Häkchen, um diesen Wert zu bestätigen. Danach stellen Sie die Gas-Sollwerte in den Pufferkammern, der Prozesskammer und einem Inkubator entsprechend der Art der einzuführenden Zellen ein. Reinigen Sie die Oberfläche der Prozesskammer mit steriler Mullbinde und einem nicht brennbaren Desinfektionsmittel, beispielsweise einem Produkt auf Basis von Benzalkoniumchlorid.Reinigen Sie anschließend die Handschuhe und Oberflächen, die häufig berührt werden, wie beispielsweise Türgriffe. Danach reinigen Sie die Oberfläche des Laminar-Flow-Hoods und der Pufferkammer mit 70 %igem Ethanol und lassen Sie diese trocknen. Anschließend stellen Sie den Kolben oder die Zellkulturplatte in den Haubenraum und wischen kurz die äußere Oberfläche mit einem sterilen Gazetupfer, das mit Ethanol getränkt ist.Danach den Kolben oder die Platte in die Pufferkammer stellen und einen Verdünnungsfaktor durchführen. Unmittelbar nach Abschluss den Kolben oder die Platte in den entsprechenden Inkubator transferieren. Da sich der Inkubator am hinteren Ende der Prozesskammer befindet, ein Fach in die Prozesskammer herausziehen, um die Zellen abzulegen, und vermeiden, dass die Inkubatortüren unnötig über längere Zeiträume geöffnet bleiben.In diesem Schritt bereiten Sie das Zellkulturmedium vor. Lassen Sie das Medium 20 Minuten lang in einem leicht geöffneten Behälter, damit es sich mit den Kohlendioxid- und Sauerstoffkonzentrationen im System anreichern kann. Danach entfernen Sie das alte Medium aus den Vertiefungen.Bei pluripotenten Stammzellen entfernen Sie nahezu das gesamte alte Medium, wobei eine kleine Menge des alten Mediums verbleibt, um eine Austrocknung während des Fütterungsprozesses zu verhindern. Bei neuralen Stammzellen entfernen Sie die Hälfte des alten Mediums. Anschließend geben Sie frisches Medium in die Zellkulturplatten und stellen die Platten in den dafür vorgesehenen Inkubator zurück.Hier ist ein Bild der iPSCs zu sehen. Dargestellt sind die iPSCs, die lebend mit AF594-markiertem Trial 160 im Verdünnungsverhältnis 1:100 in Medium gefärbt wurden. Alle iPSCs wurden in der Zellproduktionsstätte unter 5 % Sauerstoff mit Sendai-Virus transduziert.Und hier ist das Phasenkontrastbild von aus iPSCs abgeleiteten neuronalen Stammzellen, die in Kammerobjektträgern bei 5 % Sauerstoff kultiviert wurden. Die Zellen wurden anschließend mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und mit einem primären Anti-humanen Nestin-Antikörper sowie einem sekundären Alexa Fluor 488-Antikörper gefärbt. Wenn man diese Methoden beherrscht, können sie bei korrekter Durchführung innerhalb von zwei Stunden durchgeführt werden.Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Gas-Konzentrationen vor Beginn korrekt einzustellen. Nach dem Verfahren können weitere Methoden wie die Umprogrammierung und Differenzierung angewendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise den Einfluss von Hypoxie auf Pluripotenz oder Multipotenz. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern im Bereich der Stammzellbiologie den Weg, um klinische Zellproduktion zur Behandlung pädiatrischer neurodegenerativer Erkrankungen zu erforschen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Die Fähigkeit, menschliche neurale Stammzellen / Vorläuferzellen (hNSPCs) in vitro zu manipulieren, um ihre Eignung als Zelltransplantaten für therapeutische Zwecke zu untersuchen und für die menschliche Entwicklung des Nervensystems zu erforschen. Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Kultivierung und Passagierung hNSPCs in der Hoffnung, steigende Reproduzierbarkeit der Forschung mit menschlichen Stammzellen.

Passagierung humaner neuraler Stammzellen

Eine einfache und zuverlässige Methode zur Isolierung und Kultivierung von neuralen Stammzellen aus gebrauchten menschlichen fetalen kortikalen Gewebe wird beschrieben. Kulturen von bekannten menschlichen neurologischen Erkrankungen abgeleitet werden können für die Charakterisierung von pathologischen zellulären und molekularen Prozesse eingesetzt werden, sowie eine Plattform bieten, um pharmakologische Wirksamkeit zu beurteilen.

Generierung von neuralen Stammzellen aus menschlichen Föten Ausrangierte Rindengewebe

Das Video beschreibt das Verfahren zur Aufrechterhaltung einer kontrollierten Umgebung in einer Zellkultur-Workstation für das Wachstum und die Pflege von neuronalen Stammzellen. Diese Verfahren umfassen das Festlegen von Kammerbedingungen, Reinigungsprotokolle und die Vorbereitung des Mediums, um maximale Sterilität und Reproduzierbarkeit zu erhalten und die traditionellen Methoden zu ersetzen.

Umgang mit neuronalen Stammzellkulturen in einer Zellproduktionsanlage

Hier präsentieren wir Kulturprotokolle für humane pluripotente Stammzellen (hPSC), die auf dem Wachstum von dissoziierten Einzelzellen basieren. Diese neue Methode, bei der Rho-assoziierte Kinase-Inhibitoren oder die Laminin-Isoform 521 (LN-521) verwendet werden, eignet sich für die Herstellung großer Mengen homogener hPSCs, die genetische Manipulation und die Wirkstoffforschung.

Alternative Kulturen für menschlichen pluripotenten Stammzellen Produktion, Wartung und Genetic Analysis

Dieses Protokoll bietet eine einfache und effiziente Möglichkeit, humane pluripotente Stammzellen (hPSCs) zu vermehren, indem nur konditionierte Medien aus der menschlichen Plazenta in einer mit Gelatine überzogenen Schale verwendet werden, ohne zusätzliche exogene Supplementierung oder hPSC-spezifische synthetische Substrate.

A Novel Kultur Modell für menschliche pluripotente Stammzelle Propagation auf Gelatine in Placenta Anlage Medien

In diesem Protokoll wollen wir beschreiben eine reproduzierbare Methode für Kombination dissoziiert menschlicher pluripotenter Stammzellen abgeleitet Neuronen und Astrozyten gemeinsam in 3D Kugel Kokulturen, pflegen diese Kugeln in den frei schwimmenden Bedingungen und anschließend Messung der synaptischen Schaltung Aktivität der Kugeln mit Immunoanalysis und multielectrode Array-Aufnahmen.

Synaptische batteriegestützte Modellierung mit 3D Kokulturen von Astrozyten und Neuronen aus menschlicher pluripotenter Stammzellen

Hier wird ein Protokoll zur Erzeugung einer einzelzelligen Kultur menschlicher embryonaler Stammzellen und deren anschließende Differenzierung in neuronale Vorläuferzellen vorgestellt. Das Protokoll ist einfach, robust, skalierbar und eignet sich für Arzneimittelscreenings und anwendungen in der regenerativen Medizin.

Effiziente neuronale Differenzierung mit einzelzellischer Kultur menschlicher embryonaler Stammzellen

Wir zeigen die Automatisierung von humaninduzierten pluripotenten Stammzellkulturen (hiPSC) und neuronalen Differenzierungen, die mit automatisierter Bildgebung und Analyse kompatibel sind.

Automatisierte Produktion von humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten kortikalen und dopaminergen Neuronen mit integrierter Live-Zell-Überwachung

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Erzeugung von aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Neuronen in einem 3D-Suspensionsbioreaktor.

Herstellung von humanen Neurogenin 2-induzierbaren Neuronen in einem dreidimensionalen Suspensionsbioreaktor

Dieses Protokoll stellt eine einzigartige Möglichkeit dar, Zellkulturen des Zentralnervensystems aus embryonalen Tag-17-Mäusegehirnen für die neuro(immun)ologische Forschung zu generieren. Dieses Modell kann mit verschiedenen experimentellen Techniken analysiert werden, darunter RT-qPCR, Mikroskopie, ELISA und Durchflusszytometrie.

Etablierung gemischter neuronaler und glialer Zellkulturen aus embryonalen Mäusegehirnen zur Untersuchung von Infektionen und angeborener Immunität

Hier stellen wir ein Protokoll für ein automatisiertes Zellkultursystem vor. Dieses automatisierte Kultursystem reduziert den Arbeitsaufwand und kommt den Anwendern zugute, einschließlich Forschern, die mit dem Umgang mit induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) nicht vertraut sind, von der Wartung von iPS-Zellen bis hin zur Differenzierung in verschiedene Zelltypen.

Ein automatisiertes Kultursystem zur Erhaltung und Differenzierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

Lernen Sie die Kultivierung pluripotenter und neuraler Stammzellen in einem geschlossenen Zellkultursystem für maximale Sterilität und reproduzierbare Ergebnisse nach cGMP-Standards.

Die Kultivierung humanen pluripotenten und Neurale Stammzellen in einem geschlossenen Zellkultursystem für Grund- und Präklinische Forschung (Video) | JoVE Journal

Die Kultivierung humanen pluripotenten und Neurale Stammzellen in einem geschlossenen Zellkultursystem für Grund- und Präklinische Forschung

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